專利名稱：一種高純度耐熱β-葡聚糖酶的制備方法
技術領域：
一種制備高純度重組耐熱β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法，屬于生化分離工程領 域。
背景技術：
β-1，3_1，4-葡聚糖屬植物細胞壁中的結構性非淀粉多糖，是以混合(1-3)和 (1-4) β -糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于麥類和糠麩中，在大麥整粒 和胚乳中的含量高達4. 0 % 8. 0 %。β -1，3-1，4-葡聚糖主要被3種葡聚糖內切酶分解， 它們是 β -1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、β -1，3-葡聚糖酶(EC 3.2.1. 39)和 β -1，3-1， 4_葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)。另外，葡聚糖外切酶也起一定的作用。其中作用最強的是 β -1，3-1，4-葡聚糖酶(β -1，3-1，4-D-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶，又稱地衣多糖酶，以下簡 稱β-葡聚糖酶)，它分解β-1，3-1，4-葡聚糖中β_1，3鄰接的β_1，4鍵，其水解的主要 產(chǎn)物為三糖(3-0-β-D-纖維二糖-D-葡萄糖)和四糖(3-0-β-D-纖維三糖-D-葡萄糖)。 該酶早期主要應用于啤酒工業(yè)，可降低麥汁粘度，提高麥汁濾速及得率，改善啤酒風味，保 持成品酒穩(wěn)定性。近年來，飼料工業(yè)中發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖是谷物的重要抗營養(yǎng)因子，單胃動物 由于自身不具備合成葡聚糖酶的微生物及分解葡聚糖的酶系，使食糜在腸道中具 有較高的粘度，而阻止蛋白質和脂肪營養(yǎng)的吸收，降低飼料的轉化率。在飼料中添加葡 聚糖酶，可以大大降低β “葡聚糖粘度，從而改善麥類營養(yǎng)價值，同時減少排泄物對環(huán)境的 污染。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種能高效表達重組蛋白的酵母，一方面 由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生 長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。目前應用于蛋白質分離純化的方法有很多，如硫酸銨分級沉淀、有機溶劑沉淀、沉 淀凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析和層析聚焦等。它們的原理和適用范圍各不相 同，沉淀法主要用于純化方案的開始階段，層析法則主要用于中后期，其中以離子交換層 析最為常用，占所有蛋白質純化方案的75%，這和它具有的許多優(yōu)點分不開分辨率高、交 換容量高，有利于放大分離規(guī)模、應用靈活、分離原理明確、操作簡單。常用的離子交換功 能基團類型有陽離子交換劑CM(羧甲基)、S(磺甲基)，陰離子交換劑DEAE(二乙基胺乙 基)、Q(季胺基)等。本發(fā)明以本研究室構建的高產(chǎn)耐熱性重組Pichia pastoris GS 115-PpICZaA-bgl為出發(fā)菌，對其發(fā)酵并進行分離純化得到電泳純β _1，3_1，4_葡聚糖酶 樣品。主要研究凍融法、酶法和超聲破碎法破壁對酶活力的影響，考察硫酸銨分級沉淀的特 點，最后采用離子交換層析獲得了較純的重組酶，并用SDS-PAGE進行鑒定。重組β-葡聚 糖酶粗酶液經(jīng)過硫酸銨分級沉淀和DEAE-650M離子交換層析，純化倍數(shù)為22. 57倍，回收率 為20. 06%，最終比活力達到17674U/mg。SDS-PAGE鑒定表明純化后的重組β -葡聚糖酶為 一單一條帶，分子量大小約為27kDa。

發(fā)明內容
