專利名稱：基于雀稗固氮菌的根際促生菌肥及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物肥料領(lǐng)域，涉及一種菌肥，同時還涉及該菌肥的生產(chǎn)方法，尤其涉 及一種對小麥類禾本科作物具有固氮、溶磷、促生作用的高效根際菌肥及其制備方法。
背景技術(shù)：
植物根際促生菌(PlantGrowth Promoting Rhizobacteria，簡稱 PGPR)是指自 由生活在土壤或定植于植物根表、根內(nèi)或莖葉的一類可促進植物生長、防治病害、增加作物 產(chǎn)量的有益微生物。通常指具有固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素、分泌抗生素和產(chǎn)生促進植物生 長生理活性物質(zhì)等能力或至少具有其中之一能力的細菌。其可增加植物的植物量，提高植 物營養(yǎng)品質(zhì)，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)產(chǎn)生抗病性等諸多功效。PGPR是80年代發(fā)展起來的一種菌肥， 它應(yīng)用面積較廣，主要用于禾本科、蔬菜類，它能產(chǎn)生生長素、抑制病原菌、固氮和分解磷化 物，PGPR的作用不是單一的，接種大量優(yōu)勢有益細菌于作物根際，促生作用是綜合的結(jié)果， 它并不是普通微肥某一種效應(yīng)而是一種綜合效應(yīng)。作用機理分泌植物促生物質(zhì)，有人從能 促進難溶性磷轉(zhuǎn)化的50個分離物中，發(fā)現(xiàn)43個產(chǎn)生植物生長激素，29個產(chǎn)生赤霉素，45個 產(chǎn)生激動素類物質(zhì)，在這些PGPR中還分泌多種維生素，細維生Bi、B6、H、B12等，還有的能 分泌氨基酸；促進出芽，調(diào)控土傳病害。減輕土傳病害、降低發(fā)生的次數(shù)。PGPR能產(chǎn)生鐵載 體，它能對Fe3+具有超強絡(luò)合力，能產(chǎn)生大量鐵載體的根際細菌在與不能產(chǎn)生鐵載體或產(chǎn) 量很小的有害微生物競爭鐵素營養(yǎng)時將占優(yōu)勢，從而抑制有害微生物的生長繁殖，表現(xiàn)出 生物防治作用。目前，國內(nèi)PGI^R菌的研究及相關(guān)生態(tài)菌肥的生產(chǎn)報道不多。國外，特別是印度、巴 基斯坦、巴西、美國、澳大利亞等國家做了廣泛的研究，已有自己的PGI^R生態(tài)菌肥產(chǎn)品，同 時新的研究領(lǐng)域和新技術(shù)不斷出現(xiàn)。因不同生境的植物根系、莖桿生存著特定的促生菌菌 株，因此我們只能借鑒國外的成功經(jīng)驗，從我國特定氣候，生境中分離出PGH 菌株，以生產(chǎn) 出適合我國氣候、生境的生物菌肥，同時要在理論方面作更是深入的研究。目前，國內(nèi)豆科 植物生物肥料較多，但禾本科及其他非豆科植物生物肥料空缺。世界范圍內(nèi)禾本科作物種 植面積較大，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)功能。它們大多數(shù)都以氮、磷為主要的營養(yǎng)元素。 大量研究結(jié)果表明，PGI^R在小麥、玉米、水稻、甘蔗等禾本科植物根際得到分離，PGPR的研 究范圍和內(nèi)容也在不斷擴展和深入。PGI^R特別是兼具固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素、分泌抗生 素于一身的菌種，是寶貴的生物資源，它們的開發(fā)利用將在生物菌肥的研制和禾本科植物 的研發(fā)中起到舉足輕重的作用。故從市場需求及人們環(huán)保意識增強等方面考慮，生態(tài)菌肥 的研究及其開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的是，提供一種具有固氮、溶磷、分泌促生植物激 素作用的菌肥，該肥料適應(yīng)性強、性能穩(wěn)定，具有固氮、溶磷、促生長等多種功能。同時，本發(fā) 明的目的還在于提供一種小麥禾本科作物用高效根際菌肥的制備方法。本發(fā)明通過如下技術(shù)措施實現(xiàn)菌株雀稗固氮菌的篩選1. 土樣采集樣品采自臨沂地區(qū)小麥根際沉積物，樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，低 溫保存。2.