專利名稱：用于檢測(cè)核糖核酸的組合物、方法和試劑盒的制作方法
用于檢測(cè)核糖核酸的組合物、方法和試劑盒領(lǐng)域本教導(dǎo)總地說(shuō)來(lái)涉及用于檢測(cè)、擴(kuò)增和定量核糖核酸(RNA)包括但不限于編碼 RNA和非編碼RNA(ncRNA)的方法、試劑和試劑盒。引言基因組表達(dá)模式的分析為差異表達(dá)在許多生物學(xué)過(guò)程(包括但不限于各種疾病 狀態(tài))中的作用提供了有價(jià)值的見解。這樣的分析，無(wú)論是基于mRNA的基因表達(dá)還是基于 小非編碼RNA的表達(dá)分析，將成為生物科學(xué)的許多科目中快速擴(kuò)展的研究手段。小非編碼 RNA的發(fā)現(xiàn)也是引起巨大的科學(xué)和醫(yī)學(xué)興趣的領(lǐng)域。據(jù)信，通過(guò)了解基因組的哪些部分何時(shí) 和為什么被轉(zhuǎn)錄，可獲得對(duì)許多復(fù)雜且相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程的更好理解。小非編碼RNA在橫跨進(jìn)化譜的許多生物中正快速顯現(xiàn)為基因調(diào)控的重要效應(yīng) 物。動(dòng)物、植物和真菌包含幾個(gè)不同種類的小RNA ；包括但不限于miRNA、siRNA、piRNA和 rasiRNA。此類微小的基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的長(zhǎng)度通常在大約18_40nt的大小范圍內(nèi)，然而它們 對(duì)細(xì)胞過(guò)程的影響卻是深遠(yuǎn)的。已顯示它們?cè)诎l(fā)育時(shí)間選擇(developmentaltiming)和細(xì) 胞命運(yùn)機(jī)制、腫瘤進(jìn)展、神經(jīng)發(fā)生、轉(zhuǎn)座子沉默、病毒防御等中起著關(guān)鍵作用。它們通過(guò)結(jié)合 至它們的靶并利用許多機(jī)制(包括異染色質(zhì)修飾、翻譯抑制、mRNA衰減和甚至新生肽翻轉(zhuǎn) (turnover)機(jī)制)負(fù)作用于基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行基因調(diào)控。因此，給定的樣品中小RNA的鑒定 可極大地促進(jìn)基因表達(dá)分析。一些小RNA從基因組中確定的位置產(chǎn)生。微RNA是這樣的種類；它們通常由RNA 聚合酶II從多順?lè)醋踊虼剞D(zhuǎn)錄，或也可從前mRNA內(nèi)含子產(chǎn)生。迄今已知數(shù)千個(gè)獨(dú)特的 miRNA序列。其他種類的小RNA，例如piRNA或內(nèi)源siRNA通常不從基因組中確定的基因座 轉(zhuǎn)錄。相反，它們響應(yīng)事件例如病毒感染或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)而產(chǎn)生并且用于沉默此類否 則將導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p害的‘外源’序列。ncRNA的描述可見于，特別地，Eddy, Nat. Rev. Genet. 2 :919_29，2001 ；Mattick 禾口 Makunin，Human Mol. Genet. 15 :R17_29，2006 ；Hannon 等人，Cold Springs Harbor Sympos. Quant. Biol. LXXI :551_64，2006。測(cè)定樣品中全部的 小RNA群體的序列提供了同時(shí)鑒定和甚至表征所有類別的此類RNA的直接方法。概述本教導(dǎo)涉及用于檢測(cè)和定量下列的方法、試劑和試劑盒(i)小RNA分子，也稱為 非翻譯功能性RNA、非編碼RNA(ncRNA)和小非信使RNA(snmRNA)；和(ii)編碼RNA，其可以 是或可以不是通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法片段化和/或分級(jí)分離(fractionate)的。根據(jù)某些公開的方法，形成包含至少一種待檢測(cè)的RNA分子、至少一種第一銜接 子(adaptor)、至少一種第二銜接子和雙鏈特異性RNA連接酶的連接反應(yīng)組合物。第一銜接 子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上含有至少2個(gè)核糖核 苷，所述第二寡核苷酸，當(dāng)?shù)谝还押塑账崤c第二寡核苷酸雜交在一起時(shí)，包含單鏈部分。第 二銜接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸含有5’磷酸基團(tuán)，所述第 四寡核苷酸，當(dāng)?shù)谌押塑账崤c第四寡核苷酸雜交在一起時(shí)，包含單鏈部分。在連接反應(yīng)組 合物中通過(guò)雙鏈特異性RNA連接酶將第一銜接子和第二銜接子連接至RNA分子，從而形成連接產(chǎn)物。第一銜接子和第二銜接子以定向方式與RNA分子退火(由于它們的結(jié)構(gòu))，并 且各銜接子同時(shí)或幾乎同時(shí)而非相繼地(例如，將第二銜接子和RNA分子與連接酶組合，然 后第二銜接子被連接至RNA分子的3’末端，然后將第一銜接子與連接的RNA分子-第二銜 接子組合，然后第一銜接子連接至RNA分子-第二銜接子的5’末端，在將第二銜接子連接 至RNA分子與將第一銜接子連接至RNA分子之間插入純化步驟，參見，例如，Elbashir等人， Genes andDevelopment 15 188-200, 2001 ；Berezikov 等人，Nat. Genet. Supp. 38 :S2_S7, 2006)連接至與其退火的RNA分子。應(yīng)理解，向連接反應(yīng)組合物中加入組分的順序不受限 制，并且可以以任何順序添加組分。還應(yīng)理解，在加入組分的過(guò)程中，可在加入反應(yīng)組合物 的所有組分之前在連接酶存在的情況下將銜接子與相應(yīng)的RNA分子連接，例如但不限于， 可在加入第一銜接子之前在連接酶存在的情況下將第二銜接子與相應(yīng)的RNA分子連接，和 應(yīng)理解，此類反應(yīng)在本教導(dǎo)的預(yù)期的范圍內(nèi)，只要將一種銜接子連接至RNA分子的時(shí)間與 將另一種銜接子連接至RNA分子的時(shí)間之間不存在純化步驟即可。將RNA指導(dǎo)的DNA聚合 酶(有時(shí)稱為依賴于RNA的DNA聚合酶)與連接產(chǎn)物組合以形成反應(yīng)混合物，將所述混合 物在適合于反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的條件下進(jìn)行溫育。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與核糖核酸酶，通常核糖核酸酶 H(RNA酶H)組合，并從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中降解至少一些核糖核苷以形成擴(kuò)增模板。將擴(kuò)增模板與至少一種正向引物、至少一種反向引物和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶 (有時(shí)稱為依賴于DNA的DNA聚合酶)組合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物。將擴(kuò)增反應(yīng)組合物 在適合于允許產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的條件下進(jìn)行熱循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)至少一種擴(kuò) 增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，使用報(bào)告探針和/或核酸染料間接檢測(cè)至少一種RNA類別 在樣品中的存在。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)組合物還包含報(bào)告探針，例如但不限于 TaqMan 探針、分子信標(biāo)、Scorpion 引物等，或核酸染料，例如但不限于SYBR Green 或其他核酸結(jié)合染料或核酸嵌入染料。在本教導(dǎo)的某些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括實(shí)時(shí)或終點(diǎn) 檢測(cè)技術(shù)，包括但不限于定量PCR。在一些實(shí)施方案中，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分的序 列，這使得能夠鑒定相應(yīng)的RNA分子。在一些實(shí)施方案中，從起始材料中的RNA分子產(chǎn)生 包含文庫(kù)特異性核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的文庫(kù)，其中至少一些擴(kuò)增產(chǎn)物類別共有文庫(kù)特異 性標(biāo)識(shí)符(identifier)，例如但不限于文庫(kù)特異性核苷酸序列，包括但不限于條形碼序列 (barcode sequence)或雜交標(biāo)簽或公共標(biāo)志物(commonmarker)或親和標(biāo)簽。在一些實(shí)施 方案中，可組合和分析兩個(gè)或更多個(gè)文庫(kù)，然后基于文庫(kù)特異性標(biāo)識(shí)符對(duì)結(jié)果進(jìn)行去卷積 (deconvoluted)0根據(jù)某些公開的方法，在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組合物中只使用一種聚合酶，包含DNA指導(dǎo) 的DNA聚合酶活性和RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶并且不使用另外的聚合酶。 在其他方法實(shí)施方案中，向反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組合物中加入RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和DNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶，并且不向擴(kuò)增反應(yīng)組合物中加入另外的聚合酶。在一些實(shí)施方案中，用于檢測(cè)樣品中的RNA分子的方法包括將樣品與至少一種第 一銜接子、至少一種第二銜接子和包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽組合以形成連接 反應(yīng)組合物(其中將至少一種第一銜接子和至少一種第二銜接子連接至樣品的RNA分子， 從而在相同的連接反應(yīng)組合物中形成連接產(chǎn)物)，和檢測(cè)連接產(chǎn)物的RNA分子或其替代物 (surrogate)。在一些實(shí)施方案中，至少一種第一銜接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷 酸，所述第一寡核苷酸具有10至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度并且在3’末端含有至少2個(gè)核糖核苷，所述第二寡核苷酸包含與第一寡核苷酸大體上互補(bǔ)的核苷酸序列并且當(dāng)?shù)谝还押塑账?與第二寡核苷酸形成雙鏈時(shí)還包含1至8個(gè)核苷酸的單鏈5’部分。在一些實(shí)施方案中，至 少一種第二銜接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸具有10至60個(gè) 核苷酸的長(zhǎng)度并且包含5，磷酸基團(tuán)，所述第四寡核苷酸包含與第三寡核苷酸大體上互補(bǔ)的 核苷酸序列并且當(dāng)?shù)谌押塑账崤c第四寡核苷酸形成雙鏈時(shí)還包含1至8個(gè)核苷酸的單鏈 3’部分。在一些實(shí)施方案中，單鏈部分獨(dú)立地具有簡(jiǎn)并核苷酸序列，或與RNA分子的一部分 互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方案中，第一和第三寡核苷酸具有不同的核苷酸序列。在連接反 應(yīng)組合物中，待檢測(cè)的RNA分子與至少一種第一銜接子的單鏈部分和至少一種第二銜接子 的單鏈部分雜交。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)RNA分子或其替代物包括，將連接產(chǎn)物與i) RNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶，ii)含有依賴于DNA的DNA聚合酶活性和依賴于RNA的DNA聚合酶活性的DNA聚 合酶，或i i i) RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶組合；反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物以形成 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；用核糖核酸酶H從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中降解至少一些核糖核苷以形成擴(kuò)增模板；當(dāng) 如i)中那樣組合連接產(chǎn)物時(shí)，將擴(kuò)增模板與至少一種正向引物、至少一種反向引物和DNA 指導(dǎo)的DNA聚合酶組合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物；循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組合物以形成至少一種擴(kuò)增 產(chǎn)物，然后確定擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分的序列，從而檢測(cè)RNA分子。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生RNA文庫(kù)的方法包括，將許多不同的RNA分子與許多 第一銜接子類別、許多第二銜接子類別和雙鏈特異性RNA連接酶組合以形成連接反應(yīng)組合 物，其中至少一種第一銜接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’ 末端上包含至少2個(gè)核糖核苷，所述第二寡核苷酸，當(dāng)?shù)谝还押塑账崤c第二寡核苷酸雜交 在一起時(shí)，包含單鏈部分，并且其中至少一種第二銜接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷 酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基團(tuán)，所述第四寡核苷酸，當(dāng)?shù)谌押塑账崤c第四寡核苷 酸雜交在一起時(shí)，包含單鏈部分，和將至少一種第一銜接子和至少一種第二銜接子連接至 RNA分子以形成許多不同的連接產(chǎn)物類別，其中在相同的連接反應(yīng)組合物中將第一銜接子 和第二銜接子連接至RNA分子。該方法還包括將許多連接產(chǎn)物類別與RNA指導(dǎo)的DNA聚合 酶組合，反轉(zhuǎn)錄許多連接產(chǎn)物類別中的至少一些以形成許多反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物類別，用核糖核酸 酶H(RNA酶H)從許多反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的至少一些中降解至少一些核糖核苷以形成許多擴(kuò)增 模板類別，將許多擴(kuò)增模板類別與至少一種正向引物、至少一種反向引物和DNA指導(dǎo)的DNA 聚合酶組合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物，然后循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組合物以形成含有許多擴(kuò)增產(chǎn)物類 別的文庫(kù)，其中至少一些擴(kuò)增產(chǎn)物類別包含對(duì)于文庫(kù)中至少一些其他擴(kuò)增產(chǎn)物類別是共同 的標(biāo)識(shí)序列(identification sequence) 0還公開了用于進(jìn)行某些本方法的試劑盒。本文中展示了本教導(dǎo)的這些和其他特 征。附圖本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下面描述的附圖僅用于舉例說(shuō)明目的。這些圖無(wú)意以任 何方式限定本教導(dǎo)的范圍。

圖1提供了本教導(dǎo)的各種示例性方法實(shí)施方案的示意性概述。圖2A-圖2B 圖2A示意性描述了示例性第一銜接子21和示例性第二銜接子22 ； 圖2B示意性描述圖IA中顯示的示例性第一和第二銜接子與示例性RNA分子23定向退
8火。通過(guò)箭頭24顯示第一銜接子21與RNA分子23的5’末端的連接接合點(diǎn)(ligation junction)，以及通過(guò)箭頭25顯示第二銜接子22與RNA分子23的3’末端的連接接合點(diǎn)。 空心矩形描述了 RNA序列例如21A和23的序列。水平實(shí)線描述了 DNA序列例如21B和22A 的DNA序列。圖3提供了本教導(dǎo)的示例性實(shí)施方案的示意性概述。將一群小RNA分子33與第 一銜接子31和第二銜接子32以及Rnl2連接酶組合以形成連接產(chǎn)物34。未退火的銜接子 和/或不期望的退火副產(chǎn)物分子35也可存在于連接反應(yīng)組合物中。將反應(yīng)組合物與RNA 指導(dǎo)的DNA聚合酶組合以產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物36，然后將該組合物與核糖核酸酶H組合以產(chǎn)生 擴(kuò)增模板38。將擴(kuò)增模板38與DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、正向引物310和反向引物311組合 以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物。在該示例性實(shí)施方案中，反向引物還包含標(biāo)識(shí)序列312，有時(shí)稱為 “條形碼”序列。圖4提供了本教導(dǎo)的示例性實(shí)施方案的示意性概述。在該示例性實(shí)施方案中，凝 膠純化(Gel Purif.)擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包含插入序列(由圖4中彎曲括號(hào)顯示)、第 一引物區(qū)域(圖4中顯示為Pl)和包括條形碼或標(biāo)識(shí)序列(圖4中顯示為be)的第二引物 區(qū)域(圖4中顯示為P2)。圖5描述了如實(shí)施例1中所述產(chǎn)生的示例性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。泳道1 :10bp DNA 梯(IOOng ；Invitrogen P/N 10821-015，Carlsbad, CA)；泳道2 起始材料為IOOng總RNA，無(wú)連接酶的對(duì)照；泳道3 起始材料為IOOng總RNA，無(wú)RT的對(duì)照；泳道4 起始材料為 IOOfmol mirVana Reference Panel v. 9. 1(Applied Biosystems P/N 4388891, Foster City, CA)；泳道5 起始材料為IOOng總RNA ；禾口泳道6 起始材料為來(lái)自5 μ g總RNA的f lashPAGE FractionatorSystem純化的 RNA。圖6描述了如實(shí)施例2中所述單獨(dú)或組合地使用各種雙鏈依賴性連接酶產(chǎn)生的示 例性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。泳道 1 IOOng IObp DNA 梯(Invitrogen)；泳道2 10個(gè)單位的噬菌體T4RNA連接酶2，200U逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)；泳道3 10個(gè)單位的噬菌體T4RNA連接酶2，無(wú)RT ；泳道4 10個(gè)單位的噬菌體T4RNA連接酶I，200U RT ；泳道5 10個(gè)單位的噬菌體T4RNA連接酶1，無(wú)RT ；泳道6 10個(gè)單位的噬菌體T4DNA連接酶，200U RT ；泳道7 10個(gè)單位的噬菌體T4DNA連接酶，無(wú)RT ；泳道8 噬菌體T4RNA連接酶I和噬菌體T4DNA連接酶各5個(gè)單位，200U RT ；泳道9 噬菌體T4RNA連接酶I和噬菌體T4DNA連接酶各5個(gè)單位，無(wú)RT ；和泳道10 無(wú)連接酶，200U RT。圖7A描述了連接反應(yīng)組合物中產(chǎn)生的示例性連接產(chǎn)物(由箭頭注釋的雙連接顯 示的)的電泳圖，所述連接反應(yīng)組合物包含各種第一銜接子、各種第二銜接子或各種第一 銜接子和各種第二銜接子的組合，以及許多不同miRNA分子(包含大致等摩爾濃度的大約
9500個(gè)不同類別的合成的miRNA分子)和噬菌體T4的RNA連接酶2，如實(shí)施例4中所描述 的。橫跨圖7A的頂部的數(shù)字4、6和8相應(yīng)于反應(yīng)組合物中各第一銜接子的第二寡核苷酸 和各第二銜接子的第四寡核苷酸上的簡(jiǎn)并核苷酸序列的數(shù)目(在圖7B中顯示為N)。X-軸T3-4表示在只包含含有結(jié)構(gòu)T3:27N(參見圖7B)的第一銜接子的連接組合物中產(chǎn) 生相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中在該情況下N等于4個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；T3-6表示在只包含含有結(jié)構(gòu)T3:27N的第一銜接子的連接反應(yīng)組合物中產(chǎn)生相應(yīng) 的連接產(chǎn)物，其中N在該情況下等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；T3-8表示在只包含含有結(jié)構(gòu)T3:27N的第一銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接 產(chǎn)物，其中N在該情況下等于8個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；T7-4表示在只使用含有結(jié)構(gòu)T7:N28(參見圖7B)的第二銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生 相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中N在該情況下等于4個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；T7-6表示在只使用含有結(jié)構(gòu)T7:N28(參見圖7B)的第二銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生 相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中N在該情況下等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；T7-8表示在只使用含有結(jié)構(gòu)T7:N28的第二銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接 產(chǎn)物，其中N在該情況下等于8個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；T3-4+T7-4表示在使用含有結(jié)構(gòu)T3:27N的第一銜接子和含有結(jié)構(gòu)T7:N28的第二 銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中N在該情況下在兩種銜接子的所有類別中 等于4個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；T3-6+T7-6表示在使用含有結(jié)構(gòu)T3:27N的第一銜接子和含有結(jié)構(gòu)T7:N28的第二 銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中N在該情況下在兩種銜接子的所有類別中 等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；和T3-8+T7-8表示在使用含有結(jié)構(gòu)T3:27N的第一銜接子和含有結(jié)構(gòu)T7:N28的第二 銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中N在該情況下在兩種銜接子的所有類別中 等于8個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；數(shù)字27是指第一銜接子的第一寡核苷酸的長(zhǎng)度，數(shù)字28是指第二銜接子的第三 核苷酸的長(zhǎng)度。圖7B示意性描述了本教導(dǎo)的示例性第一和第二銜接子，其中N分別代表示例性第 一銜接子或第二銜接子的下鏈(lower strand)即第二寡核苷酸或第四寡核苷酸上的一系 列簡(jiǎn)并核苷。圖8A 描述了使用各種第一銜接子、各種第二銜接子、或各種第一銜接子和各種 第二銜接子的組合產(chǎn)生的示例性連接產(chǎn)物(由箭頭標(biāo)示)的電泳圖，如實(shí)施例5中描述的 和圖8B中描繪的。X-軸T3r2-6表示在只使用含有T3r2:276N(參見圖8B)的第一銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn) 生相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中6N等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸，r2表示2個(gè)3’核糖核苷酸；T7-6表示在只使用含有T7:6N 28(參見圖8B)的第二銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相 應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中6N等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；T3r2-6+T7-6表示在使用含有T3r2 27 6N的第一銜接子和含有T7 6N 28的第二
10銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中r2表示2個(gè)3’核糖核苷酸，以及其中6N 在兩種銜接子的所有類別中等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；rT3-6表示在只使用含有rT3:27 6N的第一銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接 產(chǎn)物，其中6N等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸，rT3表示所有核苷酸，rT7-6表示在只使用含有rT7:6N 28的第二銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接 產(chǎn)物，其中rT7表示所有核糖核苷酸，6N等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸；和rT3-6+rT7-6表示在使用含有rT3 27 6N的第一銜接子和含有rT7 6N 28的第二 銜接子的連接反應(yīng)中產(chǎn)生相應(yīng)的連接產(chǎn)物，其中rT3和rT7表示所有核糖核苷酸，并且6N 在兩種銜接子的所有類別中等于6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸。圖8B示意性描述了本教導(dǎo)的第一和第二銜接子的兩個(gè)示例組(所述兩個(gè)組包括 (i)rT3:27 6N (上部第一銜接子)和rT7:6N 28 (上部第二銜接子)和(ii)T3r2:27 6N (底 部第一銜接子)和T7:6N 28 (底部第二銜接子)，其中6N代表示例性第一銜接子的下鏈和 示例性第二銜接子的下鏈上的一系列6個(gè)簡(jiǎn)并核苷。圖9A-圖9C.圖9A和圖9B描述了根據(jù)實(shí)施例6中描述的本教導(dǎo)的某些實(shí)施方案 產(chǎn)生的示例性連接產(chǎn)物的電泳圖。就雙連接效率檢測(cè)第一銜接子和第二銜接子的3種不 同組合。這些組合包括具有兩個(gè)DNA上鏈(即，第一和第三寡核苷酸)(除了第一寡核苷 酸的3’末端上的2個(gè)核糖核苷外)，具有兩個(gè)RNA上鏈(即，第一和第三寡核苷酸)或具 有5’(第一)銜接子上的RNA上鏈(即，第一寡核苷酸)和3’(第二)銜接子上的DNA上 鏈(即，第三寡核苷酸)的第一銜接子和第二銜接子。圖9C提供了具有示例性第一銜接子 (rT3:27 6N)和第二銜接子(T7:6N28)(也在圖8B中單獨(dú)描述)的較后的銜接子結(jié)構(gòu)實(shí)施 方案的示意圖。圖IOA和圖IOB描述了顯示使用一系列連接反應(yīng)組合物根據(jù)本教導(dǎo)的某些實(shí)施 方案產(chǎn)生的示例性連接產(chǎn)物的2個(gè)電泳圖，所述連接反應(yīng)組合物各自包含(l)Rnl2連接 酶，(ii)以2和0.2皮摩爾(pmol)的濃度存在的合成的miRNA分子的庫(kù)(mirVana miRNA Reference Panelv 9. 1，Ρ/Ν 4388891 (Ambion, Austin, TX;本文中描述的)，和(iii)以 10/50，5/25、1/5、1/50、5/50、10/50、25/50、5/100 或 5/500(上鏈 / 下鏈)的上鏈對(duì)下鏈的 比存在的本文中公開的第一和第二銜接子，如實(shí)施例6中顯示和描述的。圖11示意性描述本教導(dǎo)的某些實(shí)施方案，其中從樣品中取出和/或純化核酸的各 種亞群?？蓪⒃摲椒ǖ膶?shí)施方案用于小RNA檢測(cè)和分離以及用于全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。圖12描述了使用按照本教導(dǎo)的一個(gè)方法產(chǎn)生的示例性擴(kuò)增產(chǎn)物的基于 TaqMan 的示例性檢測(cè)測(cè)定的-δ act的1呢2倍數(shù)變化(fc)(在y-軸上顯示為L(zhǎng)0g2(FC) TaqMan(-ddCt))對(duì)利用使用S0LiDTMSequenCing System的示例性測(cè)序檢測(cè)技術(shù)且使用相 同示例性擴(kuò)增產(chǎn)物的等分測(cè)定的Log2(FC)(在χ-軸上顯示為L(zhǎng)og2(FC SOLiD )的圖，如由 實(shí)施例7提供的。圖13A和圖13B描述了使用SYBR Gold染色顯現(xiàn)的包括通過(guò)本教導(dǎo)的某些實(shí)施 方案產(chǎn)生的示例性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，如實(shí)施例7中描述的。圖14示意性描述了本教導(dǎo)的各種實(shí)施方案，包括通過(guò)使用嵌入染料SYBR Green(例如，實(shí)施例8)(用于在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中進(jìn)行檢測(cè))或電泳分離的擴(kuò)增產(chǎn)物的 SYBR Gold染色(“SYBR Assay”)定量按照本教導(dǎo)產(chǎn)生的示例性擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)目的RNA分子。LEGenD 連接酶增強(qiáng)的基因檢測(cè)是指將依賴于雙鏈的連接酶用于本文中提供 的測(cè)定。圖15示意性描述了實(shí)施例8中描述的本教導(dǎo)的擴(kuò)增產(chǎn)物。