專利名稱：一種建立高效表達人環(huán)氧合酶2的重組人腸癌細胞株的方法及應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬基因工程制藥技術(shù)及應用領域，涉及一種建立高效表達人環(huán)氧合酶 2(C0X-2)的重組人腸癌HCT-116細胞株HCT-116ωχ_2的方法及應用，具體地說，本發(fā)明涉及 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含人環(huán)氧合酶2(C0X1)基因啟動子編碼序列和熒光素酶報告基因序列的永 生化哺乳動物細胞系，通過壓力篩選和基因擴增后，獲得穩(wěn)定、靈敏、高效表達C0X-2的腫 瘤克隆細胞株，并將細胞株應用于以C0X-2基因為靶點的抗腫瘤藥物的篩選及評價。
背景技術(shù)：
研究表明，環(huán)氧化酶(CyClOOXygenaSe，C0X)是前列腺素(PGs)合成過程中一個重 要的限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，從而維持機體的各種病理生理過 程。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物的環(huán)氧化酶至少有C0X-1和C0X-2兩個同工酶，C0X-1在組織中的 表達相當穩(wěn)定，對維持胃和腎功能的平衡發(fā)揮重要的作用，而C0X-2的表達在不同的組織、 不同的狀況下變動很大，它的主要產(chǎn)物是環(huán)前列腺素和PGE2?，F(xiàn)有技術(shù)公開了 C0X-2基因全長8. 3kb,由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成，定位 于第1號染色體Icf 2 25_3，由5’端0. Skb的轉(zhuǎn)錄起始點上游區(qū)，61Λ的蛋白質(zhì)編碼區(qū)以及 1.5kb 3，端非編碼區(qū)組成，其mRNA約4. 51Λ，基因編碼603或604個氨基酸，含有17個氨 基酸殘基構(gòu)成的信號肽，與C0X-1有59%-61%的同源性。在其5’旁側(cè)區(qū)，含有幾個可能 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點上游25bp位處共同的TATA框序列。一個C/EBP基序， 兩個AP-2位點，三個SP1位點，兩個NF- κ B位點，一個CRE基序和一個EST-I位點。在蛋白 質(zhì)編碼區(qū)，C0X-2基因的ORF起始于CTGCGATGC序列，由10個外顯子編碼。在3，旁側(cè)區(qū)， 整個3’UTR包含于外顯子10，其間無內(nèi)含子存在，有三個富含腺嘌呤核苷酸的序列M TAAA， 相互之間相隔^Obp。C0X-2發(fā)現(xiàn)于某些細胞中，主要定位于核膜。因此，C0X-2產(chǎn)生的Pk產(chǎn)物可進入 核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶細胞基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明C0X-2不僅是啟動炎癥反應的關鍵酶，而且其表達 和與腫瘤的發(fā)生、增殖、分化、浸潤、轉(zhuǎn)移及預后等方面有重要作用。研究提示，C0X-2主要通 過以下途徑導致胃癌的發(fā)生(1)C0X作為一種刺激因子在靜息狀態(tài)下不表達，只有在某些 惡性細胞中，可能由于癌基因的激活或抑癌基因的失活而被活化，C0X-2的轉(zhuǎn)錄后失控，使 C0X-2過度表達，C0X-2的過氧化酶活化可催化一系列異體氧化反應，參與氧化誘癌途徑， 從而形成致癌物；(2) C0X-2通過催化形成Pk促進腫瘤的發(fā)生，C0X-2通過催化反應可產(chǎn)生 PGG、PGH、PGE，其中PGE為其主要代謝產(chǎn)物，可誘導細胞增殖，促進細胞粘附，抑制具有免疫 調(diào)節(jié)功能的淋巴因子的產(chǎn)生，抑制T細胞和B細胞增殖，降低機體對腫瘤細胞的局部免疫反 應；(3)C0X-2過度表達可增加PGE2的合成，PGE2誘導細胞增殖并刺激Bcl_2蛋白表達，降 低介導凋亡的轉(zhuǎn)化生長因子- β (TGF-β )2型受體水平，降低介導細胞間粘附的E-鈣粘蛋 白(E-cadherin)活性，從而抵抗各種刺激誘導的細胞凋亡，促進細胞增殖，引起腫瘤的發(fā) 生；(4)C0X-2促進PG合成的增加如PGE1、PGE2和15d_PGJ等作用于EP2、EP4及PPARr等，
