專利名稱：：檢測乙肝感染相關(guān)基因str位點的方法、試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法、所用的試劑盒以及在乙肝病毒感染的人群預(yù)防和控制、遺傳咨詢中的應(yīng)用，屬于乙肝病毒易感性的遺傳學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：根據(jù)乙肝病毒(HBV)感染和發(fā)病特點的研究，乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展過程與宿主遺傳因素相關(guān)，并且對乙肝防治的療效和預(yù)后具有一定的影響作用，宿主對HBV感染的遺傳易感性在HBV感染發(fā)病和疾病進展方面都發(fā)揮著重要作用。研究乙型肝炎的宿主遺傳易感性具有十分重要的意義，不但能夠為我們理解HBV感染種族性差異提供關(guān)鍵線索，也能夠為我們以后的抗病毒治療和疾病的預(yù)防提供新的思路。近年來在乙型肝炎的宿主遺傳易感性方面的研究中主要關(guān)注于一些細胞因子的基因多態(tài)性與HBV感染的關(guān)系，其中一個重要的細胞因子即是IL-10。人類IL-10基因定位于1號染色體，其基因組包括5個外顯子和4個內(nèi)含子。IL-10整個基因均含有大量的SNP位點，其中以啟動子區(qū)最多。IL-10基因的啟動子區(qū)具有高度多態(tài)性，含多個單核苷酸多態(tài)性位點以及2個微衛(wèi)星重復(fù)序列IL-10.G和IL-IO.R，分別是位于-1193-1151位點的IL-10G微衛(wèi)星體(含有16個等位基因)和位于-4004-3987位點的IL-10R微衛(wèi)星體(含有5個等位基因)。IL-10基因2個微衛(wèi)星重復(fù)序列IL-10.G和IL-10.R有研究報道與腎移植排斥反應(yīng)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)，但尚無與HBV感染相關(guān)的研究報道。在人類基因組中，STRs是高度多態(tài)性標記的豐富來源，可采用PCR反應(yīng)檢測。STRs-PCR(短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星DNA聚合酶鏈式反應(yīng))方法的基本原理是，針對待檢測的微衛(wèi)星(STR)多態(tài)性位點設(shè)計引物進行PC財廣增，由于擴增的重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)存在差異，使得擴增產(chǎn)物片段大小不同，STR基因座的等位基因分型也不同，在電泳分離后，熒光檢測可區(qū)別不同的基因型。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法、所用的試劑盒以及在乙肝病毒感染的人群預(yù)防和控制、遺傳咨詢中的應(yīng)用。本發(fā)明人首次將IL-IO.G和IL-IO.R位點多態(tài)性與HBV感染聯(lián)系起來探討其相關(guān)性，首次在貴州少數(shù)民族中進行了IL-10基因IL-10.G和IL-IO.R位點多態(tài)性與乙肝病毒感染相關(guān)的大規(guī)模、高通量研究，并且結(jié)果顯示IL-10.G與HBV感染存在相關(guān)性。經(jīng)過一系列探討研究之后，本發(fā)明采用STRs-PCR方法，通過對IL-10啟動子區(qū)IL-10.G和IL-IO.R兩個STR位點的基因型進行檢測，從而可判斷個體對乙肝病毒的易感性，確定了IL-10.G、IL-10.R是乙肝病毒感染的新型相關(guān)基因，為乙肝病毒感染的人群預(yù)防和控制提供了新的遺傳咨詢內(nèi)容。本發(fā)明的技術(shù)方案一種檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，所述方法為STRs-PCR，即短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星DNA聚合酶鏈式反應(yīng)，具體包括以下步驟(l)采取血樣，紅細胞懸液經(jīng)過酚-氯仿抽提基因組DNA后，用TE緩沖液溶解制備模板DNA;(2)IL-10.G與IL-IO.R兩個STR位點的引物設(shè)計IL-10.R微衛(wèi)星PC財廣增的引物序列為:5'-CCCTCCAAAATCTATTTGCATAAG-3'、5'-CTCCGCCCAGTAAGTTTCATCAC-3';IL-10.G微衛(wèi)星PC財廣增的引物序列為5'-TTCCTCCCAGTTACAGTCT-3'、5'-CACCATCTCCAGCACATA-3';(3)PC財廣增體系的組配IOXPCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、上游引物G/R、下游引物G/R、TaqDNA聚合酶、模板DNA和去離子水；(4)混勻反應(yīng)體系，瞬時離心后上機，進行PCR循環(huán)反應(yīng)；(5)ABI310測序儀自動熒光檢測并分析PCR產(chǎn)物向PCR產(chǎn)物中加入去離子甲酰胺進行變性，然后置于ABI310測序儀中進行毛細管電泳及熒光檢測，再用GeneScan軟件對產(chǎn)物片段進行準確測定，后利用產(chǎn)物片段大小的數(shù)值進行基因分型。