專利名稱：一種高靈敏度焦測(cè)序反應(yīng)液及其配制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因測(cè)序領(lǐng)域，涉及一種高靈敏度焦測(cè)序反應(yīng)液及其配制方法，具體
說(shuō)是通過(guò)增加焦測(cè)序反應(yīng)液中的三磷酸腺苷硫酸化酶和熒光素酶量，使焦測(cè)序反應(yīng)信號(hào)顯 著上升的同時(shí)，其背景信號(hào)控制在很低的水平。
背景技術(shù)：
DNA序列測(cè)定技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一。目前普遍使用的DNA序 列分析技術(shù)基本上都是基于雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger法)，但Sanger法只能定性不 能定量；適合大規(guī)模測(cè)序不適合測(cè)定單堿基差異并且不能準(zhǔn)確測(cè)定引物后面的堿基序列。 焦測(cè)序(pyrosequencing)技術(shù)在進(jìn)行DNA序列分析時(shí)不需要電泳和熒光標(biāo)記，可以直接測(cè) 定引物后面的堿基序列，定量性能好，結(jié)果準(zhǔn)確，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，很好的克服了 Sanger法的 缺點(diǎn)。 焦測(cè)序技術(shù)是一種DNA序列實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析， 除可用于細(xì)菌、病毒、真菌的鑒定、分型及耐藥性分析外，還可用于突變及插入缺失檢測(cè)、 CpG甲基化分析、基因拷貝數(shù)鑒定等。其原理是由四種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián) 反應(yīng)，引物與單鏈DNA模板退火后，在核酸聚合酶(klenow)的作用下，依次加入4種不同的 脫氧核糖核苷酸(dNTPs)中的l種，如果加入的dNTP與模板互補(bǔ)，則發(fā)生延伸反應(yīng)，釋放出 等摩爾量的PPi ;PPi在三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)的催化作用下，與5'-磷 酸化硫酸腺苷(APS)反應(yīng)生成三磷酸腺苷(ATP) ;ATP與熒光素(luciferin)在熒光素酶 (luciferase)作用下產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與結(jié)合的dNTP數(shù)成正比；如果加入的dNTP與模 板不互補(bǔ)，則無(wú)熒光產(chǎn)生，以此來(lái)測(cè)定引物后的堿基序列。反應(yīng)中同時(shí)還加入了三磷酸腺苷 雙磷酸酶(即yrase)將未結(jié)合的dNTPs和ATP降解。 在焦測(cè)序反應(yīng)體系中，ATP硫酸化酶催化PPi和APS反應(yīng)生成ATP，而因APS是ATP 的結(jié)構(gòu)類似物，也可作為熒光素酶的底物，雖然與ATP相比反應(yīng)效率為1/1000左右，但是由 此產(chǎn)生的背景信號(hào)會(huì)對(duì)檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生干擾。在傳統(tǒng)的焦測(cè)序反應(yīng)液中，為了將單鏈延伸時(shí) 生成的PPi高效地轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，通常是將5iimol/L的APS加入到反應(yīng)液中，比如反應(yīng)液的體 積為100iiL時(shí)，5iimol/L的APS會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)于500fmol的ATP的背景信號(hào)。所以，傳統(tǒng)的 焦測(cè)序反應(yīng)液的檢測(cè)靈敏度較低，必須使用pmol級(jí)以上的DNA樣品。 焦測(cè)序反應(yīng)的光信號(hào)可通過(guò)光電倍增管(PMT)、光電偶合器(CCD)或光敏管(PD) 采集，其中PMT的檢測(cè)靈敏度最高，但由于價(jià)格昂貴、體積大難以陣列化等缺陷，限制了其 在焦測(cè)序儀器中的應(yīng)用；CCD雖然有體積小可陣列化的優(yōu)勢(shì)，但其檢測(cè)靈敏度低且成本較 高；而價(jià)格低廉且體積較小的光敏管雖可降低焦測(cè)序檢測(cè)成本，但同樣需要通過(guò)提高焦測(cè) 序反應(yīng)液的靈敏度來(lái)克服其檢測(cè)器的不足。 