專利名稱：通過連續(xù)發(fā)酵實施的乳酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母作為高倍體，使酵母的培養(yǎng)和發(fā)酵穩(wěn)定 化，使得能夠進(jìn)行長時間有效的乳酸生產(chǎn)，通過連續(xù)發(fā)酵實施的乳酸的制造方法。
背景技術(shù)：
發(fā)酵法大多可被分類為分批發(fā)酵法(Batch發(fā)酵法)和補料分批發(fā)酵法 (Fed-Batch發(fā)酵法)、以及連續(xù)發(fā)酵法。分批發(fā)酵法和補料分批發(fā)酵法的設(shè)備簡單、培養(yǎng)在 短時間內(nèi)結(jié)束，因此具有雜菌污染導(dǎo)致的損害少的優(yōu)點。但是，其存在著，隨時間經(jīng)過，培 養(yǎng)液中的生產(chǎn)物濃度變高，由于滲透壓或生產(chǎn)物阻礙等影響而導(dǎo)致生產(chǎn)性和收率降低的問 題。因此，難以長時間穩(wěn)定地維持高收率和高生產(chǎn)性。連續(xù)發(fā)酵法由于避免了發(fā)酵槽內(nèi)目 的物質(zhì)高濃度蓄積，因此存在能夠長時間維持高收率和高生產(chǎn)性的優(yōu)點，但是要使通過連 續(xù)發(fā)酵法進(jìn)行的培養(yǎng)長時間穩(wěn)定地繼續(xù)非常困難，人們反復(fù)進(jìn)行了研究。在連續(xù)發(fā)酵法的提案中，有以下方法，所述方法為用分離膜過濾微生物或培養(yǎng)細(xì) 胞，從濾液回收生產(chǎn)物，同時使經(jīng)過濾的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞保持在或返流到培養(yǎng)液中，將培 養(yǎng)液中的微生物或細(xì)胞維持在高濃度。例如，公開了在使用陶瓷膜的連續(xù)發(fā)酵裝置中進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵的技術(shù)(專利文獻(xiàn) 1 3)。但是，所公開的技術(shù)存在著由于陶瓷膜堵塞導(dǎo)致的過濾流量和過濾效率降低上的 問題，為了防止堵塞，進(jìn)行了逆清洗等。此外，還公開了通過琥珀酸的連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行的制造方法(專利文獻(xiàn)5)。該技術(shù)中， 在膜分離中采用了高過濾壓(約200kPa)。高過濾壓不僅在成本上不利，而且過濾處理中微 生物或細(xì)胞由于壓力而受到物理損傷，因此在將微生物或細(xì)胞連續(xù)地返回到培養(yǎng)液中的連 續(xù)發(fā)酵法中是不合適的。此外，專利文獻(xiàn)5中還公開了分離膜和過濾壓等技術(shù)作為用于使 連續(xù)發(fā)酵長時間繼續(xù)的提案，然而還希望連續(xù)發(fā)酵時間在300小時左右，使更長時間連續(xù) 培養(yǎng)繼續(xù)的方法。另一方面，在有機酸制造中使用的微生物的研究中，人們積極地進(jìn)行了利用對酸 耐性強的酵母的研究(非專利文獻(xiàn)1和2)。酵母中除了只存在1組染色體的單倍體酵母 之外，還存在具有多組染色體的高倍體。高倍體酵母主要作為面包酵母和釀造用酵母使用 (專利文獻(xiàn)6 8)。它們被用于食料和飲料的生產(chǎn)，也用于提高風(fēng)味和改良制造過程，但并 沒有在連續(xù)培養(yǎng)中利用的描述。此外，還公開了使用高倍體的乳酸制造方法(專利文獻(xiàn)9 12)。這些都是為了增 加乳酸合成基因的數(shù)量而利用高倍體，全部都是用補料分批發(fā)酵法進(jìn)行的培養(yǎng)，而且培養(yǎng) 時間也是在100小時以內(nèi)這樣的短時間，并沒有關(guān)于利用膜進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵的記載。此外，還報道了采用沒有營養(yǎng)需求性的營養(yǎng)非缺陷型酵母的乳酸生產(chǎn)(專利文獻(xiàn) 13)，但其培養(yǎng)時間也不到100小時，發(fā)酵法也只公開了補料分批發(fā)酵法。這樣一來，對提高生產(chǎn)性的連續(xù)發(fā)酵法以及發(fā)酵中利用的微生物都分別進(jìn)行了研 究。在用有利的連續(xù)發(fā)酵法作為發(fā)酵法培養(yǎng)微生物時，由于過濾壓隨著培養(yǎng)的進(jìn)行而增高，不可能實現(xiàn)長時間繼續(xù)，或者乳酸隨著培養(yǎng)的長期化而生產(chǎn)性降低等，難以使這兩者的優(yōu) 點充分發(fā)揮。因此，希望開發(fā)出解決這些問題，可以長時間穩(wěn)定地生產(chǎn)乳酸的連續(xù)發(fā)酵技 術(shù)。專利文獻(xiàn)1 特開平5-95778號公報專利文獻(xiàn)2 特開昭62-138184號公報專利文獻(xiàn)3 特開平10-174594號公報專利文獻(xiàn)4 特開2005-333886號公報專利文獻(xiàn)5 特開2007-252367號公報專利文獻(xiàn)6 特開2000-139326號公報專利文獻(xiàn)7 特開2002-027974號公報專利文獻(xiàn)8 特開2002-253212號公報專利文獻(xiàn)9 特開2006-006271號公報專利文獻(xiàn)10 特開2006-020602號公報專利文獻(xiàn)11 特開2007-089466號公報專利文獻(xiàn)12 特開2001-204464號公報專利文獻(xiàn)13 :US20050112737非專利文獻(xiàn) 1 -Biotechnology rogress，11，294-298 (1995)非 專禾丨J 文獻(xiàn) 2 :Journal of fermentation and bioengineering,86, 284-289(1988)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供通過能夠長時間穩(wěn)定地維持乳酸高生產(chǎn)性的連續(xù)發(fā)酵法 制造乳酸的方法。用于解決問題的手段本發(fā)明人進(jìn)行了積極的研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于在連續(xù)發(fā)酵中乳酸生產(chǎn)酵母反復(fù) 進(jìn)行長時間穩(wěn)定的增殖的同時維持乳酸的高生產(chǎn)性，將具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母采用高倍 體，能夠長時間維持乳酸的高生產(chǎn)性，從而完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明具有以下構(gòu)成。(1)通過連續(xù)發(fā)酵實施的乳酸的制造方法，其特征在于，用平均細(xì)孔徑為0. 01 μ m 以上至不到1 μ m的多孔性膜過濾處理具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母的培養(yǎng)液，從濾液 中回收生產(chǎn)物，同時使未濾過液保持在或返流到該培養(yǎng)液中，并在該培養(yǎng)液中追加發(fā)酵原 料。(2)⑴所述的乳酸的制造方法，其特征在于，在多孔性膜的膜間差壓為0. IkPa以 上至不到20kPa的范圍內(nèi)進(jìn)行過濾處理。(3) (1)或(2)所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍體酵母為2倍體。(4) (1) (3)任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍體酵母為營養(yǎng)非 缺陷型。(5) (1) (4)任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，連續(xù)發(fā)酵的乳酸對糖 收率在70%以上。
