專利名稱：：檢測乙肝病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及檢測乙肝病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性的方法。
背景技術：
：乙型病毒性肝炎(Viralh印atitisB)是目前危害我國人民身體健康最為嚴重的感染性疾病。據(jù)調(diào)查，我國慢性乙肝病毒感染者多達1.2億以上，其中慢性乙肝患者達2000萬以上。部分攜帶者及慢性肝炎患者中可發(fā)展為重癥肝炎、肝硬化甚至肝癌，每年死于肝炎及其相關性疾病的患者不下30萬例。乙肝病毒感染至今尚無特效治療方法。由于HBV的宿主范圍狹窄，有明顯嗜肝性，體外培養(yǎng)困難，極大限制了HBV感染相關的分子機制研究和抗病毒藥物的療效評價。因此，迫切需要建立一種檢測乙肝病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性的方法。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，多種有關HBV復制的細胞模型及動物模型相繼建立，為HBV的研究和抗HBV藥物評價提供了十分有用的工具。主要包括天然HBV顆粒感染的成人肝細胞和胎肝細胞模型、HBV基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細胞模型、HBV轉(zhuǎn)基因動物模型、嵌合體小鼠模型、HBV感染樹駒模型等。但上述模型還存在諸多不足，如HBV存在時間短暫或制備周期長、費用高昂等問題。近年來，采用復制型HBV基因組檢測乙肝病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性成為研究的熱點，并顯示出廣闊的應用前景，其優(yōu)越性在于(l)所用HBV病毒基因組結構具有單一性和可操控性，并能產(chǎn)生全部HBVmRNA轉(zhuǎn)錄(3.5Kb、2.4Kb/2.1Kb、0.7Kb)、HBVDNA復制中間體和包括HBsAg/HBeAg在內(nèi)的HBV抗原蛋白的表達，較好地模擬HBV在HBV感染者體內(nèi)的復制過程，有望用于特定HBV病毒株感染的分子機制研究以及抗病毒藥物的療效評價。(2)研制周期短，費用低，且可以對HBV基因組進行體外定點誘變，就臨床研究中發(fā)現(xiàn)的可疑位點進行潛在耐藥性評估。(3)Tang和Priscilla等采用HBV基因組建立的復制HBV型小鼠模型，血清病毒學、生化學改變與HBV感染人的自然感染過程極為相似；Klein等應用該模型評價核苷類似物和siRNA對HBV復制的抑制作用。(4)HBV基因組可通過質(zhì)粒載體導入細胞內(nèi)，也可利用重組腺病毒載體制備攜帶HBV基因組的腺病毒。后者可高效率感染跨種屬細胞，如小鼠、大鼠、樹駒肝細胞、鴨肝細胞等；HBV復制水平和產(chǎn)量可通過調(diào)節(jié)HBV重組腺病毒的感染數(shù)量進行控制，便于選擇合適的HBV復制水平進行藥效試驗；還可用來研究不同種屬和器官源的細胞支持HBV復制的能力，為研究HBV感染種屬和器官特異性提供有力的工具。國內(nèi)外有關HBV復制能力的檢測方法主要集中在以下方面l.HBV基因片段的選擇HBV基因組全長3.2kb，分別調(diào)控3.5kb，2.4kb，2.lkb，0.7kb長度的HBVmRNA的轉(zhuǎn)錄，并編碼合成HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶、HBsAg及HBx蛋白。HBV全基因組、S基因組、X基因組的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠目前均有報道。Chisari等率先建立能表達HBsAg的HBV轉(zhuǎn)基因4小鼠模型，肝細胞呈現(xiàn)"毛玻璃樣"改變，最終結節(jié)再生；Wirth等用HBV調(diào)節(jié)成分或小鼠白蛋白啟動子控制的HBVS編碼區(qū)序列產(chǎn)生了HBs轉(zhuǎn)基因小鼠模型，所有肝細胞均表達HBsAg并分泌至血液循環(huán)。Guidotti等用含小鼠主要尿蛋白啟動子控制的C基因編碼區(qū)及SV40多聚腺苷酸尾的質(zhì)粒，顯微注射C57BL/XS幾胚胎后產(chǎn)生Mup-Core50系小鼠，通過與親代C57BL/6逆代雜交而繁殖，MC50鼠在小鼠主要尿蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄控制下表達HBV核心蛋白，出生時肝內(nèi)存在少量的核心蛋白，隨時間延長逐漸增多。屠亞軍等建立了人HBx基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型，所用HBV(adr)1.15kbDNA片段(病毒基因第7071856位核苷酸)含完整的HBx基因編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄增強子、主要RNA起始位點及多聚腺苷酸位點，結果小鼠肝、腎、睪丸組織內(nèi)檢出高水平0.7kb轉(zhuǎn)錄物，免疫沉淀法證實HBx蛋白的存在；小鼠4月齡時出現(xiàn)肝細胞癌前病變，810月齡時出現(xiàn)肝內(nèi)腫瘤結節(jié)；針對X基因起始區(qū)的反義核酸藥物可有效地抑制HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟HBx基因的表達。但上述HBV部分片段轉(zhuǎn)基因小鼠模型僅表達單一基因產(chǎn)物，不能產(chǎn)生病毒，因此不適宜研究病毒復制機制及抗病毒藥物療效的評價。現(xiàn)有資料表明，HBV基因組通過逆轉(zhuǎn)錄機制和基因組循環(huán)利用的方式，產(chǎn)生3.5kb前基因組RNA(pregenomicRNA)作為病毒逆轉(zhuǎn)錄復制的模板(即前基因組RNA)。在病毒復制過程中，HBV多聚酶結合于3.5kbmRNA5'末端的E莖-環(huán)結構，形成RNA/多聚酶復合物，并被核心抗原多肽二聚體包裹成未成熟的核殼體。