4通過EP/cAMP等途徑激活各種胞內(nèi)激酶如PKA、Ras蛋白活性，誘導VEGFmRNA和蛋白表達 水平上調(diào)，參與腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移；( C0X-2可使細胞周期存在明顯G1 期推遲，而且Cyclin D1蛋白激酶、Rb1激酶和細胞周期依賴激酶(⑶K4)活性明顯下降，這 樣通過阻礙細胞周期，阻止延長細胞生存期，增強對胞外基質(zhì)的粘附，而異常延長細胞生存 期使一系列基因突變，促進腫瘤形成。另外，C0X-2可促進腫瘤細胞相關血管的生成，增加 癌細胞的侵襲性，激活基質(zhì)金居蛋白酶2降解細胞外基質(zhì)，產(chǎn)生促血小板凝集的血栓烷等， 從而有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。C0X-2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的整個過程中起著重要的作用，參與了腫瘤形成的 多個環(huán)節(jié)。因此，對腫瘤組織或腫瘤細胞中C0X-2活性檢測可以作為監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展 的一個重要手段，同時C0X-2在細胞中的基因表達水平也可以作為抗腫瘤藥物篩選的一個 重要指標。熒光素酶報告基因(Iuc)根據(jù)來源不同主要分為細菌熒光素酶 (bacterialluciferase，BL)、螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase, FL)以及以海星、發(fā) 光魚、發(fā)光甲蟲等為來源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。BL是 由2個多肽亞基組成的異源二聚體，相對分子質(zhì)量約為79X 103。在還原性黃素(FMNH)、 八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在時，發(fā)射出藍綠光G50-490nm)。FL由單 一的多肽鏈組成，相對分子質(zhì)量為(60 64) X IO3,在Mg2+、ATP、O2存在時催化D-熒光素 (D-Luciferin)氧化脫羧發(fā)光(550 580nm)。由于Iuc的檢測方法簡便，靈敏度高，因而成 為目前應用最廣泛的報告基因之一，其主要應該于基因表達研究、蛋白質(zhì)間相互作用研究、 毒性物質(zhì)檢測研究、RNAi研究等。熒光素酶基因已被廣泛應用于不同啟動子下外源基因表達強度和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研 究的報告基因。該報告基因的靈敏度高，對于研究低水平表達如弱啟動子的調(diào)控方式有較 大的意義。實踐表明，熒光素酶檢測的最大優(yōu)點是不損害監(jiān)測對象，便于在整體水平或離體 器官內(nèi)測定基因產(chǎn)物是否表達?？梢姽獾男纬墒褂^察基因的空間表達成為可能，為研究細 胞分化、細胞問聯(lián)絡、基因的空間表達和生物(或細胞)間的相互作用提供了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為研究腫瘤相關基因的表達提供一種更為直接、便捷、敏感的 技術(shù)手段。涉及一種建立高效表達人環(huán)氧合酶2 (C0X-2)的重組人腸癌HCT-116細胞株 HCT-116cox-2的方法，具體地說，本發(fā)明涉及建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含人環(huán)氧合酶2 (COX-幻基因啟動 子編碼序列和熒光素酶報告基因序列的永生化哺乳動物細胞系，通過壓力篩選和基因擴增 后，獲得穩(wěn)定、靈敏、高效表達C0X-2的腫瘤克隆細胞株。本發(fā)明在前期構(gòu)建的pGL3-BasiC-C0X-2重組質(zhì)粒的基礎上，采用含熒光素酶基 因(lUC2/I hlUC)和藥物篩選基因抗性位點的新型載體質(zhì)粒pGL4系列載體，構(gòu)建新的重組 質(zhì)粒pGL4-C0X-2，使該重組質(zhì)粒在原來pGL3-BasiC-C0X-2重組質(zhì)粒只具備螢火蟲熒光素 酶基因的基礎上，同時含有一個可以進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的抗性基因；通過將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 哺乳動物細胞，用藥物對細胞進行篩選，建立一種穩(wěn)定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基 因的重組細胞極株。