專利名稱：高純度膠原蛋白的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明有關(guān)于一種膠原蛋白制備方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種纖維蛋白(fibrous protein)，其可在軟骨、筋腱、真皮組織以及 其它結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)。膠原蛋白已廣泛運(yùn)用于工業(yè)以及醫(yī)藥。膠原蛋白一般藉由可將非膠原蛋白物質(zhì)移除的反復(fù)酸溶或酵素處理，而由結(jié)締組 織純化出來(lái)。此種處理需重復(fù)數(shù)次以改善膠原蛋白的純度。重復(fù)處理不僅會(huì)拉長(zhǎng)純化工藝， 更會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白產(chǎn)率低。因而需要一種新穎的高純度膠原蛋白制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的特征為一種高純度膠原蛋白制備方法，其先由一結(jié)締組織(例如 真皮組織或筋腱)制造一膠原蛋白基質(zhì)，然后再由基質(zhì)萃取出膠原蛋白。詳細(xì)言之，此方法 包含下列步驟⑴提供一結(jié)締組織，其表面積為20平方毫米(mm2)至2平方公尺(m2)(例 如，25平方公厘至900平方公分)；(ii)以一第一酸液使該結(jié)締組織的體積至少膨脹百分 之五十(較佳為100%至500% )而形成一膨脹結(jié)締組織；(iii)清洗該膨脹結(jié)締組織以除 去非膠原蛋白物質(zhì)藉此形成一膠原蛋白基質(zhì)；以及(iv)利用一萃取液從該膠原蛋白基質(zhì) 萃取出膠原蛋白，藉此制造一含有膠原蛋白的溶液。上述的膨脹步驟可藉由將結(jié)締組織浸泡于該第一酸液而達(dá)成。較佳地，上述的浸 泡步驟藉由同時(shí)將一液體噴射至結(jié)締組織或同時(shí)以一超音波處理結(jié)締組織而達(dá)成。上述的 結(jié)締組織源自真皮組織或筋腱。該第一酸液的PH值為1至6 (較佳為2至4)，且該第一酸 液實(shí)質(zhì)上不包含鹽類，也就是說(shuō)溶液中沒有鹽類成分，或者是鹽類濃度非常低，使得溶液的 離子強(qiáng)度不大于0. 005M。上述的酸液可由甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷 酸或其混合物來(lái)制備。較佳的是，上述酸液為0. 1-6M的醋酸溶液。在上述的膨脹步驟之后，將膨脹后的結(jié)締組織加以清洗以除去非膠原蛋白物質(zhì)， 藉此制備出一膠原蛋白基質(zhì)。上述的清洗步驟可藉由將該膨脹結(jié)締組織浸泡于一清洗液 而達(dá)成，該清洗液可以進(jìn)一步包含清潔劑、蛋白水解酶或其混合物；在上述浸泡或清洗步驟 中，可將該膨脹結(jié)締組織以超音波處理或以液體噴射處理。然后將前述膠原蛋白基質(zhì)浸于一萃取液中，藉此形成一含有膠原蛋白的溶液。該 萃取液可以是含有弱有機(jī)酸(例如甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸或其 混合物)的酸液，該酸液的PH值適于溶解膠原蛋白(較佳為小于4)。此外，該萃取液可以 是含有鹽(例如氯化鈉或氯化鉀)的中性溶液(例如0. 05M的Tris緩沖溶液)，該鹽的濃 度適于溶解膠原蛋白(例如大于1M)。在一實(shí)施例中，膠原蛋白藉由下列步驟從該膠原蛋白 基質(zhì)萃取出研磨該膠原蛋白基質(zhì)而制得膠原蛋白粉末，以及將該膠原蛋白粉末與該萃取 液混合而制得該含有膠原蛋白的溶液。該研磨步驟以及該混合步驟可同時(shí)進(jìn)行。
接著，可以習(xí)用方法將膠原蛋白由該含有膠原蛋白的溶液中沉淀。在一實(shí)施例中， 該膠原蛋白藉由透析法沉淀。在另一實(shí)施例中，將該含有膠原蛋白的溶液與一鹽以IM至4M 的濃度混合來(lái)使膠原蛋白沉淀；如此獲得的膠原蛋白較佳需進(jìn)行脫鹽。在又一實(shí)施例中，將 該含有膠原蛋白的溶液的PH值調(diào)整至4. 5到8來(lái)使膠原蛋白沉淀。制得的膠原蛋白可加以冷凍干燥、空氣干燥或真空干燥而形成膠原蛋白粉末、膠 原蛋白海綿狀物(sponge)、膠原蛋白片狀物或膠原蛋白膜。制得的膠原蛋白粉末可分散 于一酸液中而形成一膠原蛋白分散溶液，制得的膠原蛋白粉末亦可以蛋白水解酶處理以 制造無(wú)端肽膠原蛋白(atelop印tide collagen)。