專利名稱：一種雙水相萃取分離蛋白質(zhì)和酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)的萃取分離方法，特別涉及一種雙水
相萃取分離蛋白質(zhì)和酶的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)和酶在人類日常生活、疾病預(yù)防與治療以及工業(yè)生產(chǎn)中都發(fā)揮著重要的作 用，其提取分離是獲取這類物質(zhì)的必要手段。目前，工業(yè)上初步提取蛋白質(zhì)的主要方法有鹽 析法、等電點沉淀法和有機溶劑沉淀法。雖然這幾種方法都能在一定程度上達到分離的目 的，但仍然存在諸多缺點，如操作過程較為繁瑣，對操作條件要求也比較苛刻，而且分離過 程中容易發(fā)生蛋白變性，降低了蛋白分離提取的收率和效率。尋求操作簡單、生產(chǎn)周期短、 能耗小、操作條件溫和，且易于放大的分離方法一直是研究和開發(fā)的重要課題。
雙水相萃取技術(shù)是一種操作簡單、易于放大的分離方法，自20世紀60年代提出以 來得到廣泛關(guān)注。如N. L. P. Dallora等人利用聚乙二醇/氨基甲酸銨雙水相體系分別對 牛血清白蛋白、胰島素和溶菌酶的分配進行了考察(Biochemical Engineering Journal, 2007,34:92-97);杜學(xué)敏和李波等人用聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系分別對糖化酶和淀 粉酶的萃取分離進行了考察(中國釀造，2007，1 : 7 9 ;食品工業(yè)科技，2006， 8 :77-79)。 傳統(tǒng)的雙水相系統(tǒng)是由親水性的兩種聚合物或一種水溶性聚合物與一種無機鹽組成，雖然 此種體系具有條件溫和、易放大、可連續(xù)操作等優(yōu)點，但由于組分中的水溶性聚合物粘度較 大、目標產(chǎn)物需要反萃取，且昂貴的高聚物回收困難，因此大大限制了它的工業(yè)應(yīng)用。實 際上，親水性的短鏈醇與無機鹽也能形成雙水相，這種體系具有價格低廉、操作步驟簡單、 溶劑回收容易、分相時間短等優(yōu)勢。單羥基的短鏈醇與無機鹽形成的雙水相體系在生物 基化學(xué)品、氨基酸、抗生素、天然產(chǎn)物、中藥成分等的提取中得到了廣泛的應(yīng)用。申請人做 了大量的研發(fā)工作(中國專利:C訓(xùn)1012151A ;中國專利:C訓(xùn)1531652A ;Biotechnology Letters, 2008， 30 :2079-2084 ;Biotechnology Letters, 2009， 31 :371 76)。在蛋白質(zhì)分 離方面，A. Louwrier采用乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系對多種蛋白質(zhì)和酶的分配特性進行 了考察，發(fā)現(xiàn)此體系對穩(wěn)定性較好的蛋白有一定的分離效果(Biotechnology Techniques, 1998， 12 (5) :363-365)，我們也將該體系應(yīng)用于酵母來源重組白蛋白發(fā)酵液的雙水相固液 分離(中國專利CN200910010281.8)。但對于大多數(shù)的蛋白質(zhì)來說，較高濃度的甲醇、乙 醇、異丙醇等有機溶劑容易導(dǎo)致蛋白變性失活。因此，單羥基的短鏈醇/無機鹽雙水相體 系對大多數(shù)的蛋白質(zhì)分離來說不太適合。而叔丁醇和硫酸銨構(gòu)成的三相分配(Colloids andSurfaces A :Physicochemical and Engineering Aspects, 1998， 142 :295 02)，則利 用了大部分蛋白沉淀于相界面、且保留較高活性的特點，實質(zhì)上是鹽析與有機溶劑沉淀的 共同作用，缺乏對蛋白分離的選擇性，實際應(yīng)用會受到諸多限制。 多元醇是蛋白質(zhì)的羥基滲透劑，對蛋白質(zhì)具有保護作用，常被用作多肽、蛋白質(zhì)和 酶的穩(wěn)定劑和添加劑。如路福平等人提出了含有丙二醇的液體堿性蛋白酶復(fù)合穩(wěn)定劑的 方案(中國專利CN101215555A);(斯文德.卡斯加德等人提出向培養(yǎng)基中加多羥基化合物，如1，2丙二醇、1，3丙二醇等來增加多肽和蛋白質(zhì)的溶解度、減少結(jié)晶和沉淀(專利