增加熒光素酶濃度可使光信號(hào)增強(qiáng)，但由APS產(chǎn)生的背景信號(hào)也會(huì)隨之升高，因 此不能僅通過(guò)增加熒光素酶量來(lái)提高焦測(cè)序反應(yīng)靈敏度。另外，由于減少使用的APS量，焦 測(cè)序反應(yīng)中的熒光信號(hào)也會(huì)降低，因此也不能通過(guò)降低APS的量來(lái)降低焦測(cè)序反應(yīng)的背景信號(hào)。有研究提出用丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)代替ATP硫酸化酶，其底物AMP和PEP不與 熒光素酶反應(yīng)，所以增加熒光素酶量也不會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)的增加。使用PPDK的焦測(cè)序體系 可以通過(guò)增加熒光素酶量達(dá)到對(duì)fmol級(jí)模板的檢測(cè)，但目前市場(chǎng)上還沒(méi)有商品化PPDK供 應(yīng)，且該酶不易通過(guò)基因工程表達(dá)獲得。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在傳統(tǒng)的APS-ATP硫酸化酶焦測(cè)序反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，建立一種 高靈敏度、低背景信號(hào)的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，用于低成本的微量DNA的實(shí)時(shí)短序列 分析。 本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 —種焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，該方法通過(guò)提高傳統(tǒng)的APS-ATP硫酸化酶焦測(cè)序 反應(yīng)液中ATP硫酸化酶的濃度來(lái)降低焦測(cè)序反應(yīng)的背景信號(hào)，從而提高焦測(cè)序反應(yīng)的靈敏 度。 所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，該方法在提高ATP硫酸化酶濃度的基礎(chǔ)上，通
過(guò)將熒光素酶濃度提高2 30倍來(lái)進(jìn)一步提高焦測(cè)序反應(yīng)的靈敏度。 所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其中ATP硫酸化酶的濃度需提高至其活性濃度
大于反應(yīng)液中的APS濃度；ATP硫酸化酶的活性濃度是指八倍于反應(yīng)液中的ATP硫酸化酶
的濃度。 所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其中反應(yīng)液中APS濃度為5 ii mol/L。 所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其中反應(yīng)液中ATP硫酸化酶的濃度為10U/
mL(即0. 665iimol/L)。 所述的配制方法制備的焦測(cè)序反應(yīng)液，該反應(yīng)液的組成為0. lmol/L Tris-HAc(pH7. 7) ，2,1/L EDTA， 10,1/L Mg(Ac)2，0.1 % BSA， 1,1/L DTT，5踐o1/ L APS，0.4g/L PVP，O. 4mmol/L D—luciferin，18U/ml klenow，1. 6U/ml apyrase，14. 6 292mg/Lluciferase，lOU/mL ATP sulfurylase。傳統(tǒng)的APS-ATP硫酸化酶焦測(cè)序反應(yīng)液的組成0. lmol/L Tris-HAc (pH7. 7)， 2翻1/L EDTA， lOmmol/L Mg(Ac)2，0.1 % BSA， 1翻1/L DTT， 5 ii mol/LAPS，0. 4g/LPVP， 0.4mmol/L D_luciferin，10 100U/mL Klenow，1 2U/mL apyrase，2 10mg/ Lluciferase，0. 2U/mL ATP sulfurylase。
詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明技術(shù)方案的原理為
