專利名稱：從氧化葡萄糖桿菌中分離純化右旋糖酐糊精酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白純化領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種從氧化葡萄糖桿菌中分離
純化右旋糖酐糊精酶的方法。
背景技術(shù)：
右旋糖酐(dextran)，又名葡聚糖，是一種由葡萄糖單元脫水形成的高分子聚合 物，作為一種由分泌性酶催化生成的胞外產(chǎn)物，它是世界上最早發(fā)現(xiàn)的并較早作為主要血 漿代用品的微生物多糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要是由葡萄糖的a-l，6-鍵首尾脫水縮合而成的一 條線形長分子鏈，在分子結(jié)構(gòu)中含有不同比例的a-l，2、a-l，3及a _1，4_糖苷鍵的支鏈， 分子式為(C6H1Q05)n。 右旋糖酐因其安全、無毒、生物相容性好等多種優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、 色譜分析等多個(gè)領(lǐng)域。右旋糖酐膠體液具有擴(kuò)充血容量、維持血壓的功效，供出血及外傷休 克時(shí)急救用，可作為血漿代用品。我國藥典1990版將右旋糖酐及其復(fù)方制劑列入。臨床上 應(yīng)用的常有三種規(guī)格右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。在食品工業(yè)中，右旋糖酐因 其持水性、粘稠性，作為低熱量食品添加劑，已用于多種飲料和食品的生產(chǎn)。還可代替部分 麥芽糖制作軟心巧克力的填充物或添加到啤酒釀造麥芽中去，提高制品的發(fā)泡性。在石油 工業(yè)中，右旋糖酐可作為油井鉆泥添加劑。它也可應(yīng)用于精細(xì)化工，制成交聯(lián)葡聚糖凝膠， 目前已廣泛應(yīng)用于分子篩色譜技術(shù)中。此外，在食品、動(dòng)物飼料和化妝品生產(chǎn)中作為潛在的 益生源物質(zhì)受到了相當(dāng)?shù)年P(guān)注。 研究發(fā)現(xiàn)來源于氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)中的某種酶能夠利 用麥芽糊精和淀粉部分水解物合成右旋糖酐，這種酶被命名為右旋糖酐糊精酶(dextran dextrinase， DDase)。該酶可催化供體非還原性末端上的a _1，4_吡喃葡萄糖基轉(zhuǎn)移到受 體的非還原性末端上，形成a-l，6-糖苷鍵。其中主要的反應(yīng)模式為供體上a-l，4-糖苷 鍵斷裂，葡萄糖單元轉(zhuǎn)移至受體上形成a-l，6-糖苷鍵。氧化葡萄糖桿菌右旋糖酐糊精酶 可以利用淀粉衍生物糊精來合成右旋糖酐，該右旋糖酐因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性(支鏈多)，還 可以作為膳食纖維、低脂食品、低熱量食品填充劑及膨脹劑等益生源物質(zhì)。
近年來，有關(guān)氧化葡萄糖桿菌右旋糖酐以及右旋糖酐糊精酶(DDase)的研究鮮有 報(bào)道。此外，到目前為止，國內(nèi)尚未有關(guān)氧化葡萄糖桿菌右旋糖酐糊精酶分離純化技術(shù)方法 的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種從氧化葡萄糖桿菌中分離純化右旋糖酐糊精酶的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的從氧化葡萄糖桿菌中分離純化右旋糖酐糊精酶的 方法，主要步驟如下 1)將發(fā)酵液離心收集細(xì)胞，并用磷酸緩沖液懸浮，采用超聲波法破碎細(xì)胞，在
o-4t:條件下離心收集上清酶液；
2)上清酶液部分經(jīng)硫酸魚精蛋白沉淀和硫酸銨沉淀得到含右旋糖酐糊精酶的粗 酶液； 3)粗酶液經(jīng)疏水層析純化得到右旋糖酐糊精酶粗組分； 4)右旋糖酐糊精酶粗組分經(jīng)凝膠過濾層析純化得到精制右旋糖酐糊精酶原液。 所述的方法中，硫酸魚精蛋白沉淀過程中的硫酸魚精蛋白與總蛋白的質(zhì)量比為 0. 1 10%。 所述的方法中，硫酸銨沉淀過程中硫酸銨的終濃度按重量體積比為20 80% 。 所述的方法中，步驟3中疏水層析純化過程的起始緩沖液中硫酸銨的濃度為 0. 5 3M，洗脫過程采用階段洗脫法。 所述的方法中，是采用Phenyl疏水層析柱分離純化。 所述的方法中，步驟4中凝膠過濾層析純化的洗脫流速為0. 3mL/min lmL/min。 所述的方法中，是采用Superdex 200PG凝膠色譜柱層析純化。 本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比的顯著優(yōu)點(diǎn)是該方法簡便、重復(fù)性好且蛋白的得率高。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的過程基本是i)發(fā)酵液離心收集細(xì)胞，用磷酸緩沖液重懸，采用超聲波法破碎細(xì)胞，o-4t:下離