培養(yǎng)基(I)LB培養(yǎng)基蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、Agar 20g,總體積1000ml (蒸餾 水補足)，PH 7. 0-7. 5 ；(2) NFM 培養(yǎng)基蘋果酸 5g、K2PHO4 0. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、CaCl2 · 2H20 0. 02g、 NaCl 0. lg、NaMoO4 · 2H20 0. 002g、KOH 4. 5g, Bromothymol Blue(BTB 0.5 % )5ml、 BiotinelOug、Agar 2% (固體培養(yǎng)基)，總體積 1000ml (蒸餾水補足)，PH7. 0-7. 5 ；(3)CCM 培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 2g、NaCl 0. lg、K2HPO4 0. 8g、Na2FeEDTA28mg、鉬酸鈉 25mg、酵母浸膏l(xiāng)OOmg、甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸鈉0. 5ml、蒸餾水900ml。3.菌株篩選方法取樣品lg，在無菌條件下用0. 85%生理鹽水配成10-4、10_5、10-6三個稀釋度，各稀 釋度的懸浮液接種于盛有半固體NFM、CCM培養(yǎng)基的血清試管瓶中，28-30°C培養(yǎng)48h后，注 入ImlC2H2，再置于28-30°C培養(yǎng)24h_48h后，對有C2H4產(chǎn)生的樣品以平板劃線法將其分別再 培養(yǎng)于LB、NFM、CCM平板培養(yǎng)基上，置于28-30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。然后分別挑取不 同的典型單個菌落，并接種于新準備的CCM、NFM血清小瓶中，測定其固氮活性。挑選出生長 快、圈大的菌落再分離純化后，轉(zhuǎn)斜面4°C保藏。4、菌株拮抗反應(yīng)試驗分別將培養(yǎng)純化的菌株劃線接種到盛有LB固體培養(yǎng)基的同一培養(yǎng)皿中，置于 28-30°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4-8d，并定期觀察細菌交叉點的細菌生長情況，判定其有無抑制作 用。若該交叉點細菌不生長或生長差，說明這兩種細菌共存時有拮抗作用；反之，若該交叉 點細菌生長良好，說明這兩種細菌可共存，其間沒有抑制作用。將相互之間不發(fā)生拮抗反應(yīng) 的各個菌株懸浮液混合，否則單獨使用。本發(fā)明提供了一種根際促生菌肥，是由每500_700g吸附劑中加入130_170ml菌懸 液制成，雀稗固氮菌活菌數(shù)0. 5X108-2X108cfU/g。前述的根際促生菌肥，優(yōu)選的方案是所述的吸附劑為泥炭、活性碳、蛭石或其中 的混合物。所述的吸附劑優(yōu)選為對PGPR菌株無毒、吸水保水性能好、pH值在6. 5-7. 0之間、 顆粒細小且易與種子粘著、不易結(jié)塊、廉價的泥炭(干燥、粉碎至100目。)為接種載體。發(fā)明還還提供了根際促生菌肥的制備方法，包括以下步驟[1]菌懸液的制備(1)雀稗固氮菌斜面28-30°C，培養(yǎng)2-3d ；(2)搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)瓶盛培養(yǎng)基300ml，121°C滅菌20-30min，冷卻后接入Iml 斜面菌株，置于28°C振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速125rpm/min，培養(yǎng)時間2_3d ；(3)擴大發(fā)酵300L發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基150L，121°C滅菌后置于室溫下2_3d，經(jīng)檢 查無污染后，接入15L種子培養(yǎng)液，置于28°C下的軌道搖床，轉(zhuǎn)速為125rpm/min，培養(yǎng)時間 3-4d，所得即為菌懸液；