1、通過(guò)增加ATP硫酸化酶量以降低背景信號(hào) 焦測(cè)序反應(yīng)中的背景信號(hào)主要是由APS產(chǎn)生的，因APS與ATP結(jié)構(gòu)相似，可與熒光 素酶結(jié)合，在一定的溫度和pH條件下，其反應(yīng)平衡常數(shù)為kl ;同時(shí)，APS又是ATP硫酸化酶 的強(qiáng)底物，其反應(yīng)平衡常數(shù)k2遠(yuǎn)大于kl。因此，如下述方程式(ATP硫酸化酶及熒光素酶催 化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式)所示，熒光素酶與ATP硫酸化酶競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合APS，并最終達(dá)到平衡 狀態(tài)。游離的APS被熒光素酶捕獲后生成的發(fā)光物質(zhì)(Luciferase[oxyluciferin* *APS])
即是焦測(cè)序反應(yīng)中產(chǎn)生背景信號(hào)的主要原因。
APS + luciferin + 02 + Liiciferase"<"~^~>Ludferase[oxyludferin * APS] + CO,
4
APS + ATP Si她rylase < 、 > ATP Si她ryase [APS]
在傳統(tǒng)的焦測(cè)序反應(yīng)體系中，APS濃度為5 ii mol/L， ATP硫酸化酶濃度為0. 2U/ mL(即0. 133iimol/L)。由于ATP硫酸化酶具有八個(gè)活性中心，所以0. 133踐ol/L的ATP 硫酸化酶可以結(jié)合1. 064 ii mol/LAPS，游離的APS濃度為3. 936 y mol/L，這些未被ATP硫酸 化酶結(jié)合的APS可以與熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生背景熒光信號(hào)，并且背景信號(hào)強(qiáng)度會(huì)隨著熒光素 酶的濃度增加而增加。 保持APS量不變，若增大反應(yīng)液中ATP硫酸化酶濃度至其活性濃度大于APS濃度，
則可在很大程度上限制APS與熒光素酶的結(jié)合，從而大大降低焦測(cè)序背景信號(hào)。 2、通過(guò)增加熒光素酶的量以提高光信號(hào)強(qiáng)度 —方面，在酶促反應(yīng)中，反應(yīng)的起始速度V與底物濃度[S]的關(guān)系可用米氏方程V =Vmax[S]/(Km+[S])表示，其中Vmax是酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，Km為一常數(shù)，只由酶 的性質(zhì)決定，而與酶的濃度無(wú)關(guān)。在低濃度底物情況下，反應(yīng)相對(duì)于底物是一級(jí)反應(yīng)，若底 物濃度不變，則V與Vmax成正比；當(dāng)?shù)孜餄舛确浅４髸r(shí)，反應(yīng)相對(duì)于底物S是個(gè)零級(jí)反應(yīng)， 則V趨近于Vmax。因Vmax = k。at[E] ， k。at是ES轉(zhuǎn)化為游離的E和產(chǎn)物的速度常數(shù)，所以 Vmax正比于酶濃度，也就是說(shuō)在底物一定的條件下，V與酶濃度成正比。具體在焦測(cè)序反應(yīng) 體系中，隨著熒光素酶濃度的增加，催化反應(yīng)的速率加快，產(chǎn)生光信號(hào)所需要的時(shí)間縮短， 瞬間產(chǎn)生的光信號(hào)增強(qiáng)，故檢測(cè)信號(hào)增加。 另一方面，由于焦測(cè)序反應(yīng)過(guò)程是由四種酶共同參與的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在ATP硫酸 化酶及核酸聚合酶足量的情況下，檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度決定于熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶 的濃度。焦測(cè)序反應(yīng)所形成的光信號(hào)峰的上升曲線是由于ATP與熒光素在熒光素酶催化下 產(chǎn)生光信號(hào)，而其下降曲線主要是因三磷酸腺苷雙磷酸酶催化ATP的降解。當(dāng)三磷酸腺苷 雙磷酸酶濃度一定時(shí)，其降解ATP的速度一定，而隨熒光素酶濃度增大，ATP作為熒光素酶 底物的反應(yīng)速度加快，故信號(hào)峰的高度增高，檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)。 因此，在使用高濃度ATP硫酸化酶的情況下，可以簡(jiǎn)單地通過(guò)增加熒光素酶的量