W02004/003187英2004. 1.8);王瑋等人考察了一元醇、多元醇對溶菌酶的影響，證實了多 元醇在較高濃度下仍能較好地保持酶的穩(wěn)定性(化工學(xué)報，2006， 57(1) :74-78)。
這些多元醇，尤其是親水性的二元丙醇和丁醇，可以與無機鹽形成新型的雙水相 體系，既能保護蛋白的活性，又能達到萃取分離的目的，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種雙水相萃取分離蛋白質(zhì)和酶的方法，旨在低 成本、高收率和高效率地實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離提取，解決目前蛋白質(zhì)和酶分離提取中存在的
操作過程繁瑣、生產(chǎn)周期長、能耗大、操作條件苛刻，且操作過程中易出現(xiàn)蛋白質(zhì)及酶變性 失活等問題。 本發(fā)明的技術(shù)方案是 將多元醇與無機鹽按質(zhì)量百分比加入到蛋白質(zhì)或酶溶液中，攪拌均勻，室溫下靜 置分相，所述的多元醇的質(zhì)量百分比為10 40%，無機鹽質(zhì)量百分比為10 40%，萃取溫 度為15 3(TC，攪拌、靜置分相時間為0. 5 4. 0h。所分離的目標蛋白或酶通常分配在上 相(多元醇相)，雜質(zhì)在下相(無機鹽相)。所選用的多元醇可以是二元丙醇、二元丁醇、三 元丁醇、二元戊醇、三元戊醇、二甘醇、一縮二丙二醇的一種或幾種組合，如1，2-丙二醇、1， 3-丙二醇、l，4-丁二醇、l，2-丁二醇、l，3-丁二醇、2，3-丁二醇、l，2-戊二醇的一種或幾種 組合；所選用的無機鹽可以是鈉鹽、鉀鹽、銨鹽的一種或幾種組合，如氯化鈉、硫酸銨、硫酸 鈉、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫 銨、磷酸氫二銨的一種或幾種組合。 本發(fā)明的益處和效果是與傳統(tǒng)的提取分離方法相比，本發(fā)明具有操作步驟簡單、 周期短、萃取條件溫和、能耗低等優(yōu)勢；與親水性聚合物/無機鹽或聚合物/聚合物雙水相 體系相比，具有有機溶劑廉價易回收，粘度低傳質(zhì)分相快，萃取分離一步完成等優(yōu)勢；與單 羥基的低分子有機溶劑/無機鹽體系相比，蛋白質(zhì)或酶可以萃取到上相，且保留較高的活 性，更適合蛋白質(zhì)的工業(yè)化提取分離。
具體實施例方式以下結(jié)合技術(shù)方案詳細敘述本發(fā)明的具體實施方式
。所選取的體系和分相點均非
最優(yōu)，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。 實施例中提到的分配系數(shù)是上相蛋白濃度與下相蛋白濃度的比值；蛋白收率是上 相的蛋白量與體系總蛋白量的百分比；酶比活保留率是指上相中酶的比活力與萃取前酶比 活力的百分比。
實施例1 :牛血清白蛋白的萃取分離 將牛血清白蛋白配成1. 0g/L的蛋白溶液。采用兩種雙水相體系對其進行萃取分 離(一)、稱取2.4g磷酸氫二鉀和2.7g 1，3-丙二醇加入到4.9g配制好的蛋白溶液中； (二)、稱取2.0g磷酸氫二鉀和2.5g 2，3-丁二醇加入到5.5g配制好的蛋白溶液中；(三)、 稱取1. 7g磷酸氫二鉀和2. 2g 1，2-戊二醇加入到6. lg配制好的蛋白溶液中；(四)、稱取 2. 0g磷酸氫二鉀和2. 0g二甘醇加入到6. Og配制好的蛋白溶液中。將體系混勻，使固體鹽溶解，室溫下靜置2.0h。待體系穩(wěn)定后，取樣檢測上、下相中蛋白的濃度，計算分配系數(shù)、蛋白 收率，并對上相中的蛋白進行圓二色譜分析。結(jié)果表明，牛血清白蛋白在上述四個雙水相體 系中均分配在上相，分配系數(shù)分別為4. 92、7. 84、3. 85和5. 47，蛋白收率為86. 4%、91. 1%、 77. 6%和88. 6%。圓二色譜檢測表明，白蛋白的二級結(jié)構(gòu)保持不變。