前述步驟(3)中的PC財廣增試劑為10XPCR緩沖液、25mmol/L的MgCl2、2.5mol/L的dNTPs禾口5U/yl的TaqDNA聚合酶。步驟(4)中的PCR循環(huán)反應(yīng)條件為變性溫度9396。C、時間30s，退火溫度6065。C、時間4050s，延伸溫度7075。C、時間60s。優(yōu)選的PCR循環(huán)反應(yīng)條件為變性溫度95。C、時間30s，退火溫度6rC、時間45s，延伸溫度72。C、時間60s。步驟(4)中模板DNA在變性之前于9395。C預(yù)變性35min;終末延伸溫度7075r，維持515min。優(yōu)選為模板DNA在變性之前于94。C預(yù)變性5min;終末延伸溫度72。C，維持10min。步驟(4)中PCR循環(huán)次數(shù)為2535;優(yōu)選的循環(huán)次數(shù)為30。步驟(5)中PCR產(chǎn)物變性時以Genescan-500TEMRA為內(nèi)標，置于PCR儀中95。C變性5min步驟(5)中PCR產(chǎn)物進行毛細管電泳及熒光檢測時，變性凝膠溫度為6(TC，電泳時間28min。一種通過檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型判斷個體對乙肝病毒是否易感的方法攜帶IL-10.G459bp(19CA)、IL-10.G471bp(25CA)、IL-10.G473bp(26CA)的個體對乙肝病毒具有更低的易感性。檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的試劑盒，包括(1)PC財廣增試劑:IOXPCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶；(2)DNA變性試劑去離子甲酰胺；(3)ABI310毛細管電泳試劑內(nèi)標Genescan-500TEMRA、7310P0P4分離膠；(4)熒光引物以上所述的任一方法或試劑盒在乙肝病毒感染的人群預(yù)防和控制以及遺傳咨詢中的應(yīng)用本發(fā)明所用STRs-PCR(短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星DNA聚合酶鏈式反應(yīng))方法的基本原理及操作是針對待檢測的微衛(wèi)星(STR)多態(tài)性位點設(shè)計引物進行PC財廣增，由于擴增的重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)存在差異，使得擴增產(chǎn)物片段大小不同，STR基因座的等位基因分型也不同，在電泳分離后，熒光檢測可區(qū)別不同的基因型。目前STRs-PCR技術(shù)可行多位點檢測方法，即可同時進行兩個以上STR位點的檢測，在進行多個位點的檢測時，需要根據(jù)不同的STR序列設(shè)計不同的引物，在同一反應(yīng)管中同時進行多個微衛(wèi)星位點的擴增，引物采用不同顏色熒光染料標記，以區(qū)別每個位點的等位基因。本發(fā)明即采用STRs-PCR對IL-10啟動子區(qū)IL-10.G和IL-10.R兩個STR位點進行多態(tài)性分析。實驗中首先針對IL-10啟動子區(qū)IL-10.G和IL-10.R兩個STR位點進行PC財廣增，并在正鏈引物的5'端分別用熒光素標記。在PC財廣增后，采用ABI310測序儀進行自動熒光檢測，將擴增產(chǎn)物與內(nèi)標同步進行毛細管電泳，最后用激光檢測，GeneScan軟件分析產(chǎn)物片段大小，即可對DNA片段進行準確測定，從而區(qū)別不同的基因型本發(fā)明人通過對貴州威寧彝族、黔西彝族、荔波瑤族、荔波漢族人群IL-IO.R和IL-10.G的檢測，發(fā)現(xiàn)IL-IO.R有CA11次和12次重復(fù)兩種基因型，IL-10.G有CA15次、17-26次重復(fù)的ll種基因型。將乙肝感染組和非感染組進行對比統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)IL-10.G(19CA)、(25CA)、(26CA)等位基因頻率可能與HBV感染相關(guān)感染組的IL-10.G473bp(26CA)等位基因頻率較非感染組降低；感染組IL-10.G459bp(19CA)等位基因頻率較非感染組顯著降低；感染組IL-10.G471bp(25CA)等位基因頻率較非感染組降低。