具體而言，本發(fā)明運用基因重組和分子克隆技術(shù)，擴增人C0X-2基因啟動子序列，將擴增出的C0X-2基因基因子序列和pGL4系列載體質(zhì)粒運用酶切、酶連、基因篩選等基因 重組技術(shù)進行克隆，得到連接產(chǎn)物然并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，制備出的含C0X-2 基因啟動子和熒光素酶報告基因的重組質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與含海腎熒光素酶報告 基因內(nèi)參質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，通過檢測細胞的雙熒光素酶活性證實重組質(zhì)粒能在細 胞內(nèi)穩(wěn)定表達。再將重組質(zhì)粒進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通過藥物進行加壓篩選，將質(zhì)粒序列完全整合 到細胞內(nèi)，使其能夠在腫瘤細胞內(nèi)穩(wěn)定表達C0X-2基因啟動子的活性，建立穩(wěn)定表達C0X-2 基因和熒光素酶報告基因的重組腫瘤細胞株。分別通過在體外細胞和體內(nèi)動物實驗檢測抗 腫瘤藥物對重組腫瘤細胞的抑制作用，來反映抗腫瘤藥物對C0X-2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的 影響，評價藥物的抗癌效能，從而廣泛的應用于以C0X-2為靶點抗腫瘤藥物的篩選。本發(fā)明建立高效表達人環(huán)氧合酶2的重組人腸癌細胞株的方法包括如下步驟1，構(gòu)建穩(wěn)定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基因的重組質(zhì)粒pGL4-C0X-2，通過提取人C0X-2基因啟動子，以含熒光素酶報告基因的PGL4系列質(zhì)粒為載體， 插入C0X-2基因啟動子，構(gòu)建含C0X-2基因啟動子和熒光素酶報告基因的pGL4-C0X-2重組 質(zhì)粒；本發(fā)明中，可采用的載體質(zhì)粒主要有pGL4. 14-22和pGL4. 76-84、其中最常用的是 pGL4. 17[luc2/Neo] (5599bp)和 pGL4. 79[hRluc/Neo] (4879bp)，本發(fā)明以 pGL4. 17[luc2/ Neo]為例構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒命名為pGL4. 17-C0X-2 ；所述的報告基因選自螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶基因，主要包括luc2、 luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP、hRlucCP，其中 luc2 和 luc2P 為最常用的報告基因；構(gòu)建上述重組質(zhì)粒PGL4-C0X-2，通過以下步驟1)制備含有C0X-2基因啟動子目的序列(1)提取含有C0X-2基因啟動子人基因組DNA ；(2) PCR擴增、純化C0X-2基因啟動子目的序列；2)大量制備pGL4. 17載體質(zhì)粒3)構(gòu)建穩(wěn)定表達C0X-2基因啟動子的重組質(zhì)粒(1) C0X-2基因啟動子目的序列和pGL4. 17載體質(zhì)粒的雙酶切；(2) C0X-2基因啟動子目的序列和pGL4. 17載體質(zhì)粒連接；(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，含Amf的瓊脂平板篩選陽性克隆；(4)陽性克隆單菌落的PCR鑒定，剔除假陽性菌落；(5)挑取陽性克隆單菌落搖菌，大量擴增提取制備重組質(zhì)粒；(6) PCR、雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒。本發(fā)明中，所述的重組質(zhì)粒中所含的載體質(zhì)粒為含穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抗生素篩選基因的質(zhì) 粒，其包括HygrcANec/和Pure/。其中最常用的是Nec/基因。本發(fā)明中，所述的重組質(zhì)粒中包含多酶切位點和β -內(nèi)酰胺酶基因。本發(fā)明中，所述的重組質(zhì)粒中所包含的載體質(zhì)粒和人環(huán)氧合酶2基因啟動子均含 有Bgl II和Hind III雙酶切位點 本發(fā)明中，所述的熒光素酶報告基因選自螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶基因。