實施例2 : a 、 13 -淀粉酶的萃取分離 (1) a -淀粉酶的萃取分離將a -淀粉酶(液化酶)配成約1. Og/L的酶溶液。采 用兩種體系對其進行萃取分離(一)、稱取1.8g硫酸鈉和2.3g 1，4-丁二醇加入到5.9g配 制好的酶溶液中；(二 )、稱取1. 8g硫酸鈉和2. 3g 1， 3- 丁二醇加入到5. 9g酶液中。將體 系混勻，使鹽溶解，室溫下靜置3. 0h。待體系穩(wěn)定后，測定上、下相中的蛋白濃度和酶活性， 計算蛋白和酶的分配系數(shù)、收率等。結(jié)果表明，a-淀粉酶主要分配在上相，兩個體系中蛋 白的分配系數(shù)分別為4. 54和7. 67，蛋白收率為83. 3%和87. 5%，酶比活保留率為97. 8% 和93. 3%。 (2) 13 -淀粉酶的萃取分離將13 -淀粉酶(糖化酶)配成約1. 0g/L的酶溶液。采 用兩種體系對其進行萃取分離( 一 )、稱取2. 0g硫酸銨和2. 8g 1，4- 丁二醇加入到5. 2g 配制好的酶溶液中；(二 )、稱取2. 0g硫酸銨和2. 8g 1， 3- 丁二醇加入到5. 2g酶液中。將 體系混勻，使鹽溶解，室溫下靜置3.0h。待體系穩(wěn)定后，測定上、下相中的蛋白濃度和酶活 性，計算蛋白和酶的分配系數(shù)、收率等。結(jié)果表明，P-淀粉酶主要分配在兩個體系的上相， 蛋白分配系數(shù)分別為5. 45和5. 32，蛋白收率為85. 6%和85. 3%，酶比活保留率為98. 3% 和90. 0%。 實施例3 :纖維素酶的萃取分離 將纖維素酶配成約0. 5g/L的酶溶液。稱取2. 8g 1， 4- 丁二醇和2. 0g硫酸銨加入 到5. 2g配制好的酶液中，混勻，待鹽溶解后靜置3. 5h。取樣測定上、下相中的蛋白濃度和酶 活性，計算蛋白和酶的分配系數(shù)、收率等指標。結(jié)果表明，纖維素酶主要分配在1，4-丁二醇 富集的上相，蛋白分配系數(shù)為5. 88，蛋白收率為86. 0%，酶比活保留率為74. 8% 。
實施例4 :菊粉酶的萃取分離 將菊粉酶配成約0. 5g/L的酶溶液。采用兩種體系對其進行萃取分離( 一 )、稱取 2. 0g硫酸銨和2. 8g 1， 4- 丁二醇加入到5. 2g配制好的酶溶液中；(二 )、稱取2. 0g硫酸銨 和2. 8g 1，3-丁二醇加入到5. 2g酶液中。將體系混勻，待鹽溶解后靜置2. 5h。取樣測定上、 下相中的蛋白濃度和酶活性，計算蛋白和酶的分配系數(shù)、收率等指標。結(jié)果表明，菊粉酶主 要分配在兩個雙水相體系的上相，蛋白分配系數(shù)分別為11. 05和6. 94，蛋白收率為91. 7% 和87. 4%，酶比活保留率為61. 2%和73. 7% 。
實施例5 :堿性脂肪酶的萃取分離 將堿性脂肪酶配成約0. 5g/L的酶溶液。稱取2. 2g磷酸氫二鉀和2. 5g 1， 4_ 丁二 醇加入到5. 3g配制好的酶液中，混勻，待鹽溶解后靜置4. 0h。取樣測定上、下相中的蛋白濃 度和酶活性，計算蛋白和酶的分配系數(shù)、收率等指標。結(jié)果表明，堿性脂肪酶主要分配在1， 4-丁二醇富集的上相，蛋白分配系數(shù)為4. 92，蛋白收率為84. 4%，酶比活保留率為99. 8% 。
權(quán)利要求
一種雙水相萃取分離蛋白質(zhì)和酶的方法，其特征在于將多元醇與無機鹽按質(zhì)量百分比加入到蛋白質(zhì)或酶溶液中，攪拌均勻，室溫下靜置分相，所述的多元醇的質(zhì)量百分比為10～40％，無機鹽質(zhì)量百分比為10～40％，萃取溫度為15～30℃，攪拌、靜置分相時間為0.5～4.0h。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙水相萃取分離蛋白質(zhì)和酶的方法，其特征還在于所 選用的多元醇是二元丙醇、二元丁醇、二元戊醇、三元丁醇、三元戊醇、二甘醇、一縮二丙二 醇的一種或幾種組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙水相萃取分離蛋白質(zhì)和酶的方法，其特征還在于所選用的無機鹽是鈉鹽、鉀鹽、銨鹽的一種或幾種組合。
全文摘要
一種雙水相萃取分離蛋白質(zhì)和酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。其特點在于將多元醇與無機鹽按比例直接加入到蛋白質(zhì)或酶溶液中，攪拌均勻，室溫下靜置，形成兩相，蛋白質(zhì)或酶主要分配到上相，且保留較高的活性，從而達到有效的分離提取目的。本發(fā)明的益處和效果在于開發(fā)了一種新的、操作簡便、條件溫和、生產(chǎn)成本低、易于產(chǎn)業(yè)化的蛋白質(zhì)雙水相萃取分離方法。
文檔編號C12N9/26GK101693735SQ20091030915
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者修志龍, 田明玉 申請人:大連理工大學(xué);