Pl指正向PCR引物的 一部分。P2指反向PCR引物的一部分。圖16A和圖16B描述了實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的RNA分子的示例性曲線，所述RNA分 子是加入至示例性樣品的RNA分子(圖16A)或存在于樣品中的兩個(gè)ncRNA分子(內(nèi) 源miRNA miR-16(圖16B，具有菱形符號(hào)的頂部曲線)和miR_21(圖16B，具有方形符號(hào) 的底部曲線)，如實(shí)施例8中所描述的。圖16A的斜率和y-截距是SIC 34(圓圈，頂部 線)y = -3. 2568x+32. 916，R2 = 0. 9918 ；SIC 8(三角形):y = -3. 4116x+29. 444，R2 = 0. 9886 ；SIC 37 (方形):y = -2. 8517χ+23. 685，R2 = 0. 9935 ；和 SIC 36 (菱形，底部線) y = -3. 0381x+19. 587，R2 = 0. 999。圖17提供了用于產(chǎn)生小RNA文庫(kù)的S0LiD Small RNA ExpressionKit步驟的概 述，如實(shí)施例11中提供的。經(jīng)大小選擇的擴(kuò)增的小RNA在“模板珠粒制備”階段進(jìn)入SOLiD 乳液PCR步驟。示例性實(shí)施方案的描述應(yīng)理解，上述一般描述和下列的詳細(xì)描述都只是示例性的和說(shuō)明性的，并且無(wú)意 限定本教導(dǎo)的范圍。在本申請(qǐng)中，除非明確地指出，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。例如，“a forward primer”意指可存在1個(gè)以上的正向引物；例如，一個(gè)或多個(gè)拷貝的特定正向引物 類別，以及一個(gè)或多個(gè)不同的正向引物類別。同樣地，“包含”、“含有”和“包括”或這些根詞 的修飾形式例如但不限于“包括”、“包含的”和“含有”，也不期望受到限定。術(shù)語(yǔ)“和/或” 指之前和之后的術(shù)語(yǔ)可一起或分別地使用。例如，但不作為限定，“X和/或Y”可表示“X” 或“Y”或“X和Y”。本文中使用的章節(jié)標(biāo)題只是為了組織目的而不應(yīng)被解釋為以任何方式限定所描 述的主題。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)和相似材料，包括專利、專利申請(qǐng)、論文、書籍和專題 論文明確地以它們的全文通過(guò)引用合并入本文，用于任何目的。如果一個(gè)或多個(gè)合并的文 獻(xiàn)和相似材料以與本說(shuō)明書中的術(shù)語(yǔ)定義相矛盾的方式定義或使用術(shù)語(yǔ)，則以本說(shuō)明書為 準(zhǔn)。雖然結(jié)合不同實(shí)施方案描述了本教導(dǎo)，但本教導(dǎo)無(wú)意限定于此類實(shí)施方案。相反地，本 教導(dǎo)包括各種改變、修飾和等價(jià)物，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。術(shù)語(yǔ)“或其組合”，如本文中所使用的，是指該術(shù)語(yǔ)之前所列的項(xiàng)的所有排列和組 合。例如，“A、B、C或其組合”意欲包括:A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一個(gè)，并且如果 順序在特定上下文中是重要的，那么，還包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。對(duì)該實(shí) 例進(jìn)行延伸，明確包括的是包含一個(gè)或多個(gè)項(xiàng)或項(xiàng)目的重復(fù)的組合，例如BB，AAA，AAB，BBC， AAABCCCC, CBBAAA, CABABB等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，除非根據(jù)上下文很明顯地，否則通 常對(duì)任何組合中的項(xiàng)或項(xiàng)目的數(shù)目沒(méi)有限制。根據(jù)某些公開的方法，例如但不限于，圖1中顯示的示例性實(shí)施方案，形成包含至 少一種待檢測(cè)的RNA分子、至少一種第一銜接子、至少一種第二銜接子以及雙鏈特異性RNA 連接酶的連接反應(yīng)組合物(顯示為第一和第二銜接子與RNA分子的雜交)。通常，起始材料 包含許多RNA類別和許多不同的第一銜接子和不同的第二銜接子。如圖2A和圖2B中所示，至少一種第一銜接子21包含第一寡核苷酸21A和第二寡核苷酸21B，所述第一寡核苷酸21A在3’末端上包含至少2個(gè)核糖核苷，所述第二寡核苷 酸21B，當(dāng)?shù)谝还押塑账?1A與第二寡核苷酸21B雜交在一起時(shí)，包含單鏈5’部分21C(圖 2A)，并且其中至少一種第二銜接子22包含第三寡核苷酸22A和第四寡核苷酸22B，所述第 三寡核苷酸22A包含5’磷酸基團(tuán)(在圖2B中顯示為“P”)，所述第四寡核苷酸22B，當(dāng)?shù)谌?寡核苷酸22k與第四寡核苷酸22B雜交在一起時(shí)，包含單鏈3’部分22C(圖2A)。應(yīng)理解， 在本舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中，第一寡核苷酸中所有核苷是核糖核苷，但在其他實(shí)施方案中， 第一寡核苷酸的多至全部和少至2個(gè)的核苷可以是核糖核苷，只要第一寡核苷酸21A的最 3’的2個(gè)核苷是核糖核苷；第一寡核苷酸的其余部分可包含核糖核苷、脫氧核糖核苷或兩 者的組合。圖2A的舉例說(shuō)明性第二和第四寡核苷酸的單鏈部分(分別地21B的21C和22B 的22C)描述為簡(jiǎn)并六聚體序列(顯示為NNNNNN)。然而，具有序列特異性單鏈部分和同樣 地更長(zhǎng)的和更短的單鏈部分的第一和/或第二銜接子的使用在本教導(dǎo)的范圍內(nèi)。在一些實(shí) 施方案中，簡(jiǎn)并序列是脫氧核糖核苷酸。在一些實(shí)施方案中，簡(jiǎn)并序列的長(zhǎng)度是4、6或8個(gè) 核苷酸。在一些實(shí)施方案中，第一寡核苷酸包含核糖核苷并且第二、第三和第四寡核苷酸包 含脫氧核糖核苷酸。設(shè)計(jì)第一和第二寡核苷酸使之除了單鏈部分21C外大體上互補(bǔ)。大體上互補(bǔ)的部 分可具有10至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。當(dāng)退火或雙鏈化以形成第一銜接子時(shí)，第一和第二寡 核苷酸可具有一個(gè)平端(如圖2A和圖2B中)或可在與具有單鏈部分的末端相對(duì)的末端上 具有1、2或3個(gè)核苷酸的懸突。懸突可在第一或第二寡核苷酸上。設(shè)計(jì)第三和第四寡核苷酸使之除了單鏈部分22C外大體上互補(bǔ)。大體上互補(bǔ)的部 分可具有10至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。當(dāng)退火或雙鏈化以形成第二銜接子時(shí)，第三和第四寡 核苷酸可具有一個(gè)平端(如圖2A和圖2B中)或可在與具有單鏈部分的末端相對(duì)的末端上 具有1、2或3個(gè)核苷酸的懸突。懸突可在第一或第二寡核苷酸上。回到圖1，將連接反應(yīng)組合物在適合于第一銜接子和第二銜接子與RNA分子退火 的條件下進(jìn)行溫育。第一和第三寡核苷酸(“上鏈”)可以以1 1至1 10的對(duì)第二和 第四寡核苷酸(“下鏈”)的摩爾比存在。在一些實(shí)施方案中，“上鏈”對(duì)“下鏈”的摩爾比為 1 5或1 2。將包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽用于連接退火的第一銜接子-RNA 分子-第二銜接子復(fù)合物以形成連接產(chǎn)物(在圖1中顯示為“連接”)。在相同的反應(yīng)組合 物中將第一銜接子和第二銜接子與RNA分子連接(而不是作為兩個(gè)分開的相繼的連接反應(yīng) (其在將兩個(gè)銜接子連接至RNA分子之間具有一個(gè)或多個(gè)插入的分離或純化步驟))。還應(yīng) 理解，添加連接反應(yīng)組合物的組分的順序和將兩個(gè)銜接子連接至RNA分子的順序通常不是 對(duì)提供的本教導(dǎo)的限定。 如圖2B中所示，在某些實(shí)施方案中，將第一和第二銜接子與RNA分子雜交以便(i) 第一銜接子的第一寡核苷酸的3'末端和RNA分子的5'末端毗鄰?fù)嘶鹨孕纬傻谝贿B接接 合點(diǎn)(例如，圖2B中的24)(由于RNA分子與第一銜接子的單鏈部分之間的互補(bǔ)性)和(ii) 第二銜接子的第三寡核苷酸的5’末端與相同RNA分子的3’末端毗鄰?fù)嘶鹨孕纬傻诙B接 接合點(diǎn)(例如，圖2B中的25)(由于RNA分子與第二銜接子的單鏈部分之間的互補(bǔ)性)，其 中第一和第二連接接合點(diǎn)都適合于使用包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽進(jìn)行連接。 在一些實(shí)施方案中，包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽包括Rnl2家族連接酶，包括但
13不限于Rnl2連接酶。將RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶與連接產(chǎn)物以及合適的核苷三磷酸和含有合適的鹽的緩 沖溶液組合。將該反應(yīng)混合物在適合于使用連接產(chǎn)物作為模板來(lái)產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的條件下 進(jìn)行溫育(圖1中顯示為“反轉(zhuǎn)錄”)。由于第四寡核苷酸用作RT引物，因此不需要單獨(dú)的 反轉(zhuǎn)錄引物。在一些實(shí)施方案中，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于陣列上并且使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo) 準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，用生物素標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并使用與其結(jié)合的鏈霉抗 生物素蛋白來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，使用玻璃纖維過(guò)濾器、珠粒來(lái)純化或凝膠純化 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與包含核糖核酸酶活性的肽組合以形成降 解反應(yīng)組合物，并且將其在適合于從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中降解至少一些核糖核苷的條件下進(jìn)行溫 育以形成擴(kuò)增模板。在一些實(shí)施方案中，包含核糖核酸酶活性的肽包含核糖核酸酶H(RNA 酶H)活性(在圖1中顯示為“RNA酶H降解”)。將擴(kuò)增模板與至少一種正向引物、至少一種反向引物和包含DNA指導(dǎo)的DNA聚合 酶活性的肽組合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物。當(dāng)具有RNA指導(dǎo)的和DNA指導(dǎo)的聚合酶活性的DNA 聚合酶用于上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，不必加入另外的包含DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶的肽。將擴(kuò)增 反應(yīng)組合物在適合于允許擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的條件下進(jìn)行熱循環(huán)(圖1中顯示為“擴(kuò)增”)。確 定擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分的序列，這使得能夠檢測(cè)相應(yīng)的RNA分子(圖1中顯示為“序列確 定”)。根據(jù)圖3中示意性描述的一個(gè)示例性實(shí)施方案，將一群小RNA分子33與包含含有 RNA的第一寡核苷酸(空心框中顯示的)的第一銜接子31和第二銜接子32以及Rnl2連接 酶組合以形成連接反應(yīng)組合物。將連接反應(yīng)組合物在適合于退火發(fā)生的條件下進(jìn)行溫育， 從而第一銜接子和第二銜接子與小RNA分子退火形成含有與RNA分子的5’末端退火的第 一銜接子和與小RNA分子的3’末端退火的第二銜接子的連接模板。連接酶將通過(guò)在連接 接合點(diǎn)(在圖3中顯示為實(shí)點(diǎn)并且用箭頭標(biāo)示)將第一銜接子連接至RNA分子的5’末端 和將第二銜接子連接至RNA分子的3’末端來(lái)產(chǎn)生連接產(chǎn)物34。取決于連接反應(yīng)組合物中 銜接子與RNA分子的濃度，一些未退火的第一銜接子31和/或第二銜接子32也可存在于 連接反應(yīng)組合物中。此外，特別地當(dāng)?shù)谝缓?或第二銜接子包含簡(jiǎn)并序列時(shí)，還可形成不期 望的退火副產(chǎn)物分子35。將含有連接產(chǎn)物的反應(yīng)組合物與RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶組合，并且在合適的條件 下產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物36。將含有反轉(zhuǎn)錄物36的反應(yīng)組合物與核糖核酸酶H組合，降解連接產(chǎn) 物的至少一些核糖核苷，從而產(chǎn)生擴(kuò)增模板38。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在這一點(diǎn)上，擴(kuò)增 模板本質(zhì)上包含與第二銜接子的第三寡核苷酸退火的反轉(zhuǎn)錄物的cDNA鏈。將擴(kuò)增模板38 與DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、正向引物310和反向引物311組合，以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物。在 該舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中，反向引物還包含標(biāo)識(shí)序列312，有時(shí)稱為“條形碼”序列。如果給 定的擴(kuò)增反應(yīng)組合物中所有反向引物包含相同的標(biāo)識(shí)序列并且該序列被摻入隨后的擴(kuò)增 子中，則從相同擴(kuò)增反應(yīng)組合物產(chǎn)生的所有擴(kuò)增子可被鑒定為來(lái)自該反應(yīng)組合物。將擴(kuò)增反應(yīng)組合物進(jìn)行溫度循環(huán)以允許聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生并且產(chǎn)生許多擴(kuò)增 產(chǎn)物。在該舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和/或高效液相色譜 (HPLC ；有時(shí)稱為高壓液相色譜)純化擴(kuò)增產(chǎn)物。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何技術(shù)測(cè)定純化的
14擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，鑒定相應(yīng)于該序列的RNA分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，公開的方法可用 于多種分析，包括但不限于，表達(dá)特征譜分析、定量一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)樣品(例如，進(jìn)行和未 進(jìn)行藥物處理的；惡性/腫瘤組織和相應(yīng)的正常組織樣品；使用相應(yīng)的胚胎、新生兒、青少 年和/或成人組織進(jìn)行的發(fā)育研究)中的一種或多種特定RNA分子和小RNA發(fā)現(xiàn)。應(yīng)理解，如果待產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物文庫(kù)，那么可通過(guò)該文庫(kù)的獨(dú)特標(biāo)識(shí)序列或條 形碼鑒定各擴(kuò)增產(chǎn)物文庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，用于給定的擴(kuò)增產(chǎn)物文庫(kù)的PCR引物混合 物包含正向引物(例如，參見圖3中的正向引物310)和含有獨(dú)特標(biāo)識(shí)序列或條形碼的反向 引物(例如，參見圖3中含有標(biāo)識(shí)序列312的反向引物311)。當(dāng)循環(huán)包含這樣的引物對(duì)的 擴(kuò)增反應(yīng)組合物時(shí)，條形碼被摻入該文庫(kù)的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，可將示例性第一引物與此類示 例性反向引物的任一個(gè)在擴(kuò)增反應(yīng)組合物中匹配以產(chǎn)生包含反向引物的條形碼或其互補(bǔ) 序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的文庫(kù)。例如而非作為限定，使用PCR引物混合物(其包括示例性正向引物和示例性反向 引物BCl (參見實(shí)施例11))產(chǎn)生的第一文庫(kù)中的各擴(kuò)增產(chǎn)物將包含條形碼序列AAGCCC和 /或其互補(bǔ)序列；而使用PCR引物混合物(其包括示例性正向引物和示例性反向引物BC2) 產(chǎn)生的第二文庫(kù)中的各擴(kuò)增產(chǎn)物將包含條形碼序列CACACC和/或其互補(bǔ)序列等。因此，可 在測(cè)序之前將擴(kuò)增產(chǎn)物的多個(gè)文庫(kù)混合，并且相應(yīng)于各文庫(kù)的起始材料中的RNA分子可使 用靶(RNA分子)序列或該序列的至少一部分，結(jié)合該文庫(kù)的條形碼或標(biāo)識(shí)序列來(lái)鑒定。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可將不同的標(biāo)識(shí)序列用于獨(dú)特地標(biāo)記在給定的擴(kuò)增反應(yīng)組合物中產(chǎn) 生的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4示意性描述了本教導(dǎo)的另一個(gè)示例性實(shí)施方案。根據(jù)該實(shí)施方案，將第一和 第二銜接子與RNA分子雜交(在圖4中顯示為銜接子雜交)，在合適的條件下并且在合適的 連接酶存在的情況下，產(chǎn)生連接產(chǎn)物(在圖4中顯示為連接)。向連接產(chǎn)物中加入反轉(zhuǎn)錄 酶，在合適的條件下產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(在圖4中顯示為反轉(zhuǎn)錄)。用核糖核酸酶H降解反轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物，從而形成擴(kuò)增模板(在圖4中顯示為RNA酶H)。形成包含擴(kuò)增模板、正向引物、反 向引物和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)組合物。將擴(kuò)增反應(yīng)組合物進(jìn)行熱循環(huán)，進(jìn)行 一定數(shù)目的循環(huán)(其保持在擴(kuò)增的線性范圍內(nèi))(通常，根據(jù)一個(gè)示例性實(shí)施方案，大約12 至15個(gè)循環(huán)或12至18個(gè)循環(huán))，從而允許聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生和擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生(在圖4 中顯示為PCR)。在該舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化(在圖4中顯示為 Gel Purif)，從而產(chǎn)生純化的擴(kuò)增產(chǎn)物。只要使用恰當(dāng)?shù)卮笮》旨?jí)分離的或片段化的RNA 分子，則擴(kuò)增產(chǎn)物包含插入序列(由圖4中的彎曲括號(hào)顯示的；在某些實(shí)施方案中，插入物 大小為大約15個(gè)堿基對(duì)至大約100個(gè)堿基對(duì))、第一引物區(qū)域(在圖4中顯示為Pl)和包 含條形碼或標(biāo)識(shí)序列(在圖4中顯示為be)的第二引物區(qū)域(在圖4中顯示為P2)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互換使用并且是 指通過(guò)核苷酸間磷酸二酯鍵或核苷酸間類似物連接的核苷單體(包括2' _脫氧核糖核苷 (DNA)和核糖核苷(RNA))的單鏈和雙鏈聚合物以及結(jié)合的抗衡離子例如H+、NH4+、三烷基 銨、Mg2+、Na+等。多核苷酸可完全由脫氧核糖核苷、完全由核糖核苷或其嵌合混合物組成。 如在下面進(jìn)一步描述的，例如，第一銜接子包含在其3’末端具有至少2個(gè)核糖核苷的第一 寡核苷酸。第一寡核苷酸可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多個(gè)核 糖核苷并且在一些實(shí)施方案中，核糖核苷是連續(xù)的。在一些實(shí)施方案中，第二、第三或第四寡核苷酸包含脫氧核糖核苷酸。核苷酸單體單位可包括本文中描述的任何核苷酸，包括但 不限于，核苷酸和核苷酸類似物。多核苷酸的大小范圍通常在一些單體單位，例如5至40或 5至60個(gè)(在本領(lǐng)域內(nèi)它們有時(shí)稱為寡核苷酸)至數(shù)千個(gè)單體核苷酸單位之間。除非另外 指出，否則每當(dāng)描述多核苷酸序列時(shí)，應(yīng)理解核苷酸以5'至3'的順序從左至右顯示。待檢測(cè)的RNA分子在一些實(shí)施方案中，本教導(dǎo)的RNA分子包括總RNA，總RNA的 亞組或級(jí)分，或兩者。在一些實(shí)施方案中，包含待檢測(cè)的RNA分子的樣品包含從特定樣品或 樣品庫(kù)獲得的所有RNA。在其他實(shí)施方案中，將總RNA分級(jí)分離為亞組，并且待檢測(cè)的RNA 分子存在于一個(gè)或多個(gè)分級(jí)分離的亞組中。通常，使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何技術(shù)(所述技 術(shù)產(chǎn)生樣品中的總RNA或RNA分子的亞組)從樣品提取RNA分子。在一些實(shí)施方案中，通常在形成連接反應(yīng)組合物之前，將待檢測(cè)的RNA分子片段 化。在一些實(shí)施方案中，可片段化總RNA或可使用本文中提供的方法片段化和分析分級(jí)分 離的RNA。在一些實(shí)施方案中，待檢測(cè)的RNA分子包含多個(gè)不同的RNA類別，包括但不限于， 多個(gè)不同的mRNA類別，在產(chǎn)生連接產(chǎn)物之前可對(duì)其或可以不對(duì)其進(jìn)行片段化。在一些實(shí)施 方案中，可使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法通過(guò)化學(xué)、酶促、機(jī)械方法，通過(guò)加熱或其組合片段化 RNA0使用本文中提供的方法分析片段化的RNA。因此可進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，其中分析從DNA 轉(zhuǎn)錄的序列，包括編碼RNA(例如，以進(jìn)行表達(dá)分析)或非編碼RNA。在一些實(shí)施方案中，例如使用大小分級(jí)分離方法從樣品獲得某些大小范圍內(nèi)的小 RNA分子和/或片段化的RNA。在一些實(shí)施方案中，可在連接第一和第二銜接子之前片段化 總RNA，和也可對(duì)其進(jìn)行大小分級(jí)分離；然而在其他實(shí)施方案中，將總RNA用于連接反應(yīng)組 合物。例如，而非作為限定，某些分級(jí)分離技術(shù)描述于圖11中。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行poly A選擇方法以將信使RNA(mRNA)與缺乏poly A的 RNA分子(poly A-RNA分子)分離。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)例如但不限于使用本領(lǐng)域內(nèi)已 知的PolyA選擇技術(shù)(包括但不限于，oligo-dT層析)從總RNA中分離至少一些mRNA來(lái) 將總RNA分級(jí)分離為亞組。在此類實(shí)施方案中，poly A+級(jí)分或poly A除盡級(jí)分可用于本 教導(dǎo)中以檢測(cè)存在于該級(jí)分中的至少一些RNA分子。在一些實(shí)施方案中，可分開地使用兩 種級(jí)分以檢測(cè)存在于各級(jí)分中的至少一些RNA分子。在一些實(shí)施方案中，目的RNA分子包 含poly A-RNA分子，例如但不限于大非編碼RNA。在某些實(shí)施方案中，使一群mRNA分子或一群poly A-RNA分子除盡群體中至少一 個(gè)類別的豐富的RNA分子，例如但不限于核糖體RNA或來(lái)自持家基因或高表達(dá)的基因的 mRNA,包括但不限于肌動(dòng)蛋白mRNA和球蛋白mRNA。例如，從總RNA中除盡某些mRNA或RNA 種類，例如但不限于高拷貝數(shù)目mRNA例如肌動(dòng)蛋白、GAPDH、球蛋白和其他“持家” mRNA ； 和RNA的種類例如但不限于18S RNA和28S RNA(例如，使用可商購(gòu)獲得的試劑盒例如 RiboMinus(Invitrogen, Carlsbad, CA)或 GL0BINclear (Ambion，Austin，TX)試劑盒(也 參見美國(guó)專利申請(qǐng)公開案 US 2006/0257902, Methods and Compositions forDepleting Abundant RNA Transcripts)。術(shù)語(yǔ)化學(xué)片段化在本文中以廣義使用，包括但不限于，將包含RNA的樣品暴露于 金屬離子例如但不限于鋅(Zn2+)、鎂(Mg2+)和錳(Mn2+)和加熱。術(shù)語(yǔ)酶促片段化以廣義使用，且包括將包含RNA的樣品與包含核酸酶活性的肽例 如內(nèi)切核糖核酸酶或外切核糖核酸酶在適合于所述肽切割或降解至少一些RNA分子的條
16件下組合。示例性核酸酶包括但不限于核糖核酸酶(RNA酶)例如RNA酶A、RNA酶T1、RNA 酶T2、RNA酶U2、RNA酶PhyM、RNA酶III、RNA酶PH、核糖核酸酶Vl、寡核糖核酸酶(例如， EC 3. 1. 13. 3)，外切核糖核酸酶I (例如，EC 3. 1. 11. 1)和外切核糖核酸酶II (例如，EC 3. 1. 13. 1)，然而，催化RNA分子水解為一個(gè)或多個(gè)更小的組成成分的任何肽在本教導(dǎo)的預(yù) 期內(nèi)。通過(guò)核酸例如但不限于核酶進(jìn)行的RNA分子的片段化也在本教導(dǎo)的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)機(jī)械片段化以廣義使用并且包括借助其在暴露于機(jī)械力包括但不限于，超 聲、碰撞或物理撞擊(physical impact)和剪切力時(shí)片段化核酸的任何方法。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本教導(dǎo)，在使用剩余的較大的RNA分子之前，使用“凈化” 步驟例如但不限于使用凝膠電泳、玻璃纖維濾器或使用磁珠進(jìn)行的純化來(lái)除去非常小的 RNA片段。在某些實(shí)施方案中，本教導(dǎo)的方法使用利用物理分離法分級(jí)分離的RNA分子， 所述分離法包括但不限于大小分離法例如離心、柱層析/凝膠篩分和電泳分離。在一些 實(shí)施方案中，目的RNA分子的電泳分離包括flashPAGE Fractionator System(Ambion, Austin, TX)或按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法通過(guò)從瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠切割條帶進(jìn)行的 大小選擇。在一些實(shí)施方案中，用于某些公開方法的RNA分子可通過(guò)使用多種樣品制備試 劑盒和試劑中的任一種(包括但不限于，mirVana miRNA Isolation Kit(Ambion))提取 樣品中的RNA分子的亞組來(lái)獲得。在一些實(shí)施方案中，可免疫沉淀RNA。術(shù)語(yǔ)非編碼RNA或ncRNA是指無(wú)論大小，不翻譯成蛋白質(zhì)的任何RNA分子。示 例性 ncRNA 包括轉(zhuǎn)運(yùn) RNA (tRNA)、核糖體 RNA (rRNA)、微 RNA (miRNA)、小核 RNA (snRNA)、小 核仁 RNA (snoRNA)、導(dǎo)向 RNA (gRNA)、傳出 RNA (efference RNA, eRNA)、Piwi-interacting RNA (piRNA)、重復(fù)相關(guān) siRNA (R印eat-associated siRNA, rasiRNA)、信號(hào)識(shí)別顆粒 RNA(signal recognition particle RNA)、啟動(dòng)子 RNA(pRNA)、小干擾 RNA(siRNA)和轉(zhuǎn) 運(yùn) _ 信使 RNA (tmRNA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，待檢測(cè)的RNA分子的長(zhǎng)度不是對(duì)本教導(dǎo)的限定，因?yàn)榭?分級(jí)分離和/或片段化更長(zhǎng)的分子并且可檢測(cè)級(jí)分和/或片段以重構(gòu)RNA分子。在一些實(shí) 施方案中，待檢測(cè)的RNA分子的長(zhǎng)度是12至500個(gè)核苷酸、15至110個(gè)核苷酸、15到100 個(gè)核苷酸、18至110個(gè)核苷酸、20至80個(gè)核苷酸、25至大約60個(gè)核苷酸、20至大約45個(gè) 核苷酸、20至大約41個(gè)核苷酸、20至大約40個(gè)核苷酸、21、22、23、24或25至大約36、37、 38,39,40或41個(gè)核苷酸，或其間的任何整數(shù)范圍。在一些實(shí)施方案中，待檢測(cè)的RNA分子 具有 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40或41個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，用于分級(jí)分離或片段化RNA的技術(shù)不是對(duì)本教導(dǎo)的限 定，和理解，取決于將要檢測(cè)的RNA分子的級(jí)分或片段，通?？墒褂貌煌姆旨?jí)分離或片段 化技術(shù)。在某些實(shí)施方案中，起始材料包含至少一種合成的RNA分子例如加料對(duì)照 (spike-in control)，其可用于，特別地，校準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)化。在一些實(shí)施方案中，向含有天然發(fā) 生的RNA分子的樣品中加入至少一種合成的RNA分子類別，并按照公開的方法檢測(cè)至少一 種合成的RNA類別和至少一種天然發(fā)生的RNA類別的存在。在一些實(shí)施方案中，待檢測(cè)的RNA分子具有用于有效連接的5'-單磷酸和