4
(6) (1) (5)任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，連續(xù)發(fā)酵的培養(yǎng)液中 的乳酸蓄積濃度為40g/L以上。(7) (1) (6)任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，連續(xù)發(fā)酵的乳酸生產(chǎn) 速度在7. 5g/L以上。(8) (5) (7)任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，使連續(xù)發(fā)酵繼續(xù)400小 時以上。(9) (1) (8)任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍體酵母屬于酵母 屬(Saccharomyces)0(10) (1) (9)任一項所述的乳酸的制造方法，高倍體酵母為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0發(fā)明效果如果根據(jù)本發(fā)明，通過使用高倍體酵母，可以進(jìn)行長時間穩(wěn)定地維持所希望的發(fā) 酵生產(chǎn)物乳酸的高生產(chǎn)性的連續(xù)發(fā)酵，還能以低成本穩(wěn)定地生產(chǎn)乳酸。附圖的簡要說明[

圖1]是用于說明本發(fā)明中使用的膜分離型的連續(xù)發(fā)酵裝置的一個實施方式的 概要側(cè)面圖。[圖2]是用于說明能夠在本發(fā)明中使用的其它膜分離型連續(xù)發(fā)酵裝置的一個實 施方式的概要側(cè)面圖。[圖3]圖3是用于說明本發(fā)明中使用的分離膜組件的一個實施方式的概要斜視 圖。[圖4]圖4是用于說明本發(fā)明中使用的其它分離膜組件的例子的概要斜視圖。[圖5]圖5是乳酸脫氫酶基因表達(dá)用載體。[圖6]圖6是實施例13和實施例14以及比較例16和比較例17的乳酸蓄積濃度 的變化。[圖7]圖7是實施例13和實施例14以及比較例16和比較例17的乳酸對糖收率 的變化。[圖8]圖8是實施例13和實施例14以及比較例16和比較例17的乳酸生產(chǎn)速度 的變化。[圖9]圖9是實施例15和實施例16以及比較例18和比較例19的乳酸蓄積濃度 的變化。[圖10]圖10是實施例15和實施例16以及比較例18和比較例19的乳酸對糖收
率的變化。[圖11]圖11是實施例15和實施例16以及比較例18和比較例19的乳酸生產(chǎn)速 度的變化。符號說明1發(fā)酵反應(yīng)槽2分離膜組件3水位差控制裝置4氣體供給裝置
5攪拌機6液位傳感器7培養(yǎng)基供給泵8 pH調(diào)節(jié)液供給泵9 pH傳感器·控制裝置10溫度調(diào)節(jié)器11發(fā)酵液循環(huán)泵12膜分離槽13支持板14流路材料15分離膜16 凹部17集水管18分離膜束19上部樹脂密封層20下部樹脂密封層21支持框22集水管用于實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明是在培養(yǎng)具有生產(chǎn)乳酸能力的酵母的發(fā)酵中，通過使用高倍體酵母，一邊 長時間維持乳酸的高生產(chǎn)性，一邊通過連續(xù)發(fā)酵法制造乳酸的方法，該方法是用分離膜過 濾具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母的培養(yǎng)液，從濾液中回收生產(chǎn)物，再使未濾過液保持在 或返流到培養(yǎng)液中，并在培養(yǎng)液中追加發(fā)酵原料的連續(xù)發(fā)酵中，使用平均細(xì)孔徑為Ο.ΟΙμπι 以上至不到1 μ m的多孔性膜作為分離膜，進(jìn)行過濾處理的乳酸的制造方法。首先，就本發(fā)明中作為分離膜使用的多孔性膜進(jìn)行說明。本發(fā)明中的多孔性膜，優(yōu) 選具有適應(yīng)被處理水的水質(zhì)和用途的分離性能和透水性能。多孔性膜從阻止性能和透水性 能和分離性能，例如耐污性角度來看，優(yōu)選含有多孔質(zhì)樹脂層的多孔性膜。含有多孔質(zhì)樹脂層的多孔性膜優(yōu)選在多孔質(zhì)基材的表面上具有起分離功能層作 用的多孔質(zhì)樹脂層。這里，多孔質(zhì)基材的材質(zhì)由有機材料和/或無機材料等構(gòu)成，優(yōu)選使 用有機材料，更優(yōu)選使用有機纖維。其中優(yōu)選的多孔質(zhì)基材是使用纖維素纖維、三乙酸纖 維素纖維、聚酯纖維、聚丙烯纖維和聚乙烯纖維等有機纖維構(gòu)成的織布或無紡布，更優(yōu)選使 用密度控制比較容易、制造也容易的便宜的無紡布。前述多孔質(zhì)基材的厚度在50 μ m以上 3000 μ m以下，優(yōu)選該范圍是因為能夠支持多孔質(zhì)樹脂層，給予分離膜強度。此外，多孔質(zhì)樹 脂層可以浸透在多孔質(zhì)基材中，多孔質(zhì)樹脂層也可以不浸透在多孔質(zhì)基材中，這根據(jù)用途 進(jìn)行選擇。多孔質(zhì)樹脂層可優(yōu)選使用有機高分子膜。作為有機高分子膜的材質(zhì)，可以列舉例 如，聚乙烯類樹脂、聚丙烯類樹脂、聚氯乙烯類樹脂、聚偏氟乙烯類樹脂、聚砜類樹脂、聚醚 砜類樹脂、聚丙烯腈類樹脂、聚烯烴類樹脂、纖維素類樹脂、三乙酸纖維素類樹脂等，可以是 以這些樹脂作為主要成分的樹脂混合物。這其中，作為主要成分，是指含有50重量％以上、優(yōu)選60重量％以上的該成分。尤其是，作為有機高分子膜的材質(zhì)，優(yōu)選通過溶液進(jìn)行的制 膜容易、且物理的耐久性和耐藥性優(yōu)異的聚氯乙烯類樹脂、聚偏氟乙烯類樹脂、聚砜類樹 脂、聚醚砜類樹脂、聚丙烯腈類樹脂、聚烯烴類樹脂或以這些樹脂作為主要成分的樹脂混合 物，更優(yōu)選聚偏氟乙烯類樹脂或以其作為主要成分的樹脂混合物。這里，作為聚偏氟乙烯類樹脂，優(yōu)選使用偏氟乙烯的均聚物或與可以與偏氟乙烯 共聚的乙烯類單體的共聚體。作為可以與偏氟乙烯共聚的乙烯類單體，可以列舉四氟乙烯、 六氟丙烯和三氯一氟乙烯等。此外，作為聚烯烴類樹脂，可以列舉聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯或聚氯丙烯，但優(yōu)選 聚氯乙烯。本發(fā)明中使用的多孔性膜的表面平均細(xì)孔徑在0.01 μ m以上是重要的。多孔性 膜的表面平均細(xì)孔徑如果在0.01 μ m以上，則此膜具有不容易發(fā)生由發(fā)酵時使用的菌體 導(dǎo)致的堵塞，且長時間穩(wěn)定地維持過濾性能的性能。而且，如果多孔性膜的平均細(xì)孔徑在 0. 01 μ m以上，則可使不漏出高倍體酵母的高排除率和高透水性同時實現(xiàn)，能夠長時間保持 透水性，以更高精度和再現(xiàn)性來實施。此外，在本發(fā)明的多孔性膜的表面平均細(xì)孔徑不到 0. 01 μ m時，存在多孔性膜的透水性能降低，膜即使不被污染，也無法有效運轉(zhuǎn)的情況，多孔 性膜的平均細(xì)孔徑在0.01 μ m以上、優(yōu)選0. 02 μ m以上，更優(yōu)選在0. 04 μ m以上時，可以有 效運轉(zhuǎn)。為了防止高倍體酵母的漏出，即排除率降低的麻煩的發(fā)生，以及為了防止高倍體 酵母直接堵塞孔，本發(fā)明中多孔性膜的平均細(xì)孔徑不到1 μ m十分重要，優(yōu)選在0. 4 μ m以 下，如果在0. 2 μ m以下，則可以更好的實施。此外，高倍體酵母有時是生產(chǎn)作為目的的乳 酸以外的物質(zhì)例如蛋白質(zhì)、多糖類等容易凝集的物質(zhì)的情形，另外，存在由于培養(yǎng)液中的高 倍體酵母的一部分死亡而生成細(xì)胞破碎物的情形，為了避免這些物質(zhì)導(dǎo)致的多孔性膜的堵 塞，更優(yōu)選平均細(xì)孔徑在0. Iym以下。