本發(fā)明基于蛋白質鹽析技術、蛋白質離子交換技術以及電泳技術，建立了簡易便 捷的高純度耐熱β-1，3-1，4-葡聚糖酶的制備工藝。1.將重組畢赤酵母劃線于YPD平板上進行活化，28°C培養(yǎng)2d，至長出單菌落后接 種于IOmL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h，OD6tltl達2 6，3000r/min 離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1-2次。2.將菌體用BMMY誘導培養(yǎng)基稀釋至0D_ = 1，用4層紗布代替棉花塞，于30°C， 200r/min搖床培養(yǎng)。每天補加甲醇至終濃度為0. 5% (V/V)，誘導3d后每隔24h從BMMY培 養(yǎng)基中取出ImL菌液于1.5mL離心管中，然后補加ImL BMMY于三角瓶中。3.將一定量發(fā)酵液置于_20°C冷凍過夜，37°C解凍，離心去除菌體，獲取粗酶液A。4.量取一定量的粗酶液A，加入20%的硫酸銨，靜置0. 5h，4°C，8000r/min離心 20min,取上清至另一離心管中，增加硫酸銨的濃度至40 %，靜置0. 5h，4 °C，IOOOOg離心 30min，棄上清，加入pH. 6. 5磷酸緩沖液復溶沉淀，得到粗酶液B。5.將粗酶液B裝入處理好的透析袋中，置于去離子水中4°C下過夜，中間更換去離 子水數(shù)次。6.將透析后的酶液上樣DEAE-650M離子交換柱(2. 6 X 40cm，0. 02mol/L pH6. 5NaH2P04-Na2HP0^1沖液預平衡，柱體積 IOOmL)，上樣量 50mL，依次用含 0、0. 1,0. 2mol/ L NaCl 的 0. 02mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液(pH 6. 5)洗脫，2mL/min 計時收集。7.取離子交換后精制酶液進行SDS-PAGE分析，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為 12%，電泳結束后用考馬斯亮藍R-250染色，獲得其純度數(shù)據(jù)，經(jīng)相關軟件分析，所獲酶樣 品β-1，3-1，4-葡聚糖酶純度達到90%以上。8.所獲高純度β-1，3-1，4-葡聚糖酶4°C冷藏。重組β -葡聚糖酶粗酶液經(jīng)過硫 酸銨分級沉淀和DEAE-650M離子交換層析，純化倍數(shù)為22. 57倍，回收率為20. 06 %，最終比 活力達到17674U/mg。SDS-PAGE鑒定表明純化后的重組β -葡聚糖酶為一單一條帶，分子 量大小約為27kDa。生物材料樣品保藏一株高產(chǎn)耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母，該菌株為巴斯德畢赤酵母，命名為 Pichia pastoris GS115_pPICZ α A_bgl，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 3520，保藏日期為2009年12月17日。


圖1硫酸銨分級沉淀圖。圖2DEAE-650M離子交換層析圖。圖3蛋白樣品SDS-PAGE電泳圖。
具體實施例方式實例1基于本發(fā)明的制備步驟，經(jīng)過硫酸銨沉淀以及離子交換層析對基因工程菌Pichiapastoris GS115_pPICZ α Α-bgl發(fā)酵液進行分離純化得到電泳純β _1，3-1，4_葡聚糖酶樣 品。純化倍數(shù)為22. 57倍，回收率為20. 06%，最終比活力達到17674U/mg。SDS-PAGE鑒定 表明純化后的重組β-葡聚糖酶為一單一條帶，分子量大小約為27kDa，經(jīng)相關軟件計算， 蛋白樣品中目標β -1,3-1,4-葡聚糖酶純度達到90%以上。表1重組β -葡聚糖酶純化過程總結
權利要求
一種制備高純度耐熱β 1，3 1，4 葡聚糖酶的方法，其特征是方法步驟為1.將重組畢赤酵母劃線于YPD平板上進行活化，28℃培養(yǎng)2d，至長出單菌落后接種于10mL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30℃，200r/min搖床培養(yǎng)48h，OD600達2～6，3000r/min離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1～2次。2.將菌體用BMMY誘導培養(yǎng)基稀釋至OD600＝1，用4層紗布代替棉花塞，于30℃，200r/min搖床培養(yǎng)。