在核殼體內(nèi)的HBVDNA多聚酶催化下，以3.5kbmRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成負鏈HBVDNA，然后再以負鏈DNA為模板合成正鏈HBVDNA。通過將大于HBV基因組全長的HBVDNA片段導入小鼠受精卵，能夠建立復制型HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。目前已導入的基因分別為HBV基因組的1.1、1.2、1.3、2.0個拷貝。研究顯示HBV基因組后連接有HBc和HBx基因的HBV1.3拷貝基因組轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的病毒復制水平最高，是HBV1.1、HBV1.2及HBV2.0的10100倍，與HBV慢性感染者體內(nèi)的病毒水平相近，能夠檢測到血清HBsAg和HBeAg，且可包裝成新的病毒顆粒。利用該轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)干擾素可激活宿主多個相關基因，也可通過誘生干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)和雙鏈RNA激活的蛋白激酶(PKR)發(fā)揮抗病毒作用。該模型是目前HBV相關肝病發(fā)病機制和抗病毒藥物作用機制研究中應用最廣泛的模型之一。2.載體的選擇和構建方法HBV基因組的載體常采用質(zhì)?；虿《据d體。因HBV復制模型需要排除外界因素干擾，HBV基因組在細胞或動物體內(nèi)復制和表達時，不能受到載體上外源啟動子序列的影響，唯有依靠HBV自身啟動子驅(qū)動而復制。常用質(zhì)粒載體包括pBluescript及pUC系列；病毒載體常用重組腺病毒載體。3.HBV基因組的導入途徑目前，包含HBV基因組的質(zhì)粒載體導入細胞的方式主要包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)染；導入動物體內(nèi)的方式包括尾靜脈高壓注射和直接注入肝臟內(nèi)等。包含HBV基因組的重組腺病毒可直接感染多個種屬的多種細胞；導入動物體內(nèi)的方法包括尾靜脈注射、腹腔注射以及直接注入肝臟內(nèi)等方式。表l肝炎病毒復制能力檢測的相關專利<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>雖然本領域在擴增病毒攜帶者離體樣本中的HBV基因組并建立復制體系進行特異性的毒復復制檢測和該病毒對抗病毒藥物的敏感性的研究方面取得了很大的進展，但是目前擴增病毒攜帶者離體樣本中的HBV基因組特別是1.3個拷貝的基因組的擴增制備方面速度慢，要采取多個擴增和制備步驟，另外，現(xiàn)有技術還需要將擴增得到的1.3個拷貝的基因組連接在所使用的載體自帶的啟動子之后以進行病毒復制，難以反應病毒復制的真實能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的第一個技術問題快速擴增制備1.3拷貝的HBV基因組。解決該問題的方案是提供一新的引物組，該引物組包括以下兩對引物擴增制備HBV2.4片段的引物對上游引物序列PFl:5，-CCTGCTTTAATGCCTTTGTATGC-3'(SEQIDNO.1);下游引物序列PRl:5'-TCCACCACGAGTCTAGACTCTGTGG-3'(SEQIDNO.2);擴增HBV1.7片段的引物對上游引物序列PF2;5'-CCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGA-3'(SEQIDNO.3);下游引物序列PR2:5'-CGGTGTCGAGGAGATCTCGAATAGA-3'(SEQIDNO.4)。本發(fā)明需要解決的第二個技術問題是快速檢測乙型肝炎病毒復制能力或抗病毒藥物敏感性。技術方案是提供一種檢測乙型肝炎病毒復制能力或抗病毒藥物敏感性的試劑盒，該試劑盒含有上述的引物組。該試劑盒也適用于快速建立HBV轉(zhuǎn)基因復制增殖體系同時本發(fā)明提供了擴增1.3拷貝HBV基因組的方法，包括以下步驟用上述的引物組從含HBV的樣品中擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上。其中，上述的1.3拷貝的HBV基因組是在HBV基因組后連接有HBc和HBx基因。其中，上述方法的擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上是通過以下方式完成取含HBV的樣品，用引物PF1、PR1進行PCR擴增，得到分子量約為2.4kb的目的條帶HBV2.4，連接到質(zhì)粒上保存；取含HBV的樣品，用引物PF2、PR2進行PCR擴增，得到分子量約為1.7kb的目的條帶HBV1.7，連接到質(zhì)粒上保存；采用HindIII、XbaI雙酶切連接有HBV2.4片段的質(zhì)粒，XbaI、PstI雙酶切連接有HBV1.7片段的質(zhì)粒，HindIII、PstI雙酶切目的載體，分離純化酶切后的目的載體、HBV2.4片段和HBV1.7片段，然后將HBV2.4片段、HBV1.7片段同時連接到目的載體上，即得。本發(fā)明同時也提供了一種快速檢測乙型肝炎病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性的方法。該方法包括以下步驟a、用上述的引物組從含HBV的樣品中擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上b、用該載體建立HBV轉(zhuǎn)基因復制增殖體系；c、用該HBV轉(zhuǎn)基因復制增殖體系進行乙型肝炎病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性的檢測。其中，上述的1.3拷貝的HBV基因組是在HBV基因組后連接有HBc和HBx基因?？捎捎帽景l(fā)明擴增HBV2.4片段的引物對擴增得到的HBV2.4片段的3'端與用本發(fā)明擴增HBV1.7片段的引物對所擴增得到的HBV1.7片段5'端連接得到。