專利名稱：：一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：干旱、鹽堿等非生物逆境是植物的生長和發(fā)育主要限制因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干旱、半干旱地區(qū)占地球陸地面積的33%，鹽堿地占地球陸地面積的7.6%。在我國，干旱地區(qū)的耕地面積約為5.7億畝，鹽堿地約為5.54億畝，每年因干旱、鹽堿等逆境對(duì)小麥造成的糧食減產(chǎn)達(dá)700-800億公斤。小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物之一，在國民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。然而，干旱、高鹽等逆境脅迫嚴(yán)重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展。植物的耐旱、耐鹽性大多屬于多基因控制的數(shù)量性狀，利用常規(guī)育種方法改良作物的抗逆性受到周期長、優(yōu)異種質(zhì)資源缺乏的制約。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)，從分子水平上深入研究植物與非生物逆境之間的關(guān)系，揭示植物對(duì)逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理，為培育作物抗逆新種質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。目前，通過基因工程技術(shù)已將許多抗旱，耐鹽和耐低溫相關(guān)的基因(如合成各類滲透保護(hù)劑的酶類基因、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的蛋白激酶基因)導(dǎo)入到作物中，從而提高作物的抗逆性已有大量的報(bào)道。例如，將抗逆相關(guān)的功能基因?qū)胱魑?，Lilius等將編碼膽堿脫氫酶的基因(BetA)導(dǎo)入煙草和馬鈴薯，獲得了抗鹽和耐低溫的轉(zhuǎn)基因植株(Liliusetal.，1996)。Nakamura等將甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)導(dǎo)入煙草，增加了煙草中的甜菜堿的含量，同時(shí)明顯提高了煙草對(duì)鹽和寒冷脅迫的耐受能力(Nakamuraetal.，1997)。在植物體內(nèi)，抗氧化系統(tǒng)由許多酶組成，如SOD、過氧化氫酶、過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶。SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的關(guān)鍵酶，植物中已有幾種SOD酶基因被克隆出來并在轉(zhuǎn)基因植株中得到了活驗(yàn)證性。McKEesie等將煙草Mn-SOD導(dǎo)入苜蓿，轉(zhuǎn)基因苜蓿在干旱脅迫環(huán)境下的產(chǎn)量和存活率都有了顯著提高(McKEesieetal.，1999)。植物對(duì)干旱、高鹽等逆境脅迫的耐性是多基因控制的數(shù)量性狀，其生理、生化過程是基因相互作用、共同調(diào)節(jié)的，導(dǎo)入單個(gè)功能基因雖然在一定程度上提高了植物的抗逆性，但提高幅度不大，往往不能達(dá)到有效增強(qiáng)植物抗逆性的目的(Liuetal.，1998;劉強(qiáng)等，2000)。近年來，通過轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能的分析來鑒定、闡明各種條件下基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理得到了廣泛關(guān)注(劉強(qiáng)等，2000)。Yamaguchi-Shinozaki等人的研究結(jié)果表明利用rd29A啟動(dòng)子啟動(dòng)AtDREBlA基因的表達(dá)，能夠有效提高農(nóng)作物(小麥)對(duì)干旱、高鹽和低溫的抗性(Yamaguchi-Shinozakietal.，2002;Pellegrineschietal。2004)。GmDREB3基因的超量表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株對(duì)干旱和低溫脅迫的耐性(Chenetal.，2007)。將棉花GhDREB基因轉(zhuǎn)化小麥品種揚(yáng)麥10號(hào)，轉(zhuǎn)基因小麥的耐旱、耐鹽性得到明顯提高(Gaoetal.，2009)。堿性亮氨酸拉鏈(basicleucinezi卯er，bZIP)蛋白是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛、最保守的一類蛋白。研究表明bZIP蛋白不僅參與種子貯藏基因的表達(dá)、光形態(tài)的發(fā)生以及器官建成的控制(Finkelsteinetal.，2002)，還參與植物對(duì)脫落酸、光和發(fā)育中各種信號(hào)的反應(yīng)(Jakobyetal.，2002)。MarcJakoby等對(duì)擬南芥基因組全序列分析發(fā)現(xiàn)了大量的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子。綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子(DREB類、bZIP類等)在調(diào)節(jié)植物的逆境反應(yīng)，提高植物的抗逆性中起著至關(guān)重要的作用。目前，利用抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因改良和提高擬南芥、煙草、水稻等植物的抗逆性，取得了很大成功。