專利名稱：棉花纖維特異表達(dá)的水孔蛋白家族基因GhPIP2;6的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉花基因，具體是水孔蛋白(Aquaporin，AQP)家族的棉花新基因 GhPIP2 ；6的cDNA和基因組DNA全長序列的克隆鑒定及其編碼蛋白的活性檢測；并研究它 們在棉纖維發(fā)育過程中的表達(dá)及功能，進(jìn)而應(yīng)用于棉纖維品質(zhì)改良。
背景技術(shù)：
水是植物所有活細(xì)胞的重要組成成分，對水分吸收和運(yùn)輸?shù)膰?yán)格調(diào)控是植物生長 和發(fā)育的基礎(chǔ)。在植物體內(nèi)水分的運(yùn)輸有3種途徑質(zhì)外體途徑、共質(zhì)體途徑和跨膜運(yùn)輸 途徑?？缒み\(yùn)輸途徑是指水分跨過液泡膜和質(zhì)膜的運(yùn)輸。水分的跨膜運(yùn)輸又可以分為兩種 方式，1)通過磷脂雙分子層的自由擴(kuò)散運(yùn)輸；2)通過膜上的通道蛋白進(jìn)行的被動(dòng)運(yùn)輸。生 物膜上運(yùn)輸水分的通道蛋白統(tǒng)稱為水孔蛋白(Aquaporin，AQP)。第一個(gè)水孔蛋白AQPl是 Agre研究小組在1988年從人紅細(xì)胞質(zhì)膜上分離出來的，隨后，在植物、動(dòng)物、酵母和細(xì)菌中 都發(fā)現(xiàn)有許多類似的運(yùn)輸水分的通道蛋白。水孔蛋白與1984年Gorin等從牛晶體纖維細(xì)胞膜中分離到的MIP蛋白(Major intrinsicprotein)具有很高的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性，因此將它們同歸于MIP家族， 分子質(zhì)量在26 34kDa之間。水孔蛋白具有MIP家族結(jié)構(gòu)的典型特征，序列親水性分析 表明，水孔蛋白具有由5個(gè)短環(huán)(IoopA IoopE)相連的6個(gè)跨膜α -螺旋(Hl Η6)及 N末端和C末端。B環(huán)、D環(huán)、N末端和C末端始終面向細(xì)胞質(zhì)這一側(cè)，而A環(huán)、C環(huán)和E環(huán) 則位于另一側(cè)。相對而言，水孔蛋白的N末端和C末端具有較大的可變性，而絕大多數(shù)水 孔蛋白的B環(huán)和E環(huán)上都存在一個(gè)高度保守的氨基酸序列天冬酰胺_脯氨酸_丙氨酸 (aspargine-proline-alanine, NPA)，被稱之為NPA基序，這兩個(gè)NPA基序直接參與了水通 道的形成。對于水孔蛋白的二級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，人們提出了幾種假設(shè)，其中被普遍接受并被證實(shí) 的是Jung等提出的“水漏模型”(Hourglass model)。在此模型中，B環(huán)E環(huán)各自形成半個(gè) 跨膜螺旋(HB和HE)，分別從膜的兩側(cè)折向膜內(nèi)形成第七個(gè)跨膜螺旋，2個(gè)NPA基序位于該 螺旋的中心，與其它6個(gè)跨膜螺旋共同作用，形成一個(gè)可雙向運(yùn)輸水分子的孔道。植物中水孔蛋白數(shù)目較多。例如，擬南芥中有35個(gè)，玉米和水稻中各有33個(gè) 水孔蛋白。根據(jù)其序列同源性，植物水孔蛋白可以分為4類質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(Plasma membraneIntrinsic Proteins，PIP)，液泡月莫內(nèi)在蛋白(Tonoplast Intrinsic Proteins, TIP)，類 N0D26 內(nèi)在蛋白(Nodul in26-l ike Intrinsic Proteins，NIP)，小的堿性內(nèi)在蛋白 (Small basic IntrinsicProteins, SIP) 0其中，質(zhì)膜內(nèi)在蛋白根據(jù)其序列同源性和活性 差異，又可分為PIPl和PIP2兩個(gè)亞類，在爪蟾卵母細(xì)胞或酵母細(xì)胞中表達(dá)，大多數(shù)PIPl蛋 白的活性較低或沒有活性，而PIP2蛋白的活性則明顯高于PIPl蛋白。已有研究表明，4類 水孔蛋白均具有轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的功能，同時(shí)還能轉(zhuǎn)運(yùn)一些小的中性分子，如C02、H202、尿素、硼 酸、硅酸等。它們參與了一系列重要的生理過程(例如，水分的吸收和運(yùn)輸、種子的成熟與 萌發(fā)、花粉的開裂和萌發(fā)、細(xì)胞伸長、逆境應(yīng)答等)，在植物生長發(fā)育繁殖及逆境應(yīng)答等過程 中都起著非常重要的作用。目前在棉花中僅報(bào)道了 8個(gè)水孔蛋白基因，大多在根中優(yōu)勢表達(dá)，參與水分的吸收和植物逆境應(yīng)答反應(yīng)，其它在胚珠中特異表達(dá)(GhAQPl)和纖維中優(yōu)勢 表達(dá)(GhPIPl-2和Gh γ TIP1)，但其功能和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)在棉纖維中特異表達(dá)的水孔蛋白家族新基因GhPIP2 ； 6，分析其蛋白活性及其在酵母細(xì)胞中表達(dá)對宿主細(xì)胞形態(tài)的影響，以研究其功能，為解析 纖維細(xì)胞伸長的分子機(jī)制，改良棉纖維的品質(zhì)提供新的理論基礎(chǔ)。我們構(gòu)建了棉花纖維的cDNA文庫，從文庫中隨機(jī)挑出4000個(gè)cDNA克隆，經(jīng)測序 和比較分析發(fā)現(xiàn)其中一些克隆含有水孔蛋白基因(GhPIP)的部分序列。用a-P32PP-dCTP標(biāo) 記GhPIP cDNA 3，-末端片段(0. 