其中，上述方法步驟a中擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上是通過以下方式完成將含HBV的樣品用PF1、PR1進行PCR擴增，得到分子量約為2.4kb的目的條帶HBV2.4片段，連接到質(zhì)粒上保存；將含HBV的樣品用引物PF2、PR2進行PCR擴增，得到分子量約為1.7kb的目的條帶HBV1.7片段，連接到質(zhì)粒上保存；然后采用Hind111、XbaI雙酶切連接有HBV2.4的質(zhì)粒，XbaI、PstI雙酶切連接有HBV1.7的質(zhì)粒，HindIII、PstI雙酶切目的載體，分離純化酶切后的目的載體和HBV2.4、HBV1.7片段，然后將HBV2.4、HBV1.7同時連接到目的載體上，即得。所述目的載體是指希望含有1.3拷貝HBV基因組的載體。其中，上述方法步驟b所述的HBV轉(zhuǎn)基因復制增殖體系為肝癌細胞株H印G2細胞模型、鼠成纖維細胞NIH3T3細胞模型。其中，上述方法步驟a中擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上是通過以下方式完成本發(fā)明還提供了一種擴增制備樣品中HBV的1.3拷貝基因組的方法。該方法為將含HBV的樣品用上述PF1、PR1進行PCR擴增，得到分子量約為2.4kb的目的條帶HBV2.4，連接到質(zhì)粒上保存；將含HBV的樣品用上述引物PF2、PR2進行PCR擴增，得到分子量約為1.7kb的目的條帶HBV1.7，連接到質(zhì)粒上保存；然后采用HindIII、XbaI雙酶切連接有HBV2.4的質(zhì)粒，Xbal、PstI雙酶切連接有HBV1.7的質(zhì)粒，HindIII、PstI雙酶切目的載體，分離純化酶切后的目的載體和HBV2.4、HBV1.7片段，然后將HBV2.4、HBV1.7同時連接到目的載體上，即得。所述目的載體是指希望含有1.3拷貝HBV基因組的載體。進一步，上述目的載體為不含有外源啟動子的載體。由于HBV基因組全長3.2kb，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生3.5kb前基因組RNA作為病毒逆轉(zhuǎn)錄復制的模板(即前基因組RNA)。通過在HBV全長序列5'末端重復一個C基因和X基因及其增強子，形成約1.3拷貝(4.lkb)的HBV超長序列，不僅可以產(chǎn)生完整的HBV轉(zhuǎn)錄和復制過程，而且表現(xiàn)出明顯的嗜肝性。需要說明的是，本發(fā)明出現(xiàn)的4.lkb(即約4.lkb)、1.3拷貝(即約1.3拷貝)等對核苷酸片段長度的描述術語在分子生物學操作領域是常用而清楚的，不會影響本領域技術人員對本發(fā)明技術方案的實施。本發(fā)明創(chuàng)造性地采用了兩步擴增和體外重組方法，得到該1.3拷貝的HBV基因組。其特點在于巧妙利用HBV基因組序列的自身結構。經(jīng)分析，多數(shù)HBV基因組的X基因及其增強子上游存在單一的NsiI酶切位點，而在C基因的下游存在BglII酶切位點，在兩者之間有單一的XbaI酶切位點。上述特點使在不影響目標HBV基因組原有序列的前提下，構建1.3拷貝的HBV基因組的重組質(zhì)粒成為可能。本發(fā)明方法擴增HBV特定基因片段所適用的乙肝病毒DNA模板樣品可為來自于一般的HBV慢性感染患者的離體血清樣本，并不依賴于特定的個人。2對引物是根據(jù)對現(xiàn)有的公開資料的分析后設計得到，引物序列l(wèi)(PFl)和引物序列2(PR1)的5'-端分別包含NsiI酶切位點和XbaI酶切位點；引物序列3(PF2)和引物序列4(PR2)的5'-端分別包含BglII酶切位點和XbaI酶切位點。在本發(fā)明中，PF為上游引物序列的簡寫，PR為下游引物序列的簡寫。采用引物序列1、序列2組合，引物序列3、序列4組合分別擴增HBV基因片段1(HBV2.4，大小約2.4kb)及HBV基因片段2(HBV1.7，大小約1.7kb)，經(jīng)凝膠回收純化后連接至載體上并測序鑒定。攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組載體的構建是從上述克隆有HBV基因片段的載體上，采用HindIII和XbaI酶切并膠回收HBV2.4片段，PstI和XbaI酶切并膠回收HBVl.7片段。同步HindIII和PstI酶切并膠回收pUC18載體，將HBV2.4和HBV1.7同步連接到pUC18載體上，獲得包含約4.lkbHBV基因組(約1.3拷貝)的重組質(zhì)粒pHBV4.1。載體尤其是攜帶1.3拷貝HBV基因組目的載體的選擇pUC系列為最常用的質(zhì)粒載體，結構緊湊，僅含常用多克隆位點、氨芐青霉素抗性基因、PMB1復制子，幾乎不含多余的DNA片段。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明利用HBV基因組序列的自身結構特點，創(chuàng)造性地采用了兩步擴增和體外重組方法，發(fā)展了專用的高效引物對，在不影響目標HBV基因組原有序列的前提下，擴增得到目標樣品中HBV的1.3拷貝的HBV基因組，該基因組能在細胞模型或動物模型中產(chǎn)生HBVDNA復制中間體以及所有類型的HBVmRNA轉(zhuǎn)錄(3.5kb，2.4kb，2.lkb，0.7kb)，并編碼合成HBeAg、HBsAg，較好模擬HBV在宿主體內(nèi)的復制情況，進而能夠檢測該基因組的復制能力和抗病毒藥物敏感性。使用本發(fā)明方法制備的該1.3拷貝HBV基因組序列不需要外源啟動子的作用，能夠較好地模擬HBV的作用機制和對抗病毒藥物的反應。使用本發(fā)明方法制備1.3拷貝的HBV基因組過程簡便，周期短，費用低，且能夠?qū)BV基因組進行定點誘變。很好的克服了現(xiàn)有技術的多項缺陷，具有很好的應用前景。圖1乙肝病毒HBV的結構示意圖。圖2pT/HBV4.1質(zhì)粒的構建示意圖。圖3pMD-18T/HBV2.4質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳圖譜，其中M為分子量標準Marker依次為:19329bp、7743bp、6223bp、4253bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp、421bp;第1道為pMD-18T/HBV2.4用EcoRI/PstI雙酶切，得到2.69kb載體和2.4kb插入片段(部分重疊)；第2道為pMD-18T/HBV2.4用EcoRI/PstI和PvuI酶切，2.69kb載體進一步酶切為1.6kb、lkb和135bp片段。