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6的編碼基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明的另一目的提供上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6，來源于長穗偃麥草(其直接來源為北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，其原始來源中國新疆)，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子由367個(gè)氨基酸殘基組成，是bZIP類轉(zhuǎn)錄因子。自SEQIDNO.1的氨基末端第295-355位氨基酸殘基是保守的bZIP結(jié)構(gòu)，自SEQIDNO.1的氨基末端第290-293位氨基酸殘基為核定位序列。SEQIDNO.1:MDFPGGSGRPPPQQHQHQLLPPMTPLPLTRQGSSVYSLTFDEFQSALGGPGKDFGSMNMD60ELLRNIWTAEESQAIGAGANAASSSAAAGPDHGGIQRQGSLTLPRTLSQKTVDEVWRD匪120FFGGPASASTAAEAPPPAQRQQTLGEVTLEEFLVRAGVVREDMPGPPPPVSPAPVAQAPP180PPPQPQMLFPQSNMFAPMVNPLSLANGLITGAYGQGGGGGGGAPAMVSPSPTGRPVMSNG240YGKMEDRNLSSLSPPPMPYVFNGGLRGRKPPAMEKVVERRQRRMIKNRESAARSRQRKQS300Y匪ELETEVAKLKERNEELQRKQAEMLERQKNEVFEKVTRQAGLTSKRICLRRTLTGPW359為了使蛋白EeABF6便于純化，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明所公開的SEQIDNO.1序列，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子EeABF6可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。根據(jù)本發(fā)明的EeABF6編碼基因具有如SEQIDNO.2或3所示核苷酸序列。EeABF6的表達(dá)受干旱、鹽、脫落酸和低溫脅迫的誘導(dǎo)。SEQIDNO.31ATGGACTTTCCGGGAGGGAGCGGGAGGCCGCCGCCGCAGCAGCACCAGCACCAGCTGCTG61CCGCCGATGACGCCGCTGCCGCTCACAAGGCAGGGGTCATCGGTCTACTCGCTCACGTTC121GACGAGTTCCAGAGCGCGCTCGGCGGGCCGGGCAAGGACTTCGGATCCATGAACATGGAC181GAGCTCCTCCGCAACATCTGGACGGCCGAGGAGTCGCAGGCCATCGGCGCCGGCGCCAAC241GCCGCCTCTTCCTCCGCCGCCGCGGGGCCAGATCACGGCGGCATCCAGCGCCAGGGCTCG301CTCACGCTGCCCAGGACGCTCAGCCAGAAGACCGTCGACGAGGTCTGGCGCGACATGATG361TTCTTCGGTGGGCCCGCCTCCGCCTCCACGGCCGCCGAGGCTCCCCCGCCGGCCCAGAGG421CAGCAGACGCTCGGGGAGGTCACGCTCGAGGAGTTCCTCGTGCGCGCCGGCGTTGTGCGC481GAGGACATGCCGGGGCCGCCGCCCCCCGTGTCGCCGGCGCCCGTGGCCCAGGCGCCGCCT541CCGCCTCCGCAGCCGCAGATGCTGTTTCCTCAGAGCAACATGTTTGCTCCTATGGTGAAT601CCTCTGTCCTTGGCCAATGGGTTGATCACCGGAGCATACGGCCAGGGAGGAGGAGGTGGT661GGTGGTGCGCCCGCTATGGTTTCGCCGTCGCCGACGGGGAGGCCGGTCATGTCCAACGGC721TACGGCAAGATGGAAGACCGCAACTTGTCCTCGCTGTCGCCGCCGCCGATGCCGTATGTT781TTCAACGGCGGGCTGAGGGGGAGGAAGCCACCGGCCATGGAGAAGGTGGTCGAGAGGAGG841CAGCGGCGGATGATCAAGAACCGGGAGTCTGCGGCGAGGTCGCGCCAGAGGAAACAGAGT901TATATGATGGAATTGGAGACTGAGGTGGCAAAGCTTAAAGAGCGGAATGAGGAGTTGCAG961AGAAAACAGGCGGAGATGCTAGAGAGGCAAAAGAATGAGGTATTCGAGAAGGTCACCCGG1021CAAGCTGGACTCACGTCGAAGAGGATCTGCCTGCGGAGGACGCTGACGGGCCCTTGG含有EeABF6基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有EeABF6基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用EeABF6構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆植物的方法。本發(fā)明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述任一種含有EeABF6基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到耐逆植物。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的bZIP轉(zhuǎn)錄因子EeABF6的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)干旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有編碼基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、小麥、長穗偃麥草、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。所述植物耐逆性具體可為對(duì)非生物脅迫的耐逆性，如對(duì)或鹽脅迫的耐逆性。