來(lái)實(shí)現(xiàn)高靈敏度的焦測(cè)序反應(yīng)。 本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明通過(guò)增加焦測(cè)序反應(yīng)液中的ATP硫酸化酶量，從而抑制其底物APS和熒光 素酶反應(yīng)，APS與熒光素酶的反應(yīng)受抑制后可降低焦測(cè)序反應(yīng)的背景信號(hào)，增加熒光素酶 量可提高光信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)背景信號(hào)不增加，使得在高濃度熒光素酶條件下，背景信號(hào)控制 在很低的水平，而反應(yīng)信號(hào)顯著上升，因此使用與通常相比低一個(gè)數(shù)量級(jí)的幾十fmol量的 DNA就可進(jìn)行堿基測(cè)序。同時(shí)，這一新型的高靈敏反應(yīng)液可應(yīng)用于以價(jià)格低廉的光敏管陣列 為檢測(cè)器的便攜式生物發(fā)光分析儀，從而實(shí)現(xiàn)快速、高效、低成本的DNA分析。本發(fā)明克服 了傳統(tǒng)的技術(shù)偏見(jiàn)，通過(guò)提高傳統(tǒng)的APS-ATP硫酸化酶焦測(cè)序反應(yīng)液中ATP硫酸化酶的濃 度或者ATP硫酸化酶的濃度與熒光素酶的量就可以提高焦測(cè)序反應(yīng)的靈敏度。


圖1是不同濃度ATP硫酸化酶的焦測(cè)序反應(yīng)液檢測(cè)50fmol DNA單鏈的信號(hào)圖。
圖2是ATP硫酸化酶濃度與測(cè)序信號(hào)和背景信號(hào)的關(guān)系圖。
圖3是分別在低、高濃度ATP硫酸化酶條件下隨熒光素酶濃度增加的測(cè)序信號(hào)和 背景信號(hào)變化圖。 圖4是禽流感病毒M、 HA基因擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。 圖5是禽流感病毒H5M基因的焦測(cè)序檢測(cè)結(jié)果圖。 圖6是禽流感病毒H9M基因的焦測(cè)序檢測(cè)結(jié)果圖。 圖7是禽流感病毒H5HA基因的焦測(cè)序檢測(cè)結(jié)果圖。 圖8是禽流感病毒H9HA基因的焦測(cè)序檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述
實(shí)施例1 :高靈敏度的焦測(cè)序反應(yīng)液配制
l.ATP硫酸化酶濃度的優(yōu)化 已知APS與ATP硫酸化酶形成酶底物復(fù)合體的反應(yīng)的米氏常數(shù)Km = 0. 56 y mol/ L，為了達(dá)到最大反應(yīng)速度，且過(guò)量的底物又不至于抑制酶活性，底物濃度需為Km值的10 倍，因此本實(shí)驗(yàn)中固定APS濃度為5iimol/L。焦測(cè)序反應(yīng)液中的其他組分分別為0. lmol/ L Tris-HAc(pH 7.7)，2,1/L EDTA， 10,1/L Mg(Ac)2，0.1 % BSA， lmmol/LDTT，0. 4g/L PVP，0.4,1/L D-luciferin，5iimol/L APS， 18U/ml Klenow， 1. 6U/ml apyrase， 29. 2mg/ L luciferase。平行配制6份反應(yīng)液，在每份100 y L測(cè)序反應(yīng)液中分別加入0. 1、0. 2、 0.5、1、2、5iiL的ATP硫酸化酶(Sigma，20U/ml，13. 3iimol/L)，即ATP硫酸化酶濃度從 0. 0133iimol/L逐漸增大到0. 665 y mol/L，用該系列反應(yīng)液分別對(duì)50fmol DNA單鏈進(jìn)行檢 測(cè)，結(jié)果如圖1所示，背景信號(hào)隨著ATP硫酸化酶濃度增加而急劇下降，并且信號(hào)強(qiáng)度略有 增加。以ATP硫酸化酶的一系列濃度與測(cè)序信號(hào)和背景信號(hào)分別作圖，見(jiàn)圖2，曲線A為ATP 硫酸化酶的濃度與測(cè)序信號(hào)的關(guān)系曲線，B為ATP硫酸化酶的濃度與背景信號(hào)的關(guān)系曲線。
結(jié)果顯示當(dāng)ATP硫酸化酶的濃度超過(guò)0. 0665 y mol/L后，測(cè)序信號(hào)與ATP硫酸化 酶濃度無(wú)關(guān)；當(dāng)ATP硫酸化酶濃度大于0. 0133 y mol/L小于0. 266 y mol/L時(shí)，背景信號(hào)隨 著ATP硫酸化酶濃度增加顯著降低，而當(dāng)ATP硫酸化酶濃度大于0. 266 y mol/L后，背景信 號(hào)降低幅度明顯減小，直至ATP硫酸化酶濃度為0. 665 mol/L時(shí)，背景信號(hào)極低接近于零。