[2]吸附劑的處理將吸附劑干燥、粉碎，過100目篩，121°C滅菌2_3h，分裝500g/袋備用；[3]菌肥接種和培養(yǎng)用已滅菌的量筒量取150ml菌懸液接種到500g滅菌的吸附劑中，在無菌操作下裝 入塑料包裝袋中立即封口，并將菌懸液與吸附劑混勻，再用滅菌針在塑料袋的四周及中間 扎幾個孔，置于28-30°C培養(yǎng)6-7d，使雀稗固氮菌進一步繁殖，活菌數(shù)均在IO8個/g，包裝后 常溫下保存，即為根際促生菌肥。前述的制備方法，所述步驟(1)的培養(yǎng)基是蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、 Agar 20g，蒸餾水 1000ml，PH 7. 0-7. 5。前述的制備方法，所述步驟(2)和步驟(3)的培養(yǎng)基是糖漿10g、酵母膏5g、 CMC-Na5g、KH2PO4O. 5g、MgSO4O. 25g、蒸餾水 1000ml, PH 7. 0-7. 5。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下述突出的技術(shù)效果1、本發(fā)明采用特殊培養(yǎng)(LB、NFM、CCM)基法從小麥根際分離出具有固氮、分泌植 物生長類物質(zhì)及容磷作用的固氮菌株；2、本發(fā)明菌株從我國小麥根際獲得，適應(yīng)性強、性能穩(wěn)定，能產(chǎn)生多種小麥生長促 進物質(zhì)，小麥植株生長健壯，產(chǎn)量、產(chǎn)值高；3、本發(fā)明產(chǎn)品，不含有無機化肥的成分，長期使用不會污染土壤，并可改良土壤。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例、實驗例詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但保護范圍不被此限制。實施例中所用蛋白胨、酵母膏、NaCl、K2PH04等常規(guī)藥品皆為國產(chǎn)分析純，均可從市 場購買配制。實施例1菌株雀稗固氮菌的篩選。1. 土樣采集樣品采自臨沂地區(qū)小麥根際沉積物，樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，低 溫保存。2.培養(yǎng)基(I)LB培養(yǎng)基蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、Agar 20g,總體積1000ml (蒸餾 水補足)，PH 7. 0-7. 5 ；(2) NFM 培養(yǎng)基蘋果酸 5g、K2PHO4 0. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、CaCl2 · 2H20 0. 02g、 NaCl 0. lg、NaMoO4 · 2H20 0. 002g、KOH 4. 5g, Bromothymol Blue(BTB 0.5 % )5ml、 BiotinelOug、Agar 2% (固體培養(yǎng)基)，總體積 1000ml (蒸餾水補足)，PH7. 0-7. 5 ；(3)CCM 培養(yǎng)基=KH2PO4 0. 2g、NaCl 0. lg、K2HPO4 0. 8g、Na2FeEDTA28mg、鉬酸鈉 25mg、酵母浸膏100mg、甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸鈉0. 5ml、蒸餾水900ml。3.菌株篩選方法取樣品lg，在無菌條件下用0. 85%生理鹽水配成10-4、10_5、10-6三個稀釋度，各稀 釋度的懸浮液接種于盛有半固體NFM、CCM培養(yǎng)基的血清試管瓶中，28-30°C培養(yǎng)48h后，注 入ImlC2H2，再置于28-30°C培養(yǎng)24h_48h后，對有C2H4產(chǎn)生的樣品以平板劃線法將其分別再 培養(yǎng)于LB、NFM、CCM平板培養(yǎng)基上，置于28-30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。然后分別挑取不同的典型單個菌落，并接種于新準備的CCM、NFM血清小瓶中，測定其固氮活性。挑選出生長 快、圈大的菌落再分離純化后，轉(zhuǎn)斜面4°C保藏。4、菌株拮抗反應(yīng)試驗分別將培養(yǎng)純化的菌株劃線接種到盛有LB固體培養(yǎng)基的同一培養(yǎng)皿中，置于 28-30°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4-8d，并定期觀察細菌交叉點的細菌生長情況，判定其有無抑制作 用。若該交叉點細菌不生長或生長差，說明這兩種細菌共存時有拮抗作用；反之，若該交叉 點細菌生長良好，說明這兩種細菌可共存，其間沒有抑制作用。將相互之間不發(fā)生拮抗反應(yīng) 的各個菌株懸浮液混合，否則單獨使用。實施例2根際促生菌肥的制作。