因此，本發(fā)明中使用的多孔性膜的表面平均細(xì)孔徑， 多孔性膜的平均細(xì)孔徑優(yōu)選在0. 4 μ m以下，更優(yōu)選在0. 2 μ m以下，特別優(yōu)選在0. 1 μ m以 下。這里，本發(fā)明中表面的平均細(xì)孔徑可以通過測定在倍率10，000倍的掃描型電子 顯微鏡觀察多孔質(zhì)膜表面時，在9.2 μ mX 10. 4μπι的范圍內(nèi)可以觀察到的所有細(xì)孔的直 徑，進(jìn)行平均后求得。平均細(xì)孔徑也可以用掃描型電子顯微鏡，以10，000倍的倍率，拍攝膜 表面，隨機選擇10個以上、優(yōu)選20個以上的細(xì)孔，測定這些細(xì)孔的直徑，求出平均數(shù)。細(xì) 孔不成圓狀時，通過以下方法求出，即用圖像處理裝置等，求出與細(xì)孔的面積相同面積的圓 (等價圓)，以等價圓直徑作為細(xì)孔的直徑。本發(fā)明中使用的多孔性膜的表面的平均細(xì)孔徑，細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差小，即細(xì)孔徑 的大小是一致的，能夠獲得均勻的濾液，標(biāo)準(zhǔn)偏差ο優(yōu)選在Ο. μπι以下。而且，為了使發(fā) 酵運轉(zhuǎn)管理變得容易，平均細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差越小越好。平均細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ可以通 過下述(式1)計算得出，該式中以在上述10，000倍的倍率的掃描型電子顯微鏡多孔膜表 面的觀察下，在9. 2 μ mX 10. 4μ m范圍內(nèi)能夠觀察到的細(xì)孔數(shù)作為N，以測定的各個直徑作 為Xk，以細(xì)孔直徑的平均值作為X (ave)。
IJ(Xk-XCave))
(式1)
0" =、1坦
N在本發(fā)明使用的分離膜中，培養(yǎng)液的透過性是重要的性能之一。作為多孔性膜的 透過性的指標(biāo)，可以采用使用前的多孔性膜的純水透過系數(shù)。本發(fā)明中，多孔性膜的純水透 過系數(shù)，在以用透析膜(東麗(株)制7 O卜，4〒一 B2-1.5H)過濾飲用水之后的水作 為原水，25°C、以落差高度Im測定透水量計算時，優(yōu)選為2X10-9m7m2/S/pa以上，純水透過 系數(shù)如果為2X10-9m7m2/S/pa以上6X 10-7m7m2/S/pa以下，則可以獲得實用上足夠的透過 水量。更優(yōu)選為 2X l(T9m7m7s/pa 以上 1 X l(T7m7m2/s/pa 以下。本發(fā)明中使用的多孔性膜的膜表面的粗糙度是與表面垂直方向的高度的平均值。 膜表面粗糙度是為了使附著于分離膜表面的高倍體酵母容易被攪拌或通過循環(huán)泵產(chǎn)生的 液流形成的膜面清洗效果而容易剝離的因子之一。多孔性膜的表面粗糙度優(yōu)選在0. Ιμπι 以下。膜表面粗糙度如果在0. 1 μ m以下，附著于膜上的高倍體酵母容易剝離，在高倍體酵 母的過濾中，能夠使膜表面上發(fā)生的剪切力降低，抑制酵母的破壞，抑制多孔性膜的堵塞， 因而可以長時間穩(wěn)定的過濾，而且能夠以較低的膜間差壓實施連續(xù)發(fā)酵，因此即使膜堵塞 時，清洗恢復(fù)性也比在高膜間差壓下運作的情況要好。而且，由于通過抑制堵塞，可以進(jìn)行 穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)酵，因此優(yōu)選多孔性膜的表面粗糙度越小越好。定。
這里，膜表面粗糙度可以使用下述的原子力顯微鏡裝置(AFM)，在下述條件下測
裝置原子力顯微鏡裝置(Digital Instruments (株)制Nanoscope IIIa) 條件SiN懸臂(Digital Instruments(株)制)
掃描模式接觸模式(氣中測定) 水中輕敲(水中測定) 10ym,25ym 四方(氣中測定) 5μπι、10μπι 四方(水中測定) 512X512
樣品制備測定時的膜樣品，常溫下浸漬在乙醇中15分鐘后，浸漬于RO水中24小 時并洗凈后，風(fēng)干再用。 根據(jù)上述的原子力顯微鏡裝置(AFM)獲得的各點的Z軸方向的高度，用下述的 (式2)計算膜表面粗糙度(dMUgh)。
探針
掃描范圍
掃描分辨率
drough =— “‘‘
=1 1、
dMUgh:表面粗糙度(μπι) Zn :Ζ軸方向的高度(μπι) Z 掃描范圍的平均高度(μπι)
(式2)
8
N:測定樣品數(shù)本發(fā)明中使用的多孔性膜的形狀可以是平膜，也可以是中空纖維膜。多孔性膜的 形狀為平膜時，其平均厚度根據(jù)其用途來選擇，但優(yōu)選在20 μ m以上5000 μ m以下，更優(yōu)選 在50 μ m以上2000 μ m以下。多孔性膜為中空纖維膜時，中空纖維的內(nèi)徑優(yōu)選在200 μ m以 上5000 μ m以下，膜厚優(yōu)選在20 μ m以上2000 μ m以下。此外，在中空纖維的內(nèi)部還可以含 有由有機纖維或無機纖維制成筒狀的織物或編物。就本發(fā)明中使用的多孔性膜的制造方法進(jìn)行例示性說明。首先，就作為多孔性膜的一個優(yōu)選方式的平膜的制造方法進(jìn)行說明。在多孔質(zhì)基 材的表面上形成含有樹脂和溶劑的原液的被膜，同時使該原液浸漬于多孔質(zhì)基材中。然后， 只使具有被膜的多孔質(zhì)基材的被膜側(cè)表面與含有非溶劑的凝固浴接觸，使樹脂凝固，同時 在多孔質(zhì)基材的表面上形成多孔質(zhì)樹脂層。原液通過使樹脂溶解于溶劑中來調(diào)整。原液溫度，從制膜性的角度考慮，通常優(yōu)選 在5 120°C的范圍內(nèi)選擇。溶劑為溶解樹脂的、作用于樹脂并促進(jìn)它們形成多孔質(zhì)樹脂層 的溶劑。作為溶劑，可以使用N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N，N-二 甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、N-甲基_2_吡咯烷酮、甲基乙基酮、四氫呋喃、四甲基 脲、磷酸三甲酯、環(huán)己酮、異佛爾酮、Y-丁內(nèi)酯、甲基異戊基酮、鄰苯二甲酸二甲酯、丙二醇 甲基醚、碳酸異丙烯酯、雙丙酮醇、甘油三乙酸酯、丙酮和甲基乙基酮等。這其中，優(yōu)選使用 樹脂溶解性高的N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N, N- 二甲基乙酰胺(DMAc)、N, N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、二甲亞砜(DMS0)。這些溶劑可以單獨使用，也可以兩種以上混合使用。此外，還可以在溶劑中添加聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和甘油等溶劑以 外的成分。還可以在溶劑中添加非溶劑。非溶劑為不溶解樹脂的液體。非溶劑起到控制樹 脂凝固的速度，控制細(xì)孔大小的作用。作為非溶劑，可以使用水、甲醇和乙醇等醇類。其中， 作為非溶劑，從價格方面考慮，優(yōu)選水和甲醇。溶劑以外的成分和非溶劑也可以是混合物。還可以在原液中添加開孔劑。開孔劑具有在浸漬于凝固浴時被抽出，使樹脂層成 為多孔質(zhì)的作用。通過添加開孔劑，可以控制平均細(xì)孔徑的大小。開孔劑優(yōu)選在凝固浴的 溶解性高。作為開孔劑，可以使用例如氯化鈣或碳酸鈣等無機鹽。此外，作為開孔劑，可以 使用聚乙二醇和聚丙二醇等聚氧化烯類，聚乙烯醇、聚乙烯醇縮丁醛和聚丙烯酸等水溶性 高分子化合物和甘油。