以下是本發(fā)明人對IL-IO.G與IL-IO.R進行STRs-PCR檢測的主要實驗結(jié)果擴增IL-10.G的引物序列在正鏈的5'端用熒光素HEX標記，在熒光信號轉(zhuǎn)換為電泳圖象時表現(xiàn)為黑色波峰；而擴增IL-IO.R位點的引物用6-FAM進行標記，在熒光信號轉(zhuǎn)換為電泳圖象時表現(xiàn)為藍色波峰；Genescan-500TEMRA內(nèi)標的熒光信號轉(zhuǎn)換為電泳圖象時表現(xiàn)為紅色波峰，且每個波峰標示了該處片段大小的確切數(shù)值，相當(dāng)于分子量標準。經(jīng)毛細管電泳后的產(chǎn)物波峰圖象，由GenescanAnalysis3.O軟件將該處波峰圖象轉(zhuǎn)換為數(shù)值，可直接在圖象上讀出產(chǎn)物片段大小的準確數(shù)值。見圖l。IL-IO.R的STRs-PCR結(jié)果見圖2;IL-10.G的STRs-PCR結(jié)果見圖3。部分IL-10.G與IL-10.R位點等位基因頻率與HBV感染的相關(guān)分析1.IL-10.R等位基因頻率與HBV感染的相關(guān)分析貴州威寧彝族、黔西彝族、荔波瑤族、荔波漢族總體IL-IO.R等位基因頻率與HBV感染的相關(guān)分析IL-10.R.110bp(llCA)、IL-10.R.112bp(12CA)等位基因頻率在民族總體感染組與非感染組間分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P〉0.05)。表1貴州威寧養(yǎng)族、乾西養(yǎng)族、泰波職、泰^KSlIL-10.R^S因頻率[人數(shù)(tt^J)]與HBV^的相^析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.IL-10.G等位基因頻率與HBV感染的相關(guān)分析2.l貴州威寧彝族、黔西彝族、荔波瑤族、荔波漢族總體IL-10.G等位基因頻率與HBV感染的相關(guān)分析IL-10.G.473bp(26CA)等位基因頻率在民族總體感染組與非感染組間分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05):民族總體感染組的473bp(26CA)等位基因頻率較非感染組降低。其余各等位基因頻率在民族總體感染組與非感染組間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P〉0.05)。表2貴州威寧彝族、彭西彝族、蘊波瑤族、荒^族總體IL-10.G^t基因頻_率與HBV感染的相^析_^eaa非^s^x'值p值451bp(15CA)10(L5%)6(1.8%)?！鰈必O-TOO455bp(1TCA)4(0.3%)2(0.3%)0-0003LOOO45Tbp(18CA)25(3.7%)11(3.3%)。■101。■751459bp(19CA)393(58.7%)。■099。■753姐bp(20CA)76(11.3%)34(10.3%)0.2440-621(21CA)7(1、)6(1.8%)L031?！?74站5bp(22CA)33(4.9%)14(4-2*)0-2300-6314fi7bp(23CA)71(10.6*)33(10%)?！?85?！?71469bp(24CA)39(5.8%)17(5.2%)CL187O.細471bp(25CA)11(1.6%)0.0410.839473bp(26CA)1(0.W)4(1.2%)5-021。■0432.2貴州黔西彝族IL-10.G等位基因頻率與HBV感染的相關(guān)分析IL-10.G459bp(19CA)在黔西鼻族感染組與非感染組中分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05):感染組IL-10.G459bp(19CA)等位基因頻率較非感染組顯著降低。其余各等位基因頻率在黔西彝族感染組與非感染組間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P〉0.05)。表3貴州彭西舜族IL-10.G雜基因頻率與HBV職的相粉析非^^X，值P值451bp(15CA)2(2.2%)1(0.8%)?！鯰O5?！?78455bp(17CA)0(0%)o(os)45Tbp(18CA)6(6.7*)4(3.3%)1-2600.332459bp(19CA)43(47.8%)77(64.2*)5.641。■01S461bp(20CA)14(15.0%)10(8.3%)?！?65?！?04(21CA)2(2.2%)1(0.8%)0-TO50.578465bp(22CA)4(3-3%)。■173?！?2T467bp(23CA)13(14-")14(11.7%)。■354?！?52469!]p(24CA)5(5.6%)8(6.7%)0-1090.7414Tlbp(25CA)1(1.W)0(0%)1.340。