本實施例根際促生菌肥是由500g吸附劑中加入130ml菌懸液制成，雀稗固氮菌活 菌數(shù)2X108cfu/g。吸附劑為泥炭，優(yōu)選對PGI3R菌株無毒、吸水保水性能好、pH值在6. 5-7. 0 之間、顆粒細小且易與種子粘著、不易結(jié)塊、廉價的泥炭(干燥、粉碎至100目。)該根際促生菌肥的制備方法，包括以下步驟[1]菌懸液的制備(1)雀稗固氮菌斜面28-30°C，培養(yǎng)2-3d ；(2)搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)瓶盛培養(yǎng)基300ml，121°C滅菌20-30min，冷卻后接入Iml 斜面菌株，置于28°C振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速125rpm/min，培養(yǎng)時間2_3d ；(3)擴大發(fā)酵300L發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基150L，121°C滅菌后置于室溫下2_3d，經(jīng)檢 查無污染后，接入15L種子培養(yǎng)液，置于28°C下的軌道搖床，轉(zhuǎn)速為125rpm/min，培養(yǎng)時間 3-4d，所得即為菌懸液；[2]吸附劑的處理將吸附劑干燥、粉碎，過100目篩，121°C滅菌2_3h，分裝500g/袋備用；[3]菌肥接種和培養(yǎng)用已滅菌的量筒量取150ml菌懸液接種到500g滅菌的吸附劑中，在無菌操作下裝 入塑料包裝袋中立即封口，并將菌懸液與吸附劑混勻，再用滅菌針在塑料袋的四周及中間 扎幾個孔，置于28-30°C培養(yǎng)6-7d，使雀稗固氮菌進一步繁殖，活菌數(shù)均在IO8個/g，包裝后 常溫下保存，即為根際促生菌肥。所述步驟(1)的培養(yǎng)基是蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、Agar 20g，蒸餾水 1000ml, PH 7. 0-7. 5。所述步驟⑵和步驟(3)的培養(yǎng)基是糖漿10g、酵母膏5g、CMC-Na5g、KH2P040. 5g、 MgSO4O. 25g、蒸溜水 1000ml，PH 7. 0-7. 5。實施例3根際促生菌肥的制作。本實施例根際促生菌肥是由700g吸附劑中加入 170ml菌懸液制成，雀稗固氮菌活菌數(shù)0.5X108cfu/g。吸附劑為活性碳。該根際促生菌肥 的制備方法同實施例2。實驗例1實驗地點山東臨沭縣；實驗方法1、實驗材料供試小麥品種農(nóng)大 664;供試土壤試驗前耕層(0-20cm) 土壤養(yǎng)分含量，有機質(zhì)1. 57 %，全氮0. 099 %，全磷 0.072%，全鉀 1.08% ；堿解氮 96. 37mg/kg，速效磷 21.40mg/kg，速效鉀 107. 33mg/kg。2、實 驗處理每個處理實驗小區(qū)面積4畝，采用隨機區(qū)組排列，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。所有試 驗小區(qū)的條件(如土壤、灌溉、肥料、生育期和行株距等田間管理措施以及光照等因素)一致，且符合當?shù)乜茖W(xué)的農(nóng)業(yè)種植實踐。試驗設(shè)計為4個處理，其處理名稱代號及內(nèi)容如下①根際促生菌肥60斤/畝配施磷二銨10斤/畝；②根際促生菌肥40斤/畝配施磷二銨20斤/畝；③根際促生菌肥30斤/畝配施磷二銨30斤/畝；④磷二銨50斤/畝。各處理追肥一致，統(tǒng)一追施尿素40斤/畝。1、試驗結(jié)果分析1. 1實施例2根際促生菌肥對小麥性狀的影響表1不同處理對小麥主要經(jīng)濟性狀的影響
權(quán)利要求
1.雀稗固氮菌，其特征是，通過下述步驟獲得A.土樣采集樣品采自臨沂地區(qū)小麥根際沉積物，樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯 袋中，低溫保存；B.培養(yǎng)基(1)LB培養(yǎng)基蛋白胨 10g、酵母膏 5g、NaCl 10g、Agar 20g，總體積 1000ml，pH 7. 0-7. 5 ；(2)NFM 培養(yǎng)基蘋果酸 5g、K2PHO4O. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、CaCl2 · 2H20 0. 02g、NaCl 0. Ig^NaMoO4 ·2Η20 0. 002g>K0H 4. 