專利名稱：：一種植物抗黃矮病相關(guān)蛋白TiDPK1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種植物抗黃矮病相關(guān)蛋白提TiDPKl及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大麥黃矮病毒可侵染小粒禾谷類植物，引起小麥、大麥、燕麥等小粒禾谷類作物和牧草的黃矮病，造成產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失。大麥黃矮病毒(barleyyellowdwarfvirus,BYDV)是由蚜蟲介導(dǎo)進(jìn)行傳播的。根據(jù)不同蚜蟲的傳播特性，把大麥黃矮病毒分為以下BYDV-PAV、BYDV-MAV、BYDV-GAV、BYDV-GPA、CYDV-RPV和SGV株系及RMV株系。其中BYDV-GPV(我國(guó)特有的株系類型)，BYDV-GAV為我國(guó)主流的株系。黃矮病是小麥的一種重要病毒病。小麥一旦感染黃矮病即無(wú)藥可治，造成小麥減產(chǎn)和品質(zhì)下降，因此黃矮病也稱為"小麥癌癥"，且分布廣泛，在世界各麥區(qū)地均有發(fā)生。例如，1978年美國(guó)因小麥黃矮病的大爆發(fā)致使小麥減產(chǎn)60%80%。1988年德國(guó)冬小麥因黃矮病流行而減產(chǎn)40%。近年來(lái)，因小麥黃矮病危害，每年澳大利亞的小麥損失約3000萬(wàn)美元；新西蘭、阿根廷、土耳其、突尼斯等國(guó)也有黃矮病的發(fā)生。1966年、1970年、1973年、1978年、1980年、1987年、19981999年我國(guó)的西北、華北部分地區(qū)和東北大面積發(fā)生此病害(張?jiān)銎G，辛志勇，抗黃矮病小麥生物技術(shù)育種研究進(jìn)展，作物雜志，2005，5:4-7)，僅1999年陜西、山西等麥區(qū)因黃矮病造成小麥減產(chǎn)20%30%，個(gè)別嚴(yán)重麥區(qū)減產(chǎn)超過50%，小麥產(chǎn)量損失達(dá)數(shù)億公斤(曹亞萍，張明義，喬合心等，冬小麥黃矮病抗性的遺傳分析，麥類作物學(xué)報(bào)，2000，28(6):738742)。近年來(lái)由于暖冬、暖春現(xiàn)象頻繁，降水明顯減少，給蚜蟲越冬、繁殖和毒源保存創(chuàng)造了有利條件，致使黃矮病在我國(guó)有擴(kuò)展和危害加重的趨勢(shì)，小麥黃矮病流行范圍已遍及陜西、山西、甘肅、四川、寧夏、內(nèi)蒙古、河北和江蘇等多個(gè)小麥產(chǎn)區(qū)。因此，黃矮病的防治對(duì)于保證小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展非常重要。選育和推廣應(yīng)用抗黃矮病小麥新品種，是防治該病害的最經(jīng)濟(jì)有效途徑。然而，迄今，小麥初級(jí)基因庫(kù)中尚未發(fā)現(xiàn)真正有效的抗性基因，僅鑒定出對(duì)BYDV-MAV株系表現(xiàn)一定耐性的Bdvl基因。近年來(lái)從偃麥草屬、冰草屬、賴草屬、披堿草屬、鵝冠草屬中鑒定出十幾種小麥遠(yuǎn)源親緣植物免疫或高抗黃矮病，其中以中間偃麥草的研究與利用最多(張?jiān)銎G，辛志勇，抗黃矮病小麥生物技術(shù)育種研究進(jìn)展，作物雜專，2005，5:4-7)。中間偃麥草高抗BYDV-PAV、-GAV、-GPV、-MAV，-RPV等株系，至少含有3個(gè)抗黃矮病基因，分別位于第7同源群染色體7X長(zhǎng)臂(7Ai-ftlL)，7E長(zhǎng)臂和第2同源染色體2Ai-2短臂，分別命名為Bdv2、Bdv3、Bdv4。通過小麥X中間偃麥草遠(yuǎn)緣雜交，育成抗黃矮病的部分雙二倍體TAF46、無(wú)芒中4(中5)。分別以TAF46、中5做橋梁親本，育成抗黃矮病的二體附加系Ll與Zl、Z2、Z6。利用組織培養(yǎng)、中國(guó)春ph突變體誘導(dǎo)部分同源染色體配對(duì)等途徑，成功地將Ll中抗黃矮病基因Bdv2導(dǎo)入小麥，育成一批抗黃矮病的小麥_中間偃麥草易位系，包括TC5-TC10、TC14以及YW642、YW443、YW243等(張?jiān)銎G，辛志勇，抗黃矮病小麥生物技術(shù)育種研究進(jìn)展，作物雜志，2005，5:4-7)。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶抗黃矮病基因Bdv2的小麥-中間偃麥草易位系YW642、YW443、YW243等，高抗BYDV-GAV、-MAV、-GPV和-PAV等株系，并且GISH、RFLP標(biāo)記等分析結(jié)果證明，攜帶Bdv2的中間偃麥草染色體7X長(zhǎng)臂(7Ai-#lL)端部小片段易位到小麥染色體7D長(zhǎng)臂端部(張?jiān)銎G，辛志勇，馬有志等，M即pingofaBYDVresistancegenefromThintermediumintermediuminwheatbackgroundbymolecularmarkers,ScienceinChina(SeriesC)，1999，42(6):663668)。本實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果還表明，YW642能顯著抑制BYDV的復(fù)制與運(yùn)動(dòng)(XiaodongLiu，ZengYanZhang通訊作者，ZhiyongXin，2005，Molecularevidenceofbarleyyellowdwarfvirusreplication/movementsuppressedbytheresistancegeneBdv2derivedfromTh.intermedium,遺傳學(xué)報(bào)，32:942-947)。理論上說，YW642、YW443、YW243等應(yīng)該可以做為抗黃矮病小麥育種中易于利用的抗性種質(zhì)。然而，這些易位系雖然高抗黃矮病致病株系但并被沒有成功地應(yīng)用、育成多少抗黃矮病小麥新品種，主要原因可能是抗黃矮病的染色體7Ai-ftlL片段存在著不利的連鎖累贅。因此，迫切需要從抗黃矮病的小麥_中間偃麥草易位系YW642等材料中分離克隆出Bdv2等抗黃矮病重要基因，研究其抗性作用分子機(jī)制，并應(yīng)用于基因工程育種，以高效地培育抗黃矮病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的小麥新品種。本實(shí)驗(yàn)室和國(guó)外學(xué)者，以抗黃矮病小麥-中間偃麥草易位系YW642、TC14等材料，分子標(biāo)記了來(lái)自小麥近緣植物中間偃麥草(Thinopyrumintermedium)的抗黃矮病基因Bdv2，將Bdv2定位到易位染色體的7AiftlL片段上(張?jiān)銎G等1999，2001，2004;Stoutjesdijk，P.，Kammholz，S.，Kleven，S.，Matsay，S.，Banks,P.，andLarkin，P.2001，PCR—basedmolecularmarkerfortheBdv2Thinopyrumintermedi咖sourceofbarleyyellowdwarfvirusresistanceinwheat.Aust.J.Agric.Res.52:383—1388;Ayala，L，Henry，M.