蛋白水解酶的例子包含，但不限于，胃 蛋白酶(ρ印sin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰凝乳蛋 白酶(chymotrypsin)、膠原蛋白酶(collagenase)、無(wú)花果蛋白酶(f icin)、木瓜蛋白酶 (papain)、勝月太酶(peptidase)、蛋白酶 A(proteinaseA)、蛋白酶〖(proteinase K)、胰蛋白 酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbialproteases)及其混合物。下文特舉本發(fā)明一些實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明如后。本發(fā)明的其他目的或特征將呈現(xiàn)于 后述實(shí)施例以及后附的申請(qǐng)專利范圍。
具體實(shí)施例方式膠原蛋白長(zhǎng)約300奈米(nm)，直徑約1. 5奈米(nm)。大量的膠原蛋白分子形成膠 原蛋白纖維絲，而一束膠原蛋白纖維絲形成一膠原蛋白纖維。膠原蛋白分子之間以及膠原 蛋白分子內(nèi)部存在著共價(jià)的交聯(lián)，藉此在結(jié)締組織內(nèi)形成了纖維狀的網(wǎng)絡(luò)。在此所述為一種高純度膠原蛋白制備方法，其直接先由一結(jié)締組織制造一膠原蛋 白基質(zhì)，然后再由該膠原蛋白基質(zhì)萃取出膠原蛋白。制備膠原蛋白基質(zhì)起始材料(亦即結(jié)締組織)可取自于動(dòng)物，例如牛、豬、馬、羊、雞、鴨、火雞、鵝、鯨 魚或者鯊魚等畜類或魚類。適用于本發(fā)明方法的結(jié)締組織包含，但不限于，真皮組織、皮下 組織、韌帶、筋腱、腱膜、軟骨以及骨頭組織。假如需要的話，可先用人工[例如藉由粗略的 切開(grossdissection)]或機(jī)械清理結(jié)締組織以除去不需要的材料，例如脂肪及脂質(zhì)。在 一實(shí)施例中，真皮組織取自新鮮的動(dòng)物皮，將動(dòng)物皮除去脂質(zhì)、以鹽水(saline)清洗皮數(shù) 次后，以一植皮刀(dermatome)除去動(dòng)物皮的表面層即可獲得真皮組織。所得的真皮組織 可用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)一步清洗。假如需要，結(jié)締組織可以先用一適合的有機(jī)溶劑或者是一有機(jī)溶劑與水的混合液 進(jìn)行處理，使有機(jī)溶劑可以滲透入結(jié)締組織。有機(jī)溶劑包含，但不限于醇、酮、丙酮、乙腈、氯 仿、N，N- 二甲基甲酰胺、二甲亞砜或其混合物。當(dāng)使用有機(jī)溶劑與水的混合液時(shí)，有機(jī)溶劑 與水的比例高于1 5(例如1 4、1 1或4 1)。當(dāng)結(jié)締組織含有毛發(fā)或毛根時(shí)，可先以一微堿溶液或蛋白水解酶處理以除去毛 發(fā)或毛根，蛋白水解酶可為，例如分散酶(dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶 (papain)、胃蛋白酶(ρ印sin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain), 無(wú)花果蛋白酶(ficin)或其混合物。接著，將上述任一結(jié)締組織浸泡于適量酸液中，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，使得結(jié)締組織 膨脹到所需的標(biāo)準(zhǔn)，亦即比原厚度至少增加50 %的厚度(較佳為原厚度的2-5倍)。上述的酸液可以一有機(jī)酸來(lái)制備，有機(jī)酸可為，例如甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、 磷酸或其混合物。在一實(shí)施例中，酸液可為濃度0. 1-6M(較佳為0. 1-2M或0. 5-1. 25M)的 醋酸。為了獲得較佳的膨脹效果，本發(fā)明所使用的酸液實(shí)質(zhì)上不包含鹽類。在上述的膨脹步驟中，結(jié)締組織是懸浮于以上所述的酸液中。假如需要的話，可利 用一或數(shù)道液體來(lái)處理結(jié)締組織，促使酸液滲透入結(jié)締組織并縮短膨脹結(jié)締組織至所需標(biāo) 準(zhǔn)的時(shí)間。上述的液體可以由一容器的噴嘴或噴孔來(lái)噴出，上述的酸液及結(jié)締組織置放于 該容器內(nèi)?