4kb)，以此為探針，篩選纖維cDNA文庫，得到100多個(gè)陽 性克隆，經(jīng)測序證實(shí)其中一些克隆含有GhPIP2 ；6基因的全長cDNA序列。GhPIP2 ；6基因的cDNA全長為1012bp，其開放閱讀框?yàn)?37bp，編碼278個(gè)氨基酸， 蛋白分子量約為29. BkDa0經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，GhPIP2 ；6蛋白具有水孔蛋白的典型結(jié)構(gòu)和保守序 列，含有5個(gè)短環(huán)連接的6個(gè)α-跨膜螺旋和兩個(gè)高度保守的“NPA”基序(圖1)。與已知 的擬南芥和棉花水孔蛋白序列相比較，GhPIP2 ；6與PIP2類蛋白的同源性較高(序列相似 性76 94% )，與PIPl類蛋白的同源性次之，而與其它種類的水孔蛋白序列相似性較低。為獲取GhPIP2 ；6基因的基因組DNA全長序列，本申請人在其開放閱讀框(ORF)兩 端設(shè)計(jì)一對引物(見表1)，以棉花基因組DNA為模板，在94°C -5min, 1個(gè)循環(huán)；94°C -lmin, 58°C -lmin,72°C -2min，32個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)條件下得到了一個(gè)IOlObp的產(chǎn)物。測序結(jié)果 顯示該DNA序列為GhPIP2 ；6基因的DNA全長序列，與其cDNA序列比較分析發(fā)現(xiàn)該基因含 有兩個(gè)內(nèi)含子，長度為89和84bp，第一個(gè)內(nèi)含子插入在編碼Gly94密碼子內(nèi)，第二個(gè)內(nèi)含子 插入在編碼His239與Trp240的密碼子之間(圖2)。為驗(yàn)證GhPIP2 ；6基因編碼的蛋白是否具有水通道活性，我們利用爪蟾卵母細(xì)胞 系統(tǒng)進(jìn)行檢測。先在體外轉(zhuǎn)錄合成GhPIP基因帶帽結(jié)構(gòu)的cRNA并定量，然后按每個(gè)細(xì)胞 50ngcRNA進(jìn)行顯微注射。注射后的卵母細(xì)胞在孵育液中靜置培養(yǎng)2 3天，以使GhPIP2 蛋白在細(xì)胞內(nèi)充分合成并整合到細(xì)胞膜上。檢測蛋白活性時(shí)，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至高滲溶液 1/5ND96溶液中后，拍照記錄細(xì)胞體積的變化。卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入1/5ND96溶液后，因細(xì)胞內(nèi) 外的滲透差，水分進(jìn)入細(xì)胞而使其膨脹，體積變大。根據(jù)細(xì)胞體積變化的速率可計(jì)算細(xì)胞 膜的水導(dǎo)度，也即是GhPIP2蛋白的活性。如圖3A所示，注射GhPIP2 cRNA的細(xì)胞快速膨 脹，體積明顯增大；而注射水的對照細(xì)胞大小基本沒有變化。表達(dá)GhPIP2蛋白的卵母細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到1/5 ND96溶液后3分鐘內(nèi)細(xì)胞半徑變化如表2所示，對照細(xì)胞的體積變化很小，半 徑差僅約5. 4 μ m，而表達(dá)GhPIP2蛋白的卵母細(xì)胞膨脹明顯，在3min內(nèi)即使細(xì)胞半徑增 加了 21. 7 22. 8 μ m。細(xì)胞膨脹速率不同，說明細(xì)胞膜對水的透性存在差異，即水導(dǎo)度不 同。對照細(xì)胞的水導(dǎo)度Pf = 9. 82 士 5. 27μπιΛ(η = 30)，而表達(dá)GhPIP2 ；6的細(xì)胞水導(dǎo)度為 41. 03 士 8. 07 μ m/s (η = 30)，與對照相比，細(xì)胞水導(dǎo)度增加了約4. 2倍(圖3Β)。用水孔蛋 白活性抑制劑HgCl2 (50 μ Μ)預(yù)處理上述卵母細(xì)胞0. 5h，則細(xì)胞膨脹速度明顯下降(表2)， GhPIP2 ；6的水通道活性顯著降低(圖3B)。以上結(jié)果說明GhPIP2 ；6蛋白具有運(yùn)輸水分的 功能，能提高細(xì)胞膜對水的透性。為研究GhPIP2 ；6基因在棉花各組織/器官中的表達(dá)模式，用改良的CTAB/酸酚法提取棉花組織/器官的總RNA，分別做實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Northern雜交，結(jié)果如圖4A和 4B所示。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示GhPIP2 ；6基因在纖維中特異表達(dá)，且Northern雜交結(jié)果顯 示GhPIP2;6在6 12 DPA纖維中的表達(dá)量有明顯差異。因此，我們又采集并提取了 3 20 DPA的纖維的總RNA，對這個(gè)基因在纖維發(fā)育過程中的表達(dá)情況作進(jìn)一步詳細(xì)的分析，實(shí) 時(shí)定量RT-PCR結(jié)果如圖4C所示。GhPIP2 ；6在纖維發(fā)育過程中的表達(dá)模式基本一致，其轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物主要集中在3 12 DPA纖維中，在9 DPA纖維中表達(dá)量最高，在15 20 DPA纖維 中，表達(dá)量急劇下降到很低的水平。GhPIP2 ；6mRNA在伸長期的棉纖維中大量積累，表明這些基因產(chǎn)物在纖維細(xì)胞伸 長過程中可能起重要作用。為進(jìn)一步研究GhPIP2基因(蛋白)的功能，GhPIP2;6基因的 編碼序列(ORF)被重組到酵母表達(dá)載體PREP-5N質(zhì)粒中，隨后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)細(xì)胞。