，Gonz，N.，Ginkel，M.，Mujeeb-Kazi，A.，Keller,B.，andKhairallah，M.(2001)AdiagnosticmolecularmarkerallowingthestudyofTh.intermedium—derivedresistancetoBYDVinbreadwheatsegregatingpopulations.Theor.Appl.Genet.102，942—949;Ayala，L，Bariana，H.，Singh，R.，Gibson,J.，Gibson,A.，andMechanicos，P.(2007)TrigenomicchromosomesbyrecombinationofThinopyrumintermediumandTh.ponticumtranslocationsinwheat.Theor.Appl.Genet.116,63-75)。但是，由于中間偃麥草與小麥的親緣關(guān)系非常遠(yuǎn)，攜帶Bdv2的中間偃麥草染色體(7XL、7Ai#lL)片段與小麥部分同源染色體(7D)間很難發(fā)生交換分離，難以通過正常的F2群體精細(xì)定位Bdv2與分子標(biāo)記之間的遺傳距離，因此，圖位克隆法不適用于分離克隆7AiftlL片段上Bdv2等決定黃矮病抗性的重要基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗黃矮病蛋白，命名為TiDPKl，來(lái)源于中間偃麥草。本發(fā)明提供的植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白(TiDPKl)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物黃矮病抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的TiDPKl便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的TiDPKl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的TiDPKl的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼上述小麥黃矮病抗性重要蛋白的基因(TiDPKl)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因1)編碼序列是序列表中序列1的自5'端第196位-第1473位所示的基因；2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的基因；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與1)或2)限定的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7%SDS)中，65t:預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7%SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65t:雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液I(20,1/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，5%SDS)，65。C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，1%SDS)，65。C洗膜30min。上述3)或4)的基因具體可以是序列3所示的基因。序列3所示的基因是上述編碼基因的基因組DNA，該基因組DNA包括了2個(gè)內(nèi)含子，第一個(gè)內(nèi)含子位于序列3的自5'端的第126-629位，第二個(gè)內(nèi)含子位于序列3的自5'端的第1644-1724位。含有以上任一所述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體可將所述基因插入pAHC25載體的多克隆位點(diǎn)得到。含有以上任一所述基因(TiDPKl)的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增所述基因(TiDPKl)全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可將編碼所述植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的基因TiDPKl導(dǎo)入目的植物(如植物細(xì)胞或組織)中，得到黃矮病抗性高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。具體來(lái)說，可以將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，得到黃矮病抗性高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將編碼所述蛋白的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得黃矮病抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發(fā)明采用比較基因?qū)W、RACE技術(shù)、染色體定位、基因沉默快速分析功能、轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)等方法相結(jié)合的多元策略，進(jìn)行了中間偃麥草染色體(7XL、7Ai#lL)片段上的抗黃矮病重要基因TiDPKl的分離和功能分析。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的TiDPKl基因在抗黃矮病的小麥材料(如YW642)中表達(dá)，受BYDV-GAV誘導(dǎo)后，Y怖42葉片的TiDPKl表達(dá)量得到提高，以接種12小時(shí)最高；亞細(xì)胞定位顯示TiDPKl是1個(gè)膜蛋白；基因沉默結(jié)果顯示沉默掉TiDPKl基因后，抗黃矮病的植物材料(如YW642)中BYDV-GAV相對(duì)濃度提高，并且感病指數(shù)上升。說明了TiDPKl基因與抗黃矮病密切相關(guān)。轉(zhuǎn)入TiDPKl基因的原感病小麥對(duì)黃矮病的抗性得到顯著提高。本研究為開展小麥抗黃矮病作用的分子機(jī)制研究和分子育種，高效地培育抗黃矮病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的小麥新品種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。圖1為TiDPKl基因的EST功能標(biāo)記的篩選。圖2為利用Q-RTPCR分析在接種攜BYDV-GAV岈蟲(毒岈)和岈蟲(無(wú)毒岈)的YW642葉片中TiDPKl基因的表達(dá)譜。圖3為TiDPKl蛋白的亞細(xì)胞定位圖，A是GFP-TiDPKl;B是GFP。