；蛘撸虼送?，可將超音波(由一超音波震動(dòng)裝置產(chǎn)生)或高頻率水波(藉由一電 磁場(chǎng)產(chǎn)生)施加于浸泡于酸液中的結(jié)締組織，以促使酸液滲透入結(jié)締組織。使用一清洗液來(lái)清洗上述膨脹步驟所制備的膨脹結(jié)締組織，以實(shí)質(zhì)上除去上述膨 脹結(jié)締組織中的非膠原蛋白物質(zhì)，藉此以制備一膠原蛋白基質(zhì)。所述的清洗液可含有清潔 劑、螯合劑、蛋白酶或其混合物。用以制備清洗液的范例清潔劑包含，但不限于十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulphate, SDS)、Tego化合物[例如介面活性劑Tween-80、非離子清潔劑TffR(Triton W. R. 1339)、對(duì)-異辛烷基聚氧-乙烯苯酚聚合物(p-isooctylpolyoxy-ethylene phenol polymer)與四丁酚醛(Triton A20)表面活性劑]、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、溴化十六燒基三甲基銨(cetyltrimethyl ammonium bromide)、二辛燒鈉磺基 琥珀酸酯(dioctyl sodium sulphosuccinate)、品名為「Emasol 4130J的聚氧基乙烯山梨 糖醇油酸酉旨(polyoxyethylene sorbitan monoleate)介面活性齊[J、品名為「Lubrol W」的 非離子介面活性劑、品名為「Nonidet P40」的非離子介面活性劑)。在一實(shí)施例中，使用一 含有SDS濃度0. 01 %至10%的清洗液，在4°C至45°C溫度下處理所述膨脹結(jié)締組織1小時(shí) 至150小時(shí)。所述清潔液所含的螯合劑包含，但不限于乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetra-acetic acid, EDTA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十 二燒基 _1，4，7，10，-四乙酸(1， 4,7, 10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, D0TA)>1,4,7,10-四 氮雜環(huán)十 二燒基_1，4，7，10，-四亞甲基磷酸[1，4，7，10-tetraazacyclododecane-l， 4,7,10-tetrakis (methylenephosphonic acid), D0TP]、環(huán)己二胺四醋酸(trans-1， 2-diaminocyclohexantetra-acetic acid, CDTA)、4,5_ 二 輕基苯-1,3- 二石黃酸(4,
5-dihydroxybenzene-l,3-disulphonicacid, Tiron)> 硫月尿(thiourea)>8- ψ 基
啉-5-石黃酸(8-hydroxyquinoline-5-sulphonic acid)、3,6_ 二石黃基 8_ 二輕基萘(3,
6-disulpho-l,8-dihydroxy-naphthalene)> EriochromeschwarzT[1-(1-徑基 ~2~ 蔡基 偶氮)-2-羥基-5-硝基-4-萘磺酸]{Eriochromeschwarz T [1- (l-hydroxy-2-naphth ylazo)-2-hydroxy-5__nitro-4-naphthalenesulphonic acid]}、紅紫酸 I安(ammonium purpurate)等。較佳的螯合劑為0. OlmM至IOOmM的EDTA?；蛘?，或此外，清洗液可包含一或多種蛋白水解酶，例如無(wú)花果蛋白酶(ficin)、 胃蛋白酶(P印Sin)、胰蛋白酶(trypsin)、分散酶(dispase)以及溶血素(hermolysin), 以除去連接于細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)、其它非膠原蛋白的蛋白質(zhì)與膠原蛋白分子的末端肽 (telopeptide)。在此技術(shù)領(lǐng)域中，有限度的酵素切割(亦即使非膠原蛋白的蛋白質(zhì)降解但 仍保持膠原蛋白纖維的完整性))的條件是眾所皆知的。