下面，就作為多孔性膜的一個優(yōu)選方式的中空纖維膜的制造方法進(jìn)行說明。中空 纖維膜可以通過從二重管式金屬口外側(cè)的管吐出包含樹脂和溶劑的原液，并從二重管式金 屬口內(nèi)側(cè)的管吐出中空部形成用流體，然后在冷卻浴中冷卻固化的方式制作。原液可以通過使上述平膜的制造方法中所述的樹脂以20重量％以上60重量％以 下的濃度溶解于上述平膜的制造方法中所述的溶劑中來調(diào)整。此外，通?？梢允褂脷怏w或 液體作為中空部形成用流體。此外，在獲得的中空纖維膜的外表面上還可以涂覆(層疊) 新的多孔性樹脂層。層疊可以是為了使中空纖維膜的性質(zhì)例如親水性或疏水性、細(xì)孔徑等 變化成所希望的性質(zhì)而進(jìn)行的。層疊的新的多孔性樹脂層可以通過以下方式制造，即通過 使樹脂溶解于溶劑的原液與含有非溶劑的凝固浴接觸，使樹脂凝固。該樹脂的材質(zhì)優(yōu)選是 例如與上述有機高分子膜的材質(zhì)同樣的材質(zhì)。此外，層疊方法沒有特別限定，可以將中空纖 維膜浸漬于原液中，也可以在中空纖維膜的表面上涂布原液，層疊后，通過擠出付著的原液的一部分，用氣刀吹跑，來調(diào)整層疊量。本發(fā)明中使用的多孔性膜用樹脂等部材來粘著、封閉中空纖維膜的中空部，通過 設(shè)置在支持體而形成分離膜組件。本發(fā)明中使用的多孔性膜還可以通過與支持體組合，形成分離膜組件。使用支持 板作為支持體，該支持板的至少一面上配備本發(fā)明中使用的多孔性膜的分離膜組件是本發(fā) 明使用的具有多孔性膜的分離膜組件的一個優(yōu)選的實施方式。為了擴大透水量，優(yōu)選在支 持板的兩面配置分離膜，這是多孔性膜組件的優(yōu)選方式。本發(fā)明的乳酸的制造方法中，優(yōu)選在多孔性膜的膜間差壓為0. IkPa以上至不到 20kPa的范圍內(nèi)進(jìn)行過濾處理。為了過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，如果在20kPa以上的膜間差壓下進(jìn)行 過濾處理，則需要用于施加壓力的動力，制造乳酸時的經(jīng)濟(jì)效果降低。此外，通過施加20kPa 以上的較高膜間差壓，存在破碎連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)中使用的高倍體酵母的情形，導(dǎo)致生產(chǎn)乳酸 的能力下降。在不到0. IkPa的膜間差壓下，過濾費時，生產(chǎn)速度降低。作為過濾壓力的膜 間差壓如果在0. 1以上至不到20kPa的范圍內(nèi)，由于通過水位差能獲得膜間差壓，不需要特 別地保持發(fā)酵槽內(nèi)在加壓狀態(tài)，因此生產(chǎn)乳酸的能力不會降低。而且，還可列舉以下優(yōu)點， 所述優(yōu)點是不需要特別地保持發(fā)酵槽內(nèi)在加壓狀態(tài)，因此在發(fā)酵槽內(nèi)部設(shè)置多孔性膜的方 式也可以，可以使發(fā)酵裝置緊湊簡潔。這里所謂的膜間差壓，表示多孔性膜中被處理水側(cè)與透過水側(cè)的壓力差。使多孔 質(zhì)膜的每單位面積的處理流量維持在一定量運轉(zhuǎn)時，如果用多孔性膜對被處理水進(jìn)行長時 間連續(xù)的膜過濾，由于存在于被處理水的污濁物質(zhì)吸附在多孔性膜的細(xì)孔以及堆積在表面 導(dǎo)致膜被污染。那么，發(fā)生膜堵塞，膜間差壓提高，處理流量顯著降低，穩(wěn)定運轉(zhuǎn)難以繼續(xù)， 因此優(yōu)選一邊測定膜間差壓一邊進(jìn)行過濾。膜間差壓的測定方法，可以通過在多孔性膜中 被處理水側(cè)和透過水側(cè)設(shè)置壓力計，測定壓力，求出該壓力差來測定。下面，對本發(fā)明中使用的具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母進(jìn)行說明。本發(fā)明的乳 酸的制造方法中，通過使用具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母，在簡便的操作條件下，就可以 進(jìn)行長時間穩(wěn)定維持所希望的發(fā)酵生產(chǎn)物乳酸的高生產(chǎn)性的連續(xù)發(fā)酵，能以低成本穩(wěn)定地 生產(chǎn)乳酸。所謂高倍體酵母，是指細(xì)胞內(nèi)具有2組以上的染色體的酵母。高倍體酵母一般比 遺傳學(xué)分析中使用的單倍體酵母大，與其相比，較難發(fā)生多孔質(zhì)膜的堵塞，適于長時間培 養(yǎng)?？梢粤信e以下優(yōu)點通過使用高倍體酵母，可以使膜表面上發(fā)生的剪切力降低，酵母的 破壞受到抑制，多孔性膜的堵塞也受到抑制，可以在實現(xiàn)長時間穩(wěn)定地過濾的同時實現(xiàn)膜 的再利用，能夠?qū)崿F(xiàn)低成本化。此外，在膜堵塞時，與單倍體酵母相比，清洗恢復(fù)性良好。高 倍體酵母的染色體組數(shù)沒有特別限定，優(yōu)選為具有2組染色體的2倍體酵母。高倍體酵母可以列舉例如發(fā)酵工業(yè)中經(jīng)常使用的面包酵母、清酒酵母、葡萄酒酵 母和啤酒酵母等酵母等。使用的高次倍數(shù)對酵母可以是從自然環(huán)境中分離的，也可以是通 過突變或基因重組改變了部分性質(zhì)的酵母。具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母是指導(dǎo)入了乳酸脫氫酶基因(以下有時稱為 LDH)的高倍體酵母。對導(dǎo)入了乳酸脫氫酶的高倍體酵母的制造方法沒有特別限定，但通過 使染色體上導(dǎo)入了乳酸脫氫酶基因的單倍體酵母進(jìn)行高倍體化，則可以不使每個染色體的 基因型發(fā)生變化，就簡單的使乳酸脫氫酶基因的拷貝數(shù)增加，進(jìn)而可使乳酸生產(chǎn)能力增強。
而且，本發(fā)明中，具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母如果是營養(yǎng)非缺陷型，可以使用 比以往的營養(yǎng)素少的培養(yǎng)基、即低成本的培養(yǎng)基，并且在簡單的操作條件下，可以進(jìn)行長時 間穩(wěn)定地維持乳酸的高生產(chǎn)性的連續(xù)發(fā)酵，能夠以低成本穩(wěn)定地生產(chǎn)乳酸，因此在本發(fā)明 中優(yōu)選使用。所謂酵母具有的營養(yǎng)需求性，是指野生型酵母具有的營養(yǎng)合成基因中由于某種原 因發(fā)生變異，導(dǎo)致該營養(yǎng)的合成能力受損。另外，所謂營養(yǎng)需求性的恢復(fù)是指該營養(yǎng)需求性 的變異再恢復(fù)到野生型或與其非常接近的狀態(tài)。營養(yǎng)需求性主要作為基因操作等時的標(biāo)記 使用，因此營養(yǎng)缺陷型酵母優(yōu)選在基因操作時使用。酵母具有營養(yǎng)需求性時，作為所必需營養(yǎng)素的具體例子，已知有蛋氨酸、酪氨酸、 異亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、 賴氨酸、色氨酸、亮氨酸、組氨酸等。作為顯示出營養(yǎng)缺陷型的酵母所具有的基因型，可以列 舉以下例子?！さ鞍彼嵝枨笮詍etl、met2、met3、met4、met5、met6、met7、met8、metl0、metl3、 metl4、met20·酪氨酸需求性tyrl·異亮氨酸、纈氨酸需求性ilvl、ilv2、ilv3、ilv5·苯丙氨酸需求性pha2 谷氨酸需求性GLU3·蘇氨酸需求性thrl、thr4·天冬氨酸需求性aspl、asp5·絲氨酸需求性serl、ser2·生:argl> arg3> arg4> arg5> arg8> arg9> arg80> arg81> arg82> arg84· ^BfPS^^cii :ural>ura2> ura3> ura4> ura6·腺嘌呤需求性:adel、ade2、ade3、ade4、ade5、ade6、ade8、ade9、adel2、ADE15·賴氨酸需求性=IysU lys2、lys4、lys5、lys7、lys9、IyslU lysl3、lysl4·色氨酸需求性trpl、trp2、trp3、trp4、trp5·亮氨酸需求性leul、leu2、leu3、leu4、leu5·組氨酸需求性hisl、his2、his3、his4、his5、his6、his7、his8。本發(fā)明中優(yōu)選使用的營養(yǎng)非缺陷型酵母為不具有顯示上述營養(yǎng)需求性的基因型 或為互補的酵母。而且，作為判斷是否為營養(yǎng)非缺陷型酵母的方法，可以以在酵母的最小培 養(yǎng)基SD培養(yǎng)基(表1)中是否可以生長作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。[表1]_