圖4為利用Q-RTPCR分析在實(shí)施TiDPKl基因沉默的YW642及其空白對(duì)照YW642、中8601葉片中TiDPKl基因的表達(dá)量。圖5為利用Q-RTPCR分析在實(shí)施TiDPKl基因沉默的YW642及其空白對(duì)照YW642、中8601葉片中BYDV-GAV-RdRp基因的相對(duì)表達(dá)量。圖6是空白對(duì)照YW642、中8601和實(shí)施TiDPKl基因沉默的YW642(BSMV:TiDPKl-YW642)對(duì)BYDV-GAV反應(yīng)的表型。圖7是利用TiDPKl基因特異引物對(duì)轉(zhuǎn)基因部分植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果，1:水，2:未轉(zhuǎn)基因的中8601,3-22:轉(zhuǎn)基因植株，P:轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒，箭頭指轉(zhuǎn)基因目的帶。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。完成本發(fā)明所依賴的遺傳資源是中間偃麥草Z1146，于2005年9月購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所資源種質(zhì)庫(kù)，由于是直接購(gòu)買，所以其原始來(lái)源不清楚。本發(fā)明所用的其它生物材料如下帶病毒BYDV-GAV株系的岈蟲購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。中8601(感病小麥)和小麥_中間偃麥草易位系YW642(HW642)(抗病小麥_中間偃麥草T7DS7DL-7XL易位系)張?jiān)銎G，馬有志，辛志勇等，1998，應(yīng)用基因組原位雜交技術(shù)鑒定抗黃矮病小麥新種質(zhì)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，31(3):1-4;ZhangZ，XinZ，MaY，ChenX，XuQ，LinZ.1999，MappingofaBYDVresistancegenefromThinopyrumintermediuminwheatbackgroundbymolecularmarkers.SciChinaCLifeSci.42(6):663-668.;該易位系是1991年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所辛志勇等創(chuàng)制，張?jiān)銎G等1996年鑒定出來(lái)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。BSMV-y(BMSV病毒的y載體)Burch-SmithTM，AndersonJC，MartinGB，Dinesh—K咖arSP.Applicationsandadvantagesofvirus—inducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants.ThePlantJournal，2004，39:734_746;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。hGFP載體Zhao_ShiXu，Lan-QinXia，MingChen，Xian-GuoCheng，Rui-YueZhang，Lian-ChengLi，Yun-XiangZhao，YanLu，Zhi-YongNi，LiLiu，Zhi_GangQiu，You—ZhiMa，2009，IsolationandmolecularcharacterizationoftheTriticumaestivumL.ethylene-responsivefactor1(TaERFl)thatincreasesmultiplestresstolerance,PlantMolBiol，65:719-732;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。植物表達(dá)載體pAHC25:ChristensenandQuail，1996;Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5，213-218.;中國(guó)農(nóng)業(yè)禾斗學(xué)院作物科學(xué)研究所。實(shí)施例1、新基因的發(fā)現(xiàn)1、TiDPKl基因特異的EST功能標(biāo)記的篩選與序列分析由于中間偃麥草染色體7XL(7Ai#lL)能夠易位到小麥染色體7DL上，說明中間偃麥草染色體7XL(7AiftlL)與小麥染色體7DL具有部分同源關(guān)系。盡管對(duì)中間偃麥草還未開展功能基因組研究，但小麥功能基因組特別是EST計(jì)劃的實(shí)施，許多EST被定位到小麥21條染色體上。因此我們利用小麥染色體7DL上的70個(gè)EST序列設(shè)計(jì)PCR引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增和凝膠電泳分析的條件，對(duì)攜帶Bdv2的抗黃矮病材料(中間偃麥草Z1146，小麥-中間偃麥草7X長(zhǎng)臂(7Ai#lL)雙端體附加系DT7XL，小麥_中間偃麥草易位系YW642)和無(wú)Bdv2的感黃矮病小麥材料(中8601，CS，YW641S)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用小麥EST(BQ238952)設(shè)計(jì)的引物(BQ-U:5'-GACATGCCGTATTACCACAAG-3'，BQ-L:5'-GCCAGAGCATCCTCCTTG-3')可以擴(kuò)增出TiDPKl基因特異片段，該特異片段出現(xiàn)在具有中間偃麥草7XL(攜帶Bdv2)的抗黃矮病材料，而感黃矮病小麥材料無(wú)此特異帶(圖1中箭頭所指為TiDPKl基因擴(kuò)增片段)。隨后我們從凝膠中分離源于Z1146、DT7XL、YW642的TiDPKl特異擴(kuò)增帶(260bp片段)，用特異引物(F:5'-GACATGCCGTATTACCACAAG-3'，R:5'-GCCAATGCGTCCTCCTTG-3')進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，回收，克隆，菌落-PCR篩選陽(yáng)性克隆，將含源于Z1146、DT7XL、YW642的TiDPKl基因片段的陽(yáng)性克隆各3個(gè)進(jìn)行測(cè)序分析，獲得TiDPKl基因CDNA序列的No.289-548nt序列(260bp)。2、TiDPKl基因的全長(zhǎng)cDNA序列和基因組序列的分離克隆利用源于Z1146、DT7XL、YW642的TiDPKl基因片段的序列設(shè)計(jì)3'RACE引物(3RP1:5，-CGTGATGTTCCCACGCCAAACTATTC-3，，3RP2:5'-AACAGCGTCATCTATCCCAACAAGGC-3，)，利用巢式PCR策略，以Z1146、Y怖42的cDNA為模板，快速擴(kuò)增TiDPKl基因cDNA的3'序列(具體條件；94。C3min;94。C30s，72。C3min，5個(gè)循環(huán)；94。