■4294T3bp(26CA)0(0%)1(0.8*)L340?！?292.3貴州荔波漢族IL-10.G等位基因頻率與HBV感染的相關(guān)分析IL-10.G471bp(25CA)在蒸波漢族感染組與非感染組中分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05):感染組IL-10.G471bp(25CA)等位基因頻率較非感染組降低。其余各等位基因頻率在荔波漢族感染組與非感染組間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P〉0.05)。表4貴州泰波鄉(xiāng)IL-10.G報基因頻率與HBV鵬的相效析x，但P值451bp(15CA)1(0.9%)0(0%)LOOO455bp(17CA)3(1.9%)0(0%)。■5661-000457bp(18CA)5(2.5%)3(7.9%)2-970?！?14459bp(19CA)138(67-6%)23(60-5%)0.729?！?93姐bp(20CA)3(7.9%)0-035LOOO463bp(21CA)1(0.9%)1(2.6%)1-792?！?90465bp(22CA)6(2.9%)1(2-6%)0-011LOOO46Tbp(23CA)11(5-4，)1(2-6%)。■5180-柳469bp(24CA)21(10.3*)4(10.5%)。■002LOOO471bp(25CA)0(0%)2(5.3%)10.8620-0244T3bp(26CA)0(0%)0(0%)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將IL-10基因兩個STR位點(IL-10.G、IL-10.R)與乙肝病毒感染的易感性聯(lián)系起來，確定了IL-IO.G、IL-IO.R是乙肝病毒感染的新型相關(guān)基因；并采用STRs-PCR方法，通過對IL-10啟動子區(qū)IL-10.G和IL-IO.R兩個STR位點的基因型進行檢測，從而可判斷個體對乙肝病毒的易感性，為乙肝病毒感染的人群預(yù)防和控制提供了新的遺傳咨詢內(nèi)容。圖1是ABI310GenescanAnalysis3.0所示IL-10.G與IL-10.R的STRs-PCR檢測結(jié)果圖；圖中1號波峰為IL-10.R的產(chǎn)物片段，2號波峰為IL-10.G的產(chǎn)物片段，3號波峰為TEMRA內(nèi)標片段。圖2是ABI310GenescanAnalysis3.0所示IL-10.R的STRs-PCR檢測結(jié)果圖；圖示IL-10.R為110bp(IICA重復(fù))的純合子；圖中4號波峰為IL-IO.R的產(chǎn)物片段，5號波峰為TEMRA內(nèi)標片段。圖3是ABI310GenescanAnalysis3.0所示IL-10.G的STRs-PCR檢測結(jié)果圖；圖示IL-IO.G為459bp(19CA)與465bp(22CA)的雜合子；圖中6號波峰為IL-10.G的產(chǎn)物片段，7號波峰為TEMRA內(nèi)標片段。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例l:采用STRs-PCR方法，按以下步驟檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點(IL-IO.G、IL-10.R)的基因型(1)模板DNA制備采取血樣，紅細胞懸液經(jīng)過酚(Tris-飽和苯酚)-氯仿抽提基因組DNA后，用TE緩沖液(由10mmol/LTris-HCL(pH8.0)與lmmol/LEDTA(pH8.O)組成)溶解，DU640核酸定量儀測定，計算DNA的含量，同時檢觀^DNA樣品的純度，將每個標本稀釋成約100ng/yl的應(yīng)用液。(2)IL-10.G與IL-IO.R兩個STR位點的引物設(shè)計根據(jù)Genbank報道的人類IL-10DNA序列，利用PrimerPremier5軟件自行設(shè)計IL-10.G位點引物序列以及參照相關(guān)文獻選取擴增IL-IO.R位點的引物序列，并在正鏈引物的5'端分別用熒光素HEX與6-FAM標記，并交送上?；瞪锕竞铣?。IL-10.G與IL-10.R微衛(wèi)星PCR擴增引物序列微衛(wèi)星引物糊長度IL-10.R5VCCCTOCAAAATaATTTGCATAAG3'24bpHEX5'CTCCGCCCAGTAAGTTTCATCAC3'23bpIL-10.G5VTTOCTCOCAGTTACAGTCT3v19bpWAI5'CACCATCTCCAGCACATA3v18bp(3)PCR擴增體系(25y1):IL-10.G與IL-10.R微衛(wèi)星PCRr^體系10XPCR緩沖液2.5IgCl，(25,1/L)1.5tudMTPsC2-5mol/02.0tu上游引物G/R(10，加1/L)1.0tu下游引物G/R(10.0li加l/L)1.0tuTaqD他(5U旭)0.3Pl微腿0.5Pl去離子水16.2HlTotal25(4)混勻反應(yīng)體系，瞬時離心后上機，進行PCR循環(huán)反應(yīng)，條件如鄉(xiāng)％t:火6it;延伸721;終末延伸T21;5min30s—60s—30個頃環(huán)10min_^4G保溫(5)ABI310測序儀自動熒光檢測并分析PCR產(chǎn)物①PCR產(chǎn)物變性取lylPCR產(chǎn)物，加入15yl去離子甲酰胺及O.5y1Genescan-500TEMRA內(nèi)標，混勻離心后，置于PCR儀中95。