由此可見(jiàn)，在APS量一定的條件下，增加ATP硫酸化酶的濃度至0. 665 ii mol/L (即 lOU/mL)時(shí)，因其活性濃度達(dá)到5. 32 y mol/L，大于反應(yīng)液中APS濃度，因此可在很大程度上 限制APS與熒光素酶的結(jié)合，從而大大降低焦測(cè)序背景信號(hào)。
2.熒光素酶濃度的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)分別比較低濃度與高濃度的ATP硫酸化酶條件下，熒光素酶濃度增大后對(duì) 檢測(cè)靈敏度的影響。焦測(cè)序反應(yīng)液中其他各組分濃度不變，a、b兩組實(shí)驗(yàn)中ATP硫酸化酶濃 度分別為0. 0133 ii mol/L與0. 665 y mol/L，逐步增大熒光素酶量，在每100 y L的測(cè)序反應(yīng) 液中分別加入熒光素酶(Promega， 14. 6mg/ml，5. 662GLU/ii L) 0. 1、0. 2、0. 5U、2ii L，依次對(duì) 應(yīng)為0. 5662GLU、1. 1324GLU、2. 831GLU、5. 662GLU、11. 324GLU，即反應(yīng)液中熒光素酶濃度變 化范圍為14. 6 292mg/L。用上述反應(yīng)液對(duì)50fmol DNA單鏈進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分別如圖3a、 b所示。分別將a、b兩組實(shí)驗(yàn)中的各背景信號(hào)(BG)以及測(cè)序信號(hào)加上背景信號(hào)(SIG+BG) 繪制線性圖，如圖3c所示，(SIG+BG) 1和BG1分別表示圖3a中"測(cè)序信號(hào)+背景信號(hào)"和"背景信號(hào)"，(SIG+BG) 2和BG2分別表示圖3b中"測(cè)序信號(hào)+背景信號(hào)"和"背景信號(hào)"。由 圖可見(jiàn)，當(dāng)測(cè)序反應(yīng)液中ATP硫酸化酶濃度較低時(shí)，隨著熒光素酶濃度增大，背景信號(hào)同時(shí) 與測(cè)序信號(hào)以相近的比例升高，因此很高的測(cè)定值(SIG+BG)限制了檢測(cè)靈敏度的進(jìn)一步 提高；而當(dāng)測(cè)序反應(yīng)液中ATP硫酸化酶濃度較高時(shí)，測(cè)序信號(hào)隨熒光素酶濃度增大而大幅 增高，且背景信號(hào)一直控制在很低的水平，不干擾DNA互補(bǔ)鏈合成所產(chǎn)生的光信號(hào)檢測(cè)，從 而提高了焦測(cè)序的檢測(cè)靈敏度。 實(shí)施例2 :焦測(cè)序法對(duì)禽流感病毒進(jìn)行分型
l.cDNA樣本 —株H5N1型禽流感病毒cDNA樣本由江蘇省疾病預(yù)防控制中心提供；3株H9N2型 禽流感病毒cDNA樣本(A/HeNan/2/04， A/HeNan/3/04和A/HeNan/5/04)由北京農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī) 學(xué)部提供。 2.基因特異性PCR擴(kuò)增 采用基因特異性PCR分別擴(kuò)增禽流感病毒H5和H9亞型的M基因和HA基因。100ii L PCR反應(yīng)體系中含有引物各O. 2iimol/L(見(jiàn)表l)， dNTP 0. 5mmol/L， MgCl2 3. Ommol/L，lX 緩沖液，2. 5U Taq DNA聚合酶以及100 500ng cDNA模板。熱循環(huán)參數(shù)為94。C預(yù)變性 3min ;然后以94。C變性10s，60。C (M基因)或者55。C (HA基因)退火20s， 72。C延伸40s， 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸7min使反應(yīng)完全。反應(yīng)完成后，取反應(yīng)產(chǎn)物2 y L在2. 0% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(1XTAE電泳緩沖液，電壓IOOV，恒壓電15min)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝 電泳圖譜。 表1用于基因特異性PCR擴(kuò)增的引物序列(SEQ ID NO. 1 5)
頓基因引物序列(5'—卩)產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp〉
Sequence (53 )Product size (tp)
H3' H9MMFBbin"GTGCCCAGTG\GCQ\GG\C300
MRAGTTGCCATCTGTCTGT(HG