在清洗步驟中，可將所述膨脹的結(jié)締組織浸泡于前面所提到酸液之中的任一種一 段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。在一實(shí)施例中，將一或多道液體自一噴嘴或噴孔噴射至所述的結(jié)締組織，以 促進(jìn)非膠原蛋白物質(zhì)的移除。所述液體可為水、包含清潔劑的溶液或包含酵素的溶液。在 另一實(shí)施例中，使用超音波處理浸泡于清洗液中的膨脹結(jié)締組織，可改善清洗效率。習(xí)知用以將非膠原蛋白物質(zhì)由結(jié)締組織移除的方法(例如美國(guó)專利第 7，498，412,5, 993，844以及5，374，539號(hào))亦可用于本發(fā)明。可將已經(jīng)進(jìn)行過(guò)上述清洗步驟的膠原蛋白基質(zhì)在液態(tài)氮中冷凍干燥法進(jìn)行保 存。或者，膠原蛋白基質(zhì)可浸泡于一磷酸鹽緩沖溶液中并儲(chǔ)存于4°C的溫度環(huán)境。當(dāng)有需 要時(shí)，可藉由一般的化學(xué)或物理方法使上述的膠原蛋白基質(zhì)交聯(lián)化。用于使上述膠原蛋 白基質(zhì)交聯(lián)化的交聯(lián)劑包含戊二醛(glutaraldehyde)、甲醛(formaldehyde)、碳二酰胺 (carbodiimide)或其它聚環(huán)氧樹脂化合物(poly印oxy compound)，例如乙二醇二縮水甘油 Bi (glycol diglycidyl ether)、聚醚多縮水甘油醚(polyol polyglycidylether)、二羧酸 二縮水甘油酉旨(dicarboxylic acid diglycidyl ester)。前述用以制備膠原蛋白基質(zhì)的方法在至少兩個(gè)面向上不同于習(xí)知的方法。第一， 本發(fā)明的方法不需要嚴(yán)苛的物理或化學(xué)處理法(例如研磨、均質(zhì)化或酸/堿降解)，這些方 法都會(huì)破壞結(jié)締組織中膠原蛋白纖維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。第二，用以膨脹結(jié)締組織的酸液實(shí)質(zhì)上 不包含鹽類，而一般習(xí)知方法是利用鹽類來(lái)穩(wěn)定膠原蛋白纖維。從膠原蛋白基質(zhì)萃取出膠原蛋白以前述方法制備的膠原蛋白基質(zhì)可以被研磨，例如以震蕩、攪拌、均質(zhì)化、絞碎、撕 裂、切割、磨碎、切或其混合方式。將膠原蛋白基質(zhì)(完整的或研磨過(guò)的)浸于一萃取液中 一段適當(dāng)期間，以允許溶解最大量的膠原蛋白。在一實(shí)施例中，將研磨過(guò)的膠原蛋白基質(zhì)與 萃取液在溫和的機(jī)械動(dòng)作(例如震蕩、攪動(dòng)或攪拌)下混合以促進(jìn)膠原蛋白溶解。該萃取液可以是一酸液或含有鹽的中性溶液，其pH值或鹽濃度適于溶解膠原蛋 白。適用于制備萃取液的酸包含，但不限于，甲酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、 磷酸或其混合物。當(dāng)使用醋酸時(shí)，其濃度為0. 1_6M(較佳為0. 1-2M或0. 5-1. 25M)。例示的鹽 包含氯化鈉以及氯化鉀，其濃度為0. 1_2M(較佳為1M)。例示的中性溶液包含磷酸緩沖溶液 (PBS)以及Tris緩沖溶液。當(dāng)使用pH值7-8的中性緩沖溶液，可加入一種或多種中性鹽(例 如IM氯化鉀或氯化鈉)以增加膠原蛋白在緩沖溶液中的溶解度。其它適用于制備萃取液 的緩沖溶液包含，但不限于，甘胺酸-HCl緩沖溶液(glycine-HCl buffer)、Clark and Lubs 緩沖溶液、檸檬酸-Na2HPO4 緩沖溶液(citric acid-Na2HP04 buffer), Britton-Robinson 緩沖溶液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(citric acid-sodium citrate buffer)、貝 他-貝他，-二甲基戊二酸-NaOH 緩沖溶液(beta :beta' -dimethylglutaricacid-NaOH buffer)、醋酸鈉-檸檬酸鈉緩沖溶液(sodium acetate-sodiumcitrate buffer)、琥珀 酸-NaOH 緩沖溶液(succinic acid-NaOH buffer)、二 甲胂酸-HCl 緩沖溶液(sodium cacodylate-HCl buffer)、馬來(lái)酸氧鈉-NaOH 緩沖溶液(sodium hydrogen maleate-NaOH