C變性5min，后迅速轉(zhuǎn)移至冰盒中以保持產(chǎn)物單鏈結(jié)構(gòu)。②ABI310測序儀毛細管電泳PCR產(chǎn)物變性后，剪去管蓋置入ABI310測序儀中(灌有7310P0P4分離膠)進行自動毛11細管電泳(電泳時P0P4分離膠自動灌入毛細管)及熒光檢測，變性凝膠溫度設(shè)為6(TC，電泳時間28min。③GeneScan軟件分析產(chǎn)物大小PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后，采用ABI310DataCollection軟件收集熒光信號，將信號轉(zhuǎn)換為電泳圖象，并用ABI310GenescanAnalysis3.O軟件將圖象信號轉(zhuǎn)換為數(shù)值(表示擴增的片段長度大小)，對產(chǎn)物片段進行準確測定，然后根據(jù)片段長度大小推算CA重復(fù)的次數(shù)，從而確定其基因型(所檢測的STR位點的基因全序列是可以在NCBI上査出的，也就是說包括引物在內(nèi)的擴增出的片段其序列是已知的，而擴增出的產(chǎn)物長度差異來自于CA重復(fù)的次數(shù)，因此根據(jù)擴增出的片段長度大小結(jié)合已知序列，可以得出CA重復(fù)的次數(shù))。檢測結(jié)果及個體對乙肝病毒是否易感的判斷IL-10.R位點有11CA、12CA兩種基因型，IL-10.G位點有15CA、(17-26)CA^^—種基因型，其中IL-10.G(19CA)、(25CA)、(26CA)等位基因頻率與HBV感染相關(guān)攜帶IL-10.G459bp(19CA)、IL-10.G471bp(25CA)、IL-10.G473bp(26CA)的個體對乙肝病毒具有更低的易感性。實施例2:采用STRs-PCR方法，按以下步驟檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點(IL-IO.G、IL-10.R)的基因型(1)模板DNA制備采取血樣，紅細胞懸液經(jīng)過酚(Tris-飽和苯酚)-氯仿抽提基因組DNA后，用TE緩沖液(由10mmol/LTris-HCL(pH8.0)與lmmol/LEDTA(pH8.O)組成)溶解，DU640核酸定量儀測定，將每個標本稀釋成約100ng/yl的應(yīng)用液。(2)IL-10.G與IL-IO.R兩個STR位點的引物設(shè)計利用PrimerPremier5軟件設(shè)計IL-10.G位點引物序列，參照相關(guān)文獻選取擴增IL-10.R位點的引物序列，并在正鏈引物的5'端分別用熒光素HEX與6-FAM標記，并交送上?；瞪锕竞铣伞L-10.G與IL-10.R微衛(wèi)星PCR擴増引物序列微衛(wèi)星引物序列長度熒^ifiIL-10.R5VCOCTCCMAATCTATTTGCATMG3'24bpHEX5JCTCDGCOCAGTMGTTTCATCAC3'23bpIL-10.G5;TTCCTCOCAGTTACAGTCT3'l%p5'CACCATCTOCAGCACATA3'18bp(3)PC財廣增體系(25y1):IL-10.G與IL-10.R微衛(wèi)星PGRJTWt系10XPCR緩沖液2.5tUIgCl，(25,1/L)1.5Pl2.0Pl上游引物G/R(10.0Pido1/L)1.0tu下游引物G/R(10.0P加l/L)1.0tuTaqD貼|^S|(5U/tU)0.3Pl驟DNA0.5Pl去離子水16.2kllTotal25Pl(4)混勻反應(yīng)體系，瞬時離心后上機，進行PCR循環(huán)反應(yīng)，條件如下3min鵬mr:30s退火601;42s32頓環(huán)延伸721;60s終末延伸72r;12ndn(5)ABI310測序儀自動熒光檢測并分析PCR產(chǎn)物①PCR產(chǎn)物變性取PCR產(chǎn)物，加入去離子甲酰胺及Genescan-500TEMRA內(nèi)標，混勻離心后，置于PCR儀中95。C變性5min，后迅速轉(zhuǎn)移至冰盒中以保持產(chǎn)物單鏈結(jié)構(gòu)。②ABI310測序儀毛細管電泳PCR產(chǎn)物變性后，剪去管蓋置入ABI310測序儀中進行自動毛細管電泳及熒光檢測，變性凝膠溫度設(shè)為6(TC，電泳時間28min。