173'-羥基。例如，一些小RNA的生物發(fā)生導(dǎo)致具有包含三磷酸的5’末端的RNA分子。根據(jù)本 教導(dǎo)的某些實(shí)施方案，此類RNA分子不適合于銜接子連接和擴(kuò)增。因此，不能將具有5'帽 結(jié)構(gòu)的完整mRNA分子和具有5'三磷酸的RNA分子，包括小RNA例如來(lái)自線蟲(C. elegans) 的內(nèi)源siRNA(Pak 2007)有效地連接至反應(yīng)組合物中的雜交的銜接子，除非首先用脫帽酶 (decapping enzyme)例如但不限于煙草酸焦磷酸酶(TAP)、核酸酶PI、Dcplp脫帽酶、Dcp2 脫帽酶或DcpS脫帽酶處理它們以將RNA分子的5'末端轉(zhuǎn)變成5'單磷酸。當(dāng)目的RNA分 子包含5’-三磷酸時(shí)，本教導(dǎo)的某些實(shí)施方案使用煙草酸焦磷酸酶將RNA分子的5’末端轉(zhuǎn) 變成5’單磷酸，從而使得它們適合用于連接。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)某些片段化技術(shù)產(chǎn)生的片段最初不具有適合用于酶促連 接的末端；在一些實(shí)施方案中，用激酶例如但不限于噬菌體T4多核苷酸激酶處理此類片 段，以使5’末端或3’末端適合用于根據(jù)本教導(dǎo)的連接。待檢測(cè)的RNA可以是單鏈或雙鏈的，因?yàn)閷⒋龣z測(cè)的RNA與至少一種第一銜接子、 至少一種第二銜接子組合，并退火以便包含雙鏈特異性RNA連接酶的多肽可形成連接產(chǎn) 物。根據(jù)本教導(dǎo)，目的RNA分子可以是合成的或天然發(fā)生的?？墒褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)熟知的 寡核苷酸合成法合成RNA分子。還可按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，例如但不限于體外轉(zhuǎn)錄 技術(shù)，包括但不限于美國(guó)專利 5，958，688 ；5，723，290 ；5，514，545 ；5，021，335 ；5，168，038 ； 5，545，522 ；5, 716, 785 ；5, 891, 636 ；和6，291，170，通過(guò)生物化學(xué)方法在體內(nèi)或體外合成 RNA分子。此類技術(shù)的詳細(xì)描述可見于，特別地，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage 等人，eds. , John Wiley & Sons, New York, New York,包括自 2005 年5月以來(lái)的最新資料(在下文中“Beaucage等人”)；以及Blackburn和Gait。用于合 成RNA分子、銜接子和引物的自動(dòng)化核酸合成儀可從許多來(lái)源商購(gòu)獲得，包括例如Applied Biosystems (Foster City，CA)。還可使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的體內(nèi)方法和/或體外方法通過(guò) 生物合成產(chǎn)生RNA分子、銜接子和引物。此類技術(shù)的描述可見于，特別地，Sambrook等人 和Ausubel等人?？蓪⒑塑疹愃莆锢? ‘ -OMe-, LNA-,鹵素-或阿拉伯糖-衍生物，例 如，或通用核堿基(universal nucleobase)整合入銜接子，只要第四寡核苷酸是可引發(fā)的 (primeable)底物。純化或部分純化的RNA可從許多來(lái)源商購(gòu)獲得，包括Fi ΓS tCho ice TotalRNA、Firs tChoice Poly(A)、Firs tChoice Tumor RNA 禾口 mirVana miRNA Reference Panel(Ambion, Austin, TX) ；Reference Total RNA, Human and Mouse, 和 Universal Reference RNA(Stratagene, LaJolla, CA)；和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC)，Manassas, VA0在一些實(shí)施方案中，待檢測(cè)的RNA分子存在于樣品中。術(shù)語(yǔ)“樣品”在本文中以廣 義使用，并且意在包括廣泛的生物材料以及從此類包含或懷疑包含RNA的生物材料衍生或 提取的組合物。示例性樣品包括全血；紅細(xì)胞；白細(xì)胞；血沉棕黃層；毛發(fā)；趾甲和表皮材 料；拭子，包括口腔拭子、咽喉拭子、陰道拭子、尿道拭子、子宮頸拭子、直腸拭子、傷口拭子、 囊腫拭子(abcess swab)、鼻咽拭子等；尿；痰；唾液；精液；淋巴液；羊膜液；腦脊髓液；腹 膜滲出液；胸腔積液；來(lái)自囊腫的液體；滑液；玻璃體液；眼房水；粘液囊液(bursafluid)； 洗眼液；眼抽吸物(eye aspirates)；血漿；肺灌洗液；肺抽吸物；和組織，包括肝、脾、腎、 肺、腸、腦、心臟、肌肉、胰腺、活組織檢查材料等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，從上述示例性生物樣品的任一種獲得的裂解物、提取物或材料也在本教導(dǎo)的范圍內(nèi)。組織培養(yǎng)細(xì)胞，包括外 植材料、原代細(xì)胞、次級(jí)細(xì)胞系等以及獲自任何細(xì)胞的裂解物、提取物或材料也在本文中使 用的術(shù)語(yǔ)生物樣品的含義內(nèi)。從法院、農(nóng)業(yè)和/或環(huán)境背景獲得的包含或懷疑包含至少一 種RNA分子的材料也在術(shù)語(yǔ)樣品的期望的含義內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，樣品包含合成的核 酸序列。在一些實(shí)施方案中，樣品是完全合成的，例如但不限于，包含含有至少一種合成的 核酸序列的緩沖液的對(duì)照樣品。在某些實(shí)施方案中，樣品是環(huán)境樣品，例如土壤、水或空氣 樣品。植物miRNA可在3’末端具有2' _0_甲基基團(tuán)并且可在本文中引述的連接反應(yīng) 中進(jìn)行連接。然而，這樣的連接的效率，與在3’末端具有2' -OH的RNA類別相比較，將降 低。第一銜接子和第二銜接子如上所說(shuō)明的，至少一種第一銜接子包含第一寡核苷 酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端包含至少2個(gè)核糖核苷，所述第二寡核苷 酸，當(dāng)?shù)谝还押塑账崤c第二寡核苷酸雜交在一起時(shí)，包含單鏈5’部分，如圖2A中所描述的。 設(shè)計(jì)第一和第二寡核苷酸使之除了單鏈部分外大體上互補(bǔ)，如下文進(jìn)一步描述的。大體上 互補(bǔ)的部分可具有10至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，大體上互補(bǔ)的部分可具 有10至40個(gè)核苷酸，12或15至30個(gè)核苷酸、20、21、22或23至25、27或29個(gè)核苷酸，或 任何這些范圍之間的任何整數(shù)范圍的長(zhǎng)度。當(dāng)退火或雙鏈化以形成第一銜接子時(shí)，第一和 第二寡核苷酸可具有一個(gè)平端(如圖2A和圖2B中)或可在與具有單鏈部分的末端相對(duì)的 末端上具有1、2或3個(gè)核苷酸的懸突。懸突可以在第一或第二寡核苷酸上。還如上所說(shuō)明的，至少一種第二銜接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述 第三寡核苷酸包含5’磷酸基團(tuán)，所述第四寡核苷酸，當(dāng)?shù)谌押塑账崤c第四寡核苷酸雜交 在一起時(shí)，包含單鏈3’部分，也如圖2A中所描述的。設(shè)計(jì)第三和第四寡核苷酸使之除了單 鏈部分外大體上互補(bǔ)，如下文進(jìn)一步描述的。大體上互補(bǔ)的部分可具有10至60個(gè)核苷酸 的長(zhǎng)度。當(dāng)退火或雙鏈化以形成第二銜接子時(shí)，第三和第四寡核苷酸可具有一個(gè)平端(如 圖2A和圖2B中)或可在與具有單鏈部分的末端相對(duì)的末端上具有1、2或3個(gè)核苷酸的懸 突。懸突可在第一或第二寡核苷酸上。在一些實(shí)施方案中，除了第一寡核苷酸在3，末端包含至少2個(gè)核糖核苷外，第一、 第二、第三和第四寡核苷酸獨(dú)立地包含脫氧核糖核苷、核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸和核 糖核苷酸兩者。應(yīng)理解，在圖2A的舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中，第一寡核苷酸中的所有核苷是 核糖核苷，但在其他實(shí)施方案中，第一寡核苷酸的多至所有和少至2個(gè)的核苷可以是核糖 核苷，只要第一寡核苷酸的最3’的2個(gè)核苷是核糖核苷；第一寡核苷酸的剩余部分可包含 核糖核苷、脫氧核糖核苷或兩者的組合。在一些實(shí)施方案中，第二、第三和第四寡核苷酸包 含脫氧核糖核苷并且第一寡核苷酸包含所有核糖核苷。在一些實(shí)施方案中，第一寡核苷酸 包含核糖核苷并且第二、第三和第四寡核苷酸包含脫氧核糖核苷酸。第一和第二銜接子的 寡核苷酸的長(zhǎng)度彼此獨(dú)立。第一、第二、第三和第四寡核苷酸的序列使得在銜接子的雙鏈化部分中獲得實(shí)質(zhì) 的互補(bǔ)性，如上所述的。在一些實(shí)施方案中，第一和第三寡核苷酸的序列是不同的。銜接子 的雙鏈化部分的核苷酸的特定序列不限定本文中的方法。在一些實(shí)施方案中，銜接子序列 的一部分包含“啟動(dòng)子序列”，包括但不限于適合于使用合適的聚合酶例如但不限于T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的序列。在一些實(shí)施方案中，第一銜接 子包含第一啟動(dòng)子的“啟動(dòng)子序列”，第二銜接子包含第二啟動(dòng)子的“啟動(dòng)子序列”。第一寡核苷酸的3’末端和第三寡核苷酸的5’末端適合用于連接至待檢測(cè)的RNA 分子，所述RNA分子也適合用于連接?！斑m合用于連接的”寡核苷酸是指至少一種待檢測(cè)的 RNA分子和至少一種第一銜接子和/或至少一種第二銜接子，其各自包含合適的反應(yīng)基團(tuán)。 示例性反應(yīng)基團(tuán)包括但不限于第一銜接子的第一寡核苷酸的3'末端上的游離羥基和待檢 測(cè)的RNA分子的5'末端上的游離磷酸基團(tuán)，待檢測(cè)的RNA分子的3'末端上的游離羥基和 第二銜接子的第三寡核苷酸的5'末端上的游離磷酸基團(tuán)。銜接子的單鏈部分舉例說(shuō)明性的第二和第四寡核苷酸的單鏈部分在圖2A中描 述為簡(jiǎn)并六聚體序列(顯示為NNNNNN)。然而，具有序列特異性單鏈部分和同樣地更長(zhǎng)和更 短的單鏈部分的第一和/或第二銜接子的使用在本教導(dǎo)的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，單鏈部分獨(dú)立地包含脫氧核糖核苷、核糖核苷或脫氧核糖核 苷和核糖核苷的組合。在一些實(shí)施方案中，單鏈部分包含脫氧核糖核苷。在銜接子的單鏈部分的一些實(shí)施方案中，單鏈部分的長(zhǎng)度短至1個(gè)核苷酸和長(zhǎng)至 8個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，單鏈部分的長(zhǎng)度為2，4，6或8個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案 中，單鏈部分的長(zhǎng)度為4或6個(gè)核苷酸。第二寡核苷酸的單鏈部分的長(zhǎng)度不依賴于第四寡 核苷酸的單鏈部分的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，將單鏈部分的核苷序列設(shè)計(jì)成與待檢測(cè)的特定RNA分子的5’ 序列或3’序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，待檢測(cè)的特定RNA分子與至少一種第一銜接子的 單鏈部分和至少一種第二銜接子的單鏈部分雜交以使連接反應(yīng)可發(fā)生。為了與特定序列雜 交，在一些實(shí)施方案中，單鏈部分的長(zhǎng)度獨(dú)立地是4至6個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在這樣的方法中，通 過(guò)本文中的方法定向檢測(cè)RNA分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)相應(yīng)于待檢測(cè)的RNA分子的5’ 序列或3’序列的單鏈部分，和使用本文中提供的檢測(cè)方法檢測(cè)相應(yīng)于RNA分子的有義序列 或反義序列。在一些實(shí)施方案中，將單鏈部分的序列設(shè)計(jì)為簡(jiǎn)并序列，以允許樣品的所有RNA 分子具有對(duì)簡(jiǎn)并序列的互補(bǔ)性，從而與銜接子的單鏈部分退火。在一些實(shí)施方案中，簡(jiǎn)并單 鏈部分具有1至8個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，簡(jiǎn)并單鏈部分具有4、6或8個(gè)核 苷酸的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，簡(jiǎn)并核苷序列是脫氧核糖核苷酸。在一些實(shí)施方案中，第二或第四寡核苷酸的單鏈部分的序列是簡(jiǎn)并序列，第二或 第四寡核苷酸的其他的序列是相應(yīng)于待檢測(cè)的RNA分子的序列。退火或雜交術(shù)語(yǔ)“退火”和“雜交”，包括但不限于，根詞雜交和退火的變型，可 互換使用并且是指一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸的核苷酸堿基配對(duì)相互作用(其導(dǎo)致雙鏈體、 三鏈體或其他高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成)。一級(jí)相互作用通常是核苷酸堿基特異性的，例如通過(guò) Watson-Crick和Hoogsteen類型氫鍵產(chǎn)生的A:T、A:U和G:C。在某些實(shí)施方案中，堿基堆 積和疏水相互作用還可促成雙鏈穩(wěn)定性。例如，引物與互補(bǔ)或大體上互補(bǔ)的序列退火的條 件在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，例如，如 NucleicAcid Hybridization, A Practical Approach, Hames 禾口 Higgins, eds. , IRL Press, Washington, D. C. (1985)以及 Wetmur 禾口 Davidson, Mol.Biol.31 :349，1968中所描述的。一般地，退火是否發(fā)生受到，特別地，核酸的互補(bǔ)部分 的長(zhǎng)度、PH、溫度、單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子的存在、雜交區(qū)域中G和C核苷酸的比例、介質(zhì)的粘度和變性劑的存在的影響。此類變量影響雜交所需的時(shí)間。某些核苷酸類似物或小溝結(jié)合劑 在核酸的互補(bǔ)部分中的存在也可影響雜交條件。因此，優(yōu)選的退火條件將取決于特定應(yīng)用。 然而，此類條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地確定而無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。通常，選擇退火條件以 允許核酸在反應(yīng)中選擇性地與互補(bǔ)或大體上互補(bǔ)的序列雜交，但不與其他序列雜交至任何 顯著的程度。術(shù)語(yǔ)“選擇性雜交”和其變型意指在合適的條件下，給定的序列與包含互補(bǔ)或大體 上互補(bǔ)的核苷酸串的第二序列退火，但不與不期望的序列退火。在本申請(qǐng)中，一個(gè)序列選擇 性地與另一個(gè)序列雜交或退火的陳述包括其中兩個(gè)序列完全彼此雜交的情況，和其中一個(gè) 或兩個(gè)序列的僅一部分與完整的另一個(gè)序列或另一個(gè)序列的一部分雜交的情況。為了該定 義的目的，術(shù)語(yǔ)“序列”包括核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、引物、靶特異性部分、擴(kuò)增產(chǎn)物 特異性部分、引物結(jié)合位點(diǎn)、雜交標(biāo)簽和雜交標(biāo)簽的互補(bǔ)序列。術(shù)語(yǔ)“相應(yīng)的”，如本文中所用的，是指該術(shù)語(yǔ)涉及的元素之間的至少一種特定關(guān) 系。例如，第一銜接子的單鏈5’部分相應(yīng)于具有與單鏈部分雜交的末端核苷酸序列的RNA 分子。第二銜接子的單鏈3’部分相應(yīng)于具有與單鏈部分雜交的末端核苷酸序列的RNA分 子。另外的實(shí)例包括其中引物結(jié)合核酸的相應(yīng)的互補(bǔ)或大體上互補(bǔ)的引物結(jié)合部分的情 況，其中特定親和標(biāo)簽結(jié)合相應(yīng)親和標(biāo)簽的情況，例如但不限于，生物素結(jié)合鏈霉抗生物素 蛋白的情況，以及其中特定雜交標(biāo)簽與其相應(yīng)的雜交標(biāo)簽互補(bǔ)序列退火的情況等。在本申請(qǐng)中，一個(gè)序列與另一個(gè)序列相同、大體上相同、互補(bǔ)或大體上互補(bǔ)的陳述 包括其中兩個(gè)序列彼此完全相同、大體上相同、或互補(bǔ)或大體上互補(bǔ)的情況，以及其中序列 之一的僅一部分與另一個(gè)序列的一部分或與完整的另一個(gè)序列相同、大體上相同、互補(bǔ)或 大體上互補(bǔ)的情況。為了該定義的目的，術(shù)語(yǔ)“序列”包括RNA、DNA、多核苷酸、寡核苷酸、引 物、連接產(chǎn)物、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、擴(kuò)增模板、擴(kuò)增產(chǎn)物、引物結(jié)合位點(diǎn)、雜交標(biāo)簽和雜交標(biāo)簽互補(bǔ) 序列。術(shù)語(yǔ)“變性的”或“變性”，如本文中所使用的，是指其中將雙鏈多核苷酸，包括雙鏈 擴(kuò)增產(chǎn)物或雙鏈DNA或DNA: RNA雙鏈體轉(zhuǎn)變成兩個(gè)單鏈多核苷酸的任何過(guò)程。使雙鏈多核 苷酸變性包括但不限于用于使雙鏈體變性，從而釋放其兩條單鏈組分的許多種熱或化學(xué)技 術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，除非使用的變性技術(shù)抑制或略微干擾隨后的擴(kuò)增和/或檢測(cè) 步驟，否則其通常是不受限制的。連接術(shù)語(yǔ)“連接”或其形式，在本文中用于指使用包含雙鏈特異性RNA連接酶活 性的多肽的酶促連接過(guò)程，在該過(guò)程中在與模板毗鄰雜交的寡核苷酸的緊鄰末端之間形成 核苷酸間的連接。連接的形成是雙鏈依賴性和特異性的，也稱為雙鏈體依賴性的和特異性 的或模板依賴性和特異性的。核苷酸間的連接可以包括但不限于3’核糖核苷與5’核糖 核苷之間或3’核糖核苷與5’脫氧核糖核苷之間的磷酸二酯鍵的形成。術(shù)語(yǔ)“雙鏈特異性 RNA連接酶”，如本文中所使用的，是指包含RNA連接酶活性的多肽，其優(yōu)先封閉或連接具有 3’末端核糖核苷酸的寡核苷酸與具有5’磷酸基團(tuán)的寡核苷酸之間的缺口，特別地當(dāng)寡核苷 酸與模板分子緊鄰雜交時(shí)。例如，但不限于第一銜接子的第一寡核苷酸的3’末端與該第一 銜接子與之退火的RNA分子之間的缺口在圖2B中示意性地呈現(xiàn)為連接接合點(diǎn)24。在某些實(shí)施方案中，包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽是Rnl2家族連接酶， 例如噬菌體T4 RNA連接酶2 (T4 Rnl2)，包括但不限于Rnl2的酶促活性突變體或變體。T4
21連接酶的Rnll家族不同的RNA連接酶家族的原型 連接酶(參見，例如，Ho 和 Shuman，Proc. Natl. Acad. Sci. 99 (20) :12709_14 (2002)；和 Yin 等人，J. Biol. Chem. 278 17601-08 (2003))。T4Rnl2 家族包括，特別地，弧菌噬菌體 KVP40 Rnl2、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)的 RNA-編輯連接酶(REL) (TbRELl 和 TbREL2)和 Leishmania tarentolae 的 RNA-編輯連接酶(LtRELl 和 LtREL2)、痘病毒 AmEPV (昆蟲痘病 毒)連接酶、桿狀病毒AcNPV連接酶和桿狀病毒XcGV連接酶。在一些實(shí)施方案中通過(guò)使用 REL連接酶，第二和第四寡核苷酸可包含核糖核苷酸以及，在某些實(shí)施方案中，第二和第四 寡核苷酸的單鏈部分可包含核糖核苷酸。T4 Rnl2 連接酶可從 NEW ENGLAND BIOLABS (Ipswich，ΜΑ)商購(gòu)獲得，或可 如 Nandakumar 等人，JBC 280(25) :23484_23489，2005 ;Nandakumar 等人，JBC 279(30) 31337-31347,2004 ；和 Nandakumar 等人，Molecular Cell 16 :211_221，2004 中所述分離連 接酶。T4 Rnl2酶由噬菌體T4的基因gp24. 1編碼。在某些實(shí)施方案中，包含連接酶活性的 多肽包括T4 Rnl2或連接酶的Rnl2家族的另一個(gè)成員，或其酶促活性突變體或變體。在某些實(shí)施方案中，包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽是耐放射異常球菌 (Deinococcus radiodurans) RNA(DraRnl) (Raymond ^AjNucI Acids Res 35(3) 839-849，2007)，或DraRnl型連接酶，包括但不限于，來(lái)自真菌稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的具有GenBank登錄號(hào)XP_367846的、來(lái)自粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa) 的具有GenBank登錄號(hào)CAE76396的、來(lái)自玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)的具有登錄 號(hào)XP_380758的或來(lái)自阿米巴盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)的具有登錄號(hào) EAL61744的連接酶。在一些實(shí)施方案中，連接酶可包括任何上述連接酶、或其酶促活性突變 體或變體的組合。在某些實(shí)施方案中，可預(yù)先腺苷酸化包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽，可 預(yù)先腺苷酸化第三寡核苷酸的5’末端核苷酸，或可預(yù)先腺苷酸化待檢測(cè)的RNA分子的5’末 端核苷酸，或其組合。Ho等人(Structure 12 :327_339)提出了 T4 Rnl2的機(jī)制，其中其C末 端結(jié)構(gòu)域用于封閉3’_0H和5’-P RNA末端。Rnl2蛋白的N末端區(qū)段(1-249)據(jù)報(bào)導(dǎo)用作自 主腺苷酰轉(zhuǎn)移酶/App-RNA連接酶結(jié)構(gòu)域。通常，RNA連接酶通過(guò)一系列牽涉激活的共價(jià)中 間體的三個(gè)核苷酸基轉(zhuǎn)移步驟連接3' -OH與5' -PO4RNA末端。RNA連接酶與ATP反應(yīng)形成 共價(jià)的連接酶-AMP中間體+焦磷酸鹽。然后AMP從連接酶-腺苷酸轉(zhuǎn)移至5 ‘ -PO4 RNA末 端以形成RNA-腺苷酸中間體(AppRNA)。然后連接酶催化RNA 3 ‘ -OH對(duì)RNA-腺苷酸的攻擊 以通過(guò)磷酸二酯鍵封閉兩個(gè)末端，并且釋放AMP。RNA連接的機(jī)制由Nandakumar等人(ibid 2005，2004a，2004b) Yin 等人(JBC 278 20,17601-17608 ；Virology 319:141-151,2004)， Ho 等人(ibid ;PNAS，99 :20，12709-12714，2002)，Gumport 等人(在 Gene Amplification and Analysis 中，第 2 卷，由 Chirikjian，J. G.，和 Papas 編輯，Τ. S.，1981,313-345)和由 Raymond 等人(Nucleic AcidsRes. 35 :3，839-849，2007)進(jìn)一步論述。預(yù)先腺苷酸化的試 劑例如連接酶_腺苷酸、RNA-腺苷酸或嵌合DNA/RNA-腺苷酸預(yù)期用于本教導(dǎo)的一些實(shí)施 方案。根據(jù)某些實(shí)施方案，將至少一個(gè)第一銜接子的類別、至少一個(gè)第二銜接子的類別、 至少一個(gè)RNA分子的類別和包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽組合在連接反應(yīng)組合物 中。應(yīng)理解，與其中在一個(gè)反應(yīng)中將一種銜接子連接至目的RNA分子的一個(gè)末端，然后在
22第二反應(yīng)中將另一種銜接子連接至或整合入相同目的RNA分子的相對(duì)側(cè)，且通常具有插入 的凝膠純化、磷酸化或反轉(zhuǎn)錄步驟的其他技術(shù)不同，在相同的溫育時(shí)間中在相同的反應(yīng)組 合物中(即同時(shí)或幾乎同時(shí)地)將本教導(dǎo)的銜接子各自與相應(yīng)的RNA分子連接(參見，例 如，Elbashir 等人，Genes and Development 15 188—200，2001 ;Ambros 禾口 Lee，Methodsin Mol. Biol. 265 131-58,2004 ；Berezikov 等 K, Nature Genet. Supp. 38 :S2-S7,2006 ； Takada ^A, Nuc 1. Acids Res. 34(17) :ell5,2006 ；Michael, Methods in Mol. Biol. 342 189-207，2006 ；以及 Takada 和 Mano，Nature Protocols 2(12) :3136_45，2007)。應(yīng)理解， 除非另外明確地提及，否則對(duì)于本教導(dǎo)，向連接反應(yīng)組合物中加入組分的順序通常不是重 要的，并且意欲包括在術(shù)語(yǔ)“形成連接反應(yīng)組合物”或本文中使用的相似術(shù)語(yǔ)內(nèi)。因此，一 種銜接子(例如，第一銜接子)至包含RNA分子和連接酶的反應(yīng)組合物的相繼加入，然后另 一種銜接子(在本實(shí)例中，第二銜接子)至該反應(yīng)組合物的隨后加入在本教導(dǎo)的期望的范 圍內(nèi)，無(wú)論一種銜接子的加入與另一種銜接子的加入之間是否存在溫育步驟。反轉(zhuǎn)錄在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)RNA分子包括反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物以形成反轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物。術(shù)語(yǔ)“反轉(zhuǎn)錄”和“逆轉(zhuǎn)錄”和其形式，如本文中所使用的，是指從連接產(chǎn)物開始，基于 使用具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性的多肽以模板依賴性的方式進(jìn)行的脫氧核糖核苷 酸或脫氧核糖核苷酸的類似物至雜交分子的順序催化加入，產(chǎn)生雙鏈RNA-DNA雜交分子的 過(guò)程。根據(jù)本教導(dǎo)，第二銜接子的第四寡核苷酸可用作用于反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物以產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物的引物。因此加入單獨(dú)的引物以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄不是必需的。在一些實(shí)施方案中，具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性的多肽包括MMLV逆轉(zhuǎn) 錄酶，包括其酶促活性突變體或變體，例如但不限于ArrayScript 逆轉(zhuǎn)錄酶(Ambion)、 superscript 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)；或包含反轉(zhuǎn)錄活性但當(dāng)與相應(yīng)的野生型逆轉(zhuǎn)錄酶 相比時(shí)具有降低的RNA酶H活性的多肽，例如但不限于“RNA酶H-”突變體，例如RNA酶 H-HIV-I 逆轉(zhuǎn)錄酶(Wu 等人，J. Virol. 73 (6) :4794_4805，1999)。在一些實(shí)施方案中，可利用在某些反應(yīng)條件下具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活 性的DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶例如但不限于來(lái)自生氫氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)的Tth DNA聚合酶和DNA聚合酶I進(jìn)行RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活 性。核糖核酸酶H降解在一些實(shí)施方案中，用核糖核酸酶H降解反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以除去至 少一些核糖核苷從而形成擴(kuò)增模板。術(shù)語(yǔ)“降解”，特別地當(dāng)提及核糖核酸酶時(shí)，是指催化 RNA成更小的組分，例如但不限于通過(guò)RNA酶H切割反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA鏈以產(chǎn)生可用作本教 導(dǎo)的擴(kuò)增模板的單鏈或基本上單鏈的cDNA分子。擴(kuò)增術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增的”和“擴(kuò)增”以廣義使用并且是指借助于其再生或拷貝(包括互 補(bǔ)拷貝的合成)擴(kuò)增模板的至少一部分、擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分或兩者(通常以模板依賴 性方式)的任何技術(shù)，包括但不限于，用于線性或指數(shù)地?cái)U(kuò)增核酸序列的許多技術(shù)。擴(kuò)增技 術(shù)的一些非限定性實(shí)例包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、 異步引物 PCR (asynchronous primer PCR)、乳液 PCR(ePCR)、定量 PCR(qPCR)和不對(duì) 稱PCR、引物延伸、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、多重置換擴(kuò)增(MDA)、基于核酸鏈的擴(kuò)增(NASBA)、 滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、轉(zhuǎn)錄等，包括其多重形式(multiplexversion) 或組合。此類技術(shù)的描述見于，特別地，Sambrook和Russell同上；Sambrook等人；