0143]無氨基酸的酵母氮源(Difco公司制)1.7g0144]0145]葡萄糖30g0146]0147]瓊脂20g0148]
至Ij IL作為通過使?fàn)I養(yǎng)缺陷型酵母的營養(yǎng)需求性恢復(fù)，制作營養(yǎng)非缺陷型酵母的方法， 可以列舉通過基因重組法導(dǎo)入營養(yǎng)合成基因，使?fàn)I養(yǎng)需求性恢復(fù)的方法、以及重復(fù)具有不 同營養(yǎng)需求性的酵母之間接合，使子囊形成，使目的營養(yǎng)需求性恢復(fù)的過程，最終使?fàn)I養(yǎng)需 求性全部恢復(fù)，制成營養(yǎng)非缺陷型酵母的方法等。作為導(dǎo)入于具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母中的LDH，只要是編碼具有將還原型 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸轉(zhuǎn)換成氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和乳 酸的活性的蛋白質(zhì)，就沒有限定，例如，可以使用乳酸的對糖收率高的乳酸菌來源的LDH、哺 乳類來源的LDH或兩棲類來源的LDH。這其中可優(yōu)選使用人(Homo sapiens)來源和蛙類來 源的LDH。而且，蛙類中優(yōu)選使用屬于負(fù)子蟾科(Pipidae)的蛙類來源的LDH，屬于負(fù)子蟾 科的蛙類中，優(yōu)選使用非洲爪蟾(Xenopus laevis)來源的LDH。前述LDH還包含由于遺傳多態(tài)性和誘變等產(chǎn)生的變異型基因。這里所謂的 遺傳多態(tài)性，是由于基因上的自然突變導(dǎo)致基因的堿基序列的一部分發(fā)生變化，所謂 誘變，是指通過人工在基因中導(dǎo)入變異。誘變有例如，使用定點誘變導(dǎo)入用試劑盒 (Mutan-K(TakaraBio公司制))的方法、使用隨機誘變導(dǎo)入用試劑盒(BD Diversify PCR Random Mutagenesis (CL0NTECH公司制))的方法等。此外，本發(fā)明中使用的LDH如果編碼 具有將NADH和丙酮酸轉(zhuǎn)化為NAD+和乳酸的活性的蛋白質(zhì)，堿基序列的一部分中存在缺失 或插入也可以。對于具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母，前述LDH可以保持在維持于酵母染色體外 的質(zhì)粒或YAC等中，但如上所述，優(yōu)選整合在酵母染色體中保持。作為在酵母染色體中導(dǎo)入 LDH的方法，沒有特別限制，可以通過例如特開2008-29329號公報中公開的方法導(dǎo)入。此 外，在具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母中，至少保持1個LDH，優(yōu)選2個以上，更優(yōu)選3個以 上，更優(yōu)選4個以上。本發(fā)明中使用的發(fā)酵原料可以是促進(jìn)培養(yǎng)的酵母的生長，能夠使作為目的發(fā)酵生 產(chǎn)物的乳酸良好生產(chǎn)的原料，可以優(yōu)選使用例如適當(dāng)含有碳源、氮源、無機鹽類、和根據(jù)需 要添加的氨基酸和維生素等有機微量營養(yǎng)素的液體培養(yǎng)基。作為上述碳源，可優(yōu)選使用例 如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖和麥芽糖等糖類、含有這些糖類的淀粉糖化液、甘薯糖 蜜、甜菜糖蜜、高級糖蜜(High Test Molasses)、蔗汁、蔗汁提取物或濃縮液、從蔗汁中純化 或結(jié)晶化的原料糖、從蔗汁中純化或結(jié)晶化的純化糖、以及醋酸、延胡索酸等有機酸、乙醇 等醇類和甘油等。這里所謂糖類是指多元醇的最初氧化生成物，具有一個醛基或酮基，且 具有醛基的糖被分類為醛糖、具有酮基的糖被分類為酮糖的碳水化合物，優(yōu)選為葡萄糖、蔗 糖、果糖、半乳糖、乳糖或麥芽糖。上述碳源，可以在培養(yǎng)開始時一起添加，還可以在培養(yǎng)中 分批或連續(xù)地添加。此外，作為上述氮源，可以使用例如氨氣、氨水、銨鹽類、尿素、硝酸鹽類、其它輔助 使用的有機氮源例如油粕類、大豆加水分解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、維生素類、玉米 漿、酵母或酵母提取物、肉膏、蛋白胨等肽類、各種發(fā)酵菌體及其加水分解物等。此外，作為上述無機鹽類，可以適當(dāng)添加例如磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、和錳鹽等。此外，在具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母為營養(yǎng)缺陷型的情形時，可以添加作為 制品的營養(yǎng)物，或者含有該營養(yǎng)物的天然物。而且，根據(jù)需要還可以添加使用消泡劑。
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具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母的發(fā)酵培養(yǎng)條件，只要能夠進(jìn)行培養(yǎng)，就沒有特 別限制，但優(yōu)選在pH為4 8，溫度在20 40°C的范圍內(nèi)進(jìn)行。發(fā)酵培養(yǎng)液的pH用無機 酸或有機酸、堿性物質(zhì)、以及尿素、碳酸鈣和氨氣等，調(diào)整到上述范圍內(nèi)的預(yù)先確定的值。具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母的發(fā)酵培養(yǎng)中，如果需要提高氧的供給速度，可 以采用在空氣中添加氧，將氧濃度保持在21 %以上，加壓培養(yǎng)液，提高攪拌速度或者提高通 氣量等手段。相反，在需要降低氧的供給速度時，也可以在空氣中混合二氧化碳?xì)怏w、氮和 氬等不含氧的氣體再進(jìn)行供給。本發(fā)明中，可以在培養(yǎng)初期進(jìn)行分批培養(yǎng)或補料分批培養(yǎng)，在菌體濃度提高后開 始連續(xù)培養(yǎng)(抽取)，也可以接種高濃度的菌體，在培養(yǎng)開始的同時進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。從適當(dāng) 時期開始，可以進(jìn)行發(fā)酵原料液的供給和培養(yǎng)物的抽取。發(fā)酵原料液供給和培養(yǎng)物的抽取 開始時間不一定需要相同。此外，發(fā)酵原料液的供給和培養(yǎng)物的抽取可以是連續(xù)的，也可以 是間歇的?？梢栽诎l(fā)酵原料液中添加如上所示的菌體增殖所必需的營養(yǎng)素，使得菌體增殖 得以連續(xù)進(jìn)行。