5g>Bromothymol Blue 5ml、Biotine 10ug>Agar2%, 體積 1000ml, pH7. 0-7. 5 ；(3)CCM 培養(yǎng)基=KH2PO4O. 2g、NaCl 0. Ig^K2HPO4O. 8g、Na2FeEDTA28mg、鉬酸鈉 25mg、酵母 浸膏l(xiāng)OOmg、甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸鈉0. 5ml、蒸餾水900ml ；C.菌株篩選方法取樣品lg，在無菌條件下用0.85%生理鹽水配成10_4、10_5、10_6三個 稀釋度，各稀釋度的懸浮液接種于盛有半固體NFM、CCM培養(yǎng)基的血清試管瓶中，28-30°C培 養(yǎng)48h后，注入ImlC2H2，再置于28_30°C培養(yǎng)24h_48h后，對有C2H4產(chǎn)生的樣品以平板劃線 法將其分別再培養(yǎng)于LB、NFM、CCM平板培養(yǎng)基上，置于28_30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24_48h，然 后分別挑取不同的典型單個菌落，并接種于新準備的CCM、NFM血清小瓶中，測定其固氮活 性，挑選出生長快、圈大的菌落再分離純化后，轉(zhuǎn)斜面4°C保藏。
2.一種根際促生菌肥，其特征在于由每500-700g吸附劑中加入130-170ml菌懸液制 成，雀稗固氮菌活菌數(shù)0. 5X108-2X108CfU/g。
3.權(quán)利要求2所述的根際促生菌肥，其特征在于所述的吸附劑為泥炭、活性碳、蛭石 或它們的混合物。
4.權(quán)利要求3所述的根際促生菌肥，其特征在于所述的吸附劑為泥炭。
5.一種根際促生菌肥的制備方法，其特征在于包括以下步驟A.菌懸液的制備(1)雀稗固氮菌斜面28-30°C，培養(yǎng)2-3d；(2)搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng)瓶盛培養(yǎng)基300ml，121°C滅菌20-30min，冷卻后接入Iml斜面 菌株，置于28°C振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速125rpm/min，培養(yǎng)時間2_3d ；(3)擴大發(fā)酵300L發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基150L，121°C滅菌后置于室溫下2_3d，經(jīng)檢查無 污染后，接入15L種子培養(yǎng)液，置于28°C下的軌道搖床，轉(zhuǎn)速為125rpm/min，培養(yǎng)時間3_4d， 所得即為菌懸液；B.吸附劑的處理將吸附劑干燥、粉碎，過100目篩，121°C滅菌2-3h，分裝500g/袋備用；C.菌肥接種和培養(yǎng)用已滅菌的量筒量取150ml菌懸液接種到500g滅菌的吸附劑中， 在無菌操作下裝入塑料包裝袋中立即封口，并將菌懸液與吸附劑混勻，再用滅菌針在塑料 袋的四周及中間扎幾個孔，置于28-30°C培養(yǎng)6-7d，使雀稗固氮菌進一步繁殖，活菌數(shù)均在 IO8個/g，包裝后常溫下保存，即為根際促生菌肥。
6.權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)的培養(yǎng)基是蛋白胨10g、酵 母膏 5g、NaCl 10g、Agar 20g，蒸餾水 1000ml，pH 7· 0_7· 5。
7.權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)和步驟(3)的培養(yǎng)基是糖漿 10g、酵母膏 5g、CMC-Na5g、KH2PO4O. 5g、MgSO4O. 25g、蒸餾水 1000ml, pH 7. 0-7. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根際促生菌肥，是由每500-700g吸附劑中加入130-170ml菌懸液制成，雀稗固氮菌活菌數(shù)0.5×108-2×108cfu/g。本發(fā)明產(chǎn)品，不含有無機化肥的成分，長期使用不會污染土壤，并可改良土壤。
文檔編號C12R1/01GK102108335SQ200910256099
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者范玲超, 葛雨明, 陳宏坤 申請人:山東金正大生態(tài)工程股份有限公司