專利名稱：少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞的分離純化方法，特別涉及少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法。
背景技術(shù)：
少突膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細胞，在易化神經(jīng)沖動的傳遞和維持神 經(jīng)軸突的存活上發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。越來越多的研究表明，許多精神和神經(jīng)方面的疾 病如精神分裂癥、抑郁癥、多發(fā)性硬化癥、異染行腦白質(zhì)病變、創(chuàng)傷性脊髓損傷恢復(fù)障礙等 都與少突膠質(zhì)細胞發(fā)育異常、脫髓鞘或髓鞘再生障礙有關(guān)。因此，了解少突膠質(zhì)細胞的生物 學(xué)特性對少突膠質(zhì)細胞相關(guān)性疾病的治療具有指導(dǎo)意義。 目前，對少突膠質(zhì)細胞相關(guān)性疾病的研究多采用體內(nèi)脫髓鞘模型，但該模型有它 不可解決的缺陷，如只能觀察到少突膠質(zhì)細胞整個群體的情況，不能對單個少突膠質(zhì)細胞 的發(fā)育過程進行跟蹤觀察；只能得到多種細胞類型的綜合結(jié)果，不能排除其它細胞類型的 干擾；病理過程涉及多系統(tǒng)反應(yīng)，情況復(fù)雜等。因此，需要通過體外建立少突膠質(zhì)細胞模型 以彌補體內(nèi)脫髓鞘模型的不足。 成熟的少突膠質(zhì)細胞來源于少突膠質(zhì)前體細胞(0PCs)。作為一種神經(jīng)系統(tǒng)的前 體細胞，0PCs不僅具有增殖能力，還可以遷移到髓鞘損傷部位發(fā)育成少突膠質(zhì)細胞并進一 步形成新的髓鞘。自1980年McCarthy等首次從混合培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞中分離出0PCs，至今 已發(fā)展出多種0PCs分離純化方法，如振蕩分離法，免疫篩選法或熒光激活流式細胞術(shù)篩選 法，神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化法等。但這些方法存在如下問題①操作步驟不易掌握；②耗時較 長， 一般為18 20天；③0PCs獲得率較低，每只新生大鼠約可獲得104個0PCs ; 0PCs純 度較低，通常為90% 95% ;⑤機械分離對細胞損傷大，易造成細胞大量死亡；⑥需要多種 細胞生長因子的剌激，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種OPCs分離純化方法，可以方便、短時、經(jīng) 濟、高效地獲得大量純度高、活性好的OPCs，為體外建立少突膠質(zhì)細胞模型提供必要的技術(shù) 支持，同時為少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育調(diào)控、少突膠質(zhì)細胞相關(guān)性疾病的發(fā)病機制、治療藥物的 篩選等多方面研究創(chuàng)造有力條件。 為達到此目的，本發(fā)明的少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，包括以下步驟
①獲取混合細胞取出生0 3天的大鼠大腦，去除腦干、小腦、嗅球、腦膜、海馬和 海馬周邊白質(zhì)，將剩余的大腦灰質(zhì)和白質(zhì)用胰蛋白酶和DNA酶消化后，吹打成單細胞懸液， 離心棄去上清液，細胞用混合細胞培養(yǎng)基重懸，備用；所述混合細胞培養(yǎng)基由DMEM/F12培 養(yǎng)基和體積分數(shù)為10%的胎牛血清組成； ②培養(yǎng)混合細胞將步驟①所得細胞懸液接種至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶 中，溫度37t:培養(yǎng)，培養(yǎng)3 5天待底層細胞融合達65 75%時，將混合細胞培養(yǎng)基更換為少突膠質(zhì)前體細胞增殖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 5天；所述少突膠質(zhì)前體細胞增殖培養(yǎng)基由
DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分數(shù)為1 %的N2添加劑和體積分數(shù)為15 20%的B104條件培養(yǎng)基 組成； ③消化分離少突膠質(zhì)前體細胞將步驟②所得培養(yǎng)瓶中的少突膠質(zhì)前體細胞增殖 培養(yǎng)基更換為少突膠質(zhì)前體細胞分離培養(yǎng)基，溫度37t:消化10 20分鐘，從混合細胞中分 離出少突膠質(zhì)前體細胞，吹打成單細胞懸液，離心棄去上清液，細胞用少突膠質(zhì)前體細胞接 種培養(yǎng)基重懸，備用；所述少突膠質(zhì)前體細胞分離培養(yǎng)基由匿EM/F12培養(yǎng)基、質(zhì)量體積分 數(shù)為0. 01%的乙二胺四乙酸、濃度為0. 2 0. 4mg/ml的DNA酶和濃度為5 10 y g/ml的 胰島素組成；所述少突膠質(zhì)前體細胞接種培養(yǎng)基由體積分數(shù)為50%的少突膠質(zhì)前體細胞 增殖培養(yǎng)基和體積分數(shù)為50%的混合細胞培養(yǎng)基組成； ④純化少突膠質(zhì)前體細胞將步驟③所得細胞懸液接種至預(yù)先用多聚賴氨酸包被 的培養(yǎng)瓶中，溫度37t:培養(yǎng)，待細胞貼壁25 35分鐘后，將少突膠質(zhì)前體細胞接種培養(yǎng)基 更換為少突膠質(zhì)前體細胞純化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 4天，所得貼壁細胞即為少突膠質(zhì)前體 細胞；所述少突膠質(zhì)前體細胞純化培養(yǎng)基由無糖DMEM培養(yǎng)基、濃度為5 10mmol/L的乳 酸、體積分數(shù)為1%的N2添加劑和體積分數(shù)為15 20%的B104條件培養(yǎng)基組成。
進一步，所述混合細胞培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基和體積分數(shù)為10%的胎牛血清 組成； 進一步，所述0PC增殖培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分數(shù)為1 %的N2添加劑和 體積分數(shù)為15 %的B104條件培養(yǎng)基組成； 進一步，所述0PC分離培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、質(zhì)量體積分數(shù)為0. 01%的乙二 胺四乙酸、濃度為0. 2mg/ml的DNA酶和濃度為5 y g/ml的胰島素組成；
進一步，所述OPC接種培養(yǎng)基由體積分數(shù)為50%的OPC增殖培養(yǎng)基和體積分數(shù)為 50%的混合細胞培養(yǎng)基組成； 進一步，所述0PC純化培養(yǎng)基由無糖DMEM培養(yǎng)基、濃度為5mmol/L的乳酸、體積分 數(shù)為1%的N2添加劑和體積分數(shù)為15%的B104條件培養(yǎng)基組成； 進一步，所述B104條件培養(yǎng)基采用如下方法制備將神經(jīng)母細胞瘤細胞B 104用 混合細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)至完全融合，用無菌D-Hank' s液漂洗除去殘留血清，再用含有體積分 數(shù)為1 %的N2添加劑的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)3 4天，吸出培養(yǎng)基，過濾除去殘存細胞和可 能存在的細菌，再加入防腐劑苯甲基磺酰氟化物(Phenylmethylsulfonyl fluoride,PSF)， 即得B 104條件培養(yǎng)基。 本發(fā)明的有益效果在于①組合使用多種培養(yǎng)基從腦組織混合細胞中分離純化 OPCs，并以效果最好、對細胞損傷最小和用量最省等為評價指標，對各種培養(yǎng)基的組成成分 及其濃度進行了優(yōu)化；②方法簡單，可操作性強，重現(xiàn)性好；③分離純化時間縮短為10 12 天，較現(xiàn)有方法縮短8 10天；④臺盼藍活細胞計數(shù)結(jié)果顯示，采用本發(fā)明方法，每只新生 大鼠約可獲得107個0PCs， 0PCs獲得率較現(xiàn)有方法提高近1000倍；⑤0PCs標志物01ig2 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，本發(fā)明所得OPCs的純度高于95% ;⑥避免了現(xiàn)有方法中 的機械分離篩選方式，對細胞損傷??；⑦不需要細胞生長因子的剌激，成本僅為現(xiàn)有方法的 1/5 1/10。綜上所述，本發(fā)明方法可以方便、短時、經(jīng)濟、高效地獲得大量純度高、活性好 的OPCs，所得OPCs在體外條件下保持良好的增殖生長及定向分化的能力，為體外建立少突