buffer)、Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖溶液、碳酸鈉-5% CO2 緩沖溶液(sodium bicarbonate-5% CO2 buffer)、亞胺唑(咪唑)-HCl 緩沖溶液[imidazole (glyoxaline)-HCl buffer],2,4, 6-三甲基吡啶(可力丁)緩沖溶液[2，4，6-trimethylpyridine(collidine)buffer]、三 乙醇胺鹽酸鹽-NaOH 緩沖溶液(triethanolaminehydrochloride-NaOH buffer)、5，5- 二乙基巴比土酸鈉鹽緩沖溶液(sodium5，5' -diethyl barbiturate buffer)、二甲基亮 胺酰甘胺酸緩沖溶液(dimethylleucylglycine buffer)以及N-乙基嗎啉-HCl緩沖溶 液-(N-ethylmorpholine-HCl buffer)。萃取后，將不溶物移除(例如藉由離心或過(guò)濾)可得含有膠原蛋白的溶液。如有 必要，可以用相同的萃取液萃取不溶物一次或數(shù)次，上清液(soluble fraction)可以與該 含有膠原蛋白的溶液混合在一起。該含有膠原蛋白的溶液可以蛋白水解酶水解(digestion)處理以除去末端肽 (telop印tide)，藉此制造無(wú)端肽膠原蛋白(atelop印tidecollagen)。適用于此水解的蛋 白水解酶包含，但不限于，胃蛋白酶(P印sin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、木瓜凝乳蛋白酶 (chymopapain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、膠原蛋白酶(collagenase)、無(wú)花果蛋白 酶(ficin)、木瓜蛋白酶(papain)、勝肽酶(ρ印tidase)、蛋白酶A (proteinaseA)、蛋白酶 K (proteinase K)、胰蛋白酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbialproteases)及其混合 物。水解反應(yīng)的條件視所使用的酶而定。例如，當(dāng)使用胃蛋白酶時(shí)，反應(yīng)混合物的PH值約 為2-5，酶濃度約為待處理膠原蛋白的0. 001-10wt%，待處理膠原蛋白約為0. 5g/l至IOg/ 1 (較佳為lg/Ι至5g/l)。膠原蛋白可由前述含有膠原蛋白的溶液中沉淀而進(jìn)一步純化。此沉淀工藝可重復(fù) 直至達(dá)到所要的純度。在一實(shí)施例中，該膠原蛋白藉由透析法沉淀，其將前述含有膠原蛋白 的溶液以一透析管(截留分子量約為12，000至14，000)對(duì)著一緩沖溶液透析。在另一實(shí)施 例中，在該含有膠原蛋白的溶液中加入鹽(例如堿金屬鹵化物(例如氯化鈉))至IM至4M 的濃度來(lái)使膠原蛋白沉淀，然后離心收集膠原蛋白并以超過(guò)濾(ultrafiltration)、透析或 以稀釋酸液脫鹽。在又一實(shí)施例中，將該含有膠原蛋白的溶液的PH值調(diào)整至膠原蛋白不溶 的PH值來(lái)使膠原蛋白沉淀。參見W0/2004/096384。膠原蛋白的純化也可藉由前述方法的 組合而達(dá)成。沉淀的膠原蛋白可以使其重新懸浮(resuspended)并利用超過(guò)濾膜進(jìn)行緩沖 液交換。以前述任一方法制得的膠原蛋白可在真空下冷凍干燥。此外，亦可以使膠原蛋白 重新懸浮于一適當(dāng)溶液。相信在此技術(shù)領(lǐng)域中的熟悉技藝者基于前述的描述，都可將本發(fā)明充分的利用而 不需進(jìn)一步的詳細(xì)描述。因此，下文所舉實(shí)施例僅僅只是作為范例，并非用以在任何方面限 制本發(fā)明。在此引用的所有文獻(xiàn)并入本案以為參照。實(shí)施例1 制備膠原蛋白基質(zhì)自豬身上取得皮膚組織，除去脂質(zhì)后，以鹽水清洗皮數(shù)次，以植皮刀(dermatome) 除去皮的表皮層以獲得一厚度為0.3毫米(mm)的真皮組織。進(jìn)一步以磷酸鹽緩沖溶液清 洗所述的真皮組織。在清洗過(guò)后，將所有緩沖溶液殘余物自真皮組織的表面完全的除去。將真皮組織置入一裝有濃度0. 5M醋酸溶液的容器內(nèi)，并在37°C定溫放置一天半 來(lái)使真皮組織膨脹至厚度為0. 45毫米。在定溫放置期間，容器是置于一震動(dòng)器上，以使真 皮組織懸浮。接著將膨脹后的真皮組織浸泡于室溫下含有0. 5 %的SDS與0. 5mM的EDTA的溶液 中兩小時(shí)，以除去非膠原蛋白物質(zhì)而產(chǎn)生一膠原蛋白基質(zhì)。以一經(jīng)過(guò)殺菌處理的磷酸鹽緩 沖溶液清洗上述的膠原蛋白基質(zhì)，以除去殘余的SDS與EDTA。