C30s，70。C3min，5個(gè)循環(huán)；94。C30s，68。C3min，25個(gè)循環(huán)；72。C10min;)，獲得TiDPKl基因CDNA序列的No.457-1842nt序列。實(shí)施例2、基因的克隆及其分析—、基因的克隆根據(jù)實(shí)施例1的基因片段(BQ238952序列和3'RACE獲得的序列)拼接的全長(zhǎng)cDNA(核苷酸序列如1842bp的序列1所示)，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增引物(QC-U:5'-GCAGCACGCCAATCCGC-3'，QC-L:5'-GCAGCCGCTATCAACACAAGAC-3')，以中間偃麥草Zl146(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所資源種質(zhì)庫(kù))的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增TiDPKl基因的全長(zhǎng)cDNA序列(具體條件94。C3min;94。C30s，62。C35s，72。Clmin30s，5個(gè)循環(huán)；94。C30s，60。C35s，72。Clmin30s，5個(gè)循環(huán)；94。C30s，58。C35s，72。Clmin30s，25個(gè)循環(huán)；72°C10min;)，獲得序列表中序列1的自5'端第32-1827位所示的片段，其中，序列1的自5'端的第196-1473位的序列為完整開放閱讀框(ORF)，編碼序列2中由425個(gè)氨基酸組成的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸雙元激酶蛋白TiDPKl。另夕卜，以上述QC-U和QC-L為引物，以YW642、中8601的cDNA為模板擴(kuò)出的片段與序列表中序列1比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，源于Z1146、YW642的基因的TiDPKl與源于中8601的同源基因TaDPKl序列間僅存在23處單核苷酸多態(tài)性(SNP)差異。用上述QC-U禾口QC-L弓|物(QC-U:5，_GCAGCACGCCAATCCGC_3，，QC-L:5'-GCAGCCGCTATCAACACAAGAC-3')，以Z1146基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增TiDPKl基因的基因組DNA全長(zhǎng)序列，克隆，測(cè)序分析。結(jié)果得知TiDPKl基因的基因組DNA全長(zhǎng)序列為2413bp，核苷酸序列如序列表中序列3所示，包含2個(gè)內(nèi)含子，第一個(gè)內(nèi)含子位于序列3的自5'端的第126-629位，第二個(gè)內(nèi)含子位于序列3的自5'端的第1644-1724位。二、基因的分析1、TiDPKl基因的轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)A、接種帶病毒BYDV-GAV株系的蚜蟲購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病毒組。鑷取帶有蚜蟲的燕麥病葉小片置于三葉期YW642小麥植株葉腋間，在籠罩條件下強(qiáng)迫蚜蟲爬至小麥植株上取食，每株接種5-10頭岈蟲，7d后藥劑滅岈。B、Q-RT-PCR以保守的18SrRNA看家基因(18SrR-F:5'-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3'，18SrR-R:5，-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3，)作為內(nèi)標(biāo)基因使樣品間總cDNA濃度保持一致，利用TiDPKl特異弓|物TID-SNF:5'-CGCTCCCCTCCTTCCCCGTC-3，，TID-SNR:5'_tgagtatctccgttggatgagttgg_3'，TAKARA公司的SYBRPremixExTaqTM試劑盒進(jìn)行Q-RT-PCR，分析樣品中TiDPKl表達(dá)量，每個(gè)樣品至少3次重復(fù)。PCR擴(kuò)增程序95。C變性lmin，進(jìn)入95。C10s，60。Cfor31s共41個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖2所示，受BYDV-GAV誘導(dǎo)后，Y怖42葉片的TiDPKl表達(dá)量得到提高，以接種12小時(shí)最高。上述結(jié)果說明TiDPKl可能是抗黃矮病相關(guān)基因。2、TiDPKl蛋白的亞細(xì)胞定位根據(jù)序列2的TiDPKl蛋白結(jié)構(gòu)分析得知，TiDPKl雙元激酶蛋白具有膜結(jié)合位點(diǎn)。為驗(yàn)證該蛋白結(jié)構(gòu)的功能，我們構(gòu)建了P35S::TiDPKl-GFP融合蛋白載體(具體步驟利用引物GFP-F(5'-GCC腐C7TATGATTGAGGGGGCAAGGTTCC-3'斜體序列為Hindi11酶切位點(diǎn))和GFP-R(5'-TAGTCGGTGGTCATGGGCTCGG-3，斜體序列為BamHI酶切位點(diǎn))擴(kuò)增除去終止密碼子的TiDPKl基因的ORF區(qū)，連接到pMD18-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌株進(jìn)行保菌并提取質(zhì)粒，利用HindIII和BamHI將目的片段酶切下來(lái)，與經(jīng)過HindIII和BamHI酶切的hGFP載體(中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所王道文研究員提供)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆保菌并提取質(zhì)粒，并用基因槍介導(dǎo)法(參考ZhangZengYan，YaoWuLan，DongNa，LiangHongXia，LiuHongXia，HuangRongFeng.2007.AnovelERFtranscriptionactivatorinwheatanditsinductionkineticsafterpathogenandhormonetreatments.JournalofExperimentalBotany58，2993-3003)，將P35S::TiDPKl-GFP轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)(圖3中A)，同時(shí)以空載體P35S::GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)作為對(duì)照(圖3中B)。結(jié)果如圖3所示，TiDPKl-GFP僅在細(xì)胞膜表達(dá)，而GFP在洋蔥表皮細(xì)胞的核內(nèi)與膜上均表達(dá)，說明TiDPKl是1個(gè)膜蛋白。