23Ausubel 等人；PCR Primer :A LaboratoryManual, Diffenbach, Ed. , Cold Spring Harbor Press (1995) ；TheElectronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002) ；Msuih 等 人’ J. Clin. Micro. 34 501-07(1996) ；McPherson 和 MolIer，PCR TheBasics,Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ,2000( "McPherson") ；Rapley, The Nucleic Acid Protocols Handbook(2000)，Humana Press, Totowa, New Jersey ( "Rapley")；美國(guó)專禾Ij 6，027，998 和 6，511，810 ；PCT 公開案 WO 97/31256 和 W001/92579 ；Ehrlich 等人，Science 252 1643-50(1991) ；Innis ^A, PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990) ；Favis φ A, Nature Biotechnology 18:561—64(2000); Williams 等人，Nature Methods 3(7) :545_50 (2006)；和 Rabenau 等人，Infection 28: 97-102(2000)。擴(kuò)增可包括熱循環(huán)(有時(shí)稱為循環(huán)或熱學(xué)循環(huán))或可等溫進(jìn)行。在某些實(shí)施方 案中，擴(kuò)增包括至少一個(gè)循環(huán)，和通常地多個(gè)循環(huán)的連續(xù)步驟將引物與擴(kuò)增模板、擴(kuò)增產(chǎn) 物或任一個(gè)的互補(bǔ)序列的互補(bǔ)或大體上互補(bǔ)的序列雜交；使用聚合酶以模板依賴性的方式 合成核苷酸的鏈；和使新形成的核酸雙鏈體變性以分開鏈。需要時(shí)，可以重復(fù)或可以不重 復(fù)循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括在熱循環(huán)儀，例如但不限于GeneAmp PCR System 9700、9600、2700或2400熱循環(huán)儀(全都來(lái)自Applied Biosystems)中循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組合 物。在某些實(shí)施方案中，開始時(shí)不對(duì)新形成的核酸雙鏈體進(jìn)行變性，而是以它們的雙鏈形式 將其用于一個(gè)或多個(gè)隨后的步驟中，并且任一條鏈或兩條鏈可以，但非必需，用作相應(yīng)的目 的RNA分子的替代物。在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生單鏈擴(kuò)增子，例如但不限于不對(duì)稱PCR、異步 PCR或轉(zhuǎn)錄。引物延伸是擴(kuò)增技術(shù)，其包括使用延伸酶例如聚合酶以5’ =>3’方向延伸與模 板退火的引物以形成延伸產(chǎn)物，例如但不限于反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物或擴(kuò)增擴(kuò)增模板或擴(kuò)增產(chǎn) 物。根據(jù)某些實(shí)施方案，利用合適的緩沖液、鹽、PH、溫度和核苷三磷酸，聚合酶從退火的引 物的3’末端開始摻入與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸，以產(chǎn)生互補(bǔ)鏈。在某些實(shí)施方案中，用于引 物延伸的聚合酶缺乏或基本上缺乏5’外切核酸酶活性。在一些實(shí)施方案中，將擴(kuò)增模板與至少一種正向引物、至少一種反向引物和具有 DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性的多肽組合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物。術(shù)語(yǔ)“DNA聚合酶”在本文中以廣義使用，并且是指任何多肽，所述多肽能夠以模板 依賴性的方式催化脫氧核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的類似物至核酸聚合物的加入，例如 但不限于在引物延伸反應(yīng)期間脫氧核糖核苷酸至與核酸模板退火的引物的3’末端的相繼 加入。通常，DNA聚合酶包括DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，包括逆轉(zhuǎn)錄 酶。一些逆轉(zhuǎn)錄酶在某些反應(yīng)條件下具有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶。一些DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶在某些反應(yīng)條件下具有逆轉(zhuǎn)錄酶，例如但不限 于嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) (Tth)DNA聚合酶。DNA聚合酶的描述可見于，特別 地，Lehninger Principles of Biochemistry,第 3 版，Nelson 禾口 Cox,Worth Publishing, New York, NY, 2000,特別地第 26 和 29 章；Twyman，Advanced Molecular Biology :A ConciseReference, Bios Scientific Publishers, New York, NY, 1999 ；Ausubel 等人’ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& Sons, Inc.,包括自 2005 年 5 月以來(lái)的補(bǔ)充內(nèi)容(下文中 “Ausubel 等人”)；Lin 和 Jaysena，J. Mol. Biol. 271 =100-11,
241997 ；Pavlov 等人，Trends in Biotechnol. 22 :253_60，2004 ；以及 EnzymaticResource Guide polymerases，1998，Promega, Madison, WI。明確地在術(shù)語(yǔ) DNA 指導(dǎo)的 DNA 聚合酶 和RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶的期望的范圍內(nèi)的是其酶促活性突變體或變體，包括經(jīng)修飾賦予 不同溫度敏感特性的酶(參見，例如，美國(guó)專利5，773，258 ；5，677，152 ；和6，183，998 ；以及 DNA Amplification Current Techniques and Applications, Demidov 禾口 Broude，eds., Horizon Bioscience，2004，特別地第 1· 1 章)。酶的酶促活性突變體或變體為了本教導(dǎo)的目的，當(dāng)描述或主張?zhí)囟富虬?促活性的多肽時(shí)，除非另外明確地聲明，否則預(yù)期包括該酶/多肽的酶促活性突變體或變 體。例如，而非作為限定，當(dāng)術(shù)語(yǔ)“Rnl2”或“Rnl2連接酶”用于本說(shuō)明書或所附權(quán)利要求書 中時(shí)，除非另外明確地聲明，否則預(yù)期包括天然發(fā)生的或野生型Rnl2連接酶以及Rnl2連接 酶的所有酶促活性突變體或變體。類似地，RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、核糖核酸酶或DNA指導(dǎo) 的DNA聚合酶被認(rèn)為與其酶促活性突變體或變體等價(jià)。術(shù)語(yǔ)“其酶促活性突變體或變體”是 指來(lái)源于相應(yīng)的酶的一種或多種多肽，其保持至少一些期望的酶促活性例如連接、反轉(zhuǎn)錄、 降解、擴(kuò)增活性(或需要時(shí))。也在本術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)的是酶促活性片段，包括但不限于，切 割產(chǎn)物，例如但不限于Klenow片段、Stoffel片段或在大小上比相應(yīng)的酶更小的重組表達(dá) 的片段和/或多肽；相應(yīng)的酶的突變體形式，包括但不限于，天然發(fā)生的突變體，例如與“野 生型”或共有氨基酸序列不同的突變體，使用物理和/或化學(xué)誘變劑產(chǎn)生的突變體，和遺傳 工程例如但不限于隨機(jī)和定點(diǎn)誘變技術(shù)產(chǎn)生的突變體；氨基酸插入和缺失，截?cái)嘈问?，和?于核酸無(wú)義突變、錯(cuò)義突變和移碼突變而產(chǎn)生的變化(參見，例如，Sriskanda和Shuman， Nucl. Acids Res. 26(2) :525_31，1998 ;0dell 等人，Nucl. Acids Res. 31(17) :5090_5100， 2003)；可逆修飾的核酸酶、連接酶和聚合酶，例如但不限于美國(guó)專利5，773，258中描述 的那些；通過(guò)基因改組技術(shù)獲得的生物學(xué)活性多肽(參見，例如，美國(guó)專利6，319，714和 6，159，688)、剪接變體(天然發(fā)生的和遺傳工程產(chǎn)生的)，只要它們至少部分來(lái)源于一個(gè) 或多個(gè)相應(yīng)的酶；至少部分相應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)這樣的酶的多肽，其包含對(duì)天然序列的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸的修飾，包括但不限于，添加、除去或改變糖基化、二硫鍵、羥基側(cè)鏈和磷酸側(cè) 鏈，或交聯(lián)，只要此類修飾的多肽保持至少一些期望的催化活性；等等。當(dāng)針對(duì)特定酶使用 時(shí)，明確地在術(shù)語(yǔ)“其酶促活性突變體或變體”的含義內(nèi)的是該酶的酶促活性突變體、該酶 的酶促活性變體或該酶的酶促活性突變體和該酶的酶促活性變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的合適測(cè)定法將能夠容易地測(cè)量酶促活 性。因此，用于聚合酶催化活性的合適測(cè)定可包括例如測(cè)量變體在合適的條件下以模板依 賴性方式將rNTP或dNTP整合入新生的多核苷酸鏈的能力。同樣地，用于連接酶催化活性 的合適測(cè)定可包括例如，測(cè)量連接毗鄰雜交的包含合適的反應(yīng)基團(tuán)(例如本文中公開的那 些)的寡核苷酸的能力。用于此類測(cè)定的方案可見于，特別地，Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press (1989)(在下文中"Sambrook^ 人”),Sambrook 禾口 Russell,編輯,Molecular Cloning,第 3 卷，第 3 版,Cold SpringHarbor Press (2001) ,Ausubel 等人，以及 Housby 和 Southern，Nucl. Acids Res. 26 :4259_66，1998) 和下文引用的關(guān)于Rnl2連接酶的家族的參考文獻(xiàn)。擴(kuò)增引物術(shù)語(yǔ)“引物”是指與擴(kuò)增模板、擴(kuò)增產(chǎn)物或兩者的相應(yīng)的引物-結(jié)合位 點(diǎn)選擇性雜交；并且允許從其3’末端合成與相應(yīng)的多核苷酸模板互補(bǔ)的序列的多核苷酸?！耙飳?duì)”包括與擴(kuò)增產(chǎn)物的一條鏈或其互補(bǔ)序列退火的正向引物和反向引物。引物對(duì)可特 別用于某些指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在某些實(shí)施方案中，引物對(duì)的正向引物和 相應(yīng)的反向引物具有不同解鏈溫度(Tm)以允許異步引物PCR。如本文中所使用的，“正向”和“反向”用于表示引物在多核苷酸序列例如擴(kuò)增模 板或擴(kuò)增產(chǎn)物上的相對(duì)方向。例如，但非作為限定，認(rèn)為單鏈多核苷酸以其5’末端在左邊， 以水平地從左至右的方向延伸。設(shè)計(jì)“反向”引物使之以5’至3’方向，從右至左與該舉例 說(shuō)明性多核苷酸的“3’末端”上或其附近的下游引物-結(jié)合位點(diǎn)退火。設(shè)計(jì)相應(yīng)的“正向” 引物使之以5’至3’的“正向”方向從左至右與多核苷酸的“5’末端”上或其附近的上游引 物_結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)序列退火。因此，反向引物包含與多核苷酸的“反向”或下游引物_結(jié) 合位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，并且正向引物包含與正向或上游引物-結(jié)合位點(diǎn)相同的序列。應(yīng)理解， 術(shù)語(yǔ)“3末端”和“5’末端”，如本段落中所使用的，只是舉例說(shuō)明性的，并且不必按字面表 示多核苷酸的各自末端，因?yàn)榇祟愐?結(jié)合位點(diǎn)可位于內(nèi)部。相反地，唯一的限定是該 示例性引物對(duì)的反向引物與反向引物-結(jié)合位點(diǎn)退火，所述反向引物-結(jié)合位點(diǎn)在正向引 物_結(jié)合位點(diǎn)的下游或在其右邊，所述正向引物_結(jié)合位點(diǎn)包含與相應(yīng)的正向引物相同的 序列。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公認(rèn)的，這些術(shù)語(yǔ)不意欲是限定性的，而是在給定的實(shí)施方案中 提供說(shuō)明性方向。引物可包含銜接子寡核苷酸的核苷酸序列或相應(yīng)于銜接子寡核苷酸的核苷酸序 列。例如，具有SEQ ID NO :5的正向引物包含具有SEQ IDNO 1的第一寡核苷酸的序列(用T替代U)。引物與銜接子序列之間的關(guān)系的一些 實(shí)施方案可根據(jù)圖15的示意圖來(lái)理解，在所述示意圖中箭頭描述了不同的正向和反向PCR 引物或正向和反向SYBR引物。Pl和P2指引物部分。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“引物_結(jié)合位點(diǎn)”是指可直接或利用其互補(bǔ)序列作為模 板的多核苷酸序列的區(qū)域，引物可在所述模板上退火以進(jìn)行本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種引物核苷 酸延伸反應(yīng)中的任一種(例如，PCR)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，當(dāng)兩個(gè)引物-結(jié)合位點(diǎn)存 在于單個(gè)多核苷酸(例如但不限于第一延伸產(chǎn)物或第二延伸產(chǎn)物)上時(shí)，兩個(gè)引物-結(jié)合 位點(diǎn)的方向通常是不同的。例如，引物對(duì)的一個(gè)引物與第一引物_結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)并且可與 其雜交，而引物對(duì)的相應(yīng)引物經(jīng)設(shè)計(jì)與第二引物-結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)序列雜交。換句話說(shuō)，在 一些實(shí)施方案中，第一引物-結(jié)合位點(diǎn)可以為有義方向，第二引物-結(jié)合位點(diǎn)可以為反義方 向。此外，如本文中所使用的，通常選擇“通用”引物和引物-結(jié)合位點(diǎn)使之盡可能獨(dú)特(相 對(duì)于特定測(cè)定和宿主基因組)以確保測(cè)定的特異性。在一些實(shí)施方案中，引物和/或擴(kuò)增產(chǎn)物包含“啟動(dòng)子序列”，包括但不限于適合 于使用合適的聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的序列，所述聚合酶例如但不限于T 3RNA聚合酶、T7RNA聚 合酶或SP6RNA聚合酶。本教導(dǎo)的一些實(shí)施方案在將啟動(dòng)子序列整合入擴(kuò)增產(chǎn)物的方法中 使用“啟動(dòng)子-引物”。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列包括適合用于結(jié)合RNA聚合酶的許 多不同序列，例如但不限于適合用于結(jié)合第一 RNA聚合酶的第一序列和適合用于結(jié)合第二 RNA聚合酶的第二序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，當(dāng)通過(guò)某些擴(kuò)增方法擴(kuò)增包含啟動(dòng)子序列 的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可在互補(bǔ)的擴(kuò)增子中合成啟動(dòng)子序列的互補(bǔ)序列。因此，應(yīng)理解，啟動(dòng)子序 列的互補(bǔ)序列明確地包括在術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子序列的期望的含義內(nèi)，如本文中所使用的。公開的 方法和試劑盒的一些實(shí)施方案在將期望的啟動(dòng)子序列整合入擴(kuò)增產(chǎn)物的方法中使用“啟動(dòng)
26子-引物”。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，當(dāng)通過(guò)某些擴(kuò)增方法擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可在互補(bǔ)的擴(kuò)增子 中合成引物_結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)序列。因此，應(yīng)理解，引物_結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)序列明確地包括 在術(shù)語(yǔ)引物_結(jié)合位點(diǎn)的期望的含義內(nèi)，如本文中所使用的。在一些實(shí)施方案中，本教導(dǎo)的擴(kuò)增方法包括Q-PCR反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“定量PCR”、“實(shí)時(shí) PCR”或“Q-PCR”是指用于定量特定核酸序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果的許多方法。此類方 法通常分類為基于動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)(其通常確定或比較擴(kuò)增因子(amplification factor), 例如確定循環(huán)閾值(Ct))或共擴(kuò)增法(其通常比較從靶和標(biāo)準(zhǔn)模板的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn) 物的量)。許多Q-pcr技術(shù)包括報(bào)告探針、嵌入劑或兩者。例如但不限于TaqMan 探針 (Applied Biosystems)、i-探針、分子信標(biāo)、Eclipse探針、蝎形引物、Lux 引物、FRET引物、 溴化乙錠、SYBR Green I (Molecular Probes)禾口PicoGreen (MolecularProbes)。 在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括實(shí)時(shí)檢測(cè)儀器。示例性實(shí)時(shí)儀器包括ABI PRISM 7000 Sequence Detection System、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System、 Applied Biosystems 7300Real_Time PCR System、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCRSystem^ Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR System( ^ ^ ^ g Applied Biosystems) ；LightCycler System(RocheMolecular) ；Mx3000P Real-Time PCR System、Mx3005P Real-TimePCR System 和 Mx4000 Multiplex Quantitative PCR System(Stratagene， La Jolla， CA)；禾口 Smart Cycler System(Cepheid，由 Fisher Scientific分銷)。實(shí)時(shí)儀器的描述可見于，特別地，它們各自的廠商的用戶手冊(cè)； McPherson ；DNA Amplification CurrentTechnologies and Applications, Demidov 禾口 Broude, eds.，HorizonBioscience, 2004 ；以及美國(guó)專利 No. 6，814，934。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)包括多重?cái)U(kuò)增，其中使用許多不同的引物對(duì)同時(shí)擴(kuò) 增許多不同的擴(kuò)增模板、許多不同的擴(kuò)增產(chǎn)物類別或兩者(參見，例如，Henegariu等人， BioTechniques 23 =504-11,1997 ；和Rapley，特別地第79章)。公開的方法的某些實(shí)施方 案包括單重?cái)U(kuò)增反應(yīng)，包括但不限于，包括平行進(jìn)行的許多單重?cái)U(kuò)增的擴(kuò)增反應(yīng)，例如但不 限于某些TaqMan Array配置，其中平行進(jìn)行大約100個(gè)核酸酶測(cè)定以確定特異性擴(kuò)增 產(chǎn)物是否存在和以什么量存在。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)包括不對(duì)稱PCR。根據(jù)某些實(shí)施方案，不對(duì)稱PCR包 括擴(kuò)增組合物，所述組合物包含(i)至少一個(gè)引物對(duì)，其中一個(gè)引物相對(duì)于引物對(duì)的相應(yīng) 引物過(guò)量，例如但不限于5倍、10倍或20倍過(guò)量；(ii)至少一個(gè)引物對(duì)，其只包含正向引物 或只包含反向引物；(iii)至少一個(gè)引物對(duì)，其包含，在給定的擴(kuò)增條件中，導(dǎo)致一條鏈的 擴(kuò)增的引物和喪失功能的相應(yīng)的引物；或(iv)至少一個(gè)引物對(duì)，其滿足上述(i)和(iii) 的描述。因此，當(dāng)擴(kuò)增擴(kuò)增模板或擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，隨后的擴(kuò)增產(chǎn)物的一條鏈過(guò)量(相對(duì)于其互 補(bǔ)鏈)。不對(duì)稱PCR的描述可見于，特別地，McPherson，特別地在第5章中；和Rapley，特別 地在第64章中。在某些實(shí)施方案中，可使用至少一個(gè)引物對(duì)，其中一個(gè)引物的解鏈溫度(Tm5tl)高 于另一個(gè)引物的Tm5tl，有時(shí)稱為異步引物PCR(A-PCR，參見，例如，美國(guó)專利6，887，664)。在 某些實(shí)施方案中，正向引物的Thiki與相應(yīng)的反向引物的Tm5tl相差至少4-15°C。在某些實(shí)施 方案中，正向引物的Tm5tl與相應(yīng)的反向引物的Tm5tl相差至少8-15°C。在某些實(shí)施方案中，正向引物的Tm5tl與相應(yīng)的反向引物的Tm5tl相差至少10-15°C。在某些實(shí)施方案中，正向引 物的Thiki與相應(yīng)的反向引物的THIki相差至少10_12°C。在某些實(shí)施方案中，在至少一個(gè)引 物對(duì)中，正向引物的Tm5tl與相應(yīng)的反向引物的Tm5tl相差至少大約4°C，至少大約8°C，至少大 約10°C，或至少大約12°C。在某些擴(kuò)增實(shí)施方案中，除了引物對(duì)中引物的Tm5tl的差異外，引物對(duì)中一個(gè)引物 相對(duì)于另一個(gè)引物過(guò)量。在某些實(shí)施方案中，引物對(duì)中一個(gè)引物相對(duì)于另一個(gè)引物過(guò)量5 至20倍。在A-PCR的某些實(shí)施方案中，引物濃度是至少50nM。根據(jù)某些實(shí)施方案在A-PCR中，可在擴(kuò)增的第一循環(huán)中使用常規(guī)PCR以便兩個(gè)引 物退火和擴(kuò)增雙鏈擴(kuò)增子的兩條鏈。然而，通過(guò)升高相同擴(kuò)增反應(yīng)的隨后循環(huán)中的溫度，可 使具有較低Tm的引物喪失功能，以便只擴(kuò)增一條鏈。因此，其中使具有更低的Tm的引物喪 失功能的A-PCR的隨后循環(huán)導(dǎo)致不對(duì)稱擴(kuò)增。因此，當(dāng)擴(kuò)增靶區(qū)域或擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，隨后的擴(kuò) 增產(chǎn)物的一條鏈過(guò)量(相對(duì)于其互補(bǔ)鏈)。根據(jù)A-PCR的某些實(shí)施方案，可通過(guò)在第一階段的常規(guī)PCR循環(huán)期間改變循環(huán)的 次數(shù)來(lái)控制擴(kuò)增的水平。在此類實(shí)施方案中，通過(guò)改變初始常規(guī)循環(huán)的次數(shù)，可改變將在更 高的溫度下經(jīng)歷PCR的隨后循環(huán)(其中具有較低Tm的引物喪失功能)的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的量。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括體外轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)施方案中，第一銜接子、第二 銜接子、第一引物、第二引物或其組合，包含啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序列，例如但不限于啟動(dòng) 子-引物。在一些實(shí)施方案中，將包含啟動(dòng)子的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或包含啟動(dòng)子的擴(kuò)增產(chǎn)物與核 糖核苷三磷酸、合適的緩沖系統(tǒng)和合適的RNA聚合酶例如但不限于SP6、T3或T7RNA聚合酶 組合，并且按照已知的方法產(chǎn)生擴(kuò)增RNA (aRNA)。aRNA可用于陣列分析，例如微陣列或珠粒 陣列分析，其中可確定aRNA類別的序列和量。因此，在某些實(shí)施方案中，此類aRNA用作相 應(yīng)的RNA分子的替代物。最優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)的某些方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。例如，已知可通 過(guò)改變退火、聚合和變性的時(shí)間和溫度以及改變反應(yīng)組合物中的緩沖劑、鹽和其他試劑來(lái) 最優(yōu)化PCR。還可通過(guò)設(shè)計(jì)使用的引物來(lái)進(jìn)行最佳化。例如，引物的長(zhǎng)度以及G-C A-T的 比可改變引物退火的效率，從而改變擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增最優(yōu)化的描述可見于，特別地，James G. Wetmur,“ Nucleic Acid Hybrids，F(xiàn)ormation and Structure"，于Molecular Biology and Biotechnology 中，第 605-8 頁(yè)，(RobertA. Meyers ed.，1995) ；McPherson，特別地第 4 章；Rap ley ；禾口 Protocols& Applications Guide,rev. 9/04,Promega Corp.，Madison，WI0根據(jù)本教導(dǎo)，純化擴(kuò)增產(chǎn)物包括在至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)后，除去連接反應(yīng)組合物、擴(kuò) 增反應(yīng)組合物或兩者的至少一些未連接的銜接子、未連接的RNA分子、副產(chǎn)物、引物、酶或 其他組分的任何方法。此類方法包括但不限于，分子量/大小排阻法，例如凝膠過(guò)濾層析或 透析、基于序列特異性雜交的拉出法(pullout method)、親和捕獲技術(shù)、沉淀、吸附、凝膠電 泳、常規(guī)克隆、使用拼接(concatamerization)的常規(guī)克隆，或其他核酸純化技術(shù)。在一些 實(shí)施方案中，純化擴(kuò)增產(chǎn)物包括凝膠電泳，包括但不限于，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和/ 或瓊脂糖凝膠電泳。在某些實(shí)施方案中，使用高效液相色譜(HPLC ；有時(shí)也稱為高壓液相色 譜)純化擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)連接產(chǎn)物或其替代物來(lái)檢測(cè)目的RNA分子。在一些實(shí)施方案中，如