本發(fā)明中，所述的人環(huán)氧合酶2基因啟動子序列，其長度為250_700bp，優(yōu)選長度 為 562bp，序列中包含 NF- κ B、NF-IL6、SP-1、AP-2、CRE、E-Box 轉(zhuǎn)錄位點和 TATA 框。
本發(fā)明中，所述的螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶基因包括luc2、luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP、hRlucC。2，建立高效表達人環(huán)氧合酶2 (C0X-2)的重組細胞株HCT_116G°X_2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含C0X-2基因啟動子和熒光素酶報告基因的PGL4-C0X-2重組質(zhì)粒到人 腸癌HCT-116細胞株(市購)，通過藥物加壓篩選、基因擴增后，獲得穩(wěn)定、靈敏、高效表達 C0X-2基因的克隆細胞株，該細胞株在高效表達C0X-2的同時能穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶 或海腎熒光素酶活性；建立上述高效表達人環(huán)氧合酶2(C0X_2)的重組細胞株HCT_116G°X_2通過以下步 驟1)確定G418的篩選HCT-116細胞的最低篩選濃度；2)pGL4. 17-C0X-2重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCT-116細胞；3)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HCT-116細胞；(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-116細胞24h后加入G418篩選；(2)陽性單克隆細胞簇接種及傳代培養(yǎng)；(3) RT-PCR或flfestern Blot鑒定單克隆細胞株的真陽性；4)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的細胞進行熒光素酶活性檢測。本發(fā)明的進一步目的是提供上述穩(wěn)定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基因的重 組人腸癌HCT-116 x_2細胞株的應用。本發(fā)明通過體外實驗和體內(nèi)實驗，驗證抗腫瘤藥物對C0X-2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性 的影響，評價藥物的抗癌效能，結(jié)果證實，所述的細胞株可應用于以C0X-2基因為靶點的抗 腫瘤藥物的篩選和評價。本發(fā)明中，體外實驗采用不同濃度的抗腫瘤藥物作用于正常人腸癌HCT-116細胞 株和高表達C0X-2基因的HCT_116g°x_2細胞株，作用不同時間后檢測抗腫瘤藥物對兩種細胞 的生長抑制作用及對HCT-116 x_2細胞株熒光素酶活性的影響；體內(nèi)實驗包括將正常的人腸癌HCT-116細胞和高表達C0X-2基因的重組人腸癌 HCT-116ωχ_2細胞株接種于裸小鼠皮下，建立裸小鼠人腸癌皮下移植瘤，使用抗腫瘤藥物治 療裸小鼠，治療后檢測裸小鼠瘤體大小、C0X-2蛋白和mRNA的表達；通過以下步驟1) HCT-116ωχ_2細胞株篩選抗腫瘤藥物(1)正常培養(yǎng)HCT-116ωχ_2細胞并穩(wěn)定傳代；(2)抗腫瘤藥物對HCT-I 16g°x_2細胞生長抑制作用的檢測；(3)抗腫瘤藥物對HCT-116 X_2細胞熒光素酶活性的影響；2)建立人腸癌HCT-I 16g°x_2細胞裸小鼠移植瘤模型(1)重組人腸癌HCT_116g°x_2細胞株皮下接種裸小鼠，連續(xù)傳代；(2)取生長旺盛的瘤組織接種裸小鼠右側(cè)腋窩，建立裸小鼠人腸癌移植瘤模型；3)抗腫瘤藥物對人腸癌HCT-116 x_2細胞裸小鼠移植瘤模型C0X-2表達的影響(1)不同濃度抗腫瘤藥物給藥裸小鼠移植瘤模型；(2)檢測裸小鼠瘤體大小、C0X-2蛋白和mRNA的表達。本發(fā)明中，所述的抗腫瘤藥物，包括抗腫瘤的化學、生物類藥物，中藥復方、中藥單體和單味中藥提取物。本發(fā)明通過建立重組人腸癌HCT_116G°X_2細胞株的方法，可進一步建立一個可廣泛 應用于表達其它相關基因(如HIF-1、NF-KB等)的技術(shù)平臺，進而將此方法廣泛應用于現(xiàn) 代基因工程制藥領域。