5膠質(zhì)細胞模型提供了必要的技術(shù)支持，同時為少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育調(diào)控、少突膠質(zhì)細胞相 關(guān)性疾病的發(fā)病機制、治療藥物篩選等多方面研究創(chuàng)造了有力條件。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進
一步的詳細描述，其中 圖l為貼壁的混合細胞； 圖2為融合的混合細胞； 圖3為混合培養(yǎng)的0PCs ; 圖4為純化培養(yǎng)的0PCs ; 圖5為誘導(dǎo)0PCs分化各階段的細胞形態(tài)學(xué)鑒定； 圖6為誘導(dǎo)0PCs分化各階段的免疫組織化學(xué)細胞染色鑒定； 圖7為誘導(dǎo)0PCs分化各階段的Western-Blotting鑒定。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細描述。
1、實驗材料 出生0 3天的清潔級SD大鼠購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心，將大 鼠冰埋5分鐘進行麻醉，酒精噴擦頭部，斷頭，置溫度4t:預(yù)冷的無菌PBS中漂洗兩次除去血 液，再置溫度4t:預(yù)冷的含有濃度為160U/ml的青霉素和濃度為200U/ml的鏈霉素的無菌 D-Hank' s液中，在解剖顯微鏡下剝出大腦，備用。 胰蛋白酶購自Boster公司，DNA酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，多 聚賴氨酸(Poly-D-Lysine)、胰島素和三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine)購自Sigma 公司，胎牛血清和DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司，無糖DMEM培養(yǎng)基和N2添加劑 (N2-supplement)購自Invitrogen公司，乳酸(Lactate)購自合肥博美生物科技有限責(zé)任 公司，N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)購自AMERSC0公司。
混合細胞培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基和體積分數(shù)為10%的胎牛血清組成；0PC增 殖培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分數(shù)為1 %的N2添加劑和體積分數(shù)為15 %的B104條 件培養(yǎng)基組成；0PC分離培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、質(zhì)量體積分數(shù)為0. 01%的乙二胺四乙 酸、濃度為0. 2mg/ml的DNA酶和濃度為5 y g/ml的胰島素組成；0PC接種培養(yǎng)基由體積分數(shù) 為50X的0PC增殖培養(yǎng)基和體積分數(shù)為50X的混合細胞培養(yǎng)基組成；0PC純化培養(yǎng)基由無 糖DMEM培養(yǎng)基、濃度為5mmol/L的乳酸、體積分數(shù)為1 %的N2添加劑和體積分數(shù)為15%的 B104條件培養(yǎng)基組成；0PC分化培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分數(shù)為1%的N2添加劑、 濃度為5 ii g/ml的N-乙酰-L-半胱氨酸、濃度為15nmol/L的三碘甲腺原氨酸、體積分數(shù)為 1%的胎牛血清和濃度為5ii g/ml的胰島素組成。 B 104條件培養(yǎng)基采用如下方法制備將神經(jīng)母細胞瘤細胞B104接種至未經(jīng)多聚 賴氨酸包被處理的培養(yǎng)瓶中，用混合細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每隔1天全量更換新鮮的混合 細胞培養(yǎng)基，直至細胞完全融合；將培養(yǎng)細胞用無菌D-Hank' s液漂洗兩次除去殘留血清， 再用含有體積分數(shù)為1 %的N2添加劑的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，吸出培養(yǎng)基，用孔徑為0. 22 m的無菌濾器過濾除去殘存細胞和可能存在的細菌，再加入PSF至終濃度為1 y g/ ml，即得B104條件培養(yǎng)基，溫度-S(TC凍存，備用。
2、 OPCs分離純化方法 ①獲取混合細胞取出生0 3天的大鼠大腦3個，去除腦干、小腦、嗅球、腦
膜、海馬和海馬周邊白質(zhì)，將剩余的大腦灰質(zhì)和白質(zhì)置溫度4t:預(yù)冷的含有抗生素的無菌