為了獲得有效的生產(chǎn)性，發(fā)酵培養(yǎng)液中菌體的濃度優(yōu)選在發(fā)酵培養(yǎng)液的環(huán)境不適 于酵母增殖且死亡率不升高的范圍下，以高濃度狀態(tài)維持，作為其中一例，通過將菌體濃度 作為干燥重量維持在5g/L以上，可以獲得良好的生產(chǎn)效率。此外，只要不導(dǎo)致連續(xù)發(fā)酵裝 置運作上的不方便或生產(chǎn)效率降低，菌體濃度的上限值就沒有特別限定。使具有發(fā)酵生產(chǎn)能力的新鮮菌體增殖的同時進(jìn)行的連續(xù)培養(yǎng)操作，在培養(yǎng)管理 上，通常優(yōu)選在單一的發(fā)酵反應(yīng)槽中進(jìn)行。然而，如果是菌體增殖的同時生成生產(chǎn)物的連續(xù) 培養(yǎng)法，則發(fā)酵反應(yīng)槽的數(shù)目是任意的。由于發(fā)酵反應(yīng)槽的容量小等原因，也可以使用多個 發(fā)酵反應(yīng)槽。這種情況下，即使用配管并列或串聯(lián)地連接多個發(fā)酵反應(yīng)槽進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，也 可以獲得發(fā)酵生產(chǎn)物的高生產(chǎn)性。本發(fā)明中，所謂連續(xù)發(fā)酵繼續(xù)，表示連續(xù)地或者間歇地進(jìn)行發(fā)酵原料液供給和培 養(yǎng)物的抽提的狀態(tài)。本發(fā)明中，連續(xù)發(fā)酵繼續(xù)期間優(yōu)選有效生產(chǎn)乳酸。乳酸有效生產(chǎn)是指 通過乳酸蓄積濃度、乳酸生產(chǎn)速度、乳酸對糖收率進(jìn)行評價，它們中的任一個，優(yōu)選2個，更 優(yōu)選全部都在高狀態(tài)。所謂乳酸蓄積濃度是指培養(yǎng)液中所含乳酸的濃度，所謂乳酸蓄積濃度高的狀態(tài)是 指乳酸蓄積濃度在40g/L以上、優(yōu)選42g/L、更優(yōu)選44g/L。乳酸生產(chǎn)速度是指每單位時間生產(chǎn)的乳酸量，乳酸生產(chǎn)速度高的狀態(tài)是指，數(shù)式3 表示的乳酸生產(chǎn)速度在7. 5g/L/小時以上、優(yōu)選在8g/L/小時以上、更優(yōu)選在9g/L/小時以 上。Pb 乳酸生產(chǎn)速度(g/1/h) +4)····(式3) at VFM:培養(yǎng)基供給速度(1/h)FN:中和劑供給速度(1/h)P:生產(chǎn)物濃度(g/1)Pb 生產(chǎn)速度(g/1/h)S:底物濃度(g/1)
Se 供給培養(yǎng)基中的底物濃度(g/1)t:時間(h)V:培養(yǎng)液量(1)YP/S 生產(chǎn)物收率(g/g)乳酸對糖收率是指每單位時間消耗的碳源所產(chǎn)生的乳酸量的比例，乳酸對糖收率 高的狀態(tài)是指，數(shù)式4表示的乳酸對糖收率為70%以上、優(yōu)選為75%以上、更優(yōu)選為80%以 上。YP/S 生產(chǎn)物收率(g/g)W點、二二)…·(式 4)培養(yǎng)基中糖的重量均換算為葡萄糖的質(zhì)量。例如，Imol的蔗糖換算為2mol的葡萄糖。本發(fā)明制造的過濾和分離發(fā)酵液中所含的乳酸的分離和純化可以通過組合以往 已知的濃縮、蒸餾和晶析等方法進(jìn)行，可以列舉，例如通過使過濾和分離發(fā)酵液的PH達(dá)到 1以下，然后用二乙醚或乙酸乙酯等提取的方法，吸附在離子交換樹脂、清洗后洗脫的方法， 酸催化劑的存在下、使之與醇反應(yīng)形成酯、進(jìn)行蒸餾的方法，和晶析成鈣鹽或鋰鹽的方法， W02009/004922中公開的組合納米過濾膜和蒸餾的分離和純化方法等。下面，就本發(fā)明的乳酸的制造方法中使用的連續(xù)發(fā)酵裝置的優(yōu)選方式，用圖進(jìn)行 說明。圖1是用于說明本發(fā)明的通過連續(xù)發(fā)酵實施的乳酸的制造方法中使用的膜分離 型連續(xù)發(fā)酵裝置的優(yōu)選例子的概要側(cè)面圖。圖1是分離膜組件設(shè)置在發(fā)酵反應(yīng)槽的外部的 代表例。圖1中，膜分離型連續(xù)發(fā)酵裝置基本由發(fā)酵反應(yīng)槽1和膜分離層12和差壓控制裝 置3構(gòu)成。這里，分離膜組件2中整合至多孔性分離膜。作為該多孔性分離膜，合適的是使 用例如國際公開第2002/064240號小冊子中公開的分離膜和分離膜組件。此外，膜分離槽 12通過發(fā)酵培養(yǎng)液循環(huán)泵11與發(fā)酵反應(yīng)槽1連接。圖1中，通過培養(yǎng)基供給泵7，向發(fā)酵反應(yīng)槽1中投入培養(yǎng)基，根據(jù)需要，用攪拌機 5攪拌發(fā)酵反應(yīng)槽1內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)液，而且根據(jù)需要還可以用氣體供給裝置4供給必要的氣 體。此時，可以回收供給的氣體，再循環(huán)，通過氣體供給裝置4再供給。此外，根據(jù)需要，可 以通過PH傳感器·控制裝置9和pH調(diào)節(jié)液供給泵8來調(diào)整發(fā)酵液的pH，此外，根據(jù)需要， 可以通過用溫度調(diào)節(jié)器10調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液的溫度，進(jìn)行生產(chǎn)性高的發(fā)酵生產(chǎn)。而且，裝置 內(nèi)的發(fā)酵液通過發(fā)酵液循環(huán)泵11，在發(fā)酵反應(yīng)槽1與膜分離槽12之間循環(huán)。含有發(fā)酵生產(chǎn) 物的發(fā)酵培養(yǎng)液被分離膜組件2過濾并分離成微生物和發(fā)酵生產(chǎn)物，可以從裝置系統(tǒng)中取 出ο此外，由于被過濾和分離的微生物停留于裝置系統(tǒng)內(nèi)，因此裝置系統(tǒng)內(nèi)的微生物 可以維持高濃度，因而可以進(jìn)行高生產(chǎn)性的發(fā)酵生產(chǎn)。這里，通過分離膜組件2進(jìn)行的過 濾和分離通過與膜分離槽12的水面的水位差壓進(jìn)行，不需要特別的動力就可實施，根據(jù)需 要，通過液位傳感器6和差壓控制裝置3，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)分離膜組件2的過濾和分離速度以 及裝置系統(tǒng)內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)液量。根據(jù)需要，還可以通過氣體供給裝置4向膜分離槽12內(nèi)供給必要的氣體。此時，可以回收供給的氣體，再循環(huán)，通過氣體供給裝置4再供給。通過分離 膜組件2進(jìn)行的過濾和分離根據(jù)需要還可以通過泵等吸引濾過或通過加壓裝置系統(tǒng)內(nèi)部， 進(jìn)行過濾和分離。此外，可以在培養(yǎng)槽內(nèi)連續(xù)發(fā)酵地培養(yǎng)高倍體酵母，根據(jù)需要，向發(fā)酵槽 內(nèi)供給。通過在培養(yǎng)槽內(nèi)培養(yǎng)高倍體酵母，根據(jù)需要，向發(fā)酵槽內(nèi)供給，可以總是通過新鮮 的乳酸生產(chǎn)能力高的高倍體酵母進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，可以進(jìn)行長時間維持高生產(chǎn)性能的連續(xù)發(fā) 酵。接下來，圖2是用于說明本發(fā)明中使用的其它膜分離型連續(xù)發(fā)酵裝置的例子的概 要側(cè)面圖。本發(fā)明的乳酸制造方法中使用的連續(xù)發(fā)酵裝置中，分離膜組件設(shè)置在發(fā)酵反應(yīng) 槽內(nèi)部的一個代表性例子示于圖2的概要圖。