在 pREP 質(zhì)粒中，GhPIP2 ；6 的表達(dá)受到 nmt-Ι 啟動(dòng) 子的調(diào)控。nmt-Ι啟動(dòng)子的活性受外源VB1的抑制，即當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏VB1 (誘導(dǎo)培養(yǎng)基) 時(shí)，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，而當(dāng)培養(yǎng)基中存在VB1時(shí)(非誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，啟動(dòng)子下游基因不表 達(dá)。對包含pREP-GhPIP2 ；6質(zhì)粒的酵母在誘導(dǎo)或非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后的細(xì)胞形 態(tài)進(jìn)行觀察分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和表3所示。對照酵母細(xì)胞(包含PREP-5N空質(zhì)粒)無 論在非誘導(dǎo)還是在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，形態(tài)基本沒有差異(圖5a和5b)。GhPIP2 ；6轉(zhuǎn)基因酵母 (包含pREP-GhPIP2 ；6質(zhì)粒)在非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中形態(tài)與對照類似(圖5c)，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基 中細(xì)胞長度顯著比在非誘導(dǎo)條件下長得多(圖5d)。從轉(zhuǎn)基因酵母中隨機(jī)選取5個(gè)細(xì)胞系 進(jìn)行培養(yǎng)，測量其在非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)條件下的細(xì)胞長度，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示GhPIP2 ；6轉(zhuǎn)基因 酵母在誘導(dǎo)條件下與在非誘導(dǎo)條件下的細(xì)胞長度有顯著的差異，對照細(xì)胞在兩種條件下長 度沒有明顯的差異(如表3所示)。GhPIP2 ；6的表達(dá)可使細(xì)胞伸長1. 30 1. 47倍。以上 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GhPIP2 ；6基因在裂殖酵母中異源表達(dá)可以顯著改變細(xì)胞的形態(tài)，促使細(xì)胞 縱向伸長。HgCl2是水孔蛋白活性抑制劑，它能阻斷水孔蛋白介導(dǎo)的水分運(yùn)輸。為研究水孔 蛋白是否在纖維發(fā)育過程中起重要作用，本申請人用低濃度的HgCl2 (O 50 μ M)短時(shí)間 (0. 5 2h)處理開花后1天的棉花離體胚珠，再在正常條件下培養(yǎng)10 12天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖 維長度顯著下降，經(jīng)過HgCl2處理的纖維其長度是對照的52. 4 69. 7% (圖6)，這表明水 孔蛋白參與了纖維的發(fā)育尤其是纖維的伸長。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、提供了一個(gè)棉花新基因GhPIP2 ；6的全長cDNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，并 通過非洲爪蟾卵母細(xì)胞系統(tǒng)檢測了蛋白活性，發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因的編碼蛋白具有強(qiáng)的水通道活 性，證明它們屬于水孔蛋白家族。2、提供了 GhPIP2 ；6基因的全長DNA序列，該基因由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組 成。3、GhPIP2 ；6的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在處于伸長期的棉纖維細(xì)胞中大量積累，而且GhPIP2 ；6 基因的表達(dá)能顯著促使酵母細(xì)胞縱向伸長，水孔蛋白活性抑制劑HgCl2能顯著抑制纖維的 伸長，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GhPIP2 ；6參與了棉纖維的發(fā)育，在纖維伸長過程中起重要作用。本發(fā)明通過以下附圖和實(shí)施進(jìn)行進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖l.GhPIP2 ；6蛋白結(jié)構(gòu)分析及與棉花已知PIP蛋白的序列比較。圖中黑色陰影中的字母表示GhPIPl和GhPIP2中可替換的氨基酸殘基，灰色陰影 中的表示GhPIPl與GhPIP2兩類白中的差異氨基酸殘基。6個(gè)方框所在的區(qū)域指六個(gè)跨膜 螺旋(Hl H6)，加粗的字母則表示MIP家族的典型序列。箭頭所指的位置是GhPIP2;6基 因的內(nèi)含子插入的位置。已知棉花PIP蛋白在GenBank內(nèi)的Accession號(hào)碼如下=GhPIPl ； 1 (ABK60194) ；GhPIPl-2(ABR68794) ；GhPIPl ；3 (ABD63904) ；GhPIP2 ； 1 (ABK60195)； GhPIP2 ；2(ABK60195) ；GhPIP2 ;3 (ACB42440) ；GhPIP2 ；4 (ACB42441)。