D-Hank' s液中漂洗兩次，再置無菌培養(yǎng)皿中，用刀片切成約1mm3的組織塊，加入消化液 3ml (取質(zhì)量分數(shù)為0. 25%的胰蛋白酶溶液120 y 1和濃度為2mg/ml的DNA酶溶液15 yl， 加D-Hank' s液稀釋至3ml，即得)，溫度37。C孵育15分鐘，再加入胎牛血清120 (與質(zhì) 量分數(shù)為0. 25%的胰蛋白酶溶液的加入體積相等)終止消化，用吸管吹打成單細胞懸液， 1200rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入混合細胞培養(yǎng)基30ml重懸細胞，備用；
②培養(yǎng)混合細胞將步驟①所得細胞懸液接種至預(yù)先用濃度為0. lmg/ml的多聚 賴氨酸包被的25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶5ml (含有5X 106個細胞)，溫度37。C培養(yǎng)，24小時后 可見大部分細胞已貼壁(如圖1所示)，半量更換新鮮的混合細胞培養(yǎng)基，之后每隔1天全 量更換新鮮的混合細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第3 5天可見底層細胞融合達65 75% (如圖2 所示)，將混合細胞培養(yǎng)基更換為OPC增殖培養(yǎng)基5ml，之后每隔1天全量更換新鮮的OPC 增殖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 5天獲得較多的OPCs (如圖3所示)； ③消化分離OPCs :將步驟②所得培養(yǎng)瓶中的OPC增殖培養(yǎng)基更換為OPC分離培養(yǎng) 基3ml，溫度37t:消化15 20分鐘，沿瓶底小心吹打，使貼于瓶底的OPCs脫落，將培養(yǎng)基 和脫落的OPCs轉(zhuǎn)移至離心管中，吹打成單細胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入 OPC接種培養(yǎng)基6ml重懸細胞，備用； 純化OPCs :將步驟③所得細胞懸液接種至預(yù)先用濃度為0. lmg/ml的多聚賴氨 酸包被的25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶3ml，溫度37。C培養(yǎng)，待細胞貼壁30分鐘后，將OPC接種培 養(yǎng)基更換為OPC純化培養(yǎng)基5ml，培養(yǎng)2 4天，所得貼壁細胞即為OPCs，記為Pl代。
待Pl代OPCs增殖融合達60 70%時，進行消化傳代將培養(yǎng)瓶中的OPC純化培 養(yǎng)基更換為OPC分離培養(yǎng)基，溫度37t:消化15 20分鐘，吹打成單細胞懸液，1000rpm離 心5分鐘，棄去上清液，用OPC接種培養(yǎng)基制成細胞密度為105/ml的細胞懸液，所得細胞懸 液分別接種至底部鋪有蓋玻片(預(yù)先用濃度為0. lmg/ml的多聚賴氨酸包被蓋玻片)的24 孔板中和預(yù)先用濃度為0. lmg/ml的多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，溫度37t:培養(yǎng)，待細胞貼 壁后，將OPC接種培養(yǎng)基更換為OPC增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 2天，所得貼壁細胞即為P2代 OPCs(如圖4所示)。
3、采用本發(fā)明所得0PCs的鑒定 待P2代OPCs在24孔板或培養(yǎng)皿中增殖達到足夠量時，將OPC增殖培養(yǎng)基更換為 OPC分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)OPCs分化，溫度37t:培養(yǎng)，每隔1天全量更換新鮮的OPC分化培養(yǎng)基， 培養(yǎng)4 6天至OPCs分化成熟，分別于誘導(dǎo)分化過程中的不同時間點，取樣進行細胞形態(tài) 學(xué)鑒定、免疫組織化學(xué)細胞染色鑒定和Western-Blotting鑒定。 ①細胞形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果如圖5所示，0PCs在0PC增殖培養(yǎng)基中呈典型的0PC形 態(tài)，具有雙極或三極的細胞突起和立體感強的細胞胞體，經(jīng)過三次傳代后，細胞形態(tài)仍不發(fā) 生改變；0PCs在0PC分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天分化為未成熟少突膠質(zhì)細胞，在形態(tài)上突起數(shù) 量不斷增加；培養(yǎng)6天分化為成熟少突膠質(zhì)細胞，具有多極突起，大量棘和膜樣扁平結(jié)構(gòu)。