28上所述反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于陣列 上，并且進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，用生物素標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，通過(guò)使用與其結(jié)合的鏈 霉抗生物素蛋白進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，使用玻璃纖維濾器、珠粒純化反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或 凝膠純化反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與包含核糖核酸酶活性的肽組合 以形成降解反應(yīng)組合物，并且將其在適合于從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中降解至少一些核糖核苷的條件 下溫育以形成擴(kuò)增模板。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”和“探測(cè)”在本文中以廣義使用，且包括借助于其可確定特定RNA分 子，即，目的RNA分子是否存在于樣品中的任何技術(shù)。在一些實(shí)施方案中，直接或間接地檢 測(cè)替代物的存在，從而允許確定相應(yīng)的RNA分子的存在或不存在。例如，通過(guò)檢測(cè)使用擴(kuò)增 產(chǎn)物或連接產(chǎn)物作為模板獲得的一族標(biāo)記的測(cè)序產(chǎn)物；或當(dāng)與擴(kuò)增產(chǎn)物退火的核酸酶報(bào)告 探針被聚合酶切割時(shí)檢測(cè)產(chǎn)生的熒光來(lái)檢測(cè)替代物的存在，其中可檢測(cè)的信號(hào)或可檢測(cè)的 信號(hào)變化表明相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物和/或連接產(chǎn)物已被擴(kuò)增，從而表明相應(yīng)的RNA分子存在于 樣品中。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括定量可檢測(cè)的信號(hào)，包括但不限于，實(shí)時(shí)檢測(cè)法例如 定量PCR(“Q-PCR”)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括確定使用擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板產(chǎn)生的測(cè)序 產(chǎn)物或一族測(cè)序產(chǎn)物的序列；在一些實(shí)施方案中，此類檢測(cè)包括獲得一族測(cè)序產(chǎn)物的序列。 在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)RNA分子包括核酸染料，例如但不限于在Q-PCR反應(yīng)組合物中。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，連接產(chǎn)物、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、擴(kuò)增模板和擴(kuò)增序列各自用作它們直接或間 接從其產(chǎn)生的RNA分子的替代物，和理解，通過(guò)檢測(cè)此類產(chǎn)物的任一種，可直接或間接檢測(cè) 相應(yīng)的RNA分子。術(shù)語(yǔ)“報(bào)告探針”是指與相應(yīng)的擴(kuò)增子例如但不限于PCR產(chǎn)物特異性退火的一列 核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸和核苷酸類似物，并且當(dāng)檢測(cè)時(shí)，包括但不限于強(qiáng)度或發(fā)射 波長(zhǎng)的變化用于鑒定、檢測(cè)和/或定量相應(yīng)的擴(kuò)增子(從而相應(yīng)的RNA分子)。因此，通過(guò) 間接檢測(cè)擴(kuò)增子，可確定相應(yīng)的RNA分子是否存在于樣品中?？苫趫?bào)告探針的作用模式 分類大多數(shù)報(bào)告探針，例如但不限于核酸酶探針，包括但不限于TaqMan 探針；延伸探 針，包括但不限于蝎形引物、Lux 引物、Amplif Iuors等；以及雜交探針，包括但不限于分子 信標(biāo)、Eclipse 探針、light-up探針、成對(duì)的單標(biāo)記的報(bào)告探針、雜交探針對(duì)等。在某些 實(shí)施方案中，報(bào)告探針包含酰胺鍵、鎖核酸(LNA)、通用堿基或其組合，并且可包括莖-環(huán)和 無(wú)莖報(bào)告探針構(gòu)型。某些報(bào)告探針是單標(biāo)記的，然而其他報(bào)告探針是雙標(biāo)記的。在毗鄰雜 交的探針之間包含F(xiàn)RET的雙探針系統(tǒng)在術(shù)語(yǔ)報(bào)告探針的期望的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案 中，報(bào)告探針包含熒光報(bào)告基團(tuán)和猝滅劑(包括但不限于暗猝滅劑(darkquencher)和熒 光猝滅劑)。報(bào)告探針的一些非限定性實(shí)例包括TaqMan 探針；蝎形探針(也稱為蝎形 引物)；Lux 引物；FRET引物；Ecl ipse 探針；分子信標(biāo)，包括但不限于基于FRET的分 子信標(biāo)、多色分子信標(biāo)、適體信標(biāo)(aptamer beacon)、PNA信標(biāo)和抗體信標(biāo)；標(biāo)記的PNA鉗 (clamp)、標(biāo)記的PNA opener、標(biāo)記的LNA探針和包含納米晶體、金屬納米顆粒的探針和相 似的混合探針(hybrid probe)(參見，例如，Dubertret 等人，Nature Biotech. 19 :365_70， 2001 ；Zelphati等人，BioTechniques 28 =304-15,2000) 在某些實(shí)施方案中，報(bào)告探針還 包括小溝結(jié)合劑，包括但不限于TaqMan mgb探針和TaqMan mgb-nfq探針(兩者都 來(lái)自Applied Biosystems)。在某些實(shí)施方案中，報(bào)告探針檢測(cè)包括熒光偏振檢測(cè)(參見， 例如，Simeonov 和 Nikiforov，Nucl. Acids Res. 30 :e91，2002)。
29
術(shù)語(yǔ)“報(bào)告基團(tuán)”在本文中以廣義使用，并且是指任何可鑒定的標(biāo)簽、標(biāo)記或部分。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，許多不同類別的報(bào)告基團(tuán)可單獨(dú)地或與一個(gè)或多個(gè)不同報(bào)告基團(tuán) 組合用于本教導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射熒光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、磷光或電化 學(xué)發(fā)光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)的一些非限定性實(shí)例包括熒光團(tuán)、放射性同位素、色原、酶、抗原包括 但不限于表位標(biāo)簽、半導(dǎo)體納米晶體例如量子點(diǎn)、重金屬、染料、磷光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、 電化學(xué)檢測(cè)部分、結(jié)合蛋白、磷光體、稀土螯合物、過(guò)渡金屬螯合物、近紅外染料、電化學(xué)發(fā) 光標(biāo)記和質(zhì)譜相容性報(bào)告基團(tuán)例如質(zhì)量標(biāo)簽(mass tag)、電荷標(biāo)簽和同位素(參見，例如， Haff 和 Smirnov，Nucl. Acids Res. 25 :3749_50，1997 ；Xu 等人，Anal. Chem. 69 :3595_3602， 1997 ；Sauer 等人，Nucl. Acids Res. 31 :e63，2003)。術(shù)語(yǔ)報(bào)告基團(tuán)還包括多要素報(bào)告系統(tǒng)的要素，包括但不限于，親和標(biāo)簽例如生物 素抗生物素蛋白、抗體抗原等，其中一個(gè)要素與系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)其他要素相互作用 以實(shí)現(xiàn)可檢測(cè)信號(hào)的潛能。多要素報(bào)告系統(tǒng)的一些非限定性實(shí)例包括含有生物素報(bào)告基 團(tuán)的寡核苷酸和綴合有鏈霉抗生物素蛋白的熒光團(tuán)，或反之亦然；包含DNP報(bào)告基團(tuán)的 寡核苷酸和熒光團(tuán)標(biāo)記的抗DNP抗體等。用于將報(bào)告基團(tuán)連接至核酸的詳細(xì)方案可見 于，特別地，Hermanson, Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego, 1996 ； Current Protocols in NucleicAcid Chemistry, Beaucage 等人，eds.，John Wiley & Sons，New York, NY(2000)，包括自 2005 年 4 月以來(lái)的補(bǔ)充內(nèi)容；和 Haugland, Handbookof Fluorescent Probes and Research Products，第 9 片反，MolecularProbes，2002。多要素相互作用報(bào)告基團(tuán)也在術(shù)語(yǔ)報(bào)告基團(tuán)的期望的范圍內(nèi)，例如熒光團(tuán)-猝滅 劑對(duì)，包括但不限于熒光猝滅劑和暗猝滅劑(也稱為非熒光猝滅劑)。熒光猝滅劑可吸收從 熒光團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)并且在吸收足夠的熒光能量后，熒光猝滅劑可發(fā)射特征性波長(zhǎng)的熒 光，例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。例如但不限于，F(xiàn)AMtm-TAMRAtm染料對(duì)可在492nm(FAMTM 染料的激發(fā)峰)處被照亮，并且在580nm(TAMRATM染料的發(fā)射峰)處發(fā)射熒光。適合與熒 光報(bào)告基團(tuán)配對(duì)的暗猝滅劑從熒光團(tuán)吸收熒光能量，但其本身不發(fā)熒光。相反地，暗猝滅 劑消耗吸收的能量(通常作為熱)。暗或非熒光猝滅劑的一些非限定性實(shí)例包括Dabcyl、 Black Hole Quenchers、Iowa Black、QSY-7、AbsoluteQuencher、Ec 1 ipse 非熒光猝滅 劑、金屬簇例如金納米顆粒等。包含熒光團(tuán)-猝滅劑對(duì)的某些雙標(biāo)記的探針，當(dāng)對(duì)的成員在 物理上分離時(shí)，可發(fā)射熒光，例如但不限于核酸酶探針例如TaqMan 探針。其他包含熒光 團(tuán)-猝滅劑對(duì)的雙標(biāo)記的探針，當(dāng)對(duì)的成員在空間上分離時(shí)，可發(fā)射熒光，例如但不限于雜 交探針，例如分子信標(biāo)或延伸探針例如Scorpion 引物。熒光團(tuán)-猝滅劑對(duì)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟 知的并且廣泛地用于許多報(bào)告探針(參見，例如，Yeung等人，BioTechniques 36 =266-75, 2004 ；Dubertret 等人，Nat. Biotech. 19 :365_70，2001 ；禾口 Tyagi 等人，Nat. Biotech. 18 1191-96,2000)。術(shù)語(yǔ)“核酸染料”，如本文中所使用的，是指熒光分子，所述熒光分子特異于雙鏈 多核苷酸或當(dāng)與雙鏈多核苷酸結(jié)合時(shí)發(fā)射比與單鏈多核苷酸結(jié)合時(shí)顯著更強(qiáng)的熒光信 號(hào)。通常，核酸染料分子通過(guò)嵌入雙鏈區(qū)段的堿基對(duì)之間，通過(guò)結(jié)合在雙鏈區(qū)段的大溝或 小溝中，或兩者而與多核苷酸的雙鏈區(qū)段結(jié)合。核酸染料的非限定性實(shí)例包括溴化乙錠、 DAPI、Hoechst衍生物包括但不限于Hoechst 33258和Hoechst33342、包含鑭系元素螯合物 (例如但不限于具有兩個(gè)熒光四配位基β-二酮基_Eu3+螯合物的萘二亞胺(nalthalenediimide)衍生物(NDI-(BHHCT-Eu3+)2)的嵌入劑，參見，例如，Nojima 等人，Nucl. AcidsRes. Supplement No. 1，105-06 (2001))、溴化乙錠和某些非對(duì)稱花青染料例如SYBR Green、 SYBR Goid、P icoGreen 禾口 boxto。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括儀器，S卩，使用可以包括，但不必包括計(jì)算機(jī)算法的 自動(dòng)化或半自動(dòng)化檢測(cè)裝置。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)儀器包括或偶聯(lián)至裝置，所述裝置用 于在描記器、監(jiān)控器、電子屏、磁介質(zhì)、掃描儀輸出或其他二或三維顯示器上圖形顯示延伸 產(chǎn)物或其替代物的觀察到或測(cè)量的參數(shù)的強(qiáng)度和/或記錄觀察到的或測(cè)量的參數(shù)。在某些 實(shí)施方案中，將檢測(cè)步驟與至少一個(gè)分離步驟組合或所述檢測(cè)步驟是至少一個(gè)分離步驟的 延續(xù)，例如但不限于包括至少一個(gè)熒光掃描儀和至少一個(gè)繪圖、記錄或讀取組件的毛細(xì)管 電泳儀；與吸光度監(jiān)控器或熒光掃描儀和圖形記錄器偶聯(lián)的層析柱；與包括記錄和/或檢 測(cè)組件的質(zhì)譜儀偶聯(lián)的層析柱；或具有數(shù)據(jù)記錄裝置例如掃描儀或CCD照相機(jī)的微陣列。 在某些實(shí)施方案中，將檢測(cè)步驟與擴(kuò)增步驟組合，例如但不限于實(shí)時(shí)分析例如Q-PCR。用 于進(jìn)行檢測(cè)步驟的示例性系統(tǒng)，特別地，包括ABI PRISM Genetic Analyzer儀器系列、 ABI PRISM DNA Analyzer 儀器系列、ABI PRISM Sequence DetectionSystems 儀器 系列和 Applied Biosystems Real-Time PCR 儀器系列(全都來(lái)自 Applied Biosystems)； 以及微陣列和相關(guān)軟件例如AppliedBiosystems微陣列和Applied Biosystems 1700 ChemiluminescentMicroarray Analyzer和其他可商購(gòu)獲得的微陣列和可從Affymetrix， Agilent 獲得的分析系統(tǒng)(也參見 Gerry 等人，J. Mol. Biol. 292 :251_62，1999 ；De Bellis 等人，Minerva Biotec 14 :247_52，2002 ；禾口 Stears 等人，Nat. Med. 9 140-45，包括補(bǔ)充 內(nèi)容，2003)或珠粒陣列平臺(tái)(Illumina, San Diego, CA)。示例性軟件包括GeneMapper Software> GeneScan Analysis Software 禾口 GeilOtyper software (全者β 來(lái)自 Applied Biosystems)。在某些實(shí)施方案中，可基于擴(kuò)增產(chǎn)物和/或連接產(chǎn)物的至少一部分的質(zhì)荷比(m/ ζ)檢測(cè)和定量RNA分子。例如，在一些實(shí)施方案中，引物或銜接子包含質(zhì)譜-相容性報(bào)告 基團(tuán)，包括但不限于，質(zhì)量標(biāo)簽、電荷標(biāo)簽、可切割部分或被整合入擴(kuò)增產(chǎn)物并且可用于質(zhì) 譜儀檢測(cè)的同位素(參見，例如，Haff 和 Smirnov，Nucl. Acids Res. 25 :3749_50，1997 ；和 Sauer等人，Nucl. Acids Res. 31 :e63，2003)?？赏ㄟ^(guò)質(zhì)譜檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，從而允許確定相 應(yīng)的RNA分子的存在或不存在。在一些實(shí)施方案中，引物或銜接子包含限制性酶位點(diǎn)、可切 割部分等，以促進(jìn)釋放擴(kuò)增產(chǎn)物的一部分用于檢測(cè)。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)液相色譜或毛 細(xì)管電泳分離許多擴(kuò)增產(chǎn)物，使之經(jīng)歷ESI或MALDI，并通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜法的描 述可見于，特別地，The ExpandingRoie of Mass Spectrometry in Biotechnology, Gary Siuzdak, MCCPress，2003。在某些實(shí)施方案中，直接或間接地檢測(cè)替代物例如報(bào)告探針或報(bào)告探針的切割部 分。例如但不限于，將擴(kuò)增產(chǎn)物與包含猝滅劑的報(bào)告探針雜交，所述報(bào)告探針包括但不限 于，分子信標(biāo)，包括莖-環(huán)和無(wú)莖信標(biāo)，TaqMan 探針或其他核酸酶探針，Lightspeed PNA探針或微陣列捕獲探針。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)分子信標(biāo)和擴(kuò)增產(chǎn)物在溶液中游離時(shí)， 發(fā)生雜交，并且發(fā)射可檢測(cè)的信號(hào)或可檢測(cè)的不同信號(hào)。在其他實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物與固 體表面例如微陣列雜交或結(jié)合，并且發(fā)射可檢測(cè)的信號(hào)或可檢測(cè)的不同信號(hào)(參見，例如， EviArrays 禾口 EviProbes ，Evident Technologies) 0
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在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括測(cè)量或定量通常因擴(kuò)增產(chǎn)物的存在而引起的報(bào)告基 團(tuán)的可檢測(cè)信號(hào)或報(bào)告基團(tuán)的可檢測(cè)信號(hào)的變化。例如，但非作為限定，未雜交的報(bào)告探針 可發(fā)射低水平但可檢測(cè)的信號(hào)(當(dāng)與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交時(shí)，所述信號(hào)定量地增加)，包括但不限 于，某些分子信標(biāo)、LNA探針、PNA探針和light-up探針(參見，例如，Svanik等人，Analyt. Biochem. 281 :26_35，2000 ；Nikiforov 和 Jeong, Analyt. Biochem. 275 :248_53，1999 ；以及 Simeonov 和 Nikiforov，Nucl. Acids Res. 30 :e91，2002)。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括測(cè) 量熒光偏振。在一些實(shí)施方案中，確定特定RNA分子是否存在于樣品中包括評(píng)估內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)或?qū)?照序列，例如相應(yīng)的靶區(qū)域、內(nèi)部大小標(biāo)準(zhǔn)或其組合的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照 序列或內(nèi)部參照染料用于說(shuō)明泳道之間、毛管之間和/或測(cè)定之間的變化性。在某些實(shí)施 方案中，內(nèi)部對(duì)照序列包括平行擴(kuò)增以驗(yàn)證擴(kuò)增反應(yīng)或檢測(cè)技術(shù)的無(wú)關(guān)核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，使用的檢測(cè)技術(shù)通常不是限定性的。相反，許多檢測(cè)方法在 公開的方法和試劑盒的范圍之內(nèi)，只要它們?cè)试S確定樣品中RNA分子的存在或不存在。在一些實(shí)施方案中，公開的方法和試劑盒包括微流體裝置，“芯片上的實(shí)驗(yàn)室”或 微全分析系統(tǒng)(yTAS)。在一些實(shí)施方案中，使用微流體裝置進(jìn)行樣品制備。在一些實(shí) 施方案中，使用微流體裝置進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，使用微流體裝置進(jìn)行測(cè)序 或Q-PCR反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，使用微流體裝置獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分的核苷酸 序列。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)包括微流體裝置，包括但不限于，TaqMan Low Density Array (Applied Biosystems)。示例性微流體裝置的描述可見于，特別地，公開的PCT申請(qǐng) 案 W0/0185341 和 W004/011666 ；Kartalov 和 Quake，Nucl. Acids Res. 32 :2873_79，2004 ；以 及 Fiorini 和 Chiu, BioTechniques 38 :429_46，2005。測(cè)序在一些實(shí)施方案中，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分的序列，從而檢測(cè)目的RNA 分子。術(shù)語(yǔ)“測(cè)序”在本文中以廣義使用并且是指本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何技術(shù)，所述技術(shù)允 許鑒定RNA的至少一部分(包括但不限于延伸產(chǎn)物或載體插入物的至少一部分)中至少 一些連續(xù)核苷酸的順序。測(cè)序技術(shù)的一些非限定性實(shí)例包括Sanger’ s雙脫氧終止法和 Maxam和Gilbert的化學(xué)斷裂法，包括此類方法的變型；通過(guò)雜交例如但不限于擴(kuò)增產(chǎn)物 與微陣列或珠粒例如珠粒陣列的雜交進(jìn)行的測(cè)序；焦磷酸測(cè)序(參見，例如，Ronaghi等 A, Science 281 =363-65,1998)；和限制性作圖法。一些測(cè)序法包括電泳，包括但不限于 毛細(xì)管電泳和凝膠電泳；質(zhì)譜法；和單分子檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)序包括直接測(cè)序、 雙鏈體測(cè)序、循環(huán)測(cè)序、單堿基延伸測(cè)序(SBE)、固相測(cè)序或其組合。在一些實(shí)施方案中， 測(cè)序包括使用儀器例如但不限于ABI PR ISM 377DNA Sequencer, ABI PRISM 310， 3100，3100-Avant，3730 或 3730x1 Genetic Analyzer,ABI PRISM 3700DNA Analyzer 或 Applied Biosystems SOLiD System(全部來(lái)自 AppliedBiosystems)、Genome Sequencer 20System(Roche Applied Science)或質(zhì)譜儀來(lái)檢測(cè)測(cè)序產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，測(cè)序 包括乳液 PCR(參見，例如，Williams 等人，Nature Methodds 3(7) :545_50，2006)。在某 些實(shí)施方案中，測(cè)序包括高通量測(cè)序技術(shù)，例如但不限于大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(massively parallel signature sequencing，MPSS)。MPSS 的描述可見于，特別地，Zhou 等人，Methods of MolecularBiology 331 :285_311, Humana Press Inc. ；Reinartz 等人，Briefingsin Functional Genomics and Proteomics,! 95~104,2002 ；Jongeneel 等 人，GenomeResearch 15 1007-14，2005中。在一些實(shí)施方案中，測(cè)序包括將dNTP，包括但不限于dATP、 dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP或其組合整合入擴(kuò)增產(chǎn)物和將dNTP的雙脫氧核糖核苷酸形式 包括入擴(kuò)增產(chǎn)物?？捎糜诖_定核酸分子的至少一部分的序列的另外的示例性技術(shù)包括但不限于基 于乳液的PCR，然后進(jìn)行任何合適的大規(guī)模平行測(cè)序或其他高通量技術(shù)。在一些實(shí)施方案 中，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分的序列以檢測(cè)相應(yīng)的RNA分子包括定量擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些 實(shí)施方案中，使用例如PCT專利申請(qǐng)公開案WO 06/084132 (標(biāo)題為“Reagents, Methods, and Libraries For Bead-Based Sequencing，，)禾口 W007/121489 (標(biāo)題為"Reagents， Methods, and Libraries for Gel-FreeBead-Based Sequencing，，)中描述的 SOLiD System(AppliedBiosystems)進(jìn)行測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，定量擴(kuò)增產(chǎn)物包括實(shí)時(shí)或終 點(diǎn)定量PCR或兩者。在一些實(shí)施方案中，定量擴(kuò)增產(chǎn)物包括產(chǎn)生待檢測(cè)的RNA分子的表達(dá) 特征譜，例如mRNA表達(dá)特征譜和miRNA表達(dá)特征譜。在某些實(shí)施方案中，定量擴(kuò)增產(chǎn)物包 括一個(gè)或多個(gè)5'-核酸酶測(cè)定，例如但不限于，TaqMan Gene Expression Assays和 TaqMan miRNA Assays,其可包括微流體裝置，包括但不限于，低密度陣列。本領(lǐng)域內(nèi)已 知的任何合適的表達(dá)特征譜分析技術(shù)可用于公開的方法的不同實(shí)施方案中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，使用的測(cè)序方法通常不是對(duì)本方法的限定。相反地， 提供相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物或待檢測(cè)的RNA的至少一部分的或來(lái)源于擴(kuò)增產(chǎn)物的載體插入物 的至少一部分的至少一些連續(xù)核苷酸的順序的任何測(cè)序技術(shù)通?？捎糜诒痉椒āy(cè)序 技術(shù)的描述可見于，特別地，McPherson，特別地第5章中；Sambrook和Russell ；Ausubel 等 人；Siuzdak, The Expanding Role of Mass Spectrometry inBiotechnology, MCC Press，2003，特別地第7章；和Rapley。在一些實(shí)施方案中，在測(cè)序步驟之前通過(guò)酶促降 解，包括但不限于外切核酸酶ι和蝦堿性磷酸酶降解例如但不限于ExoSAP-IT 試劑 (USBCorporation)來(lái)除去未整合的引物和/或dNTP。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)凝膠或柱 純化、沉降、過(guò)濾、珠粒、磁性分離或基于雜交的拉出(適當(dāng)時(shí))來(lái)除去未整合的引物、dNTP 和/或ddNTP(參見，例如，ABlPRISM Duplex 384 Well F/R Sequence Capture Kit, AppliedBiosystems P/N 4308082)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在某些實(shí)施方案中，使用的測(cè)序/再測(cè)序 (resequencing)技術(shù)的閱讀長(zhǎng)度可以是可被有效檢測(cè)的RNA分子的大小的因子(參見，例 如，Kling，Nat. Biotech. 21(12) 1425-27)。在一些實(shí)施方案中，用第一標(biāo)識(shí)序列(在本文 中有時(shí)稱為“條形碼”)或其他標(biāo)記物標(biāo)記從來(lái)自第一樣品的RNA分子產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，用 第二標(biāo)識(shí)序列或第二標(biāo)記物標(biāo)記從來(lái)自第二樣品的RNA分子產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且在確定 相應(yīng)的樣品中相應(yīng)的RNA分子的序列之前將包含第一標(biāo)識(shí)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和包含第二標(biāo) 識(shí)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物混合。在某些實(shí)施方案中，組合3個(gè)或更多個(gè)不同的RNA文庫(kù)，各文庫(kù) 包含特異于該文庫(kù)的標(biāo)識(shí)序列。在一些實(shí)施方案中，第一銜接子、第二銜接子、正向引物、 反向引物或其組合包含標(biāo)識(shí)序列或標(biāo)識(shí)序列的互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)識(shí)序列包 含(i)5' -AAGCCC、(ii)5' -CACACC、(iii)5‘ -CCCCTT、(iν)5‘ -CATCGG、(ν)5-TCGTTG、 (vi)5' -GGGCAC, (vii)5' -CCAGAC、(viii)5' -CTCCGT、(ix)5' -CCCTTC、(x)5' -GCGGTC 中的一個(gè)或此類序列(i)-(x)的任一個(gè)的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方案中，反向引物包含SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 15至SEQ ID NO 23的序列(如實(shí)施例11中描述的)。
文庫(kù)本教導(dǎo)提供了用于檢測(cè)RNA分子的組合物、方法和試劑盒。根據(jù)某些實(shí)施方 案，產(chǎn)生包含許多不同的擴(kuò)增產(chǎn)物類別的文庫(kù)，其中擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一個(gè)類別相應(yīng)于存在 于樣品中的小RNA的一個(gè)類別。根據(jù)本教導(dǎo)的某些舉例說(shuō)明性實(shí)施方案，例如，將包含許多小RNA類別、許多mRNA 類別或兩者的樣品與許多不同的第一銜接子類別、許多不同的第二銜接子類別和包含雙鏈 特異性RNA連接酶活性的多肽組合以形成連接反應(yīng)組合物。在一些實(shí)施方案中，將mRNA片 段化、除盡不期望的核酸類別(例如但不限于rRNA、高拷貝數(shù)mRNA或基因組DNA)，或進(jìn)行 除盡和片段化。將連接反應(yīng)組合物在適合于至少一些銜接子類別與相應(yīng)的RNA分子雜交的 條件下進(jìn)行溫育。應(yīng)理解，除非明確地聲明，否則(i)將銜接子類別與包含RNA的樣品組合， ( )溫育以允許銜接子與相應(yīng)的RNA分子退火，然后(iii)向反應(yīng)組合物中加入連接酶的 過(guò)程在形成連接反應(yīng)組合物和溫育的期望的范圍內(nèi)。許多不同的銜接子類別通常包含成組的RNA/DNA寡核苷酸，所述RNA/DNA寡核苷 酸在一個(gè)末端具有單鏈簡(jiǎn)并序列，且在某些實(shí)施方案中在另一末端上或其附近具有確定 的序列，所述確定的序列可用作擴(kuò)增引物或報(bào)告探針的結(jié)合位點(diǎn)、用于樣品鑒定(例如但 不限于將從不同起始材料產(chǎn)生的文庫(kù)混合和隨后鑒定擴(kuò)增文庫(kù)的來(lái)源)，和/或隨后產(chǎn)生 的擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序。在某些實(shí)施方案中，將樣品與銜接子混合物A雜交將產(chǎn)生適合用于 SOLiD 測(cè)序(從擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)的相應(yīng)于RNA分子的序列的5'末端開始)的擴(kuò)增產(chǎn)物。相反 地，使用銜接子混合物B的雜交產(chǎn)生適合用于從3'末端開始的SOLiD 測(cè)序的擴(kuò)增產(chǎn)物。 然后將包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽加入混合物中以將雜交的銜接子連接至小 RNA分子。將連接反應(yīng)組合物與包含依賴于RNA的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶混合，且反 轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物以產(chǎn)生cDNA。將該反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與RNA酶H組合以從RNA/cDNA雙鏈體中降解 至少一些小RNA或片段化的mRNA，從而產(chǎn)生擴(kuò)增模板。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在核糖核酸 酶降解過(guò)程中也降低了未連接的銜接子和銜接子副產(chǎn)物的濃度。在這點(diǎn)上，反應(yīng)物包含樣 品中的RNA分子的cDNA拷貝。為了滿足某些測(cè)序技術(shù)的擴(kuò)增產(chǎn)物輸入要求，和在一些實(shí)施 方案中為了將標(biāo)識(shí)序列附至擴(kuò)增產(chǎn)物，可使用合適的引物組(其中至少一種正向引物，至 少一種反向引物或兩者可包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)識(shí)序列)和一定數(shù)目的PCR擴(kuò)增循環(huán)(其中當(dāng) 針對(duì)循環(huán)次數(shù)(大約12至15或大約12至18個(gè)PCR循環(huán))作圖時(shí)，檢測(cè)在線性范圍內(nèi)) 擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，限定循環(huán)次數(shù)使假PCR產(chǎn)物的合成降至最低和 保持樣品的RNA特征譜的完整性。在某些實(shí)施方案中，至少一種正向引物、至少一種反向引 物或至少一種正向和至少一種反向引物包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)識(shí)序列。某些實(shí)施方案包括使用 10組PCR引物，其中，除了 3'(反向)引物上的特異于該反向引物類別的6bp“條形碼”標(biāo) 識(shí)序列外，所述引物具有相同的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，將擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)歷大小選擇，例如但不限于，凝膠電泳，以 濃縮期望的大小范圍內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物和除去PCR副產(chǎn)物。經(jīng)適當(dāng)?shù)卮笮∵x擇的擴(kuò)增產(chǎn)物可以 以乳液 PCR(ePCR)步驟用于 SOLiD Sequencing System (Applied Biosystems)工作流，其 中將擴(kuò)增產(chǎn)物附著至珠粒，使用ePCR進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，最終進(jìn)行測(cè)序，這使得能夠確定不 同RNA分子在樣品中的存在、不存在和/或數(shù)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在某些情況下，擴(kuò)增產(chǎn)物和/或連接產(chǎn)物可用作相應(yīng)RNA