實(shí)施例2 由膠原蛋白基質(zhì)萃取膠原蛋白將以實(shí)施例1所述方法制備的膠原蛋白基質(zhì)浸于0. 5M醋酸溶液12至M小時(shí)并 加以攪拌。將產(chǎn)生的混合物以2000rpm(700Xg)離心1小時(shí)后，收集上清液并儲(chǔ)存在4°C。將含有純化膠原蛋白的上清液以胃蛋白酶(0. 2mg/ml)處理M小時(shí)以制造無(wú)端肽 膠原蛋白。實(shí)施例3 以透析法純化膠原蛋白將膠原蛋白利用實(shí)施例2所述的步驟由膠原蛋白基質(zhì)萃取出來(lái)并制備含有膠原 蛋白的溶液。將該溶液以一纖維素膜(MWC0 12-14，000)對(duì)著一 0.02M磷酸二氫鈉緩沖液 透析后，在SOOOxg離心1小時(shí)。收集團(tuán)粒(pellet)，以冷MilliQ水沖洗數(shù)次，然后將團(tuán)粒 重新懸浮在冷MilliQ水中。將懸浮液在8000xg離心1小時(shí)。將產(chǎn)生的膠原蛋白團(tuán)粒重新懸浮在0. IM的醋酸中。實(shí)施例4 以鹽析法(salting-out)或改變pH來(lái)純化膠原蛋白將膠原蛋白利用實(shí)施例2所述的步驟由膠原蛋白基質(zhì)萃取出來(lái)并制備含有膠原 蛋白的溶液。在該溶液中逐漸加入氯化鈉至最終濃度為2. 5M。收集沉淀的膠原蛋白并以蒸餾水 清洗后，將其重新懸浮在0. IM的醋酸中。此外，在該含有膠原蛋白的溶液中加入IM NaOH,將其pH值調(diào)整至7。將混合物置 于冷房中攪拌3小時(shí)讓膠原蛋白沉淀。之后，將混合物在4°C離心10分鐘后，將膠原蛋白團(tuán) 粒重新懸浮在去離子水中。將懸浮液的PH值以0. IM鹽酸調(diào)整至低于3. 5用以讓膠原蛋白 溶解。其他實(shí)施例本發(fā)明所揭露的所有特征應(yīng)可以任何結(jié)合方式實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所揭露的每一特征應(yīng) 可以相同、均等或相似目的的取代物所取代。因此，除非有明確的指定，否則所揭露的每一 個(gè)特征僅僅只是均等物或相似特征的一個(gè)種類的一實(shí)施例。由上述內(nèi)容可知，任何在此技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者，將可輕易從本發(fā)明的揭 露中了解到本發(fā)明的特征，在不偏離后附申請(qǐng)專利范圍所界定的本發(fā)明的精神與范圍下， 當(dāng)可在此進(jìn)行各種改變、取代以及修正。因此，其他實(shí)施例亦落于后附申請(qǐng)專利范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種膠原蛋白制備方法，其特征在于其包含提供一結(jié)締組織，其表面積為20平方毫米至2平方公尺；以一第一酸液使該結(jié)締組織的體積至少膨脹百分之五十而形成一膨脹結(jié)締組織，其中 該酸液實(shí)質(zhì)上不包含鹽類且該酸液的酸堿值為1至6 ；清洗該膨脹結(jié)締組織以除去非膠原蛋白物質(zhì)，藉此形成一膠原蛋白基質(zhì)；以及利用一萃取液從該膠原蛋白基質(zhì)萃取出膠原蛋白，藉此制造一含有膠原蛋白的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該萃取步驟包含研磨該 膠原蛋白基質(zhì)而制得膠原蛋白粉末，以及將該膠原蛋白粉末與該萃取液混合而制得該含有 膠原蛋白的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該研磨步驟以及該混合 步驟同時(shí)進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其另包含，在該萃取步驟之 后，將膠原蛋白由該含有膠原蛋白的溶液中沉淀，以及干燥該膠原蛋白或?qū)⒃撃z原蛋白分散于一第二酸液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中其中在該沉淀步驟中， 該膠原蛋白藉由透析法沉淀。