H5HAH5FB iDtJQ-TATGCATACAAAATTGTCAAG259
HRACCTGC1ATAGCTCCAAATAG
H9HAH9F233 3.焦測(cè)序用單鏈的制備 (1)取lOii L鏈親和素包被的磁珠于PCR反應(yīng)管中，用磁鐵吸棄上清液，加100 ii L 洗滌緩沖液洗2遍；(2)將磁珠懸浮于90 ii L洗滌緩沖液中，然后加入90 ii L PCR產(chǎn)物，在 磁珠結(jié)合儀中于37t:反應(yīng)lh，反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)輕輕振搖PCR管使磁珠始終處于懸浮狀態(tài)； (3)用磁鐵固定磁珠，吸棄上清液；用洗滌磁珠2 3遍，每次加入180 ii L H20 ;加入 0. lmol/LNaOH溶液20 y L，混勻，室溫放置10min使之變性；吸出上清液置于另一個(gè)PCR反 應(yīng)管中。固相磁珠再用10 y L 0. lmol/L NaOH洗1遍，合并上清液；(4)用100 y L洗滌緩 沖液洗滌固相磁珠2遍；然后用100 ii L IX退火緩沖液洗1遍；再將固相磁珠溶于20 ii L IX退火緩沖液中，加入2ii L 10iimol/L測(cè)序引物5'-AGT TGC CATCTG TCT GTG AG-3，進(jìn) 行退火，退火條件為93°C 30s;55°C 3min。 4。C保存?zhèn)溆谩?
4.焦測(cè)序反應(yīng) 按照本發(fā)明的焦測(cè)序反應(yīng)液的組成配制如下0. lmol/L Tris-HAc(pH 7.7)， 2mmol/L EDTA，10mmol/L Mg(Ac)2，0. 1 % BSA，lmmol/L DTT，0.4g/L PVP，0.4mmo1/
7LD_luciferin，5 li mol/L APS，18U/ml klenow，1.6U/ml apyrase，292mg/L luciferase， 10U/mLATP sulfurylase。依次加入dCTP、 dTTP、 dGTP和dATP a S，對(duì)各個(gè)與引物退火后的 樣本單鏈模板進(jìn)行序列測(cè)定。
5.結(jié)果 用MF/MR、H5F/HR、H9F/HR這3對(duì)引物分別擴(kuò)增人基因組DNA樣本、1個(gè)H5N1型病 毒樣本和3個(gè)H9N2型病毒樣本，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示A表示M基 因擴(kuò)增結(jié)果；B表示H5HA基因擴(kuò)增結(jié)果；C表示H9HA基因擴(kuò)增結(jié)果。泳道l為空白；泳道 2為人基因組DNA ;泳道3為H5N1病毒樣本；泳道4 6為H9N2病毒樣本。結(jié)果表明MF/ MR能特異性的擴(kuò)增出禽流感病毒的M基因，據(jù)此可判斷被測(cè)樣本是否為禽流感病毒樣本， 或者是否含有禽流感病毒；H5F/HR能特異性的擴(kuò)增H5N1型病毒的H5HA基因，據(jù)此可判斷 被測(cè)樣本是否為H5N1型禽流感病毒；H9F/HR能特異性的擴(kuò)增H9N2型病毒的H9HA基因，據(jù) 此可判斷被測(cè)樣本是否為H9N2型禽流感病毒。 但僅靠PCR擴(kuò)增技術(shù)無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)禽流感病毒，所以我們使用焦測(cè)序技術(shù)對(duì)現(xiàn)有 樣本進(jìn)行序列檢測(cè)。結(jié)果顯示其中一個(gè)樣本的序列為"5'-ACC GAT GCT GTG AATCTG CAA TCT GCT CAC AA-3'"(見(jiàn)圖5)，另外3個(gè)樣本的序列均為"5'-ACC TATGGT GTG AAT CAG CAA TCT GCT CAC AA-3'"(見(jiàn)圖6)。為了判斷禽流感病毒及其亞型，將檢測(cè)到的基因序列 與NCBI中已知序列進(jìn)行blast比對(duì)分析。因我們所測(cè)得的基因序列為反向鏈，故將其轉(zhuǎn)換 為正向鏈即分別為"5'-TTG TGA GCA GAT TGC AGATTC ACA GCA TCG GT' (SEQ ID NO. 6)" 禾口"5， -TTG TGA GCA GAT TGC TGA TTCACA CCA TAG GT_3， (SEQ ID NO. 7)"。比對(duì)分析結(jié) 果表明，檢測(cè)到的序列含有禽流感病毒特征的M基因序列，可判斷被測(cè)樣本為禽流感病毒。 