34分子的替代物，和理解，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物、連接產(chǎn)物或兩者可間接檢測(cè)RNA分子，和理解， 此類檢測(cè)在本教導(dǎo)的范圍內(nèi)。試劑盒還公開了用于進(jìn)行某些本方法的試劑盒。某些試劑盒實(shí)施方案包括第一 銜接子、第二銜接子、包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H(RNA 酶H) ,DNA聚合酶、引物或其組合。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括用于從RNA除去5’磷 酸的試劑，例如但不限于煙草酸焦磷酸酶。本教導(dǎo)還提供了經(jīng)設(shè)計(jì)促進(jìn)進(jìn)行某些公開的方法的試劑盒。試劑盒可通過(guò)裝配進(jìn) 行方法所需的兩個(gè)或更多個(gè)組分來(lái)用于促進(jìn)某些公開的方法的進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中， 試劑盒以預(yù)先測(cè)量的單位量包含組分以使終端用戶對(duì)測(cè)量的需要減少至最低。在一些實(shí)施 方案中，試劑盒包括用于進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)公開的方法的說(shuō)明書。在一些實(shí)施方案中，最優(yōu)化 試劑盒組分以便以彼此結(jié)合的方式進(jìn)行操作。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括至少一種第一銜接子類別、至少一種第二銜接子 類別、包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽、DNA聚合酶，包括但不限于，RNA指導(dǎo)的DNA 聚合酶、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶或包括RNA指導(dǎo)的和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性的DNA聚合 酶、核糖核酸酶H或其組合。在某些實(shí)施方案中，連接酶包括噬菌體T4 RNA連接酶2(Rnl2) 或來(lái)自Rnl2家族的連接酶。在一些實(shí)施方案中，第一銜接子、第二銜接子或第一銜接子和 第二銜接子兩者包含含有簡(jiǎn)并序列的單鏈部分。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含許多第一銜接子類別，其中每一個(gè)第一銜接子類 別包含不同的簡(jiǎn)并序列，許多第二銜接子類別，其中每一個(gè)第二銜接子類別包含不同的簡(jiǎn) 并序列，Rnl2家族的連接酶，RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，許多不同的第一引物類別，DNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶和RNA酶H(EC 3.1.26.4)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含煙草酸焦磷酸酶。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含許多第一銜接子類別，其中至少一些第一銜接子 類別包含簡(jiǎn)并序列，許多第二銜接子類別，其中至少一些第二銜接子類別包含簡(jiǎn)并序列，包 含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽，DNA聚合酶，至少一種引物類別和核糖核酸酶。在一 些實(shí)施方案中，試劑盒的DNA聚合酶包括依賴于RNA的DNA聚合酶和依賴于DNA的DNA聚 合酶。此外，試劑盒包含煙草酸焦磷酸酶。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包括正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方 案中，正向引物、反向引物或正向和反向引物包括通用引發(fā)序列或通用引發(fā)序列的互補(bǔ)序 列。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括還包含報(bào)告基團(tuán)的正向引物、反向引物或正向引物和反 向引物。在一些此類實(shí)施方案中，引物對(duì)的正向引物的報(bào)告基團(tuán)與引物對(duì)的反向引物的報(bào) 告基團(tuán)不同。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含報(bào)告探針、核酸染料、報(bào)告基團(tuán)或其組合中 的至少一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括對(duì)照序列，例如但不限于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)序列例如 持家基因或包含分子大小或分子量標(biāo)準(zhǔn)的多核苷酸梯。在某些試劑盒實(shí)施方案中，第一銜接子、第二銜接子、正向引物、反向引物或 其組合包含標(biāo)識(shí)序列或標(biāo)識(shí)序列的互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)識(shí)序列包括 (i)5 ‘ -AAGCCC、(ii)5 ‘ -CACACC、(iii)5 ‘ -CCCCTT、(iν)5 ‘ -CATCGG、(v)5-TCGTTG、 (vi)5' -GGGCAC, (vii)5' -CCAGAC、(viii)5‘ -CTCCGT、(ix)5' -CCCTTC, (χ)5' -GCGGTC 中的一個(gè)或此類序列(i)-(x)的任一個(gè)的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方案中，反向引物包含SEQ ID NO :6和SEQ ID NO: 15至SEQ ID NO :23中的一個(gè)的序列。在一些試劑盒實(shí)施方案中，提反向引物的混合物。在一些實(shí)施方案中，試劑盒提供了許多引物混合物，例 如但不限于下列中的至少兩種(i)包含第一正向引物和第一反向引物的引物混合物，其 中第一反向引物包含第一標(biāo)識(shí)序列；(ii)包含第一正向引物和第二反向引物的引物混合 物，其中第二反向引物包含第二標(biāo)識(shí)序列；(iii)包含第一正向引物和第三反向引物的引 物混合物，其中第三反向引物包含第三標(biāo)識(shí)序列；(iv)包含第一正向引物和第四反向引物 的引物混合物，其中第四反向引物包含第四標(biāo)識(shí)序列；(ν)包含第一正向引物和第五反向 引物的引物混合物，其中第五反向引物包含第五標(biāo)識(shí)序列；(vi)包含第一正向引物和第六 反向引物的引物混合物，其中第六反向引物包含第六標(biāo)識(shí)序列；(vii)包含第一正向引物 和第七反向引物的引物混合物，其中第七反向引物包含第七標(biāo)識(shí)序列；(viii)包含第一正 向引物和第八反向引物的引物混合物，其中第八反向引物包含第八標(biāo)識(shí)序列；(ix)包含第 一正向引物和第九反向引物的引物混合物，其中第九反向引物包含第九標(biāo)識(shí)序列；和(χ) 包含第一正向引物和第十反向引物的引物混合物，其中第十反向引物包含第十標(biāo)識(shí)序列。一些試劑盒實(shí)施方案包括至少一種銜接子混合物，其中每一種銜接子混合物包 含第一銜接子和第二銜接子；至少一種包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽；逆轉(zhuǎn)錄酶 (RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶)；DNA聚合酶(DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶)；核糖核酸酶；脫氧核糖核 苷三磷酸的混合物(dNTP)；和至少一種擴(kuò)增引物混合物，其中各擴(kuò)增引物混合物包含正向 引物和反向引物。在一些實(shí)施方案中，RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶包含 在某些反應(yīng)條件下具有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性的RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶或在某些條件 下具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性的DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，例如但不限于來(lái)自生氫氧化 碳嗜熱菌的Tth DNA聚合酶和DNA聚合酶I。在一些試劑盒實(shí)施方案中，依賴于DNA的DNA 聚合酶包括Taq DNA聚合酶，包括其酶促活性突變體和變體，例如但不限于，Amp 1 iTaq DNA聚合酶和AmpliTaq GO Id DNA聚合酶(Applied Biosystems)。在一些實(shí)施方案中， 核糖核酸酶包括核糖核酸酶H (RNA酶H)。一些試劑盒實(shí)施方案包括至少一種對(duì)照RNA分 子，例如但不限于至少一種陽(yáng)性對(duì)照RNA分子、至少一種陰性對(duì)照RNA分子或兩者。固體支持物在某些實(shí)施方案中，公開的方法和試劑盒包含固體支持物。在一些 實(shí)施方案中，固體支持物用于分離和/或檢測(cè)步驟，例如但不限于用于純化和/或分析擴(kuò)增 產(chǎn)物。固體支持物的非限定性實(shí)例包括瓊脂糖、wpharose、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、 膜、二氧化硅、半導(dǎo)體材料、硅、有機(jī)聚合物；任選地可鑒定的微柱體；包括變換器的生物傳 感器；適當(dāng)處理或包被的反應(yīng)容器和表面，例如但不限于微型離心或反應(yīng)管、多孔微量板的 孔，和玻璃、石英或塑料載玻片和/或蓋玻片；以及珠粒，例如但不限于磁珠、順磁珠粒、聚 合物珠粒、金屬珠粒、染料浸透的或標(biāo)記的珠粒、包被的珠粒、玻璃珠粒、微球體和納米球。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，許多固體支持物可用于公開的方法和試劑盒以及理解，固體支持 物的形狀和組成通常不是限定性的。上文已描述的本教導(dǎo)可通過(guò)參考實(shí)施例來(lái)更好地理解。下列實(shí)施例意欲只用于舉 例說(shuō)明目的，并且不應(yīng)當(dāng)解釋為以任何方式限定本文的教導(dǎo)的范圍。實(shí)施例1使用雙鏈特異性RNA連接酶Rnl2產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物將3個(gè)RNA樣品中的每一個(gè)樣品來(lái)自人胎盤的總RNAdOOy g, Ambion Ρ/Ν AM7950)，
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合成的miRNA 分子(mirVana miRNA Reference Panelv. 9. 1, IOOfmol, Ambion Ρ/Ν 4388891，合成的RNA寡核苷酸的等摩爾混合物，所述寡核苷酸代表miRBase Sequence Database版本9. 1中大多數(shù)人、小鼠和大鼠的miRNA序列)，和來(lái)自5 μ g 總 RNA 的經(jīng) flashPAGE Fractionation System 純化的總 RNA(人胎 )，與3 μ L 雜交溶液(300mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH 8. 0，2mMEDTA)禾口 2 μ L 銜接子 寡核苷酸混合物混合，所述銜接子寡核苷酸混合物包含如下寡核苷酸3. 1μΜ(5'-上，即，第一寡核苷酸)5 ‘ -CCUCUCUAUGGGCA⑶CG⑶GAU-3 ‘ , SEQ ID NO 1 ；6. 1 μΜ(5'-下，即，第二寡核苷酸)5' -NNNNNNATCACCGACTGCCCATAGAGAGG-3' , SEQ ID NO 2 ；3. 1 μΜ(3'-上，即，第三寡核苷酸)5' -P04-CGCCTTGGCCGTACAGCAG-3‘，SEQ ID NO 3 ；禾口6. 1 μΜ(3'-下，即，第四寡核苷酸)5' -CTGCTGTACGGCCAAGGCGNNNNNN-3‘ ；SEQ ID NO 4)其中“N”代表以25 25 25 25的比例混合的簡(jiǎn)并堿基(Α、C、G或Τ)。將凍干的寡核苷酸在不含核酸酶的水(Ambion Ρ/Ν ΑΜ9937)中重懸浮至100 μ M 的原液濃度，然后相應(yīng)地進(jìn)行稀釋。將RNA混合物在65°C下加熱10分鐘，然后在16°C下進(jìn) 行5分鐘以將銜接子與樣品中的小RNA雜交。然后將雜交的RNA/銜接子與10 μ L連接緩沖液(IOOmM Tris-HClpH 7. 5,20mM MgCl2, 20mM 二硫蘇糖醇，2mM ATP和40% (w/v) PEG-8000)混合，并在總共20 μ L中使用20 個(gè)單位的Τ4 RNA連接酶2(NEB，Ipswich, ΜΑ)在16°C下進(jìn)行連接，進(jìn)行16小時(shí)。此外，使 用不含核酸酶的水(代替連接酶)來(lái)制備總RNA樣品的不加連接酶的對(duì)照。通過(guò)在40 μ L的總體積中用200個(gè)單位的ArrayScript 逆轉(zhuǎn)錄酶(Ambion P/ N AM2048) ,4 μ L IOX RT 緩沖液(提供有 ArrayScript 酶)和 2yL 2. 5mM dNTP 混合物 (Ambion P/N AM8228G)在42°C下溫育30分鐘來(lái)反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物。使用不含核酸酶的水 (代替逆轉(zhuǎn)錄酶)來(lái)制備總RNA樣品的陰性RT對(duì)照。通過(guò)將10 μ L的樣品等分與10個(gè)單位的RNA酶H(Ambion P/NAM2292)在37°C下 溫育30分鐘來(lái)除去過(guò)量的RNA副產(chǎn)物，并利用PCR擴(kuò)增RNA酶處理的cDNA。50 μ L PCR反 應(yīng)物包含下列物質(zhì)38. 5 μ L 不含核酸酶的水(Ambion Ρ/Ν AM9937)，5 μ L GeneAmp 10X PCR 緩沖液 I (Applied Biosystems P/NN8080246)，4μ L 2. 5mM dNTP 混合物(Ambion P/N AM8228G)，0. 5yL 50μΜ 正向 PCR 引物:(5' -CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3' )(SEQ ID NO 5),0. 5yL 50μΜ 反向 PCR 引物(5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCCAGACCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘ )(SEQ ID NO 6)，1 μ L Ampl iTaq DNA 聚合酶(Applied Biosystems P/NN8080246)，和
0.5μ LcDNA樣品。PCR條件如下在95°C下進(jìn)行5分鐘以進(jìn)行初始變性，然后進(jìn)行15個(gè)循環(huán)在95°C 下30秒(變性)，在62°C下30秒(退火)和在72°C下30秒(延伸)。然后在72°C下進(jìn)行 7分鐘以進(jìn)行最終的延伸。將10 μ L各樣品以1 1與凝膠上樣緩沖液II (Ambion Ρ/Ν ΑΜ8547)混合，然 后將整個(gè)體積裝載至1. 0mm6 %聚丙烯酰胺凝膠上，在IX tris-硼酸鹽EDTA電泳緩沖液 (Ambion Ρ/Ν AM9863)中于180伏恒定電壓下電泳大約45分鐘。從盒中取出凝膠，然后在 IX TBE中的IX SYBR Gold核酸凝膠染料(Invitrogen P/N S11494)中染色5分鐘。使 用Alphalrmotech FluorChem SP成像儀對(duì)凝膠成像，然后使用AIphaEaSe FC軟件版 本6. 0.0處理圖像。如圖5中觀察到的，擴(kuò)增的連接產(chǎn)物(擴(kuò)增產(chǎn)物)由括號(hào)A顯示；箭頭B標(biāo)示在擴(kuò) 增反應(yīng)中擴(kuò)增的不期望的反應(yīng)副產(chǎn)物；括號(hào)C標(biāo)示擴(kuò)增反應(yīng)組合物中的殘留的未連接的銜 接子和引物。應(yīng)注意，正向PCR引物序列包含SEQ ID NO :1，第一寡核苷酸的序列(用T置換U) (其始于正向引物的核苷酸19)。還應(yīng)注意，反向引物序列包含SEQ ID NO :4，第四寡核苷 酸的序列(用T置換U)(其始于反向引物的核苷酸30)。因此，通過(guò)使用該結(jié)構(gòu)，檢測(cè)的小 RNA將具有等于圖5中觀察到的凝膠片段大小的長(zhǎng)度，例如，短于引物的長(zhǎng)度的總和。實(shí)施例2使用各種雙鏈特異性連接酶產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物 將來(lái)自人胎盤的總RNA (500ng, Ambion Ρ/Ν ΑΜ7950)與3 μ L雜交溶液和2 μ L銜 接子寡核苷酸混合物混合，并且如實(shí)施例1中所述進(jìn)行雜交。然后將雜交的RNA/銜接子與 10 μ L連接緩沖液(IOOmMTris-HCl ρΗ 7. 5,20mM MgCl2, 20mM二硫蘇糖醇，2mM ATP，和40% (w/v)PEG-8000)混合，在總共20 μ L中用10個(gè)單位的噬菌體T4RNA連接酶2、噬菌體Τ4 RNA 連接酶 1 (Ambion Ρ/Ν ΑΜ2140)、噬菌體 T4DNA 連接酶(Ambion Ρ/Ν ΑΜ2134)或 1 1 的 Τ4 RNA連接酶I與Τ4 DNA連接酶的混合物在16°C下進(jìn)行連接，進(jìn)行16小時(shí)。此外，使用不含 核酸酶的水(代替連接酶)來(lái)制備不加連接酶的對(duì)照。如實(shí)施例1中所述，反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物，用RNA酶H進(jìn)行處理并且進(jìn)行擴(kuò)增。將10 μ L 的各樣品與凝膠上樣緩沖液II (Ambion Ρ/Ν AM8547)以1 1混合，將整個(gè)體積裝載至 1. 0mm6%聚丙烯酰胺凝膠(InvitrogenP/N EC6265B0X)上，并在 IX tris-硼酸鹽 EDTA 電 泳緩沖液(Ambion P/NAM9863)中于180伏恒定電壓下電泳大約45分鐘。從盒中取出凝 膠，然后在IX TBE中的IX SYBR Gold核酸凝膠染料(Invitrogen P/NS11494)中染色5 分鐘。使用Alpha Innotech FluorChem SP成像儀對(duì)凝膠成像，使用AlphaEaSe FC軟 件版本 6. 0.0 處理圖像。將條帶與 IObp DNA 梯(IOOng ；Invitrogen Ρ/Ν 10821-015)相比 較。如圖6中所觀察到的，擴(kuò)增的連接產(chǎn)物(擴(kuò)增產(chǎn)物)由括號(hào)A顯示；箭頭B標(biāo)示擴(kuò) 增的不期望的反應(yīng)副產(chǎn)物；括號(hào)C標(biāo)示擴(kuò)增反應(yīng)組合物中殘留的未連接的銜接子和引物。 令人驚訝地，當(dāng)比較使用連接酶Rnl2 (泳道2)、連接酶Rnll (泳道4)、連接酶Dnl (泳道6) 或Rnll和Dnl的組合(泳道8)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，觀察到不同的擴(kuò)增產(chǎn)物特征譜。當(dāng)使 用Rnl2連接酶時(shí)，而非當(dāng)單獨(dú)地或組合地使用Rnll或Dnl時(shí)，觀察到在110個(gè)堿基對(duì)(bp)
38至130bp大小范圍內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭A)，所述擴(kuò)增產(chǎn)物在該舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中在預(yù) 期的擴(kuò)增的miRNA的大小范圍內(nèi)。此外，大約IOObp的擴(kuò)增產(chǎn)物的主條帶(圖6中略微遷 移至B上方)出現(xiàn)在相應(yīng)于Rnll、Dnl或兩者的所有泳道(在使用和不使用逆轉(zhuǎn)錄酶的情 況下)中，但當(dāng)使用Rnl2時(shí)，未觀察到該條帶。與在平行反應(yīng)中單獨(dú)地或組合地使用兩個(gè) 不同的連接酶產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物相比較，使用Rnl2產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的該差異是令人驚訝的 和出乎意料的。實(shí)施例3用于測(cè)序的帶條形碼的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生在進(jìn)行總RNA分離方法后，按照廠商的說(shuō)明手冊(cè)，使用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit (AMI560, Ambion)從 HeLa 細(xì)胞獲得小 RNA。如下制備連接反應(yīng)組合物。在0. 2mL不含RNA酶的薄壁PCR管(對(duì)于各反應(yīng)，其含 有2 μ L銜接子混合物(第一銜接子和第二銜接子)、3 μ L 2Χ雜交溶液(300mM NaCl, 20mM Tris,2mM EDTA，終pH 8.0)、1-3 μ L 來(lái)自 mirVana miRNA Isolation Kit 的 RNA分子溶液 (含有 1000 納克(ng)RNA)或 IOOOng 陽(yáng)性對(duì)照(F i Γ S tCho i Ce Total RNA 人胎盤； AM7950, Ambion)和0-2 μ L不含核酸酶的(NF)水(調(diào)整NF水體積以產(chǎn)生8 μ L/反應(yīng)的總 體積))中制備雜交混合物。將裝有雜交混合物的管輕輕混合，然后置于熱循環(huán)儀(其經(jīng)編 程在65°C下進(jìn)行10分鐘，然后在16°C下進(jìn)行5分鐘)中。將管保持在16°C，通過(guò)按順序 組合8μ L的經(jīng)熱循環(huán)的雜交混合物、IOyL 2Χ連接緩沖液(lOOmMTris，20mM MgCl2, 20mM DTT,2mM ATP, 40% PEG 8000, pH 7.0)和 2 μ L連接酶混合物(IOU/μ L 噬菌體T4RNA連接酶 2(Rnl2)、2U/μ LRNA酶抑制劑蛋白)來(lái)制備連接反應(yīng)組合物，對(duì)于各反應(yīng)，終體積為20 μ L。 通過(guò)上下吹打來(lái)混合管，然后在熱循環(huán)儀上于16°C下溫育16小時(shí)。通常，2小時(shí)的溫育足 以使第一銜接子和第二銜接子與RNA分子退火且使連接發(fā)生，從而產(chǎn)生連接產(chǎn)物(參見，例 如，圖3中的34)。將裝有連接產(chǎn)物的管置于冰上，然后如下制備反轉(zhuǎn)錄主混合物(RTMM)。對(duì)于各管 連接產(chǎn)物，組合 13 μ L NF 水、4 μ L 10Χ RT 緩沖液(500mM Tris-HCl pH 8. 3,750mM KCl, 30mM MgCl2, 50mM DTT，終 pH 8. 25)、2 μ L 2. 5mM dNTP 混合物和 1 μ L RT 酶混合物(200U/ 口1^燈對(duì)5(^1 {111逆轉(zhuǎn)錄酶0 嫩指導(dǎo)的0嫩聚合酶)以形成RTMM。向各連接產(chǎn)物的管中 加入20 μ L RTMM,通過(guò)上下吹打3至5次進(jìn)行混合，然后在42°C下溫育30分鐘以產(chǎn)生反轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物(參見，例如，圖3中的36)。在該溫育后，將含有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的溶液的10 μ L等分 轉(zhuǎn)移至新的0. 2mL管中，向所述管中加入1 μ L RNA酶H(10U/ μ L大腸桿菌(E. coli) RNA酶 H)。將管輕輕混合，然后在37°C下溫育30分鐘，在該時(shí)間內(nèi)降解反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并形成擴(kuò)增 模板(參見，例如，圖3中的38)。制備包含38. 5 μ L NF水、5 μ L GeneAmp PCR緩沖液 IUyLPCR引物混合物(25μΜ正向引物，25μΜ反向帶條形碼的引物)、4yL 2. 5mM dNTP 混合物和ι μ L Amp 1 iTaq dna聚合酶(5U/ μ L ；dna指導(dǎo)的dna聚合酶)的pcr主混合 物-每個(gè)待進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)總共49. 5 μ L0該示例性PCR引物混合物包含一種正向引物和 帶條形碼的反向引物。為了確定用于包含擴(kuò)增產(chǎn)物的給定溶液的PCR循環(huán)的合適次數(shù)，推薦小規(guī)模(即， 50 μ L) PCR反應(yīng)。通過(guò)在不含RNA酶的0. 2mL薄壁PCR管中將49. 5 μ L該P(yáng)CR主混合物與 0. 5 μ L含有擴(kuò)增模板的溶液組合來(lái)制備小規(guī)模擴(kuò)增反應(yīng)組合物。將擴(kuò)增反應(yīng)組合物置于具有加熱的蓋的熱循環(huán)儀中，在95°C下加熱5分鐘，然后使用在95°C下30秒-在62°C下30 秒-在72°C下30秒的條件進(jìn)行12至15個(gè)循環(huán)；然后在72°C下進(jìn)行終延伸步驟7分鐘。擴(kuò) 增循環(huán)的最佳次數(shù)取決于初始擴(kuò)增反應(yīng)組合物中擴(kuò)增產(chǎn)物的量。使用6%非變性tris-硼 酸鹽EDTA (TBE)丙烯酰胺凝膠通過(guò)電泳分析含有擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增反應(yīng)組合物的5-10 μ L等 分以確定擴(kuò)增循環(huán)的最佳次數(shù)。在進(jìn)行這樣的確定后，進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增。為了產(chǎn)生足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物用于測(cè)序和/或其他下游過(guò)程，通過(guò)PCR進(jìn)行大 規(guī)模擴(kuò)增反應(yīng)。對(duì)于每一個(gè)待進(jìn)行的反應(yīng)，通過(guò)組合77μ LNF水(Ambion ΑΜ9922)、 10XGeneAmp PCR緩沖液 1(或 IOX PCR緩沖液 I、Applied Biosystems Ρ/Ν Ν8080160)、 2 μ L帶條形碼的PCR引物(選擇的正向引物和帶條形碼的反向引物的混合物)、8 μ L dNTP 混合物和 2μ LAmpli Ta q DNA 指導(dǎo)的 DNA 聚合酶(Applied BiosystemsP/N N8080160) 來(lái)制備主混合物。在不含RNA酶的PCR板的3個(gè)分開的孔中(即，以一式三份重復(fù))組合該 主混合物的99 μ L的等分和1 μ L包含擴(kuò)增模板的溶液以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物。將PCR板 加熱至95°C并進(jìn)行5分鐘以使核酸變性，按照之前的溫度條件(在95°C下30秒-在62°C 下30秒-在72 °C下30秒)進(jìn)行循環(huán)，進(jìn)行之前確定的循環(huán)次數(shù)，最后將PCR反應(yīng)器在72 °C 下保持7分鐘以在擴(kuò)增反應(yīng)組合物中產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物混合，然后如之前一樣通 過(guò)在6%非變性TBE丙烯酰胺凝膠上電泳5-10 μ L的混合的擴(kuò)增反應(yīng)組合物來(lái)進(jìn)行分析。將二百五十(250) μ L混合的擴(kuò)增產(chǎn)物與250μ L苯酚/氯仿/異戊醇 (25 24 1，ρΗ 7.9)在不含RNA酶的1.5mL聚丙烯微量離心管中組合，通過(guò)渦漩混合。 使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下以12，OOOrpm離心管5分鐘。測(cè)量水相，然后將其轉(zhuǎn)移至新的不含 RNA酶的1. 5ml聚丙烯微量離心管中，向管中加入等體積的7. 5M乙酸銨和1/100體積的糖 原(或GlycoBlue Co-precipitant (Ambion)和0.7體積的異丙醇。將管中的內(nèi)容物充分 混合，在室溫下溫育5分鐘，然后以12，OOOrpm在室溫下離心20分鐘。取出并且棄去所得 的上清液，用ImL的70% (ν/ν)乙醇清洗沉淀3次。將沉淀風(fēng)干，然后重懸浮于ISyL不含 核酸酶的水(向其加入2yL IOX非變性凝膠上樣染料)中。向非變性TBE PAGE凝膠(所 述凝膠在另外的孔之一中包含10堿基對(duì)(bp)分子量梯(Invitrogen 10821-015)作為標(biāo) 記)的兩個(gè)孔的每一個(gè)中加入10 μ L該懸浮液。在大約140V下在凝膠中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 電泳直至染料前沿即將流出凝膠的底部邊緣(對(duì)于1. 0mm,ScmxScm的凝膠，大約30分鐘)。 按照廠商的說(shuō)明書使用SYBR Gold (Invitrogen，Carlsbad，CA)對(duì)凝膠中的核酸條帶進(jìn)行 染色，然后使用紫外光源進(jìn)行顯現(xiàn)。使用干凈的刀片，在含有擴(kuò)增產(chǎn)物的泳道中切取凝膠薄 片以獲得大約100至150bp的大小范圍內(nèi)的核酸。IOObp處的明顯的條帶可能代表不期望 的副產(chǎn)物，且不包括在從凝膠切取的薄片內(nèi)。同樣，當(dāng)使用某些測(cè)序方法，例如但不限于使 用S0LiD System(AppliedBiosystems)的乳液PCR測(cè)序法時(shí)，也避免大于大約200bp的核 酸。使用21號(hào)針在不含RNA酶的0. 5mL聚丙烯微量離心管的底部打孔，將切取的凝膠 塊轉(zhuǎn)移至該管中。然后將該0. 5mL管置于不含RNA酶的1. 5mL聚丙烯微量離心管內(nèi)，并以 12，OOOrpm離心3分鐘以破碎凝膠。取出并棄去0. 5mL管，將裝有凝膠片段的外層1. 5mL管 置于冰上。向管中加入二百(200) μ LPAGE洗脫緩沖液(1.5M乙酸銨，于IX TE緩沖液ρΗ 7. 0中)，然后將管在室溫下溫育20分鐘。在該第一次溫育后，取出上清液并且轉(zhuǎn)移至干凈 的不含RNA酶的1. 5mL聚丙烯微量離心管中，向第一管(裝有凝膠片段)中加入另外250 μ 1