[]實(shí)施例3、TiDPKl基因的抗黃矮病功能分析—、沉默YW642中的TiDPKl基因(病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù))利用BMSV病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，進(jìn)行TiDPKl的抗黃矮病功能的驗(yàn)證。用引物TiDPKl-FV:5，-AAgCggO^gACATGCCGTATTACCACAAG-3，斜體序列為Notl酶切位點(diǎn)，TiDPKl-RV:5'-CCHW，GCCAATGCGTCCTCCTTG-3，斜體序列為Pacl酶切位點(diǎn)，高保真TAQ酶擴(kuò)增TiDPKl基因的特異片段(序列1的自5'端第289至第548位)，獲得兩邊分別帶有Pacl和Notl酶切位點(diǎn)的TiDPKl基因的特異片段。回收Pacl和Notl酶切的TiDPKl基因特異片段，連接到Pacl和Notl酶切的BSMV病毒的y載體上(BSMV病毒的y載體，參考Burch-SmithTM，AndersonJC，MartinGB，Dinesh-KumarSP.Applicationsandadrantegesofvirus—inducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants.ThePlantJournal,2004，39:734-746;由美國(guó)LargeScaleBiology公司PogueGregory博士惠贈(zèng))，使TiDPKl基因的特異片段(序列1的自5'端第289至第548位)以反向法插到BMSV病毒的y載體上(被y載體的T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))，得到重組載體BSMV-y:TiDPKl。然后在攜帶Bdv2的抗黃矮病材料YW642的2葉期幼苗葉片上實(shí)施TiDPKl基因沉默，具體步驟如下采用摩擦法接種重組載體BSMV-y:TiDPKl到第二片葉完全伸展的抗病品種Y怖42的第一、第二片葉上。接種時(shí)，用未接種手固定小麥幼苗的基部，接種手的拇指和食指壓住葉片，沿著葉片伸展的方向，從葉底部連續(xù)摩擦到葉尖，第一、第二兩片葉子同時(shí)接種。接種完成后，向小麥幼苗噴施DEPC水，保鮮膜覆蓋保濕24h，之后移去保鮮膜，每隔l-2h噴施一次DEPC水，白天25°C，16h光照，晚上20。C黑暗培養(yǎng)。至此得到了基因沉默的株系(隨機(jī)取3個(gè)株系命名為BSMV:TiDPK1-1、BSMV:TiDPKl-2和BSMV:TiDPKl-3)。在實(shí)施TiDPKl基因沉默7天后，對(duì)上述3個(gè)基因沉默的株系以及未開展基因沉默的YW642和中8601按照實(shí)施例2中的接種方法接種黃矮病病毒(BYDV-GAV株系)，然后進(jìn)行下述l)和2)的檢測(cè)。1)利用Q-RT-PCR分析實(shí)施TiDPKl基因沉默的YW642及其空白對(duì)照YW642、中8601葉片中TiDPKl基因的表達(dá)量與BYDV-GAV的相對(duì)濃度A、Q-RT-PCR分析TiDPKl基因的表達(dá)量對(duì)上述3個(gè)基因沉默的株系以及未開展基因沉默的YW642和中8601進(jìn)行Q-RT-PCR分析，實(shí)驗(yàn)步驟是以保守的18SrRNA看家基因(18SrR-F:5'-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3'，18SrR-R:5'-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3')作為內(nèi)標(biāo)基因使樣品間總cDNA濃度保持一致，利用TiDPKl特異引物TID-SNF:5，-CGCTCCCCTCCTTCCCCGTC-3，，TID-SNR:5'-tgagtatctccgttggatgagttgg-3，，Takara公司的SYBRPremixExTaqTM試劑盒進(jìn)行Q-RT-PCR，每個(gè)樣品至少3個(gè)重復(fù)。PCR擴(kuò)增程序95。C變性lmin，進(jìn)入95。C10s，60。Cfor31s共41個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖4(圖4中BSMV:TiDPK1-1、BSMV:TiDPK1-2、BSMV:TiDPKl-3是不同基因沉默株系；Mock-l是未開展基因沉默的YW642、Mock-2是未開展基因沉默的中8601)所示，實(shí)施TiDPKl基因沉默5天、17天(接種BYDV-GAV的第10天)、27天(接種BYDV-GAV的第20天)后，實(shí)施TiDPKl基因沉默的YW642中TiDPKl基因已經(jīng)完全沉默、不再表達(dá)，且TiDPKl基因沉默一直維持到收獲。B、Q-RT-PCR分析BYDV-GAV-RdRp的相對(duì)表達(dá)量(BYDV-GAV-RdRp是BYDV-GAV病毒的一段基因，BYDV-GAV-RdRp的相對(duì)表達(dá)量可代表BYDV-GAV的相對(duì)濃度)。對(duì)上述3個(gè)基因沉默的株系以及未開展基因沉默的YW642和中8601進(jìn)行Q-RT-PCR分析，實(shí)驗(yàn)步驟是以保守的18SrRNA看家基因(18SrR-F:5，-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3，，18SrR-R:5'-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3')作為內(nèi)標(biāo)基因使樣品間總cDNA濃度保持一致，利用引物序列RdRP-F:5'-TGACCGAGGCTTGGAACGAC-3'，RdRP-R:5'-CGATGGTGGCGAGAGACAGT-3，，TAKARA公司的SYBRPremixExTaqTM試劑盒進(jìn)行Q-RT-PCR，分析樣品中RdRP表達(dá)量，每個(gè)樣品至少3個(gè)重復(fù)。PCR擴(kuò)增程序95。C變性lmin，進(jìn)入95。C10s，60。Cfor31s共41個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖5(圖5的橫坐標(biāo)與圖4的橫坐標(biāo)相同)所示，接種BYDV-GAV10天(實(shí)施TiDPKl基因沉默17天)，TiDPKl基因沉默的Y怖42中BYDV-GAV的相對(duì)濃度提高1-1.5倍，高于空白對(duì)照Y怖42葉片中的BYDV-GAV相對(duì)濃度，相當(dāng)于中8601葉片中的BYDV-GAV相對(duì)濃度的1/2，接種BYDV-GAV20天(實(shí)施TiDPKl基因沉默27天)，TiDPKl基因沉默的Y怖42中BYDV-GAV的相對(duì)濃度提高3_4倍，遠(yuǎn)高于空白對(duì)照抗病的Y怖42葉片中BYDV-GAV相對(duì)濃度，相當(dāng)于高感黃矮病的中8601葉片中BYDV-GAV相對(duì)濃度的3/5。2)接種BYDV-GAV30天后，觀察基因沉默的Y怖42及未開展基因沉默的對(duì)照YW642、中8601對(duì)BYDV-GAV的反應(yīng)型，進(jìn)行抗病性調(diào)查。