②免疫組織化學(xué)細胞染色鑒定取細胞爬片，以少突膠質(zhì)細胞發(fā)育各階段的特征 標志物(早期標志物NG2、中期標志物04、成熟標志物MBP、少突膠質(zhì)細胞標志物01ig2)進 行免疫組織化學(xué)細胞染色鑒定，結(jié)果如圖6所示，誘導(dǎo)分化前，OPCs的胞漿、突起和棘呈早 期標志物NG2陽性(紅色熒光)；誘導(dǎo)分化3天，未成熟少突膠質(zhì)細胞呈中期標志物04陽 性(紅色熒光)；誘導(dǎo)分化6天，成熟少突膠質(zhì)細胞的胞漿、突起和膜樣扁平結(jié)構(gòu)呈成熟標 志物MBP陽性(紅色熒光)；其中，01ig2作為少突膠質(zhì)細胞標志物，在OPCs、未成熟少突膠 質(zhì)細胞和成熟少突膠質(zhì)細胞的胞核中均可檢測出(綠色熒光)。 ③Western-Blotting鑒定分別提取0PCs、未成熟少突膠質(zhì)細胞和成熟少突膠 質(zhì)細胞的總蛋白，以少突膠質(zhì)細胞發(fā)育各階段的特征標志物(早期標志物NG2、成熟標志物 MBP、少突膠質(zhì)細胞標志物01ig2)進行Western-Blotting鑒定，結(jié)果如圖7所示，少突膠 質(zhì)細胞標志物01ig2的表達量在誘導(dǎo)分化前后變化不明顯，早期標志物NG2的表達量隨著 OPCs分化成熟稍有下降，成熟標志物MBP在OPCs的終末分化階段才表達。
根據(jù)上述實驗結(jié)果，本發(fā)明分離純化的OPCs具有典型的OPC形態(tài)，呈01ig2和NG2 陽性，能進一步分化為成熟少突膠質(zhì)細胞并表達MBP，在體外條件下保持良好的增殖生長及 定向分化的能力。 最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可 以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
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權(quán)利要求
少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，其特征在于包括以下步驟①獲取混合細胞取出生0～3天的大鼠大腦，去除腦干、小腦、嗅球、腦膜、海馬和海馬周邊白質(zhì)，將剩余的大腦灰質(zhì)和白質(zhì)用胰蛋白酶和DNA酶消化后，吹打成單細胞懸液，離心棄去上清液，細胞用混合細胞培養(yǎng)基重懸，備用；所述混合細胞培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基和體積分數(shù)為10％的胎牛血清組成；②培養(yǎng)混合細胞將步驟①所得細胞懸液接種至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，溫度37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)3～5天待底層細胞融合達65～75％時，將混合細胞培養(yǎng)基更換為少突膠質(zhì)前體細胞增殖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3～5天；所述少突膠質(zhì)前體細胞增殖培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分數(shù)為1％的N2添加劑和體積分數(shù)為15～20％的B104條件培養(yǎng)基組成；③消化分離少突膠質(zhì)前體細胞將步驟②所得培養(yǎng)瓶中的少突膠質(zhì)前體細胞增殖培養(yǎng)基更換為少突膠質(zhì)前體細胞分離培養(yǎng)基，溫度37℃消化10～20分鐘，從混合細胞中分離出少突膠質(zhì)前體細胞，吹打成單細胞懸液，離心棄去上清液，細胞用少突膠質(zhì)前體細胞接種培養(yǎng)基重懸，備用；所述少突膠質(zhì)前體細胞分離培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、質(zhì)量體積分數(shù)為0.01％的乙二胺四乙酸、濃度為0.2～0.4mg/ml的DNA酶和濃度為5～10μg/ml的胰島素組成；所述少突膠質(zhì)前體細胞接種培養(yǎng)基由體積分數(shù)為50％的少突膠質(zhì)前體細胞增殖培養(yǎng)基和體積分數(shù)為50％的混合細胞培養(yǎng)基組成；④純化少突膠質(zhì)前體細胞將步驟③所得細胞懸液接種至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，溫度37℃培養(yǎng)