本發(fā)明以抗旱、耐鹽性較強(qiáng)的長穗偃麥草(Elytrigiaelongat咖L.)為實(shí)驗(yàn)材茅斗，得至lj了抗逆相關(guān)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子EeABF6(ElytrigiaelongatumABAResponsiveElementBindingFactor6)蛋白及其編碼基因，并將EeABF6基因?qū)霟煵荩@著提高了植物的抗旱、耐鹽性。本發(fā)明的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧肌⒃鰪?qiáng)煙草抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。圖1為抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6編碼基因的cDNA克隆，以長穗偃麥草cDNA為模板，PCR擴(kuò)增含有bZIP保守域的cDNA片段，1，2:長穗偃麥草片段；M:DL2000marker(100，250，500，750，1000，2000bp)。圖2為熒光定量PCR分析EeABF6在干旱、鹽脅迫處理下的表達(dá)特征，A.煙草經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的篩選、分化培養(yǎng)；B.經(jīng)篩選、分化后獲得的再生植株生根培養(yǎng)；C.轉(zhuǎn)基因煙草6植株的PCR檢領(lǐng)lJ，其中，1，2，3，4:pBI35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草；5，6，7，8:pBI29A-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草。圖3為轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性鑒定，A.pBI35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38在含有2%PEG培養(yǎng)基上的生長情況；B.pBI35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38根的生長情況；C.pBI29A-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草在和W38在含有2%PEG培養(yǎng)基上的生長情況；D.pBI29A-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38根的生長情況。圖4為轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性鑒定，A.pBI35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38在含有200mMNaCl培養(yǎng)基上的生長情況；B.pBI35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38根的生長情況；C.pBI29A-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草在和W38在含有200mMNaCl培養(yǎng)基上的生長情況；D.pBI29A-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38根的生長情況。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。實(shí)施例1:長穗偃麥草抗旱、耐鹽相關(guān)EeABF6基因的cDNA克隆。對(duì)生長45天左右的長穗偃麥草幼苗進(jìn)行干旱處理5小時(shí)，用Trizol提取長穗偃麥草總RNA。應(yīng)用5'RACE試劑盒(5'RACESystemforR即idAmplificationofcDNAEndsKit)(GIBCO服L，CAT.NO.18374-058)和3，RACEi式劑盒(3，RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEndsKit)(GIBCO服L，CAT.NO.18373-019)獲得EeABF6基因。用Trizol提取長穗偃麥草幼苗的總RNA，用superscriptII(invitrogen)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得到cDNA。根據(jù)EeABF6基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物Pl和P2。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物PI和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物PI和P2的序列如下P1:5'-GCGGGATGGACTTTCCGG-3，，P2:5'-CCAAGGGCCCGTCAGCGT-3，。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行O.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1.0-1.2kb左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)連接，參照Cohen等的方法(ProcNatlAcadSci，69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-TEasy載體上的氨卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明擴(kuò)增到的EeABF6基因的開放閱讀框(ORF)為SEQIDNo.2的自5'末端第50至1126位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白質(zhì)。