其中，抗性調(diào)查方法是按照全國(guó)統(tǒng)一的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，單株劃分病情級(jí)別，黃矮病發(fā)病程度分為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等11級(jí)。用發(fā)病程度值的大小作為衡量抗病程度的指標(biāo)。小麥黃矮病發(fā)病強(qiáng)度(IT)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)健株1級(jí)部分葉尖黃化2級(jí)旗葉下1片葉黃化3級(jí)旗葉下2片葉黃化4級(jí)旗葉黃化1/4，旗葉下1片葉黃化5級(jí)旗葉黃化1/4，旗葉下2片葉黃化6級(jí)旗葉黃化7級(jí)旗葉黃化，旗葉下1片葉黃化8級(jí)旗葉和旗葉下2片葉黃化9級(jí)植株矮化，但能抽穗10級(jí)植株矮化顯著，不抽穗結(jié)果如表1所示，接種BYV-GAV30天后，未開展基因沉默的中8601葉片表現(xiàn)對(duì)BYDV-GAV感病的癥狀(感病指數(shù)IT:7)，TiDPKl基因沉默的Y怖42也顯示對(duì)BYDV-GAV感病的癥狀(感病指數(shù)IT:5)，而未開展基因沉默的YW642顯示高抗BYDV-GAV、無(wú)感病癥狀(IT:0照片如圖6所示)，說明TiDPKl基因是1個(gè)抗黃矮病重要基因。表1.TiDPKl基因沉默的YW642的病感指數(shù)11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和抗病性鑒定—、重組表達(dá)載體pA25-TiDPKl的構(gòu)建單子葉植物表達(dá)載體pAHC25(ChristensenandQuail，1996;Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5，213-218.由美國(guó)USDA-ARS的Dr.PeterQuail惠贈(zèng)))，含有2個(gè)表達(dá)盒；第1個(gè)表達(dá)盒具有玉米Ubiquitin啟動(dòng)子、Exon、Intron、GUS基因、Nos終止子，GUS兩端具有Smal和Sacl酶切位點(diǎn)；第2個(gè)表達(dá)盒具有玉米Ubiquitin啟動(dòng)子、Exon、Intron、Bar基因、Nos終止子。以Z1146的cDNA為模板，用加酶切位點(diǎn)的TiDPKl基因特異引物(QF-SMAI:5'-ATCCCGGGATGATTGAGGGGGCAAGGTTC-3，引入Smal酶切位點(diǎn)，QF-SACI:5，-CCGAGCTCTCAGTCGGTGGTCATGGGCTC-3'引入Sacl酶切位點(diǎn))和高保真TAQ酶PCR擴(kuò)增，獲得兩端帶Smal和Sacl酶切位點(diǎn)的TiDPKl基因完整開放閱讀框(0RF)，用Smal和Sacl酶切的該基因擴(kuò)增片段和pAHC25，連接酶切的TiDPKl基因0RF與pAHC25載體目的片段，將TiDPKl基因OR替代pAHC25的GUS基因構(gòu)建成重組載體。經(jīng)過測(cè)序鑒定，重組載體中，含有TiDPKl基因的全長(zhǎng)0RF構(gòu)建到單子葉植物表達(dá)載體pAHC25的Smal和Sacl位點(diǎn)之間，該載體中的各片段序列正確，將該重組載體命名為pA25-TiDPKl.二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、用基因槍法將pA25-TiDPKl轟擊到小麥品種中8601幼胚的愈傷組織(轟擊50槍，每槍40個(gè)愈傷組織，共計(jì)2000個(gè)愈傷組織塊)(方法參見文獻(xiàn)徐惠君，Steinbiss，H.H.，Sohn，A.，等，云南大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21:26-27)。2、轟擊后的愈傷組織在滲透壓培養(yǎng)基上后處理16h。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到SD2(MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分中添加VB工lmg/L，天冬門酰胺150mg/L，2，4-D2mg/L)，26°C，暗培養(yǎng)，恢復(fù)培養(yǎng)2周。3、將恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基中(1/2MS培養(yǎng)基附加NAAlmg/L、KTlmg/L、Bial即hos2-5mg/L)，24-26光照培養(yǎng)14d。4、將愈傷組織分化小苗后轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)篩選培養(yǎng)基中(1/2MS培養(yǎng)基附加Bial即hos2-3mg/L)，24-26光照培養(yǎng)。5、經(jīng)過2-3次Bial即hos篩選的轉(zhuǎn)化小苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基附加0.5mg/LNAA)上，將苗高7-8cm且根系發(fā)達(dá)的轉(zhuǎn)化苗移栽到花盆，在溫室生長(zhǎng)發(fā)育。至此，獲得了轉(zhuǎn)pA25-TiDPKl的轉(zhuǎn)基因植物。按照獲得轉(zhuǎn)pA25-TiDPKl的轉(zhuǎn)基因植物的方法，將空載體pAHC25轉(zhuǎn)入中8601，得到轉(zhuǎn)空載體中8601對(duì)照。在4葉期，每株轉(zhuǎn)化苗取1個(gè)葉片提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定(TID-SNF:5，-CGCTCCCCTCCTTCCCCGTC-3，，TID-SNR:5'-tgagtatctccgttggatgagttgg-3，)。結(jié)果表明，得到了轉(zhuǎn)TiDPKl基因中8601陽(yáng)性植株63株，PCR檢測(cè)部分植株及其對(duì)照的電泳圖見圖7。12對(duì)63株P(guān)CR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)TiDPKl基因小麥中8601植株、未轉(zhuǎn)基因中8601和轉(zhuǎn)空載體中8601對(duì)照，接種BYDV-GAV株系，進(jìn)行抗病性鑒定?？共⌒澡b定方法同實(shí)施例3。接種5周后開始進(jìn)行抗病鑒定。結(jié)果表明有29株轉(zhuǎn)TiDPKl基因陽(yáng)性的小麥中8601對(duì)BYDV-GAV表現(xiàn)抗性(IT1-2);未轉(zhuǎn)基因中8601葉片表現(xiàn)感病癥狀(IT7-8);轉(zhuǎn)空載體中8601對(duì)照的葉片表現(xiàn)感病癥狀(IT7-8);未轉(zhuǎn)基因YW642高抗BYDV-GAV(IT0)。再次說明TiDPKl基因是1個(gè)抗黃矮病重要基因。