圖2. GhPIP2 ；6的基因結(jié)構(gòu)。黑色方框表示外顯子，線段表示5’ -和3’ -端非編碼區(qū)及內(nèi)含子。線段下的數(shù)字 指內(nèi)含子的大小，而線段上的氨基酸及數(shù)字指內(nèi)含子在基因中插入的位點(diǎn)。ATG，起始密碼 子；TGA和TAA，終止密碼子。圖3. GhPIP2 ；6蛋白活性分析。A、表達(dá)GhPIP2蛋白的爪蟾卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到高滲溶液5分鐘前后體積變化；B、表達(dá)GhPIP2蛋白的卵母細(xì)胞的質(zhì)膜水導(dǎo)度及HgCl2對GhPIP2蛋白活性的抑制。 GhPIP2 ；6 cRNA的爪蟾卵母細(xì)胞在轉(zhuǎn)移到1/5 ND96高滲溶液之前，先轉(zhuǎn)移到含50 μ mol/L HgCl2的孵育液中預(yù)處理30分鐘，再檢測細(xì)胞的水導(dǎo)度?！?*”指經(jīng)過生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，注 射了 GhPIP2 cRNA的卵母細(xì)胞的水導(dǎo)度與對照有極顯著差異(P值<0.01) ；“++”代表經(jīng)過 HgCl2預(yù)處理的細(xì)胞水導(dǎo)度與未經(jīng)處理的細(xì)胞水導(dǎo)度有極顯著差異(P值< 0. 01)。圖4. GhPIP2 ；6基因的表達(dá)分析。A、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析GhPIP2 ；6基因在棉花不同組織/器官中的差異表達(dá) (R，根；C,子葉；L,葉片；H,下胚軸；P,花瓣；A,花藥；0，胚珠；F,纖維)；B、Northern雜交分析GhPIP2 ；6基因在棉花各組織/器官中的差異表達(dá)(R，根； C，子葉；L，葉；H，下胚軸；P，花瓣；A，花藥；0，開花后10天的胚珠；F6 F12，分別指開花后 6，8，10，12 天纖維)；C、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析GhPIP2 ；6基因在纖維發(fā)育過程中的表達(dá)(3f 20f， 指開花后3 20天纖維)。圖5.過量表達(dá)GhPIP2 ；6基因的裂殖酵母細(xì)胞形態(tài)分析。(a和b)在非誘導(dǎo)(a)或誘導(dǎo)(b)培養(yǎng)基上生長的包含pREP5N空質(zhì)粒的對照酵母 細(xì)胞；(c和d)在非誘導(dǎo)(c)或誘導(dǎo)(d)培養(yǎng)基上生長的包含pREP_GhPIP2 ；6質(zhì)粒的酵 母細(xì)胞。圖6. HgCl2顯著抑制棉纖維細(xì)胞伸長，導(dǎo)致纖維長度變短。a、用含有不同濃度的HgCl2 (0 50 μ Μ)的BT培養(yǎng)基處理開花后1天的棉花離體 胚珠0. 5小時(shí)后，再在不含HgCl2的BT培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天后的棉花胚珠；b、用含有50 μ M HgCl2的BT培養(yǎng)基處理開花后1天的棉花離體胚珠不同時(shí)間后 (0 2小時(shí))，再在不含HgCl2的BT培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天后的棉花胚珠；C、經(jīng)過不同濃度的HgCl2 (0 50 μ Μ)處理0. 5小時(shí)后再培養(yǎng)12天的離體胚珠纖 維的長度；
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表3多個(gè)不同轉(zhuǎn)GhPIP2 ；6基因的酵母細(xì)胞系和對照酵母細(xì)胞系的細(xì)胞長度統(tǒng)計(jì) 分析。d、經(jīng)過50 μ M的HgCl2處理不同時(shí)間(0 2小時(shí))后再培養(yǎng)10天的離體胚珠纖 維的長度。表1 GhPIP2 ；6基因RT-PCR引物及GhPIP2 ；6基因全長DNA序列克隆引物 表2表達(dá)GhPIP2蛋白的爪蟾卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到高滲溶液后半徑的變化 (1)棉纖維 cDNA 文庫的構(gòu)建(按 Li XB 等，2002，Molecular characterization of the cottonGhTUBl gene that is preferentially expressed in fiber. Plant Physiol 130 666-674中的方法進(jìn)行)。(2)從棉纖維cDNA文庫中隨機(jī)挑出1000個(gè)cDNA克隆，經(jīng)測序和比較分析發(fā)現(xiàn) 其中一些克隆含有水孔蛋白基因(GhPIP)的部分序列。用α-P32PP-dCTP標(biāo)記GhPIP cDNA 3’ -末端片段(0. 4kb)，以此為探針，篩選纖維cDNA文庫中2X IOP5p克隆，得到十多個(gè)陽性 克隆，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)克隆含有GhPIP2 ；6基因的全長cDNA序列。2、GhPIP2 ；6基因的DNA全長序列的克隆在GhPIP2 ；6基因ORF兩端設(shè)計(jì)一對引物(見表1)，以棉花⑶NA為模板，在94°C _5 分鐘，1個(gè)循環(huán)；94°C -1分鐘，580C -1分鐘，720C _2分鐘，32個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)條件下得到 了一個(gè)約Ikb的DNA片段，將該片段插入到PBS-T載體中。