心收集上清酶液。 2)向上清酶液部分添加硫酸魚精蛋白，該硫酸魚精蛋白與總蛋白的質(zhì)量比為 0. 1 10%，離心除去破碎細(xì)胞所產(chǎn)生的核酸類物質(zhì)，同時(shí)降低溶液的粘度；再向上清酶液 中加入硫酸銨，該硫酸銨的終濃度為20 80% (w/v)，離心沉淀雜蛋白并獲得含右旋糖酐 糊精酶的粗酶液。 3)粗酶液上樣于Phenyl疏水層析柱，起始緩沖液中含0. 5 3M的硫酸銨，洗脫階 段采用階段洗脫法，純化得到右旋糖酐糊精酶粗組分。 4)右旋糖酐糊精酶粗組分上樣于Superdex 200PG凝膠色譜層析柱，設(shè)定洗脫流 速為0. 3mL/min-lmL/min，純化得到精制右旋糖酐糊精酶。 其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
以下通過一具體實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1 步驟1)胞內(nèi)粗酶液的獲得 取100mL的培養(yǎng)液，4t:冷凍離心收集細(xì)胞，再重懸于50mM的磷酸緩沖液(pH 6. 47)。采用超聲波法破碎細(xì)胞，并在fC條件下10000r/min離心20min，收集上清酶液，結(jié) 果見表l。 步驟2)硫酸魚精蛋白沉淀 向步驟1中的胞內(nèi)粗酶液中加入一定量的硫酸魚精蛋白，使其添加量達(dá)到總蛋白 量的1%，低溫緩慢攪拌1小時(shí)(h)，高速冷凍離心去除核酸類物質(zhì)，結(jié)果見表1。
步驟3)硫酸銨沉淀 向步驟2中的粗酶液中添加40% (質(zhì)量體積比)的硫酸銨，低溫緩慢攪拌1小時(shí) (h)，高速冷凍離心去除雜蛋白，上清即為含右旋糖酐糊精酶的粗酶液，結(jié)果見表l。
步驟4)疏水層析分離純化工藝 取5mL步驟3中的粗酶液上樣于Phenyl疏水層析柱，用AKTA快速蛋白純化工作站(公知技術(shù))進(jìn)行純化。起始緩沖液為50mM磷酸緩沖液(pH 6. 47，內(nèi)含2M的硫酸銨)，采用硫酸銨2M 0的直線梯度洗脫樣品，根據(jù)280nm的吸光值接收所需組分。將各活性組分合并并濃縮得到右旋糖酐糊精酶粗組分，結(jié)果見表1。
步驟5)凝膠層析純化工藝 取2mL步驟4中的粗組分上樣于Superdex 200PG凝膠色譜柱，用AKTA快速蛋白純化工作站進(jìn)行純化。洗脫緩沖液為50mM磷酸緩沖液(pH 6. 47，內(nèi)含0. 1M的NaCl)，流速設(shè)定為0. 5mL/min，根據(jù)280nm的吸光值接收所需組分，結(jié)果見表1。
表1 :氧化葡萄糖桿菌右旋糖酐糊精酶的純化
純化步驟酶活(u)總蛋白(mg)比活(U/mg)純化倍數(shù)收率(％)
粗酶液7.9996.750.0831100
硫酸魚精蛋白7.8146.440.1682.0496.79
沉淀
硫酸銨沉淀7.1934.580.2082.5289.99
Phenyl疏水層析4.0510.340.3924.7450.70
凝膠層析2.541.212.10025.3031.8權(quán)利要求
一種從氧化葡萄糖桿菌中分離純化右旋糖酐糊精酶的方法，主要步驟如下1)將發(fā)酵液離心收集細(xì)胞，并用磷酸緩沖液懸浮，采用超聲波法破碎細(xì)胞，在0-4℃條件下離心收集上清酶液；2)上清酶液部分經(jīng)硫酸魚精蛋白沉淀和硫酸銨沉淀得到含右旋糖酐糊精酶的粗酶液；3)粗酶液經(jīng)疏水層析純化得到右旋糖酐糊精酶粗組分；4)右旋糖酐糊精酶粗組分經(jīng)凝膠過濾層析純化得到精制右旋糖酐糊精酶原液。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，硫酸魚精蛋白沉淀過程中的硫酸魚精蛋白與總蛋 白的質(zhì)量比為O. 1 10%。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，硫酸銨沉淀過程中硫酸銨的終濃度按重量體積比 計(jì)為20 80%。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟3中疏水層析純化過程的起始緩沖液中硫酸銨 的濃度為0. 5 3M，洗脫過程采用階段洗脫法。
5. 如權(quán)利要求1或4所述的方法，其中，是采用Phenyl疏水層析柱分離純化。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟4中凝膠過濾層析純化的洗脫流速為0. 3mL/ min lmlVmin。
7. 如權(quán)利要求1或6所述的方法，其中，是采用Superdex 200PG凝膠色譜柱層析純化。
全文摘要
一種從氧化葡萄糖桿菌中分離純化右旋糖酐糊精酶的方法首先離心收集菌體，然后用磷酸緩沖液懸浮后，超聲波破碎細(xì)胞，離心收集上清液。經(jīng)硫酸魚精蛋白沉淀、硫酸銨沉淀、疏水層析和凝膠層析后，即可分離得到高純度的右旋糖酐糊精酶。本發(fā)明方法簡便、重復(fù)性好且蛋白的得率高。
文檔編號C12N9/28GK101709293SQ20091024277
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者毛相朝, 王華磊, 王舒, 邢艷瓏, 魏東芝 申請人:青島生物能源與過程研究所