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該沉淀步驟包含將該含 有膠原蛋白的溶液與一鹽類以1. OM至4. OM的濃度混合，藉此將該膠原蛋白沉淀，并且該方 法另包含，在該沉淀步驟之后，將該膠原蛋白脫鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該沉淀步驟包含將該含 有膠原蛋白的溶液的PH值調(diào)整至4. 5至8，藉此將該膠原蛋白沉淀。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其另包含，在該萃取步驟 之后，將該含有膠原蛋白的溶液與一含有蛋白水解酶的溶液混合以制造無(wú)端肽膠原蛋白 (atelopeptide collagen)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該蛋白水解酶選自胃 蛋白酶(ρ印sin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰凝乳蛋 白酶(chymotrypsin)、膠原蛋白酶(collagenase)、無(wú)花果蛋白酶(ficin)、木瓜蛋白酶 (papain)、勝月太酶(peptidase)、蛋白酶A(proteinase Α)、蛋白酶〖(proteinase K)、胰蛋白 酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbial proteases)及其混合物所組成的群組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該萃取液包含由甲酸、 草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸及其混合物所組成的群組中選擇的一種酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該萃取液包含一鹽類。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該第二酸液包含由甲 酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸及其混合物所組成的群組中選擇的一種 酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于膨脹步驟包含將該結(jié)締組 織浸泡于該第一酸液且同時(shí)以一液體噴射該結(jié)締組織。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該清洗步驟包含將該 膨脹結(jié)締組織浸泡于一清洗液且同時(shí)以一液體噴射該結(jié)締組織。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該膨脹步驟包含將該 結(jié)締組織浸泡于該第一酸液中，且同時(shí)以超音波處理該結(jié)締組織。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該清洗步驟包含將該 膨脹結(jié)締組織浸泡于該清洗液中，且同時(shí)以超音波處理該膨脹結(jié)締組織。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該結(jié)締組織源自于真 皮組織或筋腱。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該結(jié)締組織的尺寸為 25平方毫米至900平方公分。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該第一酸液包含由甲 酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸及其混合物所組成的群組中選擇的一種酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該酸液的pH值為2至4。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原蛋白制備方法，其特征在于其中該酸液包含濃度0.1至 6M的醋酸。
全文摘要
一種膠原蛋白制備方法，其先制造一膠原蛋白基質(zhì)，然后再由基質(zhì)萃取出膠原蛋白。
文檔編號(hào)A23L1/0562GK102131403SQ200980101280
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者黃玲惠 申請(qǐng)人:惠合再生醫(yī)學(xué)生技股份有限公司, 成功大學(xué)