利用PBS質(zhì)粒上的T3和T7啟 動(dòng)子對目的DNA片段進(jìn)行測序。再用DNAstar軟件分析所得的序列，與基因cDNA序列進(jìn)行 比較，分析內(nèi)含子的大小和插入位置。3、GhPIP2蛋白活性檢測(1)爪蟾卵母細(xì)胞預(yù)處理低溫麻醉爪蟾后，手術(shù)方式取出適量卵巢的卵頁，并縫 合爪蟾下腹部；用鑷子將卵頁分成小塊，再用滴管取至50ml離心管中；用無鈣ND96溶液沖 洗數(shù)遍后，加入2mg/ml的膠原酶室溫消化1小時(shí)；棄上清，取出卵母細(xì)胞至孵育液中培養(yǎng)備用。(2)顯微注射體外轉(zhuǎn)錄合成基因的cRNA(按Ambion公司的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 mMACHINESP6 Kit的說明書操作)；將cRNA濃度調(diào)至1 μ g/μ 1 ；在實(shí)體顯微鏡下，用顯微注 射儀向每個(gè)卵母細(xì)胞注射50nl的cRNA，對照注射50nl的RNase-free水；(3)GhPIP2蛋白合成將注射后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新鮮的ND96溶液中，19°C靜置 培養(yǎng)2 3天，GhPIP蛋白即在卵母細(xì)胞內(nèi)合成并整合到卵細(xì)胞膜上。(4)卵細(xì)胞膜水導(dǎo)度檢測將培養(yǎng)2 3天后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1/5ND96溶液 中，在實(shí)體顯微鏡下每隔30秒拍照一次，記錄卵母細(xì)胞體積的變化。再根據(jù)
公式Pf =V。[d(V/VQ)/dt]/[SQXVw(0Smin-0Sm。ut)]，計(jì)算細(xì)胞膜的水導(dǎo)度，其中，V0 = 9X10_4cm3，S0 = 0. 045cm2, V0, S0為卵母細(xì)胞初始體積和表面積；V為變量，指t時(shí)刻時(shí)卵母細(xì)胞的體積；VW =18cm7mol，為水的摩爾體積；Osmin = 220mosm/kg，指細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，Osmout = 44mosm/ kg，指細(xì)胞外的滲透壓。4、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(1)棉花各組織總RNA的提取(按蔣建雄、張?zhí)煺妫?003，利用CTAB/酸酚法提取棉 花組織總RNA0棉花學(xué)報(bào)，15 166-167進(jìn)行)；(2)逆轉(zhuǎn)錄按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)的使用說明書操作；(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:按熒光定量PCR試劑盒(Τ0Υ0Β0)的使用說明書操作。以 棉花持家基因GhUBI作為內(nèi)參，根據(jù)公式Y(jié)= 10Δ__5Χ100%計(jì)算基因表達(dá)的相對值。Ct 是指基因擴(kuò)增產(chǎn)物最初能被熒光檢測到的循環(huán)數(shù)，ACt是指目的基因與內(nèi)參基因GhUBI循 環(huán)數(shù)的差值，即ACt = CtGhUBI-CtGhPIPs。為了得到最佳的實(shí)驗(yàn)效果，PCR擴(kuò)增條件及引 物效率都以目的基因的cDNA為模扳進(jìn)行優(yōu)化。該實(shí)驗(yàn)中每個(gè)組織采集3次樣品，分別提取 RNA,每個(gè)樣品的RNA重復(fù)3次實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)，最后統(tǒng)計(jì)9次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算其平均 值和標(biāo)準(zhǔn)差。5、Northern 雜交總RNA的電泳和轉(zhuǎn)膜及雜交均按《分子克隆》介紹的方法進(jìn)行(主編，第三版)。 雜交探針的合成是以基因cDNA的3’端約0. 2kb的序列作為雜交探針模板，按隨機(jī)引物標(biāo) 記 DNA 試劑盒(Random Primer DNA labeling Kit, Takara)的操作說明進(jìn)行的。6、酵母轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及形態(tài)觀察根據(jù)分子克隆技術(shù)，在GhPIP2 ;6基因開放閱讀框(ORF)兩端引物加上Nde I 和Sal I酶切位點(diǎn)的回文序列，用于PCR擴(kuò)增基因ORF片段。用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切該目 的DNA片段后，重組到pREP-5N質(zhì)粒中。酵母轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及形態(tài)觀察均按Li L等，2007， Molecularcharacterization of cotton GhTUA9 gene specifically expressed in fiber and involved in cell elongation. J Exp Bot，58 :3227_3238 中的方法進(jìn)行。7、棉花離體胚珠培養(yǎng)及HgCl2處理采集開花后1天的棉鈴，用體積濃度70%乙醇表面殺菌1分鐘，無菌水沖洗3 4 次后，在無菌條件下，將棉鈴中的胚珠剝離出來，置于適量BT培養(yǎng)基中，按比例加入一定量 的無菌ImM HgCl2，靜置0. 