圖4EcoRI/PstI雙酶切pMD_18T/HBVl.7質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳圖譜，其中1、2、3道pMD-18T/HBVl.7質(zhì)粒酶切后，得到2.69kb的載體和1.7kb的插入片段；M為分子量標準Marker,大小依次為19329bp、7743bp、6223bp、4253bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp、421bp。圖5復制型HBV重組質(zhì)粒pUC18/HBV4.1(簡稱pHBV4.1)的酶切產(chǎn)物電泳圖譜，其中第1道:未切質(zhì)粒，第2道分子量標準Marker,大小依次為5kb，3kb，2kb，1.5kb，lkb，750bp，500bp，250bp，lOObp;第3道pHBV4.1質(zhì)粒HindIII和EcoRI雙酶切，得到2.6kb的載體和4.lkb片段。圖6pHBV4.1在非肝源細胞NIH3T3中轉(zhuǎn)錄和復制HBV的檢測情況，表明pHBV4.1在非肝源細胞NIH3T3中復制和轉(zhuǎn)錄水平低。泳道1為NIH3T3轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pHBV4.1，泳道2為NIH3T3轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pHBV4.1及HNF4表達質(zhì)粒，泳道3為NIH3T3轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pHBV4.1及RxRa/PPARa(+lig)表達質(zhì)粒。圖7pHBV4.1在肝源細胞H印G2中的轉(zhuǎn)錄和復制HBV的檢測情況。泳道1為H印G2細胞，泳道2為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pHBV4.1的H印G2細胞。圖8HBV復制模型中，抗病毒藥物ETV抑制pHBV4.1轉(zhuǎn)錄HBVRNA的情況，NS為口服磷酸鹽緩沖液的對照組，ETV指口服恩替卡韋組。圖9HBV復制模型中，抗病毒藥物ETV抑制pHBV4.1復制HBVRNA的情況，NS為口服磷酸鹽緩沖液的對照組，ETV指口服恩替卡韋組。具體實施例方式本發(fā)明方法可以通過以下方式進行具體的實施。1.攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組質(zhì)粒的構建(l)HBV基因組全長3.2kb，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生3.5kb前基因組RNA作為病毒逆轉(zhuǎn)錄復制的模板(即前基因組RNA)。通過在HBV全長序列5'末端重復一個C基因和X基因及其增強子，形成約1.3拷貝(4.lkb)的HBV超長序列，不僅可以產(chǎn)生完整的HBV轉(zhuǎn)錄和復制過程，而且表現(xiàn)出明顯的嗜肝性。(2)HBV特定基因片段的擴增根據(jù)已知乙肝病毒DNA設計2對引物，引物序列l(wèi)(PFl)和引物序列2(PR1)的5，_端分別包含NsiI酶切位點和XbaI酶切位點;引物序列3(PF2)和引物序列4(PR2)的5'-端分別包含BglII酶切位點和XbaI酶切位點。待擴增的乙肝病毒DNA模板樣品來自于經(jīng)確診的中國HBV慢性感染患者的血清。采用引物序列1、序列2組合，引物序列3、序列4組合分別擴增HBV基因片段1(HBV2.4，大小約2.4kb)及HBV基因片段2(HBV1.7，大小約1.7kb)，經(jīng)凝膠回收純化后連接至pMD-18T載體上并測序鑒定。(3)質(zhì)粒載體的選擇pUC系列為最常用的質(zhì)粒載體，結構緊湊，僅含常用多克隆位點、氨芐青霉素抗性基因、pMBl復制子，幾乎不含多余的DNA片段。(4)攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組質(zhì)粒的構建從上述克隆有HBV基因片段的pMD-18T載體上，采用HindIII和XbaI酶切并膠回收HBV2.4片段，PstI和XbaI酶切并膠回收HBV1.7片段。同步HindIII和PstI酶切并膠回收PUC18載體，將HBV2.4和HBV1.7同步連接到pUC18載體上，獲得包含約4.lkbHBV基因組(1.3拷貝)的重組質(zhì)粒pHBV4.1。2.建立1.3拷貝HBV基因組的細胞模型采用改良磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，將pHBV4.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株H印G2、非肝源性細胞選用鼠成纖維細胞NIH3T3。轉(zhuǎn)染3天后分離純化細胞RNA及HBVDNA復制中間體。采用Northern吸印雜交檢測HBV的3.5kb，2.4/2.lkb和0.7kbmRNA水平；以Southern吸印雜交檢測HBV復制中間體DNA和上清中病毒DNA水平；ELISA法檢測細胞HBsAg和HBeAg。觀察pHBV4.1是否僅在肝源細胞系中復制，而在非肝源性細胞不復制或復制水平低。將pHBV4.1質(zhì)粒和肝富集轉(zhuǎn)錄因子HNF4(或RxRa/PPARa)共轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，觀察是否影響PHBV4.1在非肝源細胞系中的復制。3.HBV動物模型的建立和應用采用近交系清潔級BALB/c小鼠行尾靜脈高壓注射法，建立復制型HBV動物模型。模型建立方式為將復制型HBV重組質(zhì)粒pHBV4.1經(jīng)小鼠尾靜脈短時間內(nèi)快速注射入BALB/C小鼠體內(nèi)，定期檢測肝臟HBVDNA復制中間體水平(Southern吸印雜交)、肝組織HBcAg和HBsAg表達(免疫組化)、血清中HBcAg和HBsAg表達(ELISA)。