將含序列SEQIDNo.3所示EeABF6基因的重組載體命名為pTE-EeABF6，其cDNA克隆結(jié)果如圖l所示。EeABF6基因的序列在Genabnk上進(jìn)行比對(duì)，該基因與擬南芥中bZIP類轉(zhuǎn)錄因子具有較高同源性，而在長穗偃麥草中未發(fā)現(xiàn)同源蛋白基因，證明EeABF6基因是一個(gè)新的基因。實(shí)施例2:用EeABF6基因培育抗旱、耐鹽轉(zhuǎn)基因植物1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)35S-EeABF6重組表達(dá)載體的構(gòu)建以長穗偃麥草的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用含有Smal和Xbal接頭序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后Smal和Xbal雙酶切PCR產(chǎn)物，回收，將酶切產(chǎn)物正向插入載體PBI121的CaMV35S啟動(dòng)子之后的Smal和Xbal酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體35S-EeABF6。引物序列如下EeABF6[Smal]5，-GCGCCCGGGGCGGGATGGACTTTCCGG-3，EeABF6[Xbal]5，-TGCTCTAGACCAAGGGCCCGTCAGCGT—3，2)29A-EeABF6重組表達(dá)載體的構(gòu)建以長穗偃麥草的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用含有Smal和Spel接頭序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后Smal和Spel雙酶切PCR產(chǎn)物，回收，將酶切產(chǎn)物正向插入載體pBI121的rd29A啟動(dòng)子之后的Smal和Spel酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體29A_EeABF6。引物序列如下EeABF6[Smal]5'-GCGCCCGGGGCGGGATGGACTTTCCGG-3'EeABF6[Spel]5'-CGGACTAGTCCAAGGGCCCGTCAGCGT-3'2、轉(zhuǎn)基因煙草的獲得和鑒定1)轉(zhuǎn)基因煙草的獲得將上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體29A-EeABF6、35S-EeABF6分別用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，再用葉盤法分別將整合有29A-EeABF6和35S_EeABF6的根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化煙草W38，用含100mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行2輪篩選，每輪篩選10-15天，得到陽性轉(zhuǎn)基因植株。將篩選得到的陽性轉(zhuǎn)基因植株用PCR做進(jìn)一步鑒定篩選，PCR所用的一對(duì)引物為P3和P4。P3(上游引物)5，-GCGGGATGGACTTTCCGG-3'，P4(下游引物)5'-CCAAGGGCCCGTCAGCGT-3'。對(duì)29A-EeABF6、35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR鑒定，陽性轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得1Kb左右條帶，結(jié)果獲得轉(zhuǎn)29A-EeABF6煙草、35S-EeABF6煙草各30株。同時(shí)將pBI121空載體導(dǎo)入煙草W38，方法同上，作為對(duì)照，獲得15個(gè)株系的轉(zhuǎn)空載體煙草(篩選獲得的轉(zhuǎn)基因煙草用T。代表示)。2)轉(zhuǎn)EeABF6基因植株耐旱、耐鹽性鑒定將T。代轉(zhuǎn)29A-EeABF6、35S-EeABF6基因煙草植株及T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的3周齡苗的根系分別移入含有200mMNaCl、2%PEG的培養(yǎng)基中進(jìn)行鹽、干旱脅迫處理30天，觀察表型并拍照。轉(zhuǎn)基因煙草的熒光定量PCR分析如圖2所示。結(jié)果表明鹽脅迫處理30天后，29A-EeABF6轉(zhuǎn)基因植株在干旱、鹽脅迫條件下生長正常，根系發(fā)達(dá)，葉片顏色深綠；35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因植株在干旱、鹽脅迫條件下也能夠正常生長，根系發(fā)達(dá)，葉片顏色深綠；所有空載體轉(zhuǎn)基因植株葉片均萎蔫或失綠、發(fā)白而導(dǎo)致死亡。轉(zhuǎn)基因煙草耐旱、耐鹽性鑒定結(jié)果證明EeABF6基因可以提高植物的耐旱及耐鹽性。圖3A顯示的是29A-EeABF6、35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因植株、空載體轉(zhuǎn)基因植株干旱脅迫處理30天的照片；圖3B顯示的是29A-EeABF6、35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因植株、空載體轉(zhuǎn)基因植株8鹽脅迫處理30天的照片。圖4為轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性鑒定，A.pBI35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38在含有200mMNaCl培養(yǎng)基上的生長情況；B.pBI35S-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38根的生長情況；C.pBI29A-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草在和W38在含有200mMNaCl培養(yǎng)基上的生長情況；D.pBI29A-EeABF6轉(zhuǎn)基因煙草和W38根的生長情況。