本發(fā)明方法建立的重組人腸癌HCT_116G°X_2細胞株具有以下優(yōu)點能穩(wěn)定表達人環(huán)氧合酶2(C0X1)基因啟動子，可以快速、高效的合成環(huán)氧合酶2 蛋白，廣泛的應用于篩選以C0X-2基因為靶點的抗腫瘤藥物；含有熒光素酶報告基因(luc2或hRluc)，能穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶或海腎熒光 素酶活性，在各種細胞實驗中，可以通過檢測熒光活性來間接反映細胞內(nèi)C0X-2基因的表 達水平，克服其他通過mRNA或蛋白的檢測來反映C0X-2基因的表達水平；建立的重組人腸癌HCT-116ωχ_2細胞株能夠穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，傳代后細胞內(nèi)C0X-2基 因啟動子和熒光素酶報告基因的生物學性狀不會發(fā)生改變。


圖1. C0X-2基因啟動子序列的克隆，其中，Marker 為 DL2000，1、2、3、4 為 C0X-2 基因啟動子片段(562bp)。圖2. pGL4. 17-C0X-2重組質(zhì)粒的Bgl II和Hind III雙酶切及PCR結(jié)果，其中，Marker 為 DL2000,1 為 pLG4. 17-C0X-2 重組質(zhì)粒 PCR 擴增結(jié)果(562bp)，2 為 pLG4. 17-C0X-2 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果(5599+562bp)，3 為 pLG4. 17-C0X-2 重組質(zhì)粒(6161bp)，4 為 pLG4. 17 載體質(zhì)粒(5599bp)。圖3. pGL4. 17_C0X_2重組質(zhì)粒測序比對結(jié)果。圖4. pGL4. 17-C0X-2重組質(zhì)粒構(gòu)建概要圖。圖5. pGL4. 17_C0X_2重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人腸癌HCT-116細胞的雙熒光素 酶活性。圖6.抗腫瘤藥物對重組的人腸癌HCT_116g°x_2細胞株生長抑制作用的比較。圖7.不同濃度抗腫瘤藥物對重組的人腸癌HCT-116 X-2細胞株熒光素酶活性的影 響。圖8. Tan IIA對裸小鼠人腸癌HCT-116ωχ_2細胞移植瘤模型瘤體作用比較。圖9. Tan IIA對裸小鼠人腸癌HCT-116G°X_2細胞移植瘤模型C0X_2mRNA表達的影 響。
具體實施例方式下面通過實施例和說明書附圖對本發(fā)明的方案做進一步的說明，但實施例和說明 書附圖僅對本發(fā)明作必要性的解釋，其中的實例決不意味著對本發(fā)明內(nèi)容的限制。實施例lpGL4. 17-C0X-2重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)已知人的C0X-2基因啟動子序列[GenBank (gi | 4506264)]設計并合成兩端引 物
上游(5’端)引物包含C0X-2基因啟動子互補堿基，一個Hind III識別位點，三 個保護堿基，5’ -CCCAAGCTTCCTGGACGTGCTCCTGAC-3’。下游(3’端)引物包含C0X-2基因啟動子互補堿基，一個Bgl II識別位點，二個 保護堿基，5，-GAAGATCTTCCTCGACCCTCTAAAGACG-3，。以人基因組DNA為模板，利用常規(guī)PCR反應進行擴增，擴增體系為基因組 DNA2y L、2. 5mM 的 dNTP 4 μ LUOXbuffer 5 μ L、10 μ M 的上下游引物各 1 μ L、高保真 Taq 酶1 μ L，加水至50 μ L，反應條件為95°C預變性!Min ；94°C變性30s、65°C退火45s、72°C 延伸lmin，共35個循環(huán)；72°C終末延伸5min，最后4°C保溫。擴增得到約562bp的目的 片段(圖1)，將目的片段純化回收后與載體質(zhì)粒PGL4. 17均進行Bgl II和Hind III雙 酶切，酶切體系為pGL4. 17/C0X-2 目的片段(10 μ L/30 μ L)、IOU/μ L 的 Bgl II 和 Hind III 各 2. 5 μ LUOXTango Buffer 5 μ L，加水至 50 μ L，37°C 酶切過夜(8_12h)。將回收 純化后得到的兩個線性片段用T4DNA連接酶進行酶連，體系為C0X-2啟動子片段回收產(chǎn) 物(50ng/y L)5y L、pGL4. 17-C0X-2 回收產(chǎn)物(200ng/ μ L) 1 μ LUO X Buffer 2 μ L、T4DNA ligase (5U/μ L，F(xiàn)ermentas) 1 μ L，加水至20 μ L，16°C酶連5_8h，也可酶連過夜。