5 2小時(shí)后取出，用BT培養(yǎng)基清洗2次，再置于適量BT培養(yǎng)基 中，30°C，黑暗條件下靜置培養(yǎng)10 12天。棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于該基因的全長cDNA核苷酸序列如 下GGGCACGAGT CAAAAAAGCT TCCAACATTT TGAAGAAACA AAGAATCAAA CATGTCGAAG 60GMGTGAGTG MGAAGGGGT GAGCCGAAAG GACTATGTGG ATCCTCCACC GGCACCGCTC 120ATCGACGTGG CTGAGATCAA GCTTTGGTCT TTTTACAGAG CTCTCATCGC CGAATTCATC 180GCTACTCTCC TCTTCCTATA CGTCACCATA GCCACCGTCA TCGGCCACAA GAAACMCAC 240GATGCATGCG ATGGTGTTGG TCTTTTGGGC ATTGCTTGGG CTTTTGGTGG CATGATTTTC 300ATTCTTGTTT ACTGCACCGC CGGTATCTCA GGTGGTCACA TTAACCCGGC GGTGACATTT 360GGGTTGTTTT TGGCTAGGAA GGTGTCGTTA ATAAGGGCGG TGGCTTACAT GGTAGCTCM 420
100071]TGTTTGGGTG CTATTTGTGG TGTTGGGTTA GTTAAGGCAT TCATGAAGAG TGAATACAAC480
0072]TCCCTTGGCG GCGGTGTTAA CACGGTGGCG ACTGGTTATA ACAAAGGGAC TGCTTTGGGA540
0073]GCTGAGATTA TTGGGACATT CGTGCTTGTT TACACTGTTT TTTCAGCTAC TGACCCTAM600
0074]AGAAGTGCCC GTGATTCACA TGTACCCGTG TTGGCTCCAC TTCCTATAGG ATTTGCAGTG660
0075]TTCATGGTTC ATTTGGCTAC TATTCCTATC ACCGGAACTG GTATTAACCC TGCTAGAAGC720
0076]TTCGGCGCCG CCGTTATTTA CAACAACGAC AAGGCTTGGG ATGACCACTG GATATTCTGG780
0077]GTTGGACCAA TGGTGGGAGC ACTTGCGGCG GCGGCATATC ATCAGTACAT CCTTAGAGCG840
0078]GCGGCTATTA AGGCTTTGGG ATCTTTCCGG AGCAACCCCA GCAATTAAAA GCTMAAAGA900
0079]GMGAAMCC ACAATATGTT TGTCTCATTG TGTTTATAAT GTTTCTTCAT TGTTGGTTCC960
0080]TGTGTGTGTA TTGTATTATG ATTGATGATT ATTAATTCAG ACCTTTTTAT TT1012
0081]所述的一個(gè)棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于與該基因的第52 888 核苷酸對應(yīng)的編碼氨基酸序列如下
0082]MetSerLysGluValSerGluGluGlyValSerArgLysAspTyrValAsp0083]1510150084]ProProProAlaProLeulieAspValAlaGlulieLysLeuTrpSerPhe0085]2025300086]TyrArgAlaLeulieAlaGluPhelieAlaThrLeuLeuPheLeuTyrVal0087]354045500088]ThrlieAlaThrVallieGlyHisLysLysGlnHisAspAlaCysAspGly0089]5560650090]ValGlyLeuLeuGlylieAlaTrpAlaPheGlyGlyMetliePhelieLeu0091]707580850092]ValTyrCysThrAlaGlylieSerGlyGlyHislieAsnProAlaValThr0093]90951000094]PheGlyLeuPheLeuAlaArgLysValSerLeulieArgAlaValAlaTyr0095]1051101150096]MetValAlaGlnCysLeuGlyAlalieCysGlyValGlyLeuValLysAla0097]1201251301350098]PheMetLysSerGluTyrAsnSerLeuGlyGlyGlyValAsnThrValAla0099]1401451500100]ThrGlyTyrAsnLysGlyThrAlaLeuGlyAlaGlulielieGlyThrPhe0101]1551601651700102]ValLeuValTyrThrValPheSerAlaThrAspProLysArgSerAlaArg0103]1751801850104]AspSerHisValProValLeuAlaProLeuProlieGlyPheAlaValPhe0105]1901952000106]MetValHisLeuAlaThrlieProlieThrGlyThrGlylieAsnProAla0107]2052102152200108]ArgSerPheGlyAlaAlaVallieTyrAsnAsnAspLysAlaTrpAspAsp