0101]序列表0102]〈110〉北京市農(nóng)林科學(xué)院0103]〈120〉一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6及其編碼基因和應(yīng)用0104]〈160>20105]〈210>10106]〈211>3590107]〈212>PRT0108]〈213〉長穗偃麥草(ElytrigiaelongatumL.)0109]〈400>10110]MDFPGGSGRPPPQQHQHQLLPPMTPLPLTRQGSSVYSLTFDEFQSALGGP0111]GKDFGSMNMD600112]ELLRNIWTAEESQAIGAGANAASSSAAAGPDHGGIQRQGSLTLPRTLSQK0113]TVDEVWRD匪1200114]FFGGPASASTAAEAPPPAQRQQTLGEVTLEEFLVRAGVVREDMPGPPPPV0115]SPAPVAQAPP1800116]VPPPQPQMLFPQSNMFAPMVNPLSLANGLITGAYGQGGGGGGGAPAMVSPS0117]PTGRPVMSNG2400118]YGKMEDRNLSSLSPPPMPYVFNGGLRGRKPPAMEKVVERRQRRMIKNRES0119]AARSRQRKQS3000120]Y匪ELETEVAKLKERNEELQRKQAEMLERQKNEVFEKVTRQAGLTSKRIC0121]LRRTLTGPW3590122]〈210>20123]〈211>10770124]〈212>DNA0125]〈213〉長穗偃麥草(ElytrigiaelongatumL.)0126]〈400>20127]atggactttccgggagggagcgggaggccgccgccgcagcagcaccagcaccagctgctg600128]ccgccgatgacgccgctgccgctcacaaggcaggggtcatcggtctectcgctcacgttc1200129]gacgagttccagagcgcgctcggcgggccgggcaaggacttcggatccatgaacatggac1800130]gagctcctccgcaacatctggacggccgaggagtcgcaggccatcggcgccggcgccaac2400131]gccgcctcttcctccgccgccgcggggccagatcacggcggcatccagcgccagggctcg3000132]ctcacgctgcccaggacgctcagccagaagaccgtcgacgaggtctggcgcgacatgatg3600133]ttcttcggtgggcccgcctccgcctccacggccgccgaggctcccccgccggcccagagg4200134]cagcagacgctcggggaggtcacgctcgaggagttcctcgtgcgcgccggcgttgtgcgc■9gaggacatgccggggccgccgccccccgtgtcgccggcgcccgtggcccaggcgccgcct540ccgcctccgc3gCCgC3g3tgctgtttcctC3g3gC皿C3tgtttgctcctetggtg朋t600cctctgtccttggcc朋tgggttgatcaccggagcatecggcc郷g郷郷郷tggt660ggtggtgcgcccgctetggtttcgccgtcgCCg3Cgggg3ggccggtcatgtccaacggc720tecggc朋gatggaagaccgcaacttgtcctcgctgtcgccgccgccgatgccgtetgtt780ttcaacggcgggctg郷gggagg^gccaccggccatgg卿郷tggtcg卿gg郷840cagcggcggatgatc朋g朋ccgggagtctgcggcg郷tCgCgCC3g3g■tetetgatgg朋ttggagactg郷tggra3gCgg皿tg3ggagttgrag960cgg卿tgct3g3g3ggC皿皿g皿tgaggtettcgag皿ggtcacccgg1020c朋gctggactcacgtcgaag郷atctgcCtgCgg郷3cgctgacgggcccttgg107權(quán)利要求一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.—種植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6。3.如權(quán)利要求2所述的植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO.2或3所示。4.包含權(quán)利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因的重組載體5.包含權(quán)利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。6.權(quán)利要求1所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6的應(yīng)用。7.權(quán)利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeABF6及其編碼基因和應(yīng)用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，基因序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增?qiáng)煙草抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。文檔編號(hào)C12N15/63GK101704884SQ200910238039公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年11月13日優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日發(fā)明者唐益苗,楊穎,王永波,趙昌平,高世慶申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院