圖2中，膜分離型連續(xù)發(fā)酵裝置基本由發(fā)酵反應(yīng)槽1和差壓控制裝置3構(gòu)成。發(fā) 酵反應(yīng)槽1內(nèi)的分離膜組件2中整合了多孔性膜。作為該多孔性分離膜，可以使用例如國 際公開第2002/064240號小冊子中公開的分離膜和分離膜組件。分離膜組件隨后詳述。下面，就通過圖2的膜分離型連續(xù)發(fā)酵裝置進(jìn)行的連續(xù)發(fā)酵的方式進(jìn)行說明。用 培養(yǎng)基供給泵7，向發(fā)酵反應(yīng)槽1中連續(xù)地或間歇地投入培養(yǎng)基。培養(yǎng)基在投入前可以根據(jù) 需要進(jìn)行加熱殺菌、加熱滅菌或采用過濾器的滅菌處理。發(fā)酵生產(chǎn)時，根據(jù)需要，可以用發(fā) 酵反應(yīng)槽1內(nèi)的攪拌機5攪拌發(fā)酵反應(yīng)槽1內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)液。發(fā)酵生產(chǎn)時，根據(jù)需要，可以 通過氣體供給裝置4給發(fā)酵反應(yīng)槽1內(nèi)供給必要的氣體。發(fā)酵生產(chǎn)時，根據(jù)需要，可以通過 PH傳感器 控制裝置9和pH調(diào)節(jié)液供給泵8來調(diào)整發(fā)酵反應(yīng)槽1內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)液的pH，根 據(jù)需要，可以通過用溫度調(diào)節(jié)器10調(diào)節(jié)發(fā)酵反應(yīng)槽1內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)液的溫度進(jìn)行生產(chǎn)性高 的發(fā)酵生產(chǎn)。這里，盡管例示了在通過儀器檢測 和控制裝置進(jìn)行的發(fā)酵培養(yǎng)液的物理化學(xué) 條件的調(diào)節(jié)中PH和溫度的調(diào)節(jié)，但根據(jù)需要，可以進(jìn)行溶解氧和ORP的控制，而且還可以通 過在線化學(xué)傳感器等分析裝置測定發(fā)酵培養(yǎng)液中的乳酸的濃度，控制以發(fā)酵培養(yǎng)液中的乳 酸的濃度作為指標(biāo)的物理化學(xué)的條件。此外，培養(yǎng)基的連續(xù)或間歇投入優(yōu)選以通過上述檢 測裝置進(jìn)行的發(fā)酵液的物理化學(xué)環(huán)境的測定值作為指標(biāo)，適當(dāng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基投入量和速度。圖2中，用設(shè)置于發(fā)酵反應(yīng)槽1內(nèi)的分離膜組件2，將發(fā)酵培養(yǎng)液過濾和分離成菌 體和發(fā)酵生產(chǎn)物，再從裝置系統(tǒng)中取出發(fā)酵生產(chǎn)物。此外，通過將被過濾和分離的菌體留在 裝置系統(tǒng)內(nèi)，裝置系統(tǒng)內(nèi)的菌體濃度可以維持高濃度，因而可以進(jìn)行高生產(chǎn)性的發(fā)酵生產(chǎn)。 這里，由分離膜組件2進(jìn)行的過濾和分離通過與發(fā)酵反應(yīng)槽1水面的水位差壓進(jìn)行，不需要 使用特別的動力就可以實施，根據(jù)需要，通過液位傳感器6和差壓控制裝置3，可以適當(dāng)調(diào) 節(jié)分離膜組件2的過濾和分離速度以及發(fā)酵反應(yīng)槽1內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)液量。通過上述分離膜 組件進(jìn)行的過濾和分離根據(jù)需要，還可以通過泵等進(jìn)行的吸引過濾或通過加壓裝置系統(tǒng)內(nèi) 部，進(jìn)行過濾和分離。而且，還可以在另外準(zhǔn)備的培養(yǎng)槽中培養(yǎng)菌體，根據(jù)需要供給到發(fā)酵 槽內(nèi)。在培養(yǎng)槽中培養(yǎng)菌體，根據(jù)需要向發(fā)酵槽內(nèi)供給，可以總是用新鮮的菌體進(jìn)行連續(xù)發(fā) 酵，可以進(jìn)行長時間維持高乳酸生產(chǎn)性能的連續(xù)發(fā)酵。本發(fā)明的乳酸的制造方法中使用的連續(xù)發(fā)酵裝置中優(yōu)選使用的分離膜組件基于 附圖進(jìn)行說明。本發(fā)明的乳酸的制造方法中使用的連續(xù)發(fā)酵裝置中優(yōu)選可以使用國際公開 第2002/064240號小冊子中公開的分離膜和分離膜組件。以下用附圖簡要說明作為本發(fā)明中使用的分離膜組件的形態(tài)的合適例子的國際 公開第2002/064240號小冊子中公開的分離膜和分離膜組件。圖3是用于說明本發(fā)明中使用的分離膜組件的一個實施方式的概要斜視圖。分離膜組件，如圖3所示，由在具有剛性的支持板13的兩面依次配置流路材料14 和前述分離膜15而構(gòu)成。支持板13在其兩面具有凹部16。分離膜15過濾發(fā)酵培養(yǎng)液。 流路材料14是使經(jīng)分離膜15過濾的濾液有效流到支持板13的材料。流到支持板13的濾 液通過支持板13的凹部16，經(jīng)排出手段的集水管17，被取出到連續(xù)發(fā)酵裝置外部。下面，對圖4所示的其它方式的分離膜組件進(jìn)行說明。圖4是用于說明本發(fā)明中 使用的其它分離膜組件的例子的截面說明圖。分離膜組件如圖4所示，由中空纖維膜構(gòu)成的分離膜束18被部樹脂密封層19和 下部樹脂密封層20以束狀被粘著和固定。由下部樹脂密封層20進(jìn)行的粘著和固定化形成 了密封中空纖維膜的中空部，防止發(fā)酵培養(yǎng)液漏出的結(jié)構(gòu)。另一方面，形成了上部樹脂密封 層19不密封中空纖維膜的內(nèi)孔，濾液流到集水管22的結(jié)構(gòu)。該分離膜組件可以通過支持 框21設(shè)置在連續(xù)發(fā)酵裝置內(nèi)。由分離膜束18過濾的濾液通過中空纖維膜的中空部，經(jīng)集 水管22，被取出到發(fā)酵培養(yǎng)槽的外部。作為用于取出濾液的動力，可以使用水位差壓、泵、通 過液體或氣體等進(jìn)行的吸引過濾、或?qū)ρb置系統(tǒng)內(nèi)加壓等方法。通過本發(fā)明的連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行的乳酸制造方法中使用的連續(xù)發(fā)酵裝置的分離膜組 件的構(gòu)成部件，優(yōu)選是耐高壓蒸汽滅菌操作的部件。發(fā)酵裝置內(nèi)如果可以滅菌，就可以避免 在連續(xù)發(fā)酵時被不優(yōu)選的菌體污染的危險，可以實現(xiàn)更穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)酵。構(gòu)成分離膜組件 的部件，優(yōu)選在高壓蒸汽滅菌操作的條件即121°C 15分鐘下有耐性。分離膜組件部件可優(yōu) 選選擇例如不銹鋼或鋁等金屬、聚酰胺類樹脂、氟類樹脂、聚碳酸酯類樹脂、聚縮醛類樹脂、 聚對苯二甲酸丁二醇酯類樹脂、PVDF、改性聚苯醚類樹脂和聚砜類樹脂等樹脂。通過本發(fā)明的連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行的乳酸的制造方法中使用的連續(xù)發(fā)酵裝置中，分離膜 組件可以設(shè)置在發(fā)酵槽外，也可以設(shè)置在發(fā)酵反應(yīng)槽內(nèi)。分離膜組件設(shè)置在發(fā)酵反應(yīng)槽外 時，可以另外設(shè)置膜分離槽，在其內(nèi)部設(shè)置分離膜組件，可以一邊使發(fā)酵培養(yǎng)液在發(fā)酵反應(yīng) 槽和膜分離槽之間循環(huán)，一邊通過分離膜組件連續(xù)過濾發(fā)酵培養(yǎng)液。通過本發(fā)明的連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行的乳酸的制造方法中使用的連續(xù)發(fā)酵裝置中，理想的 是，膜分離槽可以進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。如果膜分離槽可以進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，則容易避免雜 菌導(dǎo)致的污染。