40PAGE洗脫緩沖液，在37°C下溫育另外40分鐘。在第二次溫育后，收集第二上清液，將其加 至第一上清液中。按照廠商的說(shuō)明書，使用離心柱(Ambion Cat#10065)并且離心以從混合 的上清液中除去殘留的凝膠碎片。將所得的液體與等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 1，pH 7. 9)在不含 RNA酶的1.5mL聚丙烯微量離心管中組合，通過(guò)渦旋混合。使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下以 12，OOOrpm將管離心5分鐘。測(cè)量水相，并將其轉(zhuǎn)移至新的不含RNA酶的1. 5ml聚丙烯微 量離心管，向管中加入等體積的7. 5M乙酸銨以及1/100體積的糖原(AM9510，Ambion ；或 GlycoBlue Co-precipitant AM9515, Ambion)和0. 7體積的異丙醇。將管中的內(nèi)容物充 分混合，在室溫下溫育5分鐘，然后以12，OOOrpm在室溫下離心20分鐘。取出并棄去所得 的上清液，用ImL的70% (ν/ν)乙醇清洗沉淀3次。將沉淀風(fēng)干，然后重懸浮于20 μ L NF 水中。通過(guò)用分光光度計(jì)測(cè)定A26tl或如上文中所描述的，通過(guò)在6%非變性PAGE凝膠上分 析來(lái)定量含有擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA。為了確定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照用戶指南(Applied Biosystems,P/N4391578 ；“用 戶指南”)，在 Applied Biosystems SOLiD System 上進(jìn)行乳液 PCR(ePCR)。為了評(píng)估在 SOLiD System上在全規(guī)模(fullscale) ePCR中提供最佳測(cè)序結(jié)果的擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，在 0. 2pg/ μ L、0. 4pg/ μ L、0. 6pg/ μ L和0. 8pg/ μ L的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度上進(jìn)行4個(gè)分開的ePCR反 應(yīng)，然后按照廠商說(shuō)明書(具體參見，用戶指南，第3和4章)進(jìn)行滴定/QC試驗(yàn)。當(dāng)確定 最佳擴(kuò)增產(chǎn)物濃度時(shí)，進(jìn)行“全規(guī)?！?ePCR反應(yīng)(參見用戶指南的第3章，第3.1節(jié))。通 過(guò)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的至少部分的序列，可直接或通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物所源自的 RNA分子，從而檢測(cè)該RNA分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，這樣的序列信息可用于鑒定新型 RNA分子，包括但不限于，小RNA的發(fā)現(xiàn)；可用于確定起始樣品中一種檢測(cè)的RNA分子類別 的量(相對(duì)于另一種檢測(cè)的RNA類別的量)，并且這樣的信息可用于，特別地，mRNA、miRNA 或其他目的RNA分子的表達(dá)特征譜分析。實(shí)施例4銜接子懸突長(zhǎng)度的評(píng)估合成和評(píng)估具有不同懸突長(zhǎng)度的第一和第二銜接子以使連接效率最大化同時(shí)使 銜接子復(fù)雜性降至最低。示例性第一銜接子包含在圖7B中描述為“T3”的第一寡核苷酸和在圖7B中描述 為“27N”的第二寡核苷酸，其中第一寡核苷酸包含來(lái)自噬菌體T3的DNA序列且在3’末端 包含2個(gè)核糖核苷酸，其中第二寡核苷酸包含來(lái)自噬菌體T3的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸序列且 在5’末端包含4、6或8個(gè)簡(jiǎn)并脫氧核糖核苷酸“N”的懸突。示例性第一銜接子的上鏈(第 一寡核苷酸)包含來(lái)自噬菌體T3啟動(dòng)子的27個(gè)核苷酸的序列5 ‘-⑶CGAGAAUUAACCXUCAC UAAAGGGA-3' (SEQ ID NO :7)，在圖7B中顯示為“T3”。下鏈(第二寡核苷酸)包含在下鏈 5' -(N)4j6j8TCCCTTTAGTGAGGGTTAATTCTCGAG-3‘ (SEQ ID NO :8(其中 N = 8)；缺乏 2 或 4 個(gè)5' -N'的SEQ ID N0:8(即，其中N為6或4))的5'末端上具有4、6或8個(gè)簡(jiǎn)并核苷 酸(在圖7B中為了說(shuō)明目的描述為“N”)的上鏈的互補(bǔ)序列，在圖7B中為了說(shuō)明目的描述 為 “27N”。示例性第二銜接子包含在圖7B中描述為“T7”的第三寡核苷酸和在圖7B中描述為 “N 28”的第四寡核苷酸，其中第三寡核苷酸包含來(lái)自噬菌體T7的DNA序列，其中第四寡核
41苷酸包含來(lái)自噬菌體T7的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸序列且在其3’末端具有4、6或8個(gè)簡(jiǎn)并脫 氧核糖核苷酸“N”的懸突。示例性第二銜接子的上鏈(第三寡核苷酸)包含在圖7B中顯 示為“T7”的來(lái)自噬菌體T7啟動(dòng)子的28個(gè)核苷酸的序列5 ‘ -P04-TCCCTATAGTGAGTCGTATTA CGAATTC-3' (SEQ ID NO :9)，其包含5’磷酸基團(tuán)(顯示為PO4)。下鏈(第四寡核苷酸)包 含在下鏈 5 ‘ -GAATTCGTAATACGACTCACTATAGGGA (N) 4,6,8_3 ‘ (SEQ ID NO 10 (其中 N = 8)； 缺乏2或4個(gè)3' -N'的SEQ ID NO 10 ( S卩，其中N為6或4))的3‘末端上具有4、6或 8個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸(在圖7B中為了說(shuō)明目的描述為“N”)的上鏈的互補(bǔ)序列，在圖7B中為了 說(shuō)明目的描述為“N 28”。將2yL水中的50皮摩爾(pmol) “T3”第一銜接子(參見圖7B)、“T7”第二銜接 子(參見圖7Β)或Τ3第一銜接子和Τ7第二銜接子(兩者具有相同數(shù)目的簡(jiǎn)并核苷酸)與 3μ L 2Χ 雜交緩沖液(300mM NaCl, 20mM Tris pH8,2mM EDTA) 一起在 95 °C 下溫育 3 分鐘， 然后冷卻至22°C。當(dāng)溫度達(dá)到22°C時(shí)，向各反應(yīng)管中加入IyL 0.13 μ M 5' 32P-標(biāo)記的 合成的微RNA庫(kù)(mirVana miRNA Reference Panel 9. 0，大約500種等摩爾濃度的來(lái)自 Sanger miRBase 9· 0 —_ (microrna. sanger. ac. uk/sequences/) fitJ'n'j^W miRNA !ψβ] 的庫(kù))，將管在65°C下溫育10分鐘，然后冷卻至22°C。然后在16°C下溫育反應(yīng)混合物30分鐘，然后向各管中加入14 μ L連接酶混合物 (0. 5 μ L RNA 連接酶 2(10 μ Μ)，2 μ L IOX Rnl2 緩沖液(IOOmM Tris pH7,20mM MgCl2, 20mM 二硫蘇糖醇，20mM ATP)，1 μ LRNA 酶抑制劑(Ambion AM2682，40U/μ L)，10 μ L 40 % PEG 8000(Sigma-Aldrich 202452)和0. 5 μ L不含RNA酶的水)。將反應(yīng)混合物在16°C下溫 育另外16小時(shí)。然后向各反應(yīng)中加入20 μ L的凝膠上樣緩沖液II (Ambion AM8546G)，在 95°C下加熱5分鐘。通過(guò)10%變性PAGE分辨32P-標(biāo)記的產(chǎn)物，并通過(guò)放射自顯影進(jìn)行顯 現(xiàn)。缺乏(i) RNA連接酶2和銜接子兩者或(ii)只缺乏銜接子的對(duì)照反應(yīng)示于圖7A的前 2個(gè)泳道中。在相應(yīng)于包含第一銜接子和第二銜接子的連接反應(yīng)混合物(即，T3-4+T7-4; T3-6+T7-6 ；和T3-8+T7-8)的凝膠泳道中觀察到大量的雙連接產(chǎn)物(連接產(chǎn)物)，如圖7A中 顯示的。因此，4、6和8個(gè)核苷酸的銜接子懸突長(zhǎng)度提供了小RNA的檢測(cè)。實(shí)施例5銜接子結(jié)構(gòu)檢測(cè)具有6-核苷酸簡(jiǎn)并懸突的5’(第一)和3’(第二)銜接子的不同結(jié)構(gòu)，所述 結(jié)構(gòu)包括ds DNA(除了 5’(第一)銜接子的上鏈(第一寡核苷酸)上的2個(gè)3’末端RNA 堿基(例如，圖8B中的T3r2 27 6N和T7 6N 28 (數(shù)字27和28分別指第一和第三寡核苷 酸的長(zhǎng)度，如實(shí)施例4中一樣))和兩個(gè)銜接子(例如，圖8B中的rT3:27 6N和rT7:6N 28) 的dsRNA · DNA雜交體(上鏈(第一和第三寡核苷酸是RNA)-下鏈(第二和第四寡核苷酸 是 DNA))。在圖8B的該舉例說(shuō)明性實(shí)施方案中，上部第一銜接子(rT3:27 6N)包含顯示為 “rT3”的含有T3序列的上鏈(第一寡核苷酸)(SEQ ID NO 7)(其中所有核苷包含核糖核 苷)，所述上鏈與下鏈(第二寡核苷酸)退火，所述下鏈包含互補(bǔ)序列且在下鏈的5’末端 上包含6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸(SEQ ID NO :8，其中N是6)，為了說(shuō)明目的描述為“27 6N”;以及其 他舉例說(shuō)明性第一銜接子(T3r2:27 6N)包含顯示為“T3r2”的含有T3序列的上鏈(其中 除了 2個(gè)最3’端的包含核糖的核糖核苷外，所有核苷包含脫氧核糖核苷)(具有2個(gè)3’末
42端核糖核苷酸的SEQ IDNO :7)，所述上鏈與描述為27 6N的與上部第一銜接子相同的下鏈 (SEQID NO :8，其中N是6)退火。再次參考圖8B，上部舉例說(shuō)明性第二銜接子(rT7:6N 28)包含為了說(shuō)明目的描述 為“rT7”的含有T7序列的上鏈(第三寡核苷酸)(SEQ IDNO 9)(其中所有核苷包含核糖核 苷，并且該序列包含5’磷酸基團(tuán))，所述上鏈與下鏈退火，所述下鏈包含為了說(shuō)明目的描述 為“6N 28”的在下鏈的5’末端上具有6個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸的互補(bǔ)序列(SEQ ID N0:10，其中N 是6)。其他舉例說(shuō)明性第二銜接子(T7:6N 28)包含為了說(shuō)明目的描述為“T7”的含有T7 序列的上鏈(SEQ ID NO :9)(其中所有核苷包含脫氧核糖核苷并且該序列包含5’磷酸基 團(tuán))，所述上鏈與描述為6N 28的與上部第二銜接子相同的下鏈(SEQ ID N0:10，其中N是 6)退火。將2 μ L水中的50pmol的第一銜接子、第二銜接子或第一銜接子和第二銜接子兩 者與 3yL 2X 雜交緩沖液(300mM NaCl, 20mM TrispH8,2mM EDTA) 一起在 95°C 下溫育 3 分 鐘，然后冷卻至22°C。向各反應(yīng)中加入一 (1) μ!^0·13μΜ5' 32P-標(biāo)記的miRNA庫(kù)(如上 所述的mirVana miRNA Reference Panel)，然后在65°C下溫育10分鐘，然后冷卻至22°C。將反應(yīng)混合物在16°C下溫育30分鐘，然后向各管中加入14yL連接酶混合物 (0. 5 μ L RNA 連接酶 2(10 μ Μ)，2 μ L IOX Rnl2 緩沖液(IOOmM Tris pH7,20mM MgCl2, 20mM 二硫蘇糖醇，20mM ATP)、1 μ LRNA 酶抑制劑(Ambion AM2682，40U/μ L)、10 μ L 40 % PEG 8000 (Sigma-Aldrich 202452)和0. 5 μ L不含RNA酶的水)。將反應(yīng)混合物在16°C下溫育 另外16小時(shí)。然后向各反應(yīng)中加入凝膠上樣緩沖液II (20 μ L，Ambion AM8546G)，在95°C 下加熱5分鐘。通過(guò)10%變性PAGE分辨32P-標(biāo)記的產(chǎn)物，然后通過(guò)放射自顯影進(jìn)行顯現(xiàn)。 如圖8A中顯示的，只有當(dāng)連接反應(yīng)混合物包含第一銜接子和第二銜接子(T3r2-6+T7-6 ；和 rT3-6+rT7-6)時(shí)，觀察到大量的連接產(chǎn)物(由箭頭標(biāo)示)，但與組合的T3r2-6+T7-6銜接子 相比，對(duì)于組合的rT3-6+rT7-6銜接子觀察到更多的不期望的反應(yīng)副產(chǎn)物(由*標(biāo)示)。實(shí)施例6銜接子組合就雙連接效率檢測(cè)第一銜接子與第二銜接子的3個(gè)不同組合。此類組合包括兩者 都具有DNA上鏈(即，除了第一寡核苷酸具有2個(gè)3’核糖核苷酸外，第一和第三寡核苷酸 都是DNA)、兩者都具有RNA上鏈(即，第一和第三寡核苷酸)或在5’(第一)銜接子上具 有RNA上鏈(S卩，第一寡核苷酸)且在3’(第二)銜接子上具有DNA上鏈(即，第三寡核苷 酸)的第一銜接子和第二銜接子(關(guān)于最后一種銜接子結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案的示意圖，參見圖 9C)。將一(1) μ L的各銜接子(各50 μ Μ)組合，并且與3 μ L 2Χ雜交緩沖液(300mM NaCl, 20mM Tris pH8,2mM EDTA) 一起在95°C下溫育3分鐘，然后冷卻至22°C。向每一個(gè)5μ L的 反應(yīng)中加入一(1) PL 0. 13μΜ5' 32P-標(biāo)記的合成的miRNA庫(kù)(上文所述的)，然后將反應(yīng) 物在65°C下溫育10分鐘，然后冷卻至22°C。然后在向各管中加入14 μ L連接酶混合物之前，將反應(yīng)混合物在16°C下溫育30 分鐘。通過(guò)將 0.5 μ LRNA 連接酶 2(10 μ Μ)、2 μ L 10XRnl2 緩沖液(IOOmM Tris pH7,20mM MgCl2，20mM 二硫蘇糖醇，20mMATP)、lyL RNA 酶抑制劑(Ambion AM2682，40U/μ L)、10 μ L 40% PEG8000 (Sigma-Aldrich 202452)和0. 5 μ L不含RNA酶的水組合來(lái)制備連接混合物。 將反應(yīng)混合物在16°C下溫育另外16小時(shí)。向各反應(yīng)中加入二十(20) μ L凝膠上樣緩沖液11(Ambion AM8546G)，然后在95°C下加熱5分鐘。通過(guò)10%變性PAGE分辨32P-標(biāo)記的產(chǎn) 物，然后通過(guò)放射自顯影進(jìn)行顯現(xiàn)。圖9A和圖9B描述了所得的連接產(chǎn)物的電泳圖。雙連 接具有DNA或RNA上鏈的銜接子以產(chǎn)生“連接產(chǎn)物”，如圖9A中描述的。在使用和不使用核糖核酸酶H(RNA酶H)降解的情況下評(píng)估銜接子的不同比率 (上鏈對(duì)下鏈，即，第一寡核苷酸對(duì)第二寡核苷酸和第三寡核苷酸對(duì)第四寡核苷酸)以使雙 連接產(chǎn)物最大化，同時(shí)使5’(第一)和3’(第二)銜接子之間的直接連接產(chǎn)生的不期望的 副產(chǎn)物(圖IOA中的“連接的銜接子”)減少至最少。將具有圖IOA的表中顯示的不同上鏈 /下鏈比率的銜接子與0. 2或2pmol mirVana miRNA ReferencePanel (上文所述的)和 3μ L 2Χ雜交緩沖液(300mM NaCl, 20mM TrispH8,2mM EDTA)混合在6 μ L反應(yīng)混合物中， 然后在65°C下溫育15分鐘和在16°C下溫育45分鐘。通過(guò)將1 μ L RNA連接酶2 (10 μ Μ)、 1 μ L RNA 酶抑制劑(Ambion AM2682，40U/μ L)、2 μ L IOX Rnl2 緩沖液(IOOmM Tris pH7, 20mM MgCl2, 20mM二硫蘇糖醇，20mM ATP)禾Π 10 μ L 40% PEG 8000 (Sigma-Aldrich 202452) 組合來(lái)制備連接混合物。向每一個(gè)管中加入連接混合物(14μ L)，在16°C下溫育16小時(shí)。在16 小時(shí)的溫育后，將4 μ L含有 500mM Tris-HCl (pH8. 3)、750mM KCl、30mM MgCl2 和 IOOmM DTT 的 IOX RT 緩沖液與 2 μ L 2. 5mM dNTP、l μ L ArrayScript 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ L, Ambion AM2048) UuL SUPERase · In RNA 酶抑制劑(20U/y L, Ambion AM2694)和
12μ L不含RNA酶的水組合，然后加入至20 μ L的連接反應(yīng)物以產(chǎn)生總共40 μ L的RT混合 物。將反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)混合物在42°C下溫育30分鐘。對(duì)于圖10A中的凝膠上顯示的泳道1至6的樣品，如下進(jìn)行PCR。將一(1) μ L來(lái) 自 RT 混合物的樣品與 10 μ L 10Χ 完全緩沖液(CompleteBuffer) (Ambion AM2050)、1 μ L dNTP(25mM)、0· 5μ L 5，引物和 0.5yL 3，引物(各 50 μ Μ)、1 μ L 的 SuperTaq DNA 聚合酶 (5U/ μ L, Ambion AM2050)和86 μ L不含RNA酶的水組合。使用20個(gè)循環(huán)(在95°C下30 秒，在50°C下30秒和在72°C下30秒)進(jìn)行PCR。將五(5) μ LPCR產(chǎn)物裝載至10%非變性 PAGE凝膠上，通過(guò)SYBR Gold (Invitrogenl 1494)染色進(jìn)行顯現(xiàn)。對(duì)于圖10A中的凝膠上顯示的泳道7至12的樣品，如下進(jìn)行RNA酶H降解反應(yīng)，然 后進(jìn)行PCR。將5 μ LRT反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至干凈的管中，與0. 5 μ L核糖核酸酶H (RNA酶H，10U/ yL, Ambion ΑΜ2292)混合，在37°C下溫育30分鐘。將一(1) μ L RNA酶H處理的樣品用于 在與之前描述的相同的條件下進(jìn)行的PCR反應(yīng)。將所有此類擴(kuò)增產(chǎn)物(使用和不使用RNA 酶H降解)裝載至10%非變性PAGE凝膠上，進(jìn)行電泳，然后通過(guò)SYBR G0ld(Invitr0gen 11494)染色進(jìn)行顯現(xiàn)，如圖10A中顯示的。將具有圖10B的表中顯示的不同上鏈/下鏈比率的銜接子與2pmol合成的 mirVana miRNA Reference Panel (上文所述的)和 3yL 2X 雜交緩沖液(300mM NaCl, 20mM Tris pH8,2mM EDTA)混合在6 μ L反應(yīng)混合物中，然后在65°C下溫育15分鐘和在16°C 下溫育1小時(shí)。如之前所述進(jìn)行連接、RT和RNA酶H處理。將一(1) μ L RNA酶H處理的 樣品用于使用SuperTaq 聚合酶(Ambion AM2050)的PCR擴(kuò)增，進(jìn)行如之前所述的20個(gè) 循環(huán)。將5 μ L的各PCR產(chǎn)物裝載至10%非變性PAGE凝膠上，進(jìn)行電泳，然后通過(guò)SYBR Gold(Invitrogen 11494)染色進(jìn)行顯現(xiàn)，如圖 10B 中顯示的。具有 1/50、5/50、10/50、25/50 和5/100的上鏈對(duì)下鏈的皮摩爾比率的銜接子全都能夠產(chǎn)生遷移至大于50bp處的期望的 產(chǎn)物。相反地，使用5/500的銜接子比率不能有效地產(chǎn)生期望的產(chǎn)物。
實(shí)施例7本方法與TaqMan miRNA測(cè)定的比較；在RNA含量上變化的樣品本實(shí)施例提供了與RT-PCRTaqMan miRNA測(cè)定相比較的本方法的定量驗(yàn)證。圖 12描述了散點(diǎn)圖，其描述了使用5’核酸酶測(cè)定法從人胎盤RNA和從人肺RNA獲得的miRNA 定量結(jié)果與根據(jù)本教導(dǎo)的某些實(shí)施方案獲得的測(cè)序結(jié)果的相對(duì)倍數(shù)變化(FC)的比較。 X-軸顯示以-Δ Δ CT表示的5’核酸酶測(cè)定結(jié)果的Iog2倍數(shù)變化(使用TaqMan Human MicroRNA Array vl. 0(Ρ/Ν 4384792 ；Applied Biosystems)和基本上按照廠商的方案進(jìn) 行的 Multiplex RT for TaqMan MicroRNAAssays (P/Ns 4383403，4383402，4383401， 4383399，4384791，4382898，4383405，4383400和4383404 ；Applied Biosystems)產(chǎn)生的)， y軸顯示根據(jù)本教導(dǎo)的實(shí)施方案的測(cè)序數(shù)據(jù)的倍數(shù)變化(基本上按照廠商的方案使 用 SOLiD Sequencing System(AppliedBiosystems)產(chǎn)生的)。產(chǎn)生高于 35 的 Ct 值的 TaqMan MicroRNAAssays (Applied Biosystems)被假定為陰性，且不包括在分析中。對(duì) 于SOLiD 測(cè)序數(shù)據(jù)，來(lái)自至少3個(gè)測(cè)序標(biāo)簽的數(shù)據(jù)是相應(yīng)的序列被認(rèn)為是“觀察到的”所 必需的。通過(guò)使用本方法，獲得0.88的R值。本實(shí)施例還提供了總RNA輸入量，因?yàn)橐恍悠奉愋桶钌倭康男NA。以圖中 指定的量使用來(lái)自人胎盤(圖13A)或小鼠肝(圖13B)的總RNA進(jìn)行本方法的一個(gè)實(shí)施方 案。一般地，將銜接子混合物A(2yl)(S0LiD 銜接子混合物A)(其含有25pmol RNA上鏈 (第一寡核苷酸)和50pmol在5'末端上具有形成懸突的6個(gè)簡(jiǎn)并DNA核苷酸的DNA下鏈 (第二寡核苷酸)作為5'(第一)銜接子，以及25pmol 5'-磷酸化的DNA上鏈(第三寡 核苷酸)和50pmol在3'末端具有形成懸突的6個(gè)簡(jiǎn)并DNA核苷酸的DNA下鏈(第四寡 核苷酸)作為3'(第二)銜接子)與3 μ 1 2Χ雜交緩沖液(300mM NaCl, 20mM Tris pH8， 2mM EDTA)和1 μ 1具有指定的量的總RNA在65°C下溫育10分鐘和在16°C下溫育5分鐘。通過(guò)將IyL RNA 連接酶 2(10μΜ)、1μ 1 RNA 酶抑制劑(AmbionAM2682，40U/μ L)、 2μ L IOX Rnl2 緩沖液(IOOmM Tris pH7，20mMMgCl2，20mM 二硫蘇糖醇，20mM ATP)禾口 10 μ L 40% PEG 8000(Sigma-Aldrich 202452)混合來(lái)制備連接混合物。將連接反應(yīng)混合物在 16°C下溫育16小時(shí)在16小時(shí)的溫育后，將4μ L IOX RT緩沖液(其含有500mMTris-HCl (pH8. 3)， 750mM KCl,30mM MgCl2 禾口 IOOmM DTT)與 2 μ L2. 5mM dNTPU μ L ArrayScript 逆轉(zhuǎn)錄酶 (200U/μ L, Ambion ΑΜ2048)和13 μ L不含RNA酶的水組合，然后加入至20 μ L連接反應(yīng)組 合物。將反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)混合物在42°C下溫育30分鐘。然后將5yL RT反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至干凈的管中，與0.5 μ L核糖核酸酶H (RNA酶H，10U/ yL, Ambion AM2292)混合，然后在37°C下溫育30分鐘。然后將0. 5 μ L RNA酶H處理的樣品 與5yL IOXAmpl iTaq 緩沖液 ι (Applied Biosystems N8080171)、4 μ L dNTP(2.5mM)、 0. 5μ L 5'弓丨物禾口 0.5yL3'弓丨物(各 50 μ Μ)、1 μ L Ampl iTaq DNA 聚合酶(5U/μ L， Applied Biosystems N8080171)和 38. 5 μ L不含 RNA酶的水組合。使用 16 個(gè)循環(huán)(在 95°C 下30秒，在62°C下30秒和在72°C下30秒)進(jìn)行PCR。將五(5) μ LPCR產(chǎn)物裝載至10% 非變性PAGE凝膠上，然后通過(guò)SYBR Gold(Invitrogen 11494)染色顯現(xiàn)。如圖13A顯示的，要指出的是，胎盤樣品富含相當(dāng)多的小RNA，并且本文中提供的方法能夠從< 25ng的總 RNA產(chǎn)生小RNA產(chǎn)物。相反地，如圖13B所示，通過(guò)比較，小鼠肝樣品含有極少量的小RNA， 因此，根據(jù)本教導(dǎo)的某些實(shí)施方案，富集此類樣品可提供更好的結(jié)果。銜接子混合物A的序列如實(shí)施例1的SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :4。實(shí)施例8實(shí)時(shí)PCR顯示小RNA文庫(kù)構(gòu)建的動(dòng)態(tài)范圍將四種含有5' -P04的合成的RNA寡核苷酸(加料對(duì)照，SIC;序列示于下面)以 橫跨1000倍輸入范圍(1000、100、10和Ipg于1000X混合物中)的變化濃度混合，然后將 混合物連續(xù)稀釋至IX。將混合物攙入500ng胎盤總RNA作為背景(圖14，圖16A)，除了將 連接反應(yīng)組合物在16°C下溫育2小時(shí)(而不是16小時(shí))外，如之前所述對(duì)四個(gè)樣品進(jìn)行連
接反應(yīng)。然后如上所述用RNA酶H處理樣品，然后將0.5yL RNA酶H處理的樣品與 5μ L IOX Amp Ii Taq 緩沖液 I(Applied BiosystemsN8080171)、4μ L dNTP(2.5mM)、 0. 5μ L 5，弓丨物禾口 0· 5μ L 3，弓丨物(各 50 μ Μ)、1 μ L Ampl iTaq DNA 聚合酶(5υ/μ L, AppliedBiosystems N8080171)和38. 5 μ L不含RNA酶的水組合。使用15個(gè)循環(huán)(在 95 0C下30秒，在62 °C下30秒和在72 °C下30秒)進(jìn)行PCR。在利用Qiagen PCR純化 試劑盒(Qiagen 28104)進(jìn)行PCR凈化后，將樣品洗脫在30 μ L水中，然后以1 400的 比率進(jìn)一步稀釋。然后將2yL稀釋的樣品與12.5yL 2X SYBR Green PCR Master Mix (AppliedBiosystems 4309155)、1 μ 1 引物混合物(各 1 μ Μ)和 9· 5 μ L 水(示意性示 于圖15中)組合。使用在95°C下10分鐘，40個(gè)循環(huán)的在95°C下15秒和在68°C下1分 鐘，然后在95°C下15秒，在60°C下1分鐘和在95°C下15秒，在ABI 7500Real_Time PCR System (Applied Biosystems4351104)上進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR。將各靶序列的循環(huán)閾值(Ct)(圖16A，y-軸平均Ct)對(duì)IoglO代表4個(gè)樣品輸 入的值(X-軸log(混合物濃度)1000X至IX，圖16A)作圖。如圖16B中所觀察到的，背景 RNA中兩個(gè)內(nèi)源miRNA對(duì)照序列(miR-16和miR-21)的Ct在樣品間相當(dāng)恒定。在本實(shí)施例中用作“加料對(duì)照”(SIC)的4種合成的RNA寡核苷酸是= (I)SIC 8 5' -Phos GCGAAUUAAUGAAAGUGGGCA(SEQ ID NO :11 ；圖 16A 中使用三角形顯示的數(shù)據(jù))； (2) SIC 34:5' -PhosACCCGACAUUAAAG⑶GGCAU(SEQ ID NO :12 ；圖 16A 中使用圓圈顯示的數(shù) 據(jù))；(3) SIC 36:5' -Phos CUCACAUUUCGGAACUGAUGC (SEQ IDNO 13 ；圖 16A 中使用菱形顯 示的數(shù)據(jù))；禾口 (4) SIC 37 5' -PhosACGGACCUCGAACUUCACCCA(SEQ ID NO :14 ；圖 16A 中使 用方形顯示的數(shù)據(jù))。因此，加料對(duì)照測(cè)定證明了本方法在橫跨至少1000倍的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi) 檢測(cè)小RNA的能力。實(shí)施例9一步 RT-PCR本實(shí)施例提供了用于產(chǎn)生擴(kuò)增模板和擴(kuò)增產(chǎn)物的示例性方法，其中RNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶存在于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組合物中。在進(jìn)行連接反應(yīng)后，向連接反應(yīng)中直接加入含有合適的緩沖液、dNTP、 ArrayScript 逆轉(zhuǎn)錄酶、Amp 1 i Ta Q DNA聚合酶以及正向和反向PCR引物的混合物，通 過(guò)輕輕地上下吹打數(shù)次(3-4x)進(jìn)行混合。將反應(yīng)混合物在熱循環(huán)儀中于42°C下溫育30分