225230235His Trp lie Phe Trp Val Gly Pro Met Val Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala240245 250255Tyr His Gln Tyr lie Leu Arg Ala Ala Ala lie Lys Ala Leu Gly Ser Phe260265270Arg Ser Asn Pro Ser Asn275278棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于該基因的基因組DNA全長核苷酸序 列如下(斜體下劃線標(biāo)記的序列為內(nèi)含子核苷酸序列)ATGTCGAAGG AAGTGAGTGA AGAAGGGGTG AGCCGAAAGG ACTATGTGGA TCCTCCACCG 60GCACCGCTCA TCGACGTGGC TGAGATCAAG CTTTGGTCTT TTTACAGAGC TCTCATCGCC 120GMTTCATCG CTACTCTCCT CTTCCTATAC GTCACCATAG CCACCGTCAT CGGCCACAAG 180AMCAACACG ATGCATGCGA TGGTGTTGGT CTTTTGGGCA TTGCTTGGGC TTTTGGTGGC 240ATGATTTTCA TTCTTGTTTA CTGCACCGCC GGTATCTCAG gtactctccc ccccccaaaa 300
aaaaacagtg acttcattaa tatagccaat tagccatttt tgttgaattt tggttgtttt 360
0123]acgacgcaa GTGGTCACATTMCCCGGCGGTGACATTTGG GTTGTTTTTG GCTAGGAAGG4200124]TGTCGTTAATMGGGCGGTGGCTTACATGGTAGCTCAATGTTTGGGTGCTATTTGTGGTG4800125]TTGGGTTAGTTAAGGCATTCATGAAGAGTGAATACAACTCCCTTGGCGGCGGTGTTAACA5400126]CGGTGGCGACTGGTTATAACMAGGGACTGCTTTGGGAGCTGAGATTATTGGGACATTCG6000127]TGCTTGTTTACACTGTTTTTTCAGCTACTGACCCTAAAAGAAGTGCCCGTGATTCACATG6600128]TACCCGTGTTGGCTCCACTTCCTATAGGATTTGCAGTGTTCATGGTTCATTTGGCTACTA7200129]TTCCTATCACCGGAACTGGTATTAACCCTGCTAGMGCTTCGGCGCCGCCGTTATTTACA7800130]ACM0GACM GGCTTGGGAT GAOCAC gtaa gcttctcttt ctaaaaaaaatttcagtgtt840tttttgttca tttagtttgt gaaactaaca aaaatggcga caatgaacag TGGATATTCT 900GGGTTGGACC MTGGTGGGA GCACTTGCGG CGGCGGCATA TCATCAGTAC ATCCTTAGAG 960CGGCGGCTAT TMGGCTTTG GGATCTTTCC GGAGCMCCC CAGCMTTM1010
1權(quán)利要求
棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2；6，其特征在于該基因的全長cDNA核苷酸序列如下GGGCACGAGT CAAAAAAGCT TCCAACATTT TGAAGAAACA AAGAATCAAA CATGTCGAAG 60GAAGTGAGTG AAGAAGGGGT GAGCCGAAAG GACTATGTGG ATCCTCCACC GGCACCGCTC 120ATCGACGTGG CTGAGATCAA GCTTTGGTCT TTTTACAGAG CTCTCATCGC CGAATTCATC 180GCTACTCTCC TCTTCCTATA CGTCACCATA GCCACCGTCA TCGGCCACAA GAAACAACAC 240GATGCATGCG ATGGTGTTGG TCTTTTGGGC ATTGCTTGGG CTTTTGGTGG CATGATTTTC 300ATTCTTGTTT ACTGCACCGC CGGTATCTCA GGTGGTCACA TTAACCCGGC GGTGACATTT 360GGGTTGTTTT TGGCTAGGAA GGTGTCGTTA ATAAGGGCGG TGGCTTACAT GGTAGCTCAA 420TGTTTGGGTG CTATTTGTGG TGTTGGGTTA GTTAAGGCAT TCATGAAGAG TGAATACAAC 480TCCCTTGGCG GCGGTGTTAA CACGGTGGCG ACTGGTTATA ACAAAGGGAC TGCTTTGGGA 540GCTGAGATTA TTGGGACATT CGTGCTTGTT TACACTGTTT TTTCAGCTAC TGACCCTAAA 600AGAAGTGCCC GTGATTCACA TGTACCCGTG TTGGCTCCAC TTCCTATAGG ATTTGCAGTG 660TTCATGGTTC ATTTGGCTAC TATTCCTATC ACCGGAACTG GTATTAACCC TGCTAGAAGC 720TTCGGCGCCG CCGTTATTTA CAACAACGAC AAGGCTTGGG ATGACCACTG GATATTCTGG 780GTTGGACCAA TGGTGGGAGC ACTTGCGGCG GCGGCATATC ATCAGTACAT CCTTAGAGCG 840GCGGCTATTA AGGCTTTGGG ATCTTTCCGG AGCAACCCCA GCAATTAAAA GCTAAAAAGA 900GAAGAAAACC ACAATATGTT TGTCTCATTG TGTTTATAAT GTTTCTTCAT TGTTGGTTCC 960TGTGTGTGTA TTGTATTATG ATTGATGATT ATTAATTCAG ACCTTTTTAT TT1012