實施例以下，用實施例說明本發(fā)明。(參考例1)具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母的制作通過對在釀酒酵母NBRC10505株中導(dǎo)入非洲爪蟾來源的L-乳酸脫氫酶基因(以 下也稱為XLDH)獲得的具有生產(chǎn)乳酸能力的酵母進(jìn)行高倍體化，制成具有生產(chǎn)乳酸能力的 高倍體酵母。并且，如以下詳細(xì)說明的那樣，給予營養(yǎng)需求性的恢復(fù)和溫度感受性變異的性 質(zhì)。用于制作高倍體酵母的酵母和用以下說明的方法制成的酵母示于表2。以下，對LDH的 插入、溫度感受性突變的賦予、營養(yǎng)需求性的恢復(fù)方法，說明詳細(xì)的程序。(其1)非洲爪蟾來源的L-LDH(XLDH)表達(dá)載體的構(gòu)建XLDH(序列號1)的克隆通過PCR法進(jìn)行。PCR中，以從非洲爪蟾腎臟來源的cDNA 文庫(STRATAGENE公司制)，按照附帶的操作規(guī)程制備的噬菌粒DNA作為模板。
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PCR擴增反應(yīng)中使用KOD-PIus聚合酶(東洋紡公司制)，反應(yīng)緩沖液、dNTPmix等 采用試劑盒附帶的產(chǎn)品。制備50μ 1的反應(yīng)體系，其中如上所述按照附帶的操作規(guī)程調(diào)整 的噬菌粒DNA為50ng/樣品、引物為50pmol/樣品，和KOD-Plus聚合酶為1單位/樣品。 用PCR擴增裝置iCycler (BI0-RAD公司制)，使反應(yīng)溶液在94°C溫度熱變性5分鐘后，以 940C (熱變性)30秒、55°C (引物的退火)30秒、68°C (互補鏈延伸)1分鐘為一個循環(huán)，進(jìn) 行30個循環(huán)，然后冷卻到4°C。并且，基因擴增用引物(序列號2，3)在5末端側(cè)添加SalI 識別序列、3末端側(cè)添加NotI識別序列而制備。純化PCR擴增片段，用T4多核苷酸激酶(TakaraBio公司制)對末端磷酸化后，連 接到PUC118載體(用限制性酶HincII切斷，對切斷面進(jìn)行脫磷酸化處理)中。用DNA連 接試劑盒Ver. 2 (TakaraBio公司制)進(jìn)行連接。用連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α的感受態(tài) 細(xì)胞(TakaraBio公司制)，接種到含50 μ g/mL抗生素氨芐青霉素的LB板上，培養(yǎng)一晚。生 長的菌落，用小型制備法回收質(zhì)粒DNA，用限制性酶SalI和NotI切斷，選擇出導(dǎo)入了非洲爪 蟾來源的LDH基因的質(zhì)粒。這一系列操作都按照附帶的操作規(guī)程進(jìn)行。用限制性酶SalI和NotI切斷插入了 XLDH的pUC118載體，通過瓊脂糖凝膠 電泳分離DNA片段，按照常規(guī)方法純化含有XLDH的片段。獲得的片段連接到圖5所示的表 達(dá)載體pTRSll的XhoI/NotI切斷部位，用與上述相同方法回收質(zhì)粒DNA，通過用限制性酶 XhoI和NotI切斷，選擇出插入了 XLDH的表達(dá)載體pTRS102。以如上所述獲得的pTRS102作為XLDH的模板，在PDCl · SEDl · TDH3基因座中插 入LDH的方法說明如下。(其2)向酵母染色體PDCl基因座插入LDH以PTRS102作為擴增模板，通過以寡核苷酸(序列號4，5)作為引物對的PCR，擴增 出含有XLDH和TDH3終止子序列的1. 3kb的PCR片段。這里，序列號4被設(shè)計成添加了對 應(yīng)于PDCl基因的起始密碼子上游60bp的序列。然后，以質(zhì)粒PTRS424作為擴增模板，通過以寡核苷酸(序列號6，7)作為引物對 的PCR，擴增出含有作為酵母選擇標(biāo)記的TRPl基因的1. 2kb的PCR片段。這里，序列號7被 設(shè)計成添加了對應(yīng)于PDCl基因終止密碼子下游60bp的序列。用瓊脂糖凝膠電泳分離各個DNA片段，按常規(guī)方法純化。以混合了此處獲得的 各1.3kb片段、1.2kb片段的混合物作為擴增模板，通過以寡核苷酸(序列號4，7)作為引物 對的PCR法，擴增出了在5末端和3末端分別添加了對應(yīng)于PDCl基因的上游和下游60bp 的序列的連接了 XLDH、TDH3終止子和TRPl基因的約2. 5kb的PCR片段。用瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR片段，按常規(guī)方法純化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，用 色氨酸非添加培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇出XLDH導(dǎo)入在染色體上的PDCl基因啟動子下游的轉(zhuǎn) 化株。按下述方式對用上述方式獲得的轉(zhuǎn)化株為非洲爪蟾來源的L-LDH導(dǎo)入在染色體 上PDCl基因啟動子下游的酵母進(jìn)行確認(rèn)。首先，用基因組DNA提取試劑盒Gen L·^ i L (TakaraBio公司制)制備轉(zhuǎn)化株的基因組DNA，以其作為擴增模板，通過以寡核苷酸(序列 號7，8)作為引物對的PCR，確認(rèn)獲得了約2. 8kb的擴增DNA片段。而且，非轉(zhuǎn)化株中，通過 上述PCR獲得了約2. Ikb的擴增DNA片段。(其3)向酵母染色體SEDl基因座插入LDH
向SEDl基因座的導(dǎo)入，以參考例1中制備的PTRS102作為擴增模板，通過以寡核 苷酸(序列號5，9)作為引物對的PCR，擴增出含有非洲爪蟾來源的LDH基因和TDH3終止子 序列的1. 3kb的PCR片段。這里，序列號9被設(shè)計成添加了對應(yīng)于SEDl基因的起始密碼子 上游60bp的序列。然后，通過以質(zhì)粒pRS423作為擴增模板，以寡核苷酸(序列號6，10)作為引物對 的PCR，擴增出含有作為酵母選擇標(biāo)記的HIS3基因的約1.3kb的PCR片段。這里，序列號 10被設(shè)計成添加了對應(yīng)于SEDl基因終止密碼子下游60bp的序列。用瓊脂糖凝膠電泳分離各個DNA片段，按常規(guī)方法純化。通過以混合了此處獲 得的兩種約1. 3kb片段的混合物作為擴增模板，以寡核苷酸(序列號9，10)作為引物對的 PCR法，擴增出了在5末端· 3末端分別添加了對應(yīng)于SEDl基因的上游·下游60bp序列的 連接了非洲爪蟾來源的LDH基因、TDH3終止子和HIS3基因的約2. 6kb的PCR片段。用瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR片段，按常規(guī)方法純化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，用 組氨酸非添加培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇出XLDH導(dǎo)入在染色體上的SEDl基因啟動子的下游的 轉(zhuǎn)化株。按下述方式對用上述方式獲得的轉(zhuǎn)化株為XLDH導(dǎo)入在染色