③GeneScan軟件分析產(chǎn)物大小PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后，采用ABI310DataCollection軟件收集熒光信號，將信號轉(zhuǎn)換為電泳圖象，并用ABI310GenescanAnalysis3.O軟件將圖象信號轉(zhuǎn)換為數(shù)值(表示擴增的片段長度大小)，對產(chǎn)物片段進行準確測定，然后根據(jù)片段長度大小推算CA重復(fù)的次數(shù)，從而確定其基因型。檢測結(jié)果及個體對乙肝病毒是否易感的判斷同實施例l。實施例3:采用STRs-PCR方法，按以下步驟檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點(IL-IO.G、IL-10.R)的基因型(1)模板DNA制備采取血樣，紅細胞懸液經(jīng)過酚-氯仿抽提基因組DNA后，用TE緩沖液溶解制備模板DNA。(2)IL-10.G與IL-IO.R兩個STR位點的引物設(shè)計利用PrimerPremier5軟件、參照文獻設(shè)計IL-10.G和IL-10.R位點的引物序列IL-10.G與IL-10.R微衛(wèi)星PCR擴增引物序列微衛(wèi)星引物序列長度熒&^￡IL-10.K5JCCCTCCAAAATCTATTTGCMAAG3'24bpHEX5'CTOXCCCAGTAAGTTTCATCAC3'23bPIL-10.G5JTTCCTCCCAGTTACAGTCT3'19bp5'CADCATCTCCACCACATA3'18bp(3)PC財廣增體系的組配10XPCR緩沖液、MgCl2(25mmol/L)、dNTPs(2.5mol/L)、上游引物G/R(10.0ymol/L)、下游引物G/R(10.0ymol/L)、TaqDNA聚合酶(5U/yl)、模板DNA和去離子水(4)混勻反應(yīng)體系，瞬時離心后上機，進行PCR循環(huán)反應(yīng)，條件如下IS3et493t:4ndn3ti96t:30s-退火64C48s延伸74t:60s—終末延伸74t:8min29^HI環(huán)(5)ABI310測序儀自動熒光檢測并分析PCR產(chǎn)物①PCR產(chǎn)物變性取PCR產(chǎn)物，加入去離子甲酰胺及Genescan-500TEMRA內(nèi)標，混勻離心后，置于PCR儀中變性，后迅速轉(zhuǎn)移至冰盒中以保持產(chǎn)物單鏈結(jié)構(gòu)。②ABI310測序儀毛細管電泳PCR產(chǎn)物變性后，置入ABI310測序儀中進行自動毛細管電泳及熒光檢測。③GeneScan軟件分析產(chǎn)物大小PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后，收集熒光信號，將信號轉(zhuǎn)換為電泳圖象，并用GenescanAnalysis3.O軟件將圖象信號轉(zhuǎn)換為數(shù)值(表示擴增的片段長度大小)，對產(chǎn)物片段進行準確測定，然后根據(jù)片段長度大小推算CA重復(fù)的次數(shù)，從而確定其基因型。檢測結(jié)果及個體對乙肝病毒是否易感的判斷同實施例l。實施例4:用于檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的試劑盒，包括(1)PC財廣增試劑IOXPCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司)；(2)DNA變性試劑去離子甲酰胺(ABI公司)；(3)ABI310毛細管電泳試劑內(nèi)標Genescan-500TEMRA(ABI公司)、7310P0P4分離膠(ABI公司)；(4)熒光引物(上?；瞪锕竞铣?。權(quán)利要求1.一種檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，所述方法為STRs-PCR，即短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星DNA聚合酶鏈式反應(yīng)，其特征在于包括以下步驟(1)采取血樣，紅細胞懸液經(jīng)過酚-氯仿抽提基因組DNA后，用TE緩沖液溶解制備模板DNA；(2)IL-10.G與IL-10.R兩個STR位點的引物設(shè)計IL-10.R微衛(wèi)星PCR擴增的引物序列為5′-CCCTCCAAAATCTATTTGCATAAG-3′、5′-CTCCGCCCAGTAAGTTTCATCAC-3′；IL-10.G微衛(wèi)星PCR擴增的引物序列為5′-TTCCTCCCAGTTACAGTCT-3′、5′-CACCATCTCCAGCACATA-3′；(3)PCR擴增體系的組配10×PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、上游引物G/R、下游引物G/R、TaqDNA聚合酶、模板DNA和去離子水；(4)混勻反應(yīng)體系，瞬時離心后上機，進行PCR循環(huán)反應(yīng)；(5)ABI310測序儀自動熒光檢測并分析PCR產(chǎn)物向PCR產(chǎn)物中加入去離子甲酰胺進行變性，然后置于ABI310測序儀中進行毛細管電泳及熒光檢測，再用GeneScan軟件對產(chǎn)物片段進行準確測定，后利用產(chǎn)物片段大小的數(shù)值進行基因分型。