焦測(cè)序法測(cè)得其中一個(gè)樣本的裂解位點(diǎn)附近堿基序列為"5'-TCC TCT TTT TCT TCT TCT TTC TCT T-3'"(見(jiàn)圖7)，轉(zhuǎn)換為正向鏈即為"5' -AAG AGA AAG AAG AAG AAA AAG AGG A-3， (SEQID NO. 8) "，blast比對(duì)分析結(jié)果表明該樣本為H5亞型；使用軟件BioXM 2. 2將該 序列翻譯成氨基酸序列為"RERRRKRG" (SEQ ID NO. 9)，根據(jù)OIE推出的新禽流感病毒致病 力鑒定標(biāo)準(zhǔn)，判斷該樣本具有潛在高致病力。焦測(cè)序法測(cè)得另外3個(gè)樣本的裂解位點(diǎn)附近 堿基序列為"5' -TCC TCT ACT TGA TCT AGC AGG CAC ATT-3'"(見(jiàn)圖8)，轉(zhuǎn)換為正向鏈即 為"5' -AAT GTG CCT GCT AGA TCA AGT AGA GGA-3' (SEQ IDNO. 10) "， blast比對(duì)分析表 明這些樣本為H9亞型；將該序列翻譯成氨基酸序列為"NVPARSSRG" (SEQ ID NO. 11)，根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)判斷這些樣本具有較低的致病力。同時(shí)用Sanger法進(jìn)行了對(duì)比測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與焦測(cè) 序法完全一致。
序列表 〈110〉華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所 〈120〉 一種高靈敏度焦測(cè)序反應(yīng)液及其配制方法 〈160〉 11 〈210>1 〈211>19 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉:0068] 〈223〉禽流感病毒H5和H9亞型M基因的正向引物
:0069] 〈400〉 1
:0070] gtgcccagtg agcgaggac 19
:0071] 〈210>2
:0072] 〈211>20
:0073] 〈212>DNA
:0074] 〈213〉人工序列
:0075] 〈220〉
:0076] 〈223>禽流感病毒H5和H9亞型M基因的反向引物
:0077] 〈400>2
:0078] agttgccatc tgtctgtgag 20
:0079] 〈210>3
:0080] 〈211>21
:0081] 〈212>DNA
:0082] 〈213〉人工序列
:0083] 〈220〉
:0084] 〈223〉禽流感病毒H5亞型HA基因的正向引物
:0085] 〈400>3
:0086] tatgcataca aaattgtcaa g 21
:0087] 〈210>4
:0088] 〈211>21
:0089] 〈212>DNA
:0090] 〈213〉人工序列
:0091] 〈220〉
:0092] 〈223>禽流感病毒H5和H9亞型HA基因的反向引物
:0093] 〈400>4
:0094] acctgctata gctccaaata g 21
:0095] 〈210>5
:0096] 〈211>21
:0097] 〈212>DNA
:0098] 〈213〉人工序列
:0099] 〈220〉
:0100] 〈223>禽流感病毒H9亞型HA基因的正向引物
:0101] <400>5
:0102] ttcaggagag agccacggaa g 21
:0103] 〈210>6
:0104] 〈211>32
:0105] 〈212>DNA
:0106] 〈213〉天然序列，來(lái)源于禽流感病毒H5亞型M基因
9
〈220〉 〈223〉 〈400>6 ttgtgagcag attgcagatt cacagcatcg gt 32 [O川]〈210>7 〈211>32 〈212>DNA 〈213〉天然序列，來(lái)源于禽流感病毒H9亞型M基因 〈220〉 〈223〉 〈400>7 ttgtgagcag attgctgatt cacaccatag gt 32 〈210>8 〈211>25 〈212>DNA 〈213〉天然序列，來(lái)源于禽流感病毒H5亞型HA基因 〈220〉 〈223〉 〈400>6 a 3ga g朋3ga 3ga 3ga 3朋3ga gga 25 Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly 1 5 〈210>9 〈211>8 〈212>PRT 〈213〉天然序列，來(lái)源于禽流感病毒H5亞型 〈220〉 〈223〉 〈400>9 Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly 1 5 〈210>10 〈211>27 〈212>DNA 〈213〉天然序列，來(lái)源于禽流感病毒H9亞型HA基因 〈220〉 〈223〉 〈400>10 aat gtg cct get aga tea agt aga gga 27