每天補加甲醇至終濃度為0.5％(V/V)，誘導3d的后每隔24h從BMMY培養(yǎng)基中取出1mL菌液于1.5mL離心管中，然后補加1mLBMMY于三角瓶中。3.將一定量發(fā)酵液置于 20℃冷凍過夜，37℃解凍，離心去除菌體，獲取粗酶液A。4.量取一定量的粗酶液A，加入20％的硫酸銨，靜置0.5h，4℃，8000r/min離心20min，取上清至另一離心管中，增加硫酸銨的濃度至40％，靜置0.5h，4℃，10000g離心30min，棄上清，加入pH 6.5磷酸緩沖液復溶沉淀，得到粗酶液B。5.將粗酶液B裝入處理好的透析袋中，置于去離子水中4℃下過夜，中間更換去離子水數(shù)次。6.將透析后的酶液上樣DEAE 650M離子交換柱(2.6×40cm，0.02mol/L pH6.5NaH2PO4 Na2HPO4緩沖液預平衡，柱體積100mL)，上樣量50mL，依次用含0、0.1、0.2mol/L NaCl的0.02mol/L NaH2PO4 Na2HPO4緩沖液(pH6.5)洗脫，2mL/min計時收集。7.取離子交換后精制酶液進行SDS PAGE分析，濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％，電泳結束后用考馬斯亮藍R 250染色，獲得其純度數(shù)據(jù)，經(jīng)相關軟件分析，所獲酶樣品β 1，3 1，4 葡聚糖酶純度達到90％以上。8.所獲高純度β 1，3 1，4 葡聚糖酶4℃冷藏。
2.將菌體用BMMY誘導培養(yǎng)基稀釋至0D_= 1，用4層紗布代替棉花塞，于30°C，200r/ min搖床培養(yǎng)。每天補加甲醇至終濃度為0. 5% (V/V)，誘導3d的后每隔24h從BMMY培養(yǎng) 基中取出ImL菌液于1. 5mL離心管中，然后補加ImLBMMY于三角瓶中。
3.將一定量發(fā)酵液置于-20°C冷凍過夜，37°C解凍，離心去除菌體，獲取粗酶液A。
4.量取一定量的粗酶液A，加入20%的硫酸銨，靜置0. 5h，4°C，8000r/min離心20min， 取上清至另一離心管中，增加硫酸銨的濃度至40%，靜置0. 5h，4°C，IOOOOg離心30min，棄 上清，加入pH 6. 5磷酸緩沖液復溶沉淀，得到粗酶液B。
5.將粗酶液B裝入處理好的透析袋中，置于去離子水中4°C下過夜，中間更換去離子水 數(shù)次。
6.將透析后的酶液上樣DEAE-650M離子交換柱(2.6 X 40cm，0. 02mol/L pH6. 5NaH2P04-Na2HP0^1沖液預平衡，柱體積 IOOmL)，上樣量 50mL，依次用含 0、0. 1,0. 2mol/ L NaCl 的 0. 02mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液(ρΗ6· 5)洗脫，2mL/min 計時收集。
7.取離子交換后精制酶液進行SDS-PAGE分析，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12 %， 電泳結束后用考馬斯亮藍R-250染色，獲得其純度數(shù)據(jù)，經(jīng)相關軟件分析，所獲酶樣品 β -1,3-1,4-葡聚糖酶純度達到90%以上。
8.所獲高純度β-1，3-1，4-葡聚糖酶4°C冷藏。
全文摘要
本發(fā)明以本研究室構建的高產(chǎn)耐熱性重組Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl為出發(fā)菌，對其發(fā)酵液進行提取并分離純化得到電泳純β-1，3-1，4-葡聚糖酶樣品。主要研究凍融法、酶法和超聲破碎法破壁對酶活力的影響，考察硫酸銨分級沉淀和乙醇分級沉淀的特點，最后采用離子交換層析獲得了較純的重組酶，并用SDS-PAGE進行鑒定。重組β-葡聚糖酶粗酶液經(jīng)過硫酸銨分級沉淀和DEAE-650M離子交換層析，純化倍數(shù)為22.57倍，回收率為20.06％，最終比活力達到17674U/mg。SDS-PAGE鑒定表明純化后的重組β-葡聚糖酶為一單一條帶，分子量大小約為27kDa。
文檔編號C12N9/24GK101921737SQ20091026484
公開日2010年12月22日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權日2009年12月24日
發(fā)明者劉春鳳, 李崎, 李永仙, 秦久福, 鄭飛云, 顧國賢 申請人:江南大學