將HBV模型小鼠分為試驗組和對照組。試驗組口服恩替卡韋，對照組口服磷酸鹽緩沖液，觀察兩組小鼠體內(nèi)HBVDNA復制中間體的水平。實施例1乙肝病毒基因片段HBV2.4和HBV1.7的擴增及連接1.HBVDNA模板的制備選擇慢性乙肝病毒感染者混合血清，HBsAg(+)，HBVDNA載量在104107拷貝數(shù)/mL之間。取血清200ill，采用經(jīng)典酚/氯仿法抽提HBVDNA，并溶于TE(pH8.0)中。2.乙肝病毒基因片段1(HBV2.4)和基因片段2(HBV1.7)的擴增[OO78](1)引物合成根據(jù)GenBank中已經(jīng)報道的中國患者HBV感染主要型別(基因型B、C、D型)基因序列設計通用引物，委托上海生物工程有限公司合成(PAGE純化)，用純水溶解稀釋為lOiimol/L濃度，分裝貯存于_20°C。HBV2.4和HBV1.7擴增用引物、片段大小見下表。表lPCR擴增及連接引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>①HBV2.4的基因擴增取HBV模板3ii1，2.5mMdNTPmix8iil、25mMMgCl25ii1、TaKaRaLATaq2.5U及引物PF1、PR1進行PCR擴增。循環(huán)參數(shù)設置為:預變性94"C5min;94。Clmin，56。Clmin，72°C2min30sec，循環(huán)35次；72。C延伸10min。反應結束后，取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，切膠回收分子量約為2.4kb的目的條帶(HBV2.4)，按Omega膠回收試劑盒說明書操作。最后用30iU純水洗脫備用，結果見圖3。②HBV1.7的基因擴增引物使用PF2、PR2，循環(huán)參數(shù)設置為預變性94°C5min;94°Clmin，56。Clmin，72°C2min，循環(huán)35次；72。C延伸10min。PCR反應結束后，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化約1.7kb的目的條帶，結果見圖4。實施例2重組質(zhì)粒pMD-18T/HBV2.4和pMD-18T/HBV1.7的構建取膠回收純化的HBV2.4片段2iil禾PpMD-18T載體0.5iU，加H20補至5iU，再加入等體積的solI(Takara)，16。C保溫lh或連接過夜。將連接反應轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌JM109100iil，并涂布于LB/Ampr抗性平板上(預先涂布X-gal/IPTG)，37t:培養(yǎng)過夜。從LB/Ampr抗性平板中央挑取10個白色菌落轉(zhuǎn)小樣提取質(zhì)粒，取1P1進行瓊脂糖凝膠電泳，以空載質(zhì)粒為對照。如重組質(zhì)粒分子量大于空載質(zhì)粒，繼續(xù)用EcoRI和PstI雙酶切鑒定。當酶切后的載體和插入片段分子量大小與預期值相符時，繼續(xù)測序分析。經(jīng)測序證實，得到包含HBV2.4片段的pMD-18T/HBV2.4質(zhì)粒。取膠回收純化的HBV1.7片段，同上述方法獲得攜帶HBV1.7的pMD-18T/HBV1.7重組質(zhì)粒。實施例3重組質(zhì)粒pUC18/HBV4.1的構建采用HindIII、XbaI雙酶切pMD-18T/HBV2.4，XbaI、PstI雙酶切pMD-18T/HBV1.7，HindIII、PstI雙酶切pUC18載體，分離純化酶切后的pUC18載體和HBV2.4、HBV1.7片段。采用TakaraDNAligationKits,將HBV2.4、HBV1.7同時連接到pUC18載體上。將連接反應轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌JM109，并涂布于LB/Ampr抗性平板上(預先涂布X-gal/IPTG)，37t:培養(yǎng)過夜。從LB/Ampr抗性平板中央挑取10個白色菌落，小樣培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，如重組質(zhì)粒分子量大于空載質(zhì)粒，繼續(xù)用HindIII和EcoRI雙酶切鑒定。當酶切后的載體和插入片段分子量大小與預期值相符時，繼續(xù)測序分析，其序列見SEQIDN0.5。經(jīng)多克隆測序證實，獲得復制型HBV重組質(zhì)粒pUC18/HBV4.1(以下簡稱pHBV4.1)，酶切驗證結果見圖5。序列分析證實，其中含有的HBV2.4片段長度為2398bp，HBV1.7片段長度為1743bp。采用BioEdit7.01軟件的ClustalW程序，將HBV2.4、HBV1.7與GenBank數(shù)據(jù)庫中各基因型相對應的HBV標準株序列進行多序列比對后發(fā)現(xiàn)具有較好的一致性，其源病毒株為基因型B、血清亞型adw2。實施例4利用pHBV4.1轉(zhuǎn)染建立的HBV細胞模型非肝源性細胞選用鼠成纖維細胞株NIH3T3，肝源細胞選用人肝癌細胞株H印G2。11將1乂106細胞接種于10cm細胞培養(yǎng)皿，5XC02、37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824小時。采用現(xiàn)有的改良磷酸鈣法，將PHBV4.1轉(zhuǎn)染H印G2細胞和NIH3T3細胞(NIH3T3細胞采用pHBV4.1單獨轉(zhuǎn)染或與HNF4或與RxRa/PPARa共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染3天后，收集培養(yǎng)上清檢測HBsAg和HBeAg;刮取細胞后重懸于TBS中，以供提取細胞總RNA和HBVDNA復制中間體。NorthernBlot檢測HBVRNA:取15ii1RNA樣品與30ii1RNA上樣緩沖液，點樣于1X瓊脂糖甲醛凝膠上，60-100V5mA電泳5-6h。采用毛細管法轉(zhuǎn)移過夜，使核酸沉淀在尼龍膜上并紫外光交聯(lián)。