將酶連產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)過含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選，在得到轉(zhuǎn)化子 的平板上隨機挑取單菌落進行PCR擴增，得到的陽性菌落進行搖菌擴增質(zhì)粒，提取質(zhì)粒后 進行PCR、Hind III和Bgl II雙酶切(圖2)及測序(圖3)鑒定，證實與目的序列一致。實施例2重組質(zhì)粒pGL4. 17_C0X_2轉(zhuǎn)染腫瘤細胞及雙熒光素酶活性檢測將培養(yǎng)于含有10%新生牛血清、100U/ml青霉素、100μ g/ml鏈霉素RPMI-1640完 全培養(yǎng)基中人腸癌HCT-116細胞株，按0. 5 X IO5/孔的量在M孔板中接種對數(shù)生長期的細 胞，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，直到細胞密度達到80%以上。將上述常規(guī)培養(yǎng)的人腸癌HCT-116細胞隨機分為陰性對照組、重組質(zhì)粒組和陽性 對照組，分別按如下劑量加入不同質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染(1)陰性對照組:pGL4. 17 (0. 25 μ g) +pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3(2)重組質(zhì)粒組:pGL4. 17-C0X-2 (0· 25 μ g) +pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3(3)陽性對照組:pGL3-Basic-C0X-2 (0. 25 μ g)+pRL-TK (0· 25 μ g)，η = 3在滅菌后的1.5ml離心管中配制待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL_TK、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體 Transfectam Reagent 復合物如下將待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK各0. 25 μ g/孔稀釋至50 μ L/孔不含血清和抗生 素的RPMI-1640中，輕柔混均后靜置5min。然后將轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體懸液(1 μ L/孔)加入50 μ L/ 孔不含血清和抗生素的RPMI-1640中，輕柔混均后靜置5min。最后將兩者混合在一起，充分 混勻靜置20min，使質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體充分結(jié)合，形成DNA/脂質(zhì)體復合物。吸除M孔板中的培養(yǎng)液，用不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)液潤洗一遍，然 后在每個孔中加入100 μ L對應的DNA/脂質(zhì)體復合物。在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3- 后，向各孔加入1000 μ 1含RPMI-1640完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)后收集樣品，進行雙 熒光素酶檢測。按照 Progega 公司的 Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒說明書指導 配制工作液IXPLB(細胞裂解液)、LAR II (螢火蟲熒光素酶檢測液)、1ΧΜορ & Glo Reagent (海腎熒光素酶檢測液)。將上述各組共轉(zhuǎn)染后的HCT-116細胞培養(yǎng)對-4他后收
9集樣品。用PBS潤洗一遍，加入100 μ L/孔的1 XPLB裂解液(M孔)，搖床室溫下200rpm 搖動 15min。取 100 μ L 的 LAR II 于 1. 5mL 的離心管內(nèi)，放入 GloMax 20/20 Iuminometer 化學發(fā)光檢測儀，加入20 μ L的細胞裂解液于離心管中，發(fā)光儀測讀10s。檢測完成后，再加 入100 μ L的IXMop & Glo Reagent，發(fā)光儀測讀IOsec。記錄檢測數(shù)據(jù)。表1是不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MKN45細胞后的螢火蟲熒光素酶活性的比較結(jié)果。表 1.