Asn Val Pro Ala Arg Ser Ser Arg Gly 1 5 〈210>11 〈211>9 〈212>PRT 〈213〉天然序列，來(lái)源于禽流感病毒H9亞型 〈220〉 〈223〉 〈400〉 11 Asn Val Pro Ala Arg Ser Ser Arg Gly 1 權(quán)利要求
一種焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其特征在于通過(guò)提高傳統(tǒng)的APS-ATP硫酸化酶焦測(cè)序反應(yīng)液中ATP硫酸化酶的濃度來(lái)降低焦測(cè)序反應(yīng)的背景信號(hào)，從而提高焦測(cè)序反應(yīng)的靈敏度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其特征在于在提高ATP硫酸化酶 濃度的基礎(chǔ)上，通過(guò)將熒光素酶濃度提高2 30倍來(lái)進(jìn)一步提高焦測(cè)序反應(yīng)的靈敏度。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其特征在于ATP硫酸化酶的濃度 需提高至其活性濃度大于反應(yīng)液中的APS濃度；ATP硫酸化酶的活性濃度是指八倍于反應(yīng) 液中的ATP硫酸化酶的濃度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其特征在于反應(yīng)液中APS濃度為 5 li mol/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其特征在于反應(yīng)液中ATP硫酸化 酶的濃度為10U/mL(即0. 665 y mol/L)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的配制方法制備的焦測(cè)序反應(yīng)液，其特征在于該反應(yīng)液的組 成為:0. lmol/L Tris-HAc(pH 7.7)，2,1/L EDTA， lOmmol/L Mg Ac)2，0. 1 % BSA， lmmol/L DTT， 5 ii mol/LAPS， 0. 4g/L PVP， 0. 4mmol/L D_熒光素，18U/ml核酸聚合酶，1. 6U/ml三磷酸 腺苷雙磷酸酶，14. 6 292mg/L熒光素酶，10U/mLATP硫酸化酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，其特征在于傳統(tǒng)的APS-ATP硫酸 化酶焦測(cè)序反應(yīng)液的組成0. lmol/L Tris-HAc(pH7. 7) ，2mmol/L EDTA， lOmmol/LMg(Ac)2， 0. 1%BSA， 1,1/L DTT，5踐ol/L APS，0.4g/L PVP， 0. 4mmol/L D-熒光素，1 2U/mL三磷 酸腺苷雙磷酸酶，10 100U/mL核酸聚合酶，2 10mg/L熒光素酶，0. 2U/mLATP硫酸化酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高靈敏度焦測(cè)序反應(yīng)液的配制方法，它通過(guò)增加焦測(cè)序反應(yīng)液中的ATP硫酸化酶量來(lái)抑制其底物APS和熒光素酶的反應(yīng)，使得在高濃度熒光素酶條件下，背景信號(hào)能夠控制在很低的水平，而反應(yīng)信號(hào)顯著上升，因此使用與通常相比低一個(gè)數(shù)量級(jí)的幾十fmol量的DNA就可進(jìn)行堿基測(cè)序。因此，對(duì)于來(lái)源稀少的樣本以及擴(kuò)增效率低下的產(chǎn)物能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的短序列測(cè)定，同時(shí)，這一新型的高靈敏反應(yīng)液還可應(yīng)用于以價(jià)格低廉的光敏管陣列為檢測(cè)器的便攜式生物發(fā)光分析儀，從而實(shí)現(xiàn)快速、高效、低成本的DNA分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101724704SQ20091026406
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者吳文娟, 周國(guó)華, 武海萍 申請(qǐng)人:華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所