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于步驟(3)中的PC財廣增試劑為10XPCR緩沖液、25mmol/L的MgC12、2.5mol/L的dNTPs禾口5U/y1的TaqDNA聚合酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于步驟(4)中的PCR循環(huán)反應(yīng)條件為變性溫度9396°C、時間30s，退火溫度6065。C、時間4050s，延伸溫度7075。C、時間60s。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于PCR循環(huán)反應(yīng)條件為變性溫度95'C、時間30s，退火溫度61。C、時間45s，延伸溫度72。C、時間60s。5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于步驟(4)中模板DNA在變性之前于9395'C預(yù)變性35min;終末延伸溫度7075。C，維持515min。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于模板DNA在變性之前于94'C預(yù)變性5min;終末延伸溫度72°C，維持10min。7.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于步驟(4)中PCR循環(huán)次數(shù)為2535。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于PCR循環(huán)次數(shù)為30。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于步驟(5)中PCR產(chǎn)物變性時以Genescan-500TEMRA為內(nèi)標，置于PCR儀中95。C變性5min。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法，其特征在于步驟(5)中PCR產(chǎn)物進行毛細管電泳及熒光檢測時，變性凝膠溫度為6(TC，電泳時間28min。11.一種通過檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型判斷個體對乙肝病毒是否易感的方法，其特征在于攜帶IL-10.G459bp(19CA)、IL-10.G471bp(25CA)、IL-10.G473bp(26CA)的個體對乙肝病毒具有更低的易感性。12.檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括(1)PC財廣增試劑IOXPCR緩沖液、MgC12、dNTPs、TaqDNA聚合酶；(2)DNA變性試劑去離子甲酰胺；(3)ABI310毛細管電泳試劑內(nèi)標Genescan-500TEMRA、7310P0P4分離膠;(4)熒光引物。13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法或試劑盒在乙肝病毒感染的人群預(yù)防和控制以及遺傳咨詢中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測與乙肝病毒感染相關(guān)的IL-10基因兩個STR位點的基因型的方法、試劑盒及應(yīng)用。所述方法為STRs-PCR，包括模板DNA的制備，兩個STR位點的引物設(shè)計，PCR擴增體系的組配，PCR循環(huán)反應(yīng)，毛細管電泳及熒光檢測并分析PCR產(chǎn)物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將IL-10基因兩個STR位點與乙肝病毒感染的易感性聯(lián)系起來，確定了IL-10.G、IL-10.R是乙肝病毒感染的新型相關(guān)基因；并采用STRs-PCR方法，通過對IL-10基因IL-10.G和IL-10.R兩個STR位點的基因型進行檢測，從而可判斷個體對乙肝病毒的易感性，為乙肝病毒感染的人群預(yù)防和控制提供了新的遺傳咨詢內(nèi)容。文檔編號C12Q1/68GK101597651SQ20091030368公開日2009年12月9日申請日期2009年6月25日優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日發(fā)明者燕何,單可人,王嬋娟申請人:貴陽醫(yī)學(xué)院