序列表〈110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所〈120〉一種植物抗黃矮病相關(guān)蛋白TiDPKl及其編碼基因與應(yīng)用〈160>3〈210>1〈211>1842〈212>DNA〈213〉中間偃麥草(Thinopyrumintermedium)〈400>1ccacgcgtccgcgcctcgcacgcagcacgccaatccgcgcccggattctc60cccgccgcccaatcgccgccgccgctcccctccttccccgtccgcagctccgctcccggc120tgaggacccatttcattgctgg3g皿C3g3teattgtcagaagctttgccattggtgtgt180gttgcatctttg皿gatgattg郷gggraaggttccacaatetgcteggcggtgccggc240atcggcggcggc卿ggg皿gctggag皿c皿gagc皿cggcttctecgacatgccgtet300teccac皿ggtcgggg卿gctcccacatgtcggtgg織gcgcggac皿catgaactcg360atg皿ctetgttggcagctccgtcgccatgtcggtgg織3C3gC3gCgtggcctcgaac420gagtcccgcaccgtcatgctc皿ccaccctggcctccgtgatgttcccacgccaaactet■tcagtttgcaacagcgtcatctetcccaac皿ggctgctgcgtctgttctc皿ggaggac540gcattggctcgggttttgatggacccaactcatccaacggagatectcacteactecgag600gagtggaccatcgatctgggg皿gctggacatgggggctccttttgctcagggggccttt660gga皿gctetatcgggg皿cateteatgggga卿tgttgccatteagctgctgg卿ag720cctgag皿tgatc^gagagatgg^cagcagtttgtgcaag皿gttetg780atgttgtcteccccaatettgteaggttcattggggcatgccgg皿gtcg840attgtttggtgtetcattectg皿tetgca腿ggtggctctgtcaggcagttccttgcc■Cg皿ggC3g3ccaagtctgtgcccctgagattggragtgatgatgttgcc960郷gg皿tggcgtetgtgcatgccctgggatttetccacagggatctg皿gtcagateac1020cttcteatttC3gC3g3C皿atccatcaagattgcagactttggagttgctcg皿tcgag1080gte皿皿ccg3ggg皿tg3Cggaaccteccgctggatggc3CCgg3g3tg1140atccagcacaggccttetgatcateaggtcgacgtgtetegctttgggattgtgccgtgg1200gagcttetgaccggcatgctccccttcacacggttcaggcagcttttgct1260gtggtga織皿皿cgctcgtcctgccatcccacaagattgcctgcctgctcteagccac1320atcatgacccgttgctgggacgcaaaccctgaagtccgcccgtcattcaacgaggtcgtc1380accatgctcgaggctgccgagacggacgttgtcagcaacgtccgteaggcacggttccgc1440tgctgcatctccgagcccatgaccaccgactgagactegtgccaggatec3g3gteccag1500朋朋tg朋朋atggg朋g朋g朋cg朋gatggga朋ggaggcgacgc朋tctcgatgtet1560agaccacactgatecacctgggcgttgcgtgtgcctgcctatccgaaggtctgatggttg1620ccctgggcteagcteggttcttcattgctgctttctectetcttgtcttegttgcatggg1680ttggagtgattgtttgccaagtetggatgatgctecgtetgttttctgttttcttggaag1740gatgctetctggtetgtteac朋ggagctetggtetgtettctccgc朋gc朋3gagcte1800tctttgtcttgtgttgategcggctgcgaa1842〈210>2〈211>425〈212>PRT〈213〉中間偃麥草(Thinopyrumintermedium)〈400>2MetlieGluGlyAlaArgPheHisAsnMetLeuGlyGlyAlaGlylie151015GlyGlyGlyArgGlyLysLeuGluAsnLysSerAsnGlyPheTyrAsp202530MetProTyrTyrHisLysValGlyGluSerSerHisMetSerValAsp354045SerAlaAspAsnMetAsnSerMetAsnTyrValGlySerSerValAla505560MetSerValAspAsnSerSerValAlaSerAsnGluSerArgThrVal65707580MetLeuAsnHisProGlyLeuArgAspValProThrProAsnTyrSer859095ValCysAsnSerVallieTyrProAsnLysAlaAlaAlaSerValLeu100105110LysGluAspAlaLeuAlaArgValLeuMetAspProThrHisProThr115120125GlulieLeuThrAsnTyrGluGluTrpThrlieAspLeuGlyLysLeu130135140AspMetGlyAlaProPheAlaGinGlyAlaPheGlyLysLeuTyrArg145150155160GlyThrTyrAsnGlyGluAspValAlalieLysLeuLeuGluLysPro165170175GluAsnAspGinGluArgAlaGinLeuMetGluGinGinPheValGin180185190GluValMetMetLeuSerThrLeuArgHisProAsnlieValArgPhe195200205<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>acttttaacctccaagggttagttgagtttagtttegttt郷tgggg皿tgcgteggte420gga朋gcttcagtgctgcgaagctcaatttggtctgtgtc皿gateggttaattttgctg■ttgctggatgg￡ltgg￡ltgg￡lttttggggcctgctetccttccttctcagccgtg咖tgg540ggca朋ttteccttgtgttgtetetgtteggttetgtgttgtgcatttcgatggacagtc600atetectctgtcctggttetatetgcaggacccatttcattgctggag皿cagateattg660tcagaagctttgccattggtgtgtgttgcatctttg皿gatgattgagggggc皿ggttc720cacaatetgcteggcggtgccggcatcggcggcggcagaggg皿gctggag皿c皿gagc780aacggcttctacgacatgccgtetteccac皿ggtcggggagagctcccacatgtcggtg840g織gcgcggctcgatgaactetgttggcagctccgtcgccatgtcggtg■g3C朋C3gC3gcgtggcctcg皿cgagtcccgcaccgtcatgctcaaccaccctggcctc960cgtgatgttcCC3CgCC3朋ctettcagtttgc皿cagcgtcatctetccc皿c皿ggct1020gctgcgtctgttctcaaggaggacgrattggctcgggttttgatggacccaactcatcca1080acggagatectcactaactacg郷賜tggaccatcgatctgggg皿gctgg織tgggg1140gctccttttgctcagggggcctttgga皿gctetetcgggg^cateteatgggga卿t1200gttgccatteagctgctggag皿gcctgaggttgatgg皿1260cagcagtttgtgc朋g朋gttatgatgttgtctecattgaggcaccccaatettgteagg1320ttcattggggcatgccgg朋gtcgattgtttggtgtetcattectgaatetgc朋皿ggt1380ggctctgtcaggcagttccttgcccg皿ggC3g3CC皿gtctgtgcccctg卿ttggra1440gtg朋3C3g3cacttgatgttgcc郷ggaatggcgtetgtgcatgccctgggatttetc1500C3C3ggg3tCtgaagtcagataaccttcteatttcagcagc^gattgca1560gactttggagttgctcgaatcgaggte^a3CCg3ggg皿tgactccagag3C3gg皿CC1620tecteagtcaattgcatccacteccgatgttttttttgtgtgcaaatgtctctcagatet1680gctgatgtcttttgcctteacaggcgctgg3tggC3CCggagatgatccagcacaggcct1740tetgatcateaggtcgacgtgtetegctttgggattgtgccgtgggagcttetgaccggc1800atgctcccctg織gcggttcaggcagcttttgctgtggt1860gctcgtcctgCC3tCCC3C3agattgcctgcctgctcteagccacatcatgacccgttgc1920tgggacgcaaaccctgaagtccgcccgtcattc皿cgaggtcgtcaccatgctcgaggct1980gccg卿cggacgttgtcagcaacgtccgt皿ggcacggttccgctgctgcatctccgag2040cccatgaccaCCg3Ctg3g3ctegtgccaggatecagagtg皿朋atggg2100朋g朋g朋cg朋gatggg皿郷郷cgacgcaatctcgatgtetegaccacactgatac2160acctgggcgttgcgtgtgcctgcctetccg皿ggtctgatggttgccctgggcteagcte2220ggttcttcattgctgctttctactetcttgtcttegttgcatgggttggagtgattgttt2280gcc朋gtetggatgatgctecgtetgttttctgttttcttgg皿ggatgctetctggtet2340gtteac朋ggagctetggtetgtettctccagctatctttgtcttgtgtt2400gatagcggctgcg241權(quán)利要求一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與植物黃矮病抗性相關(guān)的的由1)衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因1)編碼序列是序列表中序列1的自5'端第196位-第1473位所示的基因；2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的基因；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與1)或2)限定的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；4)與l)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述3)或4)的基因如序列表中序列3所示。5.含有權(quán)利要求2-4任一所述基因的重組載體或重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求2-4任一所述基因插入PAHC25載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。7.—種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2-4任一所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到黃矮病抗性高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2-4任一所述基因通過權(quán)利要求5或6所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中；所述目的植物為小麥。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物為小麥品種中8601。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述黃矮病是由黃矮病病毒BYDV-GAV株系引發(fā)的。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物抗黃矮病相關(guān)蛋白TiDPK1及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白是如下1)或2)的蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與植物耐逆相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白的編碼基因TiDPK1基因和轉(zhuǎn)基因株系、方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)。實(shí)驗(yàn)證明該基因在抗黃矮病小麥(如YW642)中特異表達(dá)，且受BYDV誘導(dǎo)上調(diào)；TiDPK1是1個(gè)膜蛋白；TiDPK1沉默的原抗黃矮病的YW642中BYDV濃度提高、感病指數(shù)上升；過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥提高了黃矮病抗性；說明TiDPK1基因是抗黃矮病重要基因。文檔編號(hào)C12N15/82GK101704883SQ200910237948公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年11月26日優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日發(fā)明者劉艷,張?jiān)銎G,徐惠君,辛志勇,陳亮,高蘭英申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所