2.按照權(quán)利要求1所述的一個(gè)棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ;6，其特征在于與該基因的第52 888核苷酸對應(yīng)的編碼氨基酸序列如下Met Ser Lys Glu Val Ser Glu Glu Gly Val Ser Arg Lys Asp1510Pro Pro Pro Ala Pro Leu lie Asp Val AlaTyr 35 ThrPro Ala 20Arg Ala Leu lieLeu lie Asp Val 25Glu Phe lie AlaGlu lieAla 40 lielie Ala Thr Val 55Leu Leu Gly lieGly HisVal Gly 70Val Tyr Cys ThrLys 60 AlaLysThr 45 GlnLeuLys 30 LeuTyr Val Asp 15Leu Trp Ser PhePhe Leu Tyr Val 50Cys Asp GlyPhe Gly Leu 105 AlaAla 90Phe Leu Ala ArgAla Trp 75Gly lie Ser GlyHis Asp Ala 65Met lie Phe liePhe Gly Gly 80His lie Asn ProMet 120 PheVal 125 MetLys 110 AlaValGly 95 SerLeu 85 ThrLysGln Cys Leu Gly 130Ser Glu Tyr Asn Ser 140lie CysLeu Gly 145Leu lie Arg 115 GlyGly GlyVal 135Gly ValAla Val 100Ala Val Ala Tyr Leu Val Lys AlaAsn 150Thr Val Ala
3.按照權(quán)利要求l所述的棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2；6，其特征在于該基因的基因組DNA全長核苷酸序列如下(斜體下劃線標(biāo)記的序列為內(nèi)含子核苷酸序列)ATGTCGAAGG AAGTGAGTGA AGAAGGGGTG AGCCGAAAGG ACTATGTGGA TCCTCCACCG60GCACCGCTCA TCGACGTGGC TGAGATCAAG CTTTGGTCTT TTTACAGAGC TCTCATCGCCl 20GAATTCATCG CTACTCTCCT CTTCCTATAC GTCACCATAG CCACCGTCAT CGGCCACAAGl 80AAACAACACG ATGCATGCGA TGGTGTTGGT CTTTTGGGCA TTGCTTGGGC TTTTGGTGGC 240ATGATTTTCA TTCTTGTTTA CTGCACCGCC GGTATCTCAG G了AC廠C廠CCC CCCCCCAAAA 300 ACGACGCAGG 7CGTCACATT AACC。GCOCG．mACArI”m GTKrIT廠IG GCrAGGAACG420TGTCGTTAAT AAGGGCGGTG GCTTACATGG TAGCTCAATG TTTGGGTGCT ATTTGTGGTG 480TTGGGTTAGT TAAGGCATTC ATGAAGAGTG AATACAACTC CCTTGGCGGC GGTGTTAACA 540CGGTGGCGAC TGGTTATAAC AAAGGGACTG CTTTGGGAGC TGAGATTATT GGGACATTCG 600TGCTTGTTTA CACTGTTTTT TCAGCTACTG ACCCTAAAAG AAGTGCCCGT GATTCACATG 660TACCCGTGTT GGCTCCACTT CCTATAGGAT TTGCAGTGTT CATGGTTCAT TTGGCTACTA 720TTCCTATCAC CGGAACTGGT ATTAACCCTG CTAGAAGCTT CGGCGCCGCC GTTATTTACA 780ACAACGACAA GGCTTGGGAT GACCAC GTAA GCTTCTCTTT CTAAAAAAAA TTTCAGTGTT 840TTTTTGTTCA TTTAGTTTGT GAAACTAACA AAAATGGCGA CAATGAACAG囂GA TA T TC T 900GGGTTGGACC AATGGTGGGA GCACTTGCGG CGGCGGCATA TCATCAGTAC ATCCTTAGAG 960CGGCGGCTAT TAAGGCTTTG GGATCTTTCC GGAGCAACCC CAGCAATTAAl o l o
全文摘要
棉花纖維特異表達(dá)的水孔蛋白家族基因GhPIP2；6。該基因的cDNA全長序列為1012bp，基因全長序列為1134bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。GhPIP2；6基因編碼的蛋白質(zhì)為278個(gè)氨基酸，分子量約為29.6kDa，其蛋白具有很高的水通道活性。GhPIP2；6在棉纖維中特異表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要在伸長期的棉纖維中積累。在酵母中表達(dá)GhPIP2；6基因能促使宿主細(xì)胞縱向伸長，細(xì)胞長度是對照的1.30～1.47倍。相反，用HgCl2處理導(dǎo)致該蛋白活性下降，棉纖維細(xì)胞伸長遲緩，長度變短。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明GhPIP2；6在棉纖維伸長過程中起重要作用，這個(gè)水孔蛋白基因?qū)τ诟牧济蘩w維品質(zhì)、增加棉花產(chǎn)量可能具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101906425SQ20091027336
公開日2010年12月8日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者吳雅潔, 李學(xué)寶, 李登弟, 王秀蘭, 阮想梅 申請人:華中師范大學(xué)