，待細胞貼壁25～35分鐘后，將少突膠質(zhì)前體細胞接種培養(yǎng)基更換為少突膠質(zhì)前體細胞純化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2～4天，所得貼壁細胞即為少突膠質(zhì)前體細胞；所述少突膠質(zhì)前體細胞純化培養(yǎng)基由無糖DMEM培養(yǎng)基、濃度為5～10mmol/L的乳酸、體積分數(shù)為1％的N2添加劑和體積分數(shù)為15～20％的B104條件培養(yǎng)基組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，其特征在于所述混合細胞培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基和體積分數(shù)為10%的胎牛血清組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，其特征在于所述少突膠質(zhì)前體細胞增殖培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分數(shù)為1%的N2添加劑和體積分數(shù)為15 %的B104條件培養(yǎng)基組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，其特征在于所述少突膠質(zhì)前體細胞分離培養(yǎng)基由DMEM/F12培養(yǎng)基、質(zhì)量體積分數(shù)為0. 01%的乙二胺四乙酸、濃度為0. 2mg/ml的DNA酶和濃度為5 y g/ml的胰島素組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，其特征在于所述少突膠質(zhì)前體細胞接種培養(yǎng)基由體積分數(shù)為50X的0PC增殖培養(yǎng)基和體積分數(shù)為50%的混合細胞培養(yǎng)基組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，其特征在于所述少突膠質(zhì)前體細胞純化培養(yǎng)基由無糖DMEM培養(yǎng)基、濃度為5mmol/L的乳酸、體積分數(shù)為1%的N2添加劑和體積分數(shù)為15%的B104條件培養(yǎng)基組成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，其特征在于所述B104條件培養(yǎng)基采用如下方法制備將神經(jīng)母細胞瘤細胞B104用混合細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)至完全融合，用無菌D-Hank' s液漂洗除去殘留血清，再用含有體積分數(shù)為1X的N2添加劑的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)3 4天，吸出培養(yǎng)基，過濾除去殘存細胞和可能存在的細菌，再加入防腐劑苯甲基磺酰氟化物，即得B104條件培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了少突膠質(zhì)前體細胞的分離純化方法，是將新生大鼠大腦皮質(zhì)和部分白質(zhì)用胰蛋白酶和DNA酶消化后，吹打成單細胞懸液，用混合細胞培養(yǎng)基接種至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)3～5天待底層細胞融合達65～75％時，換為少突膠質(zhì)前體細胞增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～5天，再換為少突膠質(zhì)前體細胞分離培養(yǎng)基，37℃消化，從混合細胞中分離出少突膠質(zhì)前體細胞，吹打成單細胞懸液，用少突膠質(zhì)前體細胞接種培養(yǎng)基接種至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，換為少突膠質(zhì)前體細胞純化培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～4天，所得貼壁細胞即為少突膠質(zhì)前體細胞；本發(fā)明可以方便、短時、經(jīng)濟、高效地獲得大量純度高、活性好的少突膠質(zhì)前體細胞。
文檔編號C12N5/079GK101735983SQ20091025105
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者牛建欽, 肖嵐 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)