_Group_Firefly_Renilla_Fire/ren
6895647 3.69799E-05 7889634 4.3855E-05 6564728 3.01612E-05 7564325 0.029699544 8232194 0.028787465 8896532 0.029857927 7648734 0.030823009 9003772 0.032791368 8230694 0.032639653實施例3穩(wěn)定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基因的重組人腸癌HCT-116ωχ_2細 胞株的建立采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGL4. 17-C0X-2重組質(zhì)粒進人腸癌HCT-116細胞，通 過G418藥物加壓篩選，建立穩(wěn)定表達C0X-2基因和熒光素酶報告基因的重組人腸癌細胞株 HCT-116g°x_2。具體方法如下細胞轉(zhuǎn)染前先進行G418藥物濃度的篩選，將培養(yǎng)于含有10%新生牛血清、100U/ mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素RPMI-1640完全培養(yǎng)基中人腸癌HCT-116細胞株，按1 X IO4/ 孔的量在M孔板中接種對數(shù)生長期的細胞，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天吸 除培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)液，分別加入500 μ L的0、100、200、300、400、500、600、700 μ g/mL的含 G418的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，復3孔，每天觀察細胞的生長狀態(tài)，3-5天換液一次。14天 時，觀察細胞全部死亡的最低濃度孔，在300 μ g/mL，做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時選用的400 μ g/mL。轉(zhuǎn)染前，在60mm的培養(yǎng)皿中接種8 X IO5個細胞，加入5ml完全培養(yǎng)基，37°C，5 % CO2培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染時要求細胞40% -80%匯合。通過分光光度計測定pGL4. 17-C0X-2重組質(zhì) 粒的濃度，用不含血清、抗生素的培養(yǎng)基稀釋5 μ g的pGL4. 17-C0X-2至總體積500 μ L，稀 釋后應顛倒幾次離心管以混勻混合物，靜置5min。另取一新的1. 5mL的離心管，用不含血 清、抗生素的培養(yǎng)基500 μ L稀釋10 μ L轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體(Transfectamine Reagent)，稀釋后應 顛倒幾次離心管以混勻混合物，靜置5min將兩者混合在一起，在室溫下Q0-25°C)孵育混 合物20分鐘，使其充分形成質(zhì)粒DNA/脂質(zhì)體復合物。在孵育的同時，吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng) 基，用PBS液洗滌一次，加入3ml的無血無抗生素培養(yǎng)基。孵育完成后吸除培養(yǎng)基，將DNA/ 脂質(zhì)體復合物全部加入60mm的培養(yǎng)皿中，輕輕搖動培養(yǎng)皿以混勻。37°C、5%C02培養(yǎng)，在細胞匯合度不超過50%時加入400μ g/mL的G418進行篩選。 注意，轉(zhuǎn)染時轉(zhuǎn)染兩組細胞，組一在轉(zhuǎn)染后細胞匯合度不超過50%時(一般是Mh)加入 G418進行篩選；組二 在轉(zhuǎn)染后待細胞匯合度達到80%時1/4000、1/1000、1/300分別接種
pGL4.1權(quán)利要求
1.一種建立高效表達人環(huán)氧合酶2的重組人腸癌細胞株的方法，其特征在于，包括如 下步驟1)構(gòu)建穩(wěn)定表達人環(huán)氧合酶2基因和熒光素酶報告基因的重組質(zhì)粒PGL4-C0X-2，通過提取人環(huán)氧合酶2基因啟動子，以含熒光素酶報告基因的PGL4系列質(zhì)粒為載體，插入人環(huán)氧合酶2基因啟動子，構(gòu)建含人環(huán)氧合酶2基因啟動子和熒光素酶報告基因的 PGL4-C0X-2重組質(zhì)粒；2)建立高效表達人環(huán)氧合酶2的重組人腸癌細胞株HCT-116ωχ_2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含人環(huán)氧合酶2基因啟動子和熒光素酶報告基因的PGL4-C0X-2重組質(zhì)粒到 人腸癌HCT-116細胞株，通過藥物加壓篩選、基因擴增后，獲得高效表達人環(huán)氧合酶2基因 的克隆細胞株HCT-I 16g°x_2 ；所述的細胞株同時高效表達人環(huán)氧合酶2和熒光素酶活性。