46鐘以允許進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生擴(kuò)增模板。然后向反應(yīng)混合物中加入RNA酶H，在熱循環(huán)儀 中于37°C下溫育30分鐘。然后將反應(yīng)溫度升高至95°C并且保持5分鐘，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò) 增循環(huán)，g卩，在62°C下進(jìn)行30秒和在72°C下進(jìn)行30秒，如實(shí)施例1中所描述的，以產(chǎn)生擴(kuò) 增產(chǎn)物。實(shí)施例10使用一種DNA聚合酶產(chǎn)生擴(kuò)增模板和擴(kuò)增產(chǎn)物在進(jìn)行連接反應(yīng)后，向連接反應(yīng)組合物中加入含有合適的緩沖液(含有最佳化的 錳和鎂的濃度)、dNTP、包含依賴于DNA的DNA聚合酶活性和依賴于RNA的DNA聚合酶活性 的DNA聚合酶以及正向和反向PCR引物的混合物，通過(guò)輕輕地上下吹打數(shù)次(3-4x)進(jìn)行混 合，以形成反轉(zhuǎn)錄組合物。將反轉(zhuǎn)錄組合物在熱循環(huán)儀中于42°C下溫育30分鐘以允許逆轉(zhuǎn) 錄酶活性產(chǎn)生擴(kuò)增模板。然后向反應(yīng)混合物中加入RNA酶H，在熱循環(huán)儀中于37°C下溫育 30分鐘。然后將反應(yīng)溫度升高至95 °C并且保持5分鐘，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增循環(huán)，即，在62°C 下進(jìn)行30秒和在72°C下進(jìn)行30秒，如實(shí)施例1中所描述的，以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例11用于產(chǎn)生小RNA文庫(kù)的示例性方法本實(shí)施例提供了用于產(chǎn)生小RNA文庫(kù)的示例性方法，如圖17中描述的。當(dāng)目的RNA 分子是小RNA時(shí)，起始材料應(yīng)當(dāng)包含小RNA級(jí)分。F i r S tCho i Ce 制備的總RNA (Applied Biosystems)經(jīng)證實(shí)包含miRNA和其他小RNA。可選擇地，可在進(jìn)行用于總RNA分離的方法 后，按照用戶手冊(cè)，使用 mirVana miRNA Isolation Kit 或mirVana PARIS Kit 獲得包含 樣品的小RNA級(jí)分的總RNA。因?yàn)镽NA樣品可基于它們的來(lái)源和RNA分離方法而在小RNA含量上變化很大，因 此使用例如但不限于使用小RNA芯片的Agilent生物分析儀評(píng)估樣品的小RNA含量以確定 在反應(yīng)中使用總RNA還是經(jīng)大小選擇的RNA，可能是非常想要的?？墒褂煤写笥?. 5%的小RNA (在大約10至40nt的大小范圍內(nèi))的總RNA樣品 而無(wú)需大小選擇。當(dāng)總RNA用于本方法時(shí)，所得的反應(yīng)產(chǎn)物的大小范圍將比從PAGE純化的 小RNA樣品產(chǎn)生的那些更大。此外，來(lái)自總RNA樣品的SOLiD 測(cè)序結(jié)果通常包括略微更多 的rRNA和tRNA讀數(shù)。應(yīng)當(dāng)就大約18至40nt的RNA級(jí)分富集含有低于0. 5%的小RNA含量的RNA樣品， 例如但不限于通過(guò) PAGE 和洗脫，通過(guò) flashPAGE Fractionator 和 flashPAGE Reaction Clean-Up Kit (AppliedBiosystems)。如實(shí)施例7中所述，不同樣品類型中小RNA的相對(duì)量變化很大。例如來(lái)自組織樣 品的RNA通常具有豐富的小RNA供給，然而來(lái)自培養(yǎng)的細(xì)胞系的RNA通常具有非常少的小 RNA。推薦的輸RNA量包括RNA 來(lái)源從組織分離的總RNA從培養(yǎng)的細(xì)胞分離的總RNA
使用PAGE大小選擇的小RNA
對(duì)照RNA (人胎盤總RNA)
量
10-500ng 100-500ng l-200ng IOOng
雜交和連接如下進(jìn)行雜交和連接。例如，設(shè)計(jì)銜接子混合物A用于從小RNA的5’ 末端開始的SOLiD 測(cè)序，和設(shè)計(jì)銜接子混合物B用于從3’末端開始的SOLiD 測(cè)序。為 了從5’和3’末端開始測(cè)定樣品中小RNA的序列，建立兩個(gè)連接，一個(gè)連接使用一種銜接子 混合物。各銜接子混合物包含第一、第二、第三和第四寡核苷酸。與銜接子混合物A相比， 銜接子混合物B為反向互補(bǔ)方向，這樣可檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的每一條鏈。在冰上，如下在0. 2mL PCR管中制備雜交混合物。雜交混合物(8 μ L總體積)量組分2 μ L 連接混合物A或B3 μ L 雜交溶液1-3 μ L RNA 樣品(l_500ng)至8 μ L 不含核酸酶的水通過(guò)輕輕地上下吹打數(shù)次混合內(nèi)容物，然后短暫離心以收集管底的溶液。將反應(yīng) 物置于具有加熱的蓋的熱循環(huán)儀中，如下對(duì)循環(huán)儀進(jìn)行編程。銜接子雜交溫育溫度 時(shí)間65 "C 10 分鐘16 0C 保持將樣品在16°C下溫育5分鐘。在16°C下維持反應(yīng)物，以顯示的順序向各樣品中加 入RNA連接試劑。連接反應(yīng)混合物(20 μ L終體積)量組分(按顯示的順序加入)IOyL 2Χ連接緩沖液2UL 連接酶混合物將混合物在設(shè)置為16°C的熱循環(huán)儀中溫育16小時(shí)。2小時(shí)的溫育通常足以進(jìn)行 連接，然而，過(guò)夜溫育導(dǎo)致略微更高的連接產(chǎn)物的量。反轉(zhuǎn)錄和RNA酶H降解將樣品置于冰上，通過(guò)組合下列試劑在冰上制備反轉(zhuǎn)錄 (RT)主混合物。在主混合物中包含額外的5-10%體積以補(bǔ)償移液誤差。RT主混合物(20 μ L/樣品)量組分13 μ L 不含核酸酶的水4 μ L IOX RT 緩沖液2 μ LdNTP1 μ L ArrayScript 逆轉(zhuǎn)錄酶20 μ L 每反應(yīng)的總體積向各樣品中加入RT主混合物(20 μ L)，輕輕地渦旋樣品以充分混合，然后短暫離 心樣品以收集管底的混合物。然后將樣品在42°C下溫育30分鐘以合成cDNA。cDNA可在_20°C下貯存數(shù)周，在_80°C下長(zhǎng)期貯存，或立即用于RNA酶H降解(下
一步)。
如下進(jìn)行RNA酶H溫育。將一定體積(10 μ L)的RT反應(yīng)混合物從之前的步驟 (cDNA)轉(zhuǎn)移至新管中。加入RNA酶H(lyL)。輕輕地渦旋混合物以進(jìn)行混合，短暫地微量 離心以收集管底的混合物，然后在37°C下溫育30分鐘。在RNA酶H處理后，樣品可在_20°C下貯存過(guò)夜或立即用于PCR。小RNA文庫(kù)擴(kuò)增試驗(yàn)性和大規(guī)模PCR 因?yàn)椴煌瑯悠奉愋涂砂黠@不同量的小 RNA,因此獲得足夠用于SOLiD 測(cè)序的DNA所需的PCR循環(huán)次數(shù)也是變化的。進(jìn)行50 μ L試 驗(yàn)性PCR以在進(jìn)行一組3次或更多次重復(fù)100 μ L反應(yīng)(大規(guī)模PCR)(用于合成用于SOLiD 測(cè)序樣品制備中的下一步驟的模板)之前，確定給定的樣品類型所需的PCR循環(huán)次數(shù)。大多數(shù)樣品應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增12至15個(gè)循環(huán)。對(duì)于試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)，對(duì)于來(lái)自具有相對(duì)高的量 的小RNA的起始材料的樣品(即，大約200-500ng來(lái)自組織的總RNA，或大約50-200ng經(jīng)大 小選擇的小RNA)，推薦12個(gè)PCR循環(huán)，對(duì)于具有相對(duì)少的小RNA的那些(即，大約l-200ng 的來(lái)自組織的總RNA，或大約100-500ng的來(lái)自培養(yǎng)的細(xì)胞的總RNA，或l-50ng經(jīng)大小選擇 的小RNA)，推薦15個(gè)循環(huán)。小RNA PCR引物組提供用于合成SOLiD 測(cè)序模板的10個(gè)不同的PCR引物組以 及 S0LiD Small RNA Expression Kit (AppliedBiosystems)。除了位于引物中部附近的 6bp條形碼外，引物組相同。PCR引物的該條形碼特征使得能夠測(cè)序和分析多重樣品。艮口， 能夠在單個(gè)SOLiD 測(cè)序反應(yīng)中測(cè)定多至10個(gè)不同的樣品的序列，每一個(gè)樣品用一個(gè)提供 的SOLiD 小RNA PCR引物組進(jìn)行擴(kuò)增?？墒褂萌魏我粋€(gè)引物組，而在該點(diǎn)不混合樣品。示例性PCR引物包括但不限于下面顯示的正向引物和帶條形碼的反向引物(各條 形碼序列以下劃線標(biāo)示)。正向引物(SEQI D NO :5)5 ‘ -CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3‘反向引物BCl (SEQ ID NO 15)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTAAGCCCCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BC2(SEQ ID NO 16)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCACACCCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BC3(SEQ ID NO 17)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCCCCTTCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BC4(SEQ ID NO 18)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCATCGGCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BC5(SEQ ID NO 19)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTTCGTTGCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BC6(SEQ ID NO 20)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTGGGCACCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BC7(SEQ ID NO 6)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCCAGACCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BC8(SEQ ID NO 21)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCTCCGTCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BC9 (SEQ ID NO 22)
49
5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTCCCTTCCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘反向引物BClO (SEQ ID NO 23)5 ‘ -CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTGCGGTCCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3‘通過(guò)如下組合試劑在冰上制備PCR主混合物(用于單個(gè)50 μ L試驗(yàn)性PCR或
100 μ L 大規(guī)模 PCR)。
PCR主混合物(用于單個(gè)反應(yīng))
試驗(yàn)性PCR大規(guī)模PCR組分
(50 μ L)(100 μ L)
38. 9μ L77. 8μ L不含核酸酶的水
5 μ L10 μ LIOX PCR緩沖液I
1 μ L2μ LSOLiD小RNA PCR引物組(
4μ L8μ L2. 5mM dNTP混合物
0. 6μ L1. 2μ LAmpli Ta q dna 聚合酶
49. 5 μ L99 μ L每反應(yīng)的總體積輕輕地渦旋混合物以充分混合，短暫微量離心以收集管底的混合物。(在確定用于 樣品類型的合適的PCR循環(huán)次數(shù)后，對(duì)于各樣品進(jìn)行3次或更多次重復(fù)的大規(guī)模PCR。將反 應(yīng)產(chǎn)物混合以產(chǎn)生足夠用于凝膠純化和隨后的SOLiD 測(cè)序樣品制備的材料。)將用于單個(gè)反應(yīng)的PCR主混合物用移液器轉(zhuǎn)移至PCR板的孔內(nèi)或0.2mL PCR管中。 對(duì)于試驗(yàn)性PCR(50 μ L)，向PCR主混合物的各等分中加入0. 5 μ L RNA酶H-處理的cDNA。 對(duì)于大規(guī)模PCR (100 μ L)，向PCR主混合物的各等分中加入IyL RNA酶H-處理的cDNA。由 于可能的反應(yīng)抑制，不推薦在50 μ L PCR中使用大于1 μ L的cDNA。將樣品置于具有加熱的蓋的熱循環(huán)儀中，進(jìn)行示于下面的熱條件。PCR循環(huán)條件
權(quán)利要求
用于檢測(cè)樣品中的RNA分子的方法，其包括將樣品與至少一種第一銜接子、至少一種第二銜接子和包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽組合以形成連接反應(yīng)組合物，其中將所述至少一種第一銜接子和所述至少一種第二銜接子連接至所述樣品的RNA分子，從而在相同的連接反應(yīng)組合物中形成連接產(chǎn)物，其中所述至少一種第一銜接子包含第一寡核苷酸，其具有10至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度并且在3’末端上含有至少2個(gè)核糖核苷，和第二寡核苷酸，其包含與所述第一寡核苷酸大體上互補(bǔ)的核苷酸序列，并且當(dāng)所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸雙鏈化時(shí)還包含1至8個(gè)核苷酸的單鏈5’部分，其中所述至少一種第二銜接子包含第三寡核苷酸，其具有10至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度并且包含5’磷酸基團(tuán)，和第四寡核苷酸，其包含與所述第三寡核苷酸大體上互補(bǔ)的核苷酸序列，并且當(dāng)所述第三寡核苷酸與所述第四寡核苷酸雙鏈化時(shí)還包含1至8個(gè)核苷酸的單鏈3’部分，其中所述單鏈部分獨(dú)立地具有簡(jiǎn)并核苷酸序列，或與所述RNA分子的一部分互補(bǔ)的序列，其中所述第一和第三寡核苷酸具有不同的核苷酸序列；其中所述RNA分子與所述至少一種第一銜接子的單鏈部分和所述至少一種第二銜接子的單鏈部分雜交；和檢測(cè)所述連接產(chǎn)物的RNA分子或其替代物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)所述RNA分子或其替代物包括 將所述連接產(chǎn)物與下列組合i)RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，ii)包含依賴于DNA的DNA聚合酶活性和依賴于RNA的DVA聚合酶活性的DNA聚合酶，或iii)RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶， 反轉(zhuǎn)錄所述連接產(chǎn)物以形成反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用核糖核酸酶H從所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中降解至少一些核糖核苷以形成擴(kuò)增模板， 當(dāng)如i)中那樣組合連接產(chǎn)物時(shí)，將所述擴(kuò)增模板與至少一種正向引物、至少一種反向 引物和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶組合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物，循環(huán)所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物以形成至少一種擴(kuò)增產(chǎn)物，然后確定所述擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一 部分的序列，從而檢測(cè)所述RNA分子。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽包括Rnl2家族 連接酶。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽包括噬菌體T4 RNA 連接酶 2(Rnl2)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一銜接子的單鏈部分，所述第二銜接子的單鏈部分， 或所述第一銜接子的單鏈部分和所述第二銜接子的單鏈部分，包含簡(jiǎn)并序列。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸包含至少15個(gè)核糖核苷。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二銜接子包含至少一個(gè)報(bào)告基團(tuán)。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種擴(kuò)增產(chǎn)物包含標(biāo)識(shí)序列。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種正向引物中的至少一種，所述至少一種反向 引物中的至少一種，或兩者，包含標(biāo)識(shí)序列。
10.權(quán)利要求8的方法，其中至少一種第一銜接子，至少一種第二銜接子，或至少一種 第一銜接子和至少一種第二銜接子包含標(biāo)識(shí)序列。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述RNA分子是小非編碼RNA。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品包含許多RNA片段并且檢測(cè)包括測(cè)定表達(dá)特征■i並 曰O
13.權(quán)利要求12的方法，其中在形成所述連接產(chǎn)物之前，除盡至少一個(gè)類別的RNA分子 的濃度。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品包括許多信使RNA(mRNA)片段并且檢測(cè)包括測(cè) 定表達(dá)特征譜。
15.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分測(cè)序，其中測(cè)序包括大 規(guī)模平行測(cè)序反應(yīng)，將至少一種擴(kuò)增產(chǎn)物與微陣列雜交，或?qū)⒅辽僖环N擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入測(cè) 序載體。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一銜接子的單鏈部分，所述第二銜接子的單鏈部 分，或所述第一銜接子的單鏈部分和所述第二銜接子的單鏈部分，包含與相應(yīng)的RNA分子 選擇性雜交的序列特異性區(qū)域。
17.用于檢測(cè)RNA分子的方法，其包括將RNA分子與至少一種第一銜接子、至少一種第二銜接子和雙鏈特異性連接酶組合以 形成連接反應(yīng)組合物，其中所述至少一種第一銜接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸， 所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2個(gè)核糖核苷，所述第二寡核苷酸在所述第一寡核 苷酸與所述第二寡核苷酸雜交在一起時(shí)包含單鏈部分，并且其中所述至少一種第二銜接子 包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基團(tuán)，所述第四寡核苷 酸在所述第三寡核苷酸與所述第四寡核苷酸雜交在一起時(shí)包含單鏈部分，將所述至少一種第一銜接子和所述至少一種第二銜接子連接至所述RNA分子以形成 連接產(chǎn)物，其中將所述第一銜接子和所述第二銜接子在相同的連接反應(yīng)組合物中連接至所 述RNA分子，將所述連接產(chǎn)物與RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶組合， 反轉(zhuǎn)錄所述連接產(chǎn)物以形成反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用核糖核酸酶H(RNA酶H)從所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中降解至少一些核糖核苷以形成擴(kuò)增模板，將所述擴(kuò)增模板與至少一種正向引物、至少一種反向引物和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶組 合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物，循環(huán)所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物以形成擴(kuò)增產(chǎn)物，并且確定所述擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分的序 列，從而檢測(cè)所述RNA分子。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述第一銜接子的單鏈部分，所述第二銜接子的單鏈部 分，或所述第一銜接子的單鏈部分和所述第二銜接子的單鏈部分，包含簡(jiǎn)并序列。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述第一寡核苷酸的至少2個(gè)核糖核苷包含至少15個(gè)核糖核苷。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述第二銜接子包含至少一個(gè)報(bào)告基團(tuán)。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物中的至少一種包含標(biāo)識(shí)序列。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述至少一種正向引物中的至少一種，所述至少一種反 向引物中的至少一種，或兩者，包含標(biāo)識(shí)序列。
23.權(quán)利要求21的方法，其中至少一種第一銜接子，至少一種第二銜接子，或至少一種 第一銜接子和至少一種第二銜接子，包含標(biāo)識(shí)序列。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述RNA分子是小非編碼RNA。
25.權(quán)利要求17的方法，其中所述RNA分子包含許多信使RNA(mRNA)片段并且檢測(cè)包 括測(cè)定表達(dá)特征譜。
26.權(quán)利要求25的方法，其中在形成所述連接產(chǎn)物之前，除盡至少一個(gè)類別的RNA分子 的濃度。
27.權(quán)利要求17的方法，其中檢測(cè)包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分測(cè)序，其中測(cè)序包括 大規(guī)模平行測(cè)序反應(yīng)，將至少一種擴(kuò)增產(chǎn)物與微陣列雜交，或?qū)⒅辽僖环N擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入 測(cè)序載體。
28.權(quán)利要求17的方法，其中所述雙鏈特異性連接酶包括Rnl2家族連接酶。
29.權(quán)利要求28的方法，其中雙鏈特異性連接酶包括噬菌體T4RNA連接酶2(Rnl2)。
30.權(quán)利要求17的方法，其中所述第一銜接子的單鏈部分，所述第二銜接子的單鏈部 分，或所述第一銜接子的單鏈部分和所述第二銜接子的單鏈部分，包含與相應(yīng)的RNA分子 選擇性雜交的序列特異性區(qū)域。
31.用于檢測(cè)RNA分子的方法，其包括將RNA分子與至少一種第一銜接子、至少一種第二銜接子和雙鏈特異性RNA連接酶組 合以形成連接反應(yīng)組合物，其中所述至少一種第一銜接子包含第一寡核苷酸和第二寡核苷 酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2個(gè)核糖核苷，所述第二寡核苷酸在所述第一 寡核苷酸與所述第二寡核苷酸雜交在一起時(shí)包含單鏈部分，并且其中所述至少一種第二銜 接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基團(tuán)，所述第四寡 核苷酸在所述第三寡核苷酸與所述第四寡核苷酸雜交在一起時(shí)包含單鏈部分，將所述至少一種第一銜接子和所述至少一種第二銜接子連接至所述RNA分子以形成 連接產(chǎn)物，其中將所述第一銜接子和所述第二銜接子在相同的連接反應(yīng)組合物中連接至所 述RNA分子，將所述連接產(chǎn)物與RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶組合，反轉(zhuǎn)錄所述連接產(chǎn)物以形成反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用核糖核酸酶H(RNA酶H)從所述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中降解至少一些核糖核苷以形成擴(kuò)增模板，將所述擴(kuò)增模板與至少一種正向引物、至少一種反向引物和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶組 合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物，循環(huán)所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物以形成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物還包含報(bào)告探 針、核酸染料、或報(bào)告探針和核酸染料，和檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物，從而檢測(cè)所述RNA分子。
32.用于產(chǎn)生RNA文庫(kù)的方法，其包括，將許多不同的RNA分子與許多第一銜接子類別、許多第二銜接子類別和雙鏈特異性 RNA連接酶組合以形成連接反應(yīng)組合物，其中至少一種第一銜接子包含第一寡核苷酸和第 二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸在3’末端上包含至少2個(gè)核糖核苷，所述第二寡核苷酸在 所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸雜交在一起時(shí)包含單鏈部分，并且其中至少一種第 二銜接子包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含5’磷酸基團(tuán)，所述第 四寡核苷酸在所述第三寡核苷酸與所述第四寡核苷酸雜交在一起時(shí)包含單鏈部分，將至少一種第一銜接子和至少一種第二銜接子連接至RNA分子以形成許多不同的連 接產(chǎn)物類別，其中將第一銜接子和第二銜接子在相同的連接反應(yīng)組合物中連接至RNA分 子，將所述許多連接產(chǎn)物類別與RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶組合，反轉(zhuǎn)錄所述許多連接產(chǎn)物類別中的至少一些以形成許多反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物類別，用核糖核酸酶H(RNA酶H)從所述許多反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的至少一些中降解至少一些核糖 核苷以形成許多擴(kuò)增模板類別，將所述許多擴(kuò)增模板類別與至少一種正向引物、至少一種反向引物和DNA指導(dǎo)的DNA 聚合酶組合以形成擴(kuò)增反應(yīng)組合物，循環(huán)所述擴(kuò)增反應(yīng)組合物以形成含有許多擴(kuò)增產(chǎn)物類別的文庫(kù)，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物類 別中的至少一些包含對(duì)于文庫(kù)中的至少一些其他擴(kuò)增產(chǎn)物類別是共同的標(biāo)識(shí)序列。
33.權(quán)利要求32的方法，其中至少一些所述正向引物、至少一些所述反向引物、或至少 一些所述正向引物和至少一些所述反向引物，包含標(biāo)識(shí)序列或標(biāo)識(shí)序列的互補(bǔ)序列。
34.一種試劑盒，其包含許多第一銜接子類別，其中各第一銜接子類別包含不同的簡(jiǎn) 并序列、許多第二銜接子類別，其中各第二銜接子類別包含不同的簡(jiǎn)并序列、Rnl2家族的連 接酶、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、許多不同的第一引物類別、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和RNA酶 H (EC 3. 1. 26. 4)。
35.權(quán)利要求34的試劑盒，其還包含煙草酸焦磷酸酶。
36.一種試劑盒，其包含許多第一銜接子類別，其中至少一些所述第一銜接子類別包 含簡(jiǎn)并序列、許多第二銜接子類別，其中至少一些所述第二銜接子類別包含簡(jiǎn)并序列、包含 雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽、DNA聚合酶、至少一個(gè)引物類別和核糖核酸酶H。
37.權(quán)利要求37的試劑盒，其中所述DNA聚合酶包括依賴于RNA的DNA聚合酶和依賴 于DNA的DNA聚合酶。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其還包含煙草酸焦磷酸酶。
全文摘要
公開了用于檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)RNA分子類別的組合物、方法和試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用包含雙鏈特異性RNA連接酶活性的多肽將第一銜接子和第二銜接子連接至RNA分子，而無(wú)需插入的純化步驟。反轉(zhuǎn)錄連接產(chǎn)物，然后除去反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的至少一些核糖核苷。加入引物，并且產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，確定至少一個(gè)類別的擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分的序列，和確定相應(yīng)的RNA分子的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，直接或間接地檢測(cè)至少一些擴(kuò)增產(chǎn)物類別，從而使得能夠確定目的RNA分子的存在和/或數(shù)量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101952461SQ200980102210
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
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