SouthernBlot檢測HBVDNA復制中間體取30ii1DNA樣品和10XDNA上樣緩沖液4iU，點樣于1X瓊脂糖凝膠，60-100V5mA電泳5_6h。將凝膠依次0.25MHCl，1015min;變性液2030min;復性液30min。然后同樣毛細管法轉(zhuǎn)移至尼龍膜上并紫外光交聯(lián)。將HBVRNA和HBVDNA復制中間體的尼龍膜片置于預雜交液中，65°C(DNA)或42°C(RNA)預雜交過夜。然后用地高辛標記的探針Dig-HBV與固定在尼龍膜的核酸進行Southern吸印雜交和Northern吸印雜交(同時加入甘油醛_3_磷酸脫氫酶GAPDH標志探針)65。C(DNA)或42。C(RNA)雜交過夜。檢測試劑采用DIGLuminescentDetectionKit,按說明書操作，最終X線膠片曝光時間選擇30min4h。鼠成纖維細胞株NIH3T3檢測結果見圖6，上半部分表示NorthernBlot檢測結果，下半部分表示SouthernBlot檢測結果，表明pHBV4.1在非肝源細胞NIH3T3中復制和轉(zhuǎn)錄水平低，加入肝細胞核因子4(H印atocyteNuclearFactor-4，HNF-4)或維甲類X受體(RetinoidXrec印toralpha,RxR)a/過氧化物酶體增殖物活化受體(Peroxisom印roliferator-activatedrec印tor，PPAR)a后明顯提高。人肝癌細胞株H印G2檢測結果見圖7，上半部分表示NorthernBlot檢測結果，下半部分表示SouthernBlot檢測結果。結果表明HBV可以在非肝源細胞中復制，但復制依賴于細胞因子HNF4或RxRa/PPARa。實施例5HBV動物模型的建立和抗病毒藥物敏感性檢測選擇健康雄性BALB/c(H-2d)小鼠，6_8周齡，體重18_20g，清潔級，標準化環(huán)境飼養(yǎng)。將小鼠分為實驗組和對照組。實驗組分別注射10iig的pHBV4.1質(zhì)粒，從而建立HBV復制的動物模型；對照組注射同等劑量的不含HBV4.l基因組的空載質(zhì)粒。注射方式為小鼠尾靜脈高壓注射法。預實驗結果表明注射后34天，肝組織中可檢測到HBsAg、HBeAg(免疫組化)和HBVDNA復制中間體(SouthernBlot)。將上述小鼠模型按體重、血清HBeAg水平配對，分成試驗組和對照組，進行抗病毒藥物敏感性檢測。實驗組口服恩替卡韋75iig/kg(溶于300ii1生理鹽水)，每隔24小時一次，共3次；對照組每次注射300生理鹽水，注射方式同實驗組。末次注射給藥后24小時處死小鼠，NorthernBlot和SouthernBlot分別檢測肝組織中HBVRNA轉(zhuǎn)錄和HBVDNA復制中間體。NorthernBlot結果(圖8)提示ETV組的HBVRNA轉(zhuǎn)錄水平和生理鹽水對照組的差異不明顯；SouthernBlot結果(圖9)提示ETV組的HBVDNA復制受到顯著抑制。SEQUENCELISTING〈110〉四川大學華西醫(yī)院〈120〉檢測乙肝病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性的方法〈130〉A0900420k〈160>5〈211〉23〈212>DNA<213>artificial〈220〉〈223〉artificial〈400>1cctgctttaatgcctttgtatgc23〈210>2〈211〉25〈212>DNA<213>artificial〈220〉〈223>artificial〈400>2tccaccacgagtctagactctgtgg25〈210>3〈211>25〈212>DNA<213>artificial〈220〉〈223>artificial〈400>3ccacagagtctagactcgtggtgga25〈210>4〈211>25〈212>DNA〈213〉artificial〈220〉〈223〉artificial〈400>4cggtgtcgaggagatctcgaataga25〈210>5〈211>4141〈212>DNA〈213〉artificial〈220〉〈223>artificial〈400〉5atgcatgtetcaggcttttectttctcgccaacttecaaggcctttctea60tctgaaccttteccccgttgctcggcaacggcctggtctgtgccaagtgt120ttgctgacgc皿cccccactggttggggcttggccateggccatcagcgcatgcgtgg皿180cctttgtgtctcctctgccgatccatectgcggaactcctagccgcttgttttgctcgca240gcaggtctggggcaacactcatcgggactgacaattctgtcgtgctctcctgc皿gtete300catcatttccatggctgcteggctgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttg360tttecgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccctcccggggccgcttggggctct420accgcccgctcctccgcctcttgteccgaccgaccacggggcgcacctctctttecgcgg■actccccgtctgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacg540ttgratggagaccaccgtgaacgcccacaggaacctgcccaaggtcttgc3teag3ggac600tcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatecttcaaagactgtgtgtt660t朋tgagtggg郷agttggggg郷卿tteggtte皿ggtctttgtectegg郷ctg720teggcate皿ttggtgtgttC3CC3gC3CCatgcaactttttcacctctgccteatcatc780tcatgttcatgtcctectgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatg840gacattgacccgtete皿gaatttggagcttctgtggagttectctcttttttgccttct■gacttctttccttctettcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtetcgggaggcc960ttagagtctccgg皿cattgttcacctcaccatecggcactcaggc皿gctettctgtgt1020tggggtgagttgatgaatctagccacctgggtggg皿gteatttgg皿gatccagcatcc1080tagtcagctetgtcaacgtt皿tetgggccacaactettg1140tggtttcacatttcctgtcttacttttgggttcttgaatatttggtgtct1200tttggagtgtggattcgcactcctcctgcatetegaccaccaaatgcccctetcttetca1260acacttccggaaactectgttgttegacga卿ggc郷tcccctegaagaagaactccc1320tcgcctcgcagacg皿ggtctcaatcgccgcgtcgcag皿gatctcaatctcgggaatct1380caatgttagtattccttggaggga朋ctttacggggctttattcttctec1440ggteccttgcttteatccte朋tggca皿ctccttcttttcctgacattcatttgcaggt1500ggacattgttgategatgteagcaatttgtggggcccctt3cagte皿tg1560attetgcctgcteggttttetcccaatgtttgcccttega1620te皿gggatcaaaccgtettatccagagtetgtegtteatcattactccc3g3CgCg3C31680ttatttecacactctttgga郷cggggatcacgtegcgc1740ctcattttgcgggtcaccatattcttgggaac^gatcteC3gC3tggg3ggttggtctt1800ccaaacctcg朋皿ggcatggggac朋atctttctgtccccaatcccctgggattcttcc1860ccgatcatcagttggaccctccaactcagatgggacctca19203CCCgC3C皿ggac皿ctggccggacgcca織郷tgggttcgggcteg1980ggttcacccctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggcctectca2040caactgtgccagcagctcctcctcctgcctccaccaatcggC3gtC3gg33ggcagtcte2100ctcccttatctccacctcte3ggg3C3CtCatcctcaggccatgc皿tgg皿CtCC3CC32160ctttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggctctgtectttcctgctggtggct2220ccagttcagg朋C3gtg3gCcctgctcagaatectgtctctgccatetcgtcaatcttet2280cg皿gactggggaccctgteccg皿catggatcaggactccteggacccc2340tgctcgtgtt織ggcggggtttttcttgtcctcacaateccacagagtc2400tegactcgtggtggacttctctcaattttcteggggg雄acccgtgtgtcttggccaaa2460attcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggtt2520atcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatcttcctctgcatcctgctgctetgcctca2580tcttcttgttggttcttctggactetc皿ggtetgttgcccgtttgtcctcteattccag2640gatcatcaac朋CC3gC3CCggaccatgraaaacctgcacgactcctgctc皿gg皿cct2700ctatgtttccctcatgttgcctecggacggaaactgcacctgtettccca2760tcccatcatcttgggctttcgc皿皿tecctetgggagtgggcctcagtccgtttctctt2820ggctcagtttactegtgccatttgttcagtggttcgtegggctttcccccactgtctggc2880tttcagttetatggatgatgtggttttgggggccaagtctgtecaacatcttgagtccct2940ttatgccgctgtteccaattttcttttgtctttgggtetecattteaaccetcacaaaac3000ggatettccctteacttcatgggatetgteattgggagttggggc織tt3060gCC3C3gg皿catettgtecaatgtgttttagg朋acttcctgte朋cag3120gcctettgattgga皿gtettgtgggtcttttggggtttgccgccccttt3180cacgcaatgtggatetcctgcttteatgcctttetatgcatgtetec皿gc朋朋caggc3240ttttectttctcgccaacttacaaggcctttcteagte皿caatatctgaaccttteccc3300cgttgctcggcaacggcctggtctgtgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggttg3360gggcttggccateggccatcagcgcatgcgtggaacctttgtgtctcctctgccgatcca3420tectgcgg皿ctcctegccgcttgttttgctcgcagraggtctggggc朋cactcatcgg3480gactgac^ttctgtcgtgctctcccgcaagtetecatcatttccatggctgcteggctg3540tgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtttecgtcccgtcggcgctgaatcc3600cgcggacgacccctcccggggccgcttggggctctaccgcccgctcctccgcctcttgta3660ccgaccgaccacggggcgracctctctttecgcggactccccgtctgtgccttctcatct3720gccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatgg3g3CC3Ccgtgaacgcc3780C3C3gg朋CCtgcccaaggtcttgcateagaggactcttggactttcagc朋tgtc朋cg3840accgaccttgaggcatacttgtgttteatgagtggg郷3gttgggggElg3900g卿tteggttaaaggtctttgtecteggaggctgteggcgtgttcacca3960gcaccatgcaactttttcacctctgccteatcatctcatgttcatgtcctactgttcaag4020cctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatggacattgacccgteta朋g朋tttg4080gagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatc4140t414權利要求擴增制備1.3拷貝的HBV基因組的引物組，包括以下兩對引物擴增制備HBV2.4片段的引物對上游引物序列PF15’-CCTGCTTTAATGCCTTTGTATGC-3’；下游引物序列PR15’-TCCACCACGAGTCTAGACTCTGTGG-3’；擴增HBV1.7片段的引物對上游引物序列PF2；5’-CCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGA-3’；下游引物序列PR25’-CGGTGTCGAGGAGATCTCGAATAGA-3’。2.檢測乙型肝炎病毒復制能力或抗病毒藥物敏感性的試劑盒，其特征在于含有權利要求l所述的引物組。3.擴增1.3拷貝HBV基因組的方法，其特征在于包括以下步驟用權利要求1所述的引物組從含HBV的樣品中擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上。4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述的1.3拷貝的HBV基因組是在HBV基因組后連接有HBc和HBx基因。5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上是通過以下方式完成取含HBV的樣品，用引物PF1、PR1進行PCR擴增，得到分子量約為2.4kb的目的條帶HBV2.4，連接到質(zhì)粒上保存；取含HBV的樣品，用引物PF2、PR2進行PCR擴增，得到分子量約為1.7kb的目的條帶HBV1.7，連接到質(zhì)粒上保存；采用HindIII、XbaI雙酶切連接有HBV2.4片段的質(zhì)粒，XbaI、PstI雙酶切連接有HBV1.7片段的質(zhì)粒，HindIII、PstI雙酶切目的載體，分離純化酶切后的目的載體和HBV2.4片段、HBV1.7片段，然后將HBV2.4片段、HBV1.7片段同時連接到目的載體上，即得。6.檢測乙型肝炎病毒復制能力或抗病毒藥物敏感性的方法，其特征在于包括以下步驟a、用權利要求1所述的引物組從含HBV的樣品中擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上；b、用該載體建立HBV轉(zhuǎn)基因復制增殖體系；c、用該HBV轉(zhuǎn)基因復制增殖體系進行乙型肝炎病毒復制能力或抗病毒藥物敏感性的檢測。7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟a擴增制備1.3拷貝HBV基因組并連接到目的載體上是通過以下方式完成取含HBV的樣品，用引物PF1、PR1進行PCR擴增，得到分子量約為2.4kb的目的條帶HBV2.4，連接到質(zhì)粒上保存；取含HBV的樣品，用引物PF2、PR2進行PCR擴增，得到分子量約為1.7kb的目的條帶HBV1.7，連接到質(zhì)粒上保存；采用HindIII、XbaI雙酶切連接有HBV2.4片段的質(zhì)粒，XbaI、PstI雙酶切連接有HBV1.7片段的質(zhì)粒，HindIII、PstI雙酶切目的載體，分離純化酶切后的目的載體、HBV2.4片段和HBV1.7片段，然后將HBV2.4片段、HBV1.7片段同時連接到目的載體上，即得；所述的1.3拷貝的HBV基因組是在HBV基因組后連接有HBc和HBx基因。8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述目的載體為不含有外源啟動子的載體。9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于步驟b所述的HBV轉(zhuǎn)基因復制增殖體系為肝癌細胞株H印G2細胞模型、鼠成纖維細胞NIH3T3細胞模型。全文摘要本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有乙型肝炎病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性步驟煩瑣，結果不夠準確的缺陷。解決該問題的技術方案是提供一種1.3拷貝的HBV基因組的引物組，包括擴增制備HBV2.4片段的引物對和擴增HBV1.7片段的引物對。同時還提供了包含上述引物組的試劑盒以及一種檢測乙型肝炎病毒復制能力和抗病毒藥物敏感性的方法。本發(fā)明方法利用HBV基因組序列的自身結構特點，創(chuàng)造性地采用了兩步擴增法擴增得到1.3拷貝的HBV基因組，過程簡便，周期短，費用低，很好的克服了現(xiàn)有技術的缺陷，有好的應用前景。文檔編號C12R1/93GK101705226SQ20091031073公開日2010年5月12日申請日期2009年12月1日優(yōu)先權日2009年12月1日發(fā)明者何芳,劉鳳君,劉聰,周陶友,唐紅,鄧麟宇,陳恩強申請人:四川大學華西醫(yī)院