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒中所含的載體質(zhì)粒為含穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染抗生素篩選基因的質(zhì)粒，其包括Hygrc/、Neor和Pure/。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒中包含多酶切位點和內(nèi) 酰胺酶基因。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒中所包含的載體質(zhì)粒和人 環(huán)氧合酶2基因啟動子均含有BglII和Hind III雙酶切位點。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的熒光素酶報告基因選自螢火蟲熒光 素酶或海腎熒光素酶基因。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人環(huán)氧合酶2基因啟動子序列，其長 度為 250-700 bp，序列中包含 NF-k B、NF-IL6、SP-l、AP-2、CRE、E-BoX 轉(zhuǎn)錄位點和 TATA 框。
7.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的人環(huán)氧合酶2基因啟動子序列，其長 度為56^p。
8.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶基 因包括 luc2、luc2P、luc2CP 和 hRluc、hRlucP 和 hRlucC。
9.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中構(gòu)建重組質(zhì)粒PGL4-C0X-2，通過以 下步驟1)制備含有C0X-2基因啟動子目的序列(1)提取含有C0X-2基因啟動子人基因組DNA；(2)PCR擴增、純化C0X-2基因啟動子目的序列；2)大量制備pGL4.17載體質(zhì)粒3)構(gòu)建穩(wěn)定表達C0X-2基因啟動子的重組質(zhì)粒(DC0X-2基因啟動子目的序列和pGL4. 17載體質(zhì)粒的雙酶切；(2)C0X-2基因啟動子目的序列和pGL4. 17載體質(zhì)粒連接；(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，含Amf的瓊脂平板篩選陽性克隆；(4)陽性克隆單菌落的PCR鑒定，剔除假陽性菌落；(5)挑取陽性克隆單菌落搖菌，大量擴增提取制備重組質(zhì)粒；(6)PCR、雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒。
10.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中建立高效表達人環(huán)氧合酶2的重組細胞株HCT-116 X_2通過以下步驟1)確定G418的篩選HCT-116細胞的最低篩選濃度；2)pGL4.17-C0X-2重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCT-116細胞；3)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HCT-116細胞；(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT-116細胞24h后加入G418篩選；(2)陽性單克隆細胞簇接種及傳代培養(yǎng)；(3)RT-PCR或Wfestern Blot鑒定單克隆細胞株的真陽性；4)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的細胞進行熒光素酶活性檢測。
11.權(quán)利要求1制得的人腸癌細胞株HCT-116 X-2在抗腫瘤藥物的篩選和評價中的應用。
12.按權(quán)利要求11的應用，其特征在于所述的抗腫瘤藥物以人環(huán)氧合酶2基因為靶點。
13.按權(quán)利要求11的應用，其特征在于所述的抗腫瘤藥物為抗腫瘤的化學藥物、生物 類藥物，中藥復方、中藥單體或單味中藥提取物。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程制藥技術(shù)及應用領域，涉及一種建立高效表達人環(huán)氧合酶2的重組人腸癌細胞株HCT-116COX-2的方法及應用。本發(fā)明方法通過建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含人環(huán)氧合酶2基因啟動子編碼序列和熒光素酶報告基因序列的永生化哺乳動物細胞系，經(jīng)壓力篩選和基因擴增后，獲得穩(wěn)定、靈敏、高效表達人環(huán)氧合酶2的腫瘤克隆細胞株，并將該細胞株應用于以人環(huán)氧合酶2基因為靶點的抗腫瘤藥物的篩選及評價。本發(fā)明建立的重組人腸癌細胞株具有靶向性強、高效快速、反應靈敏等優(yōu)點，具有可觀的應用前景。
文檔編號C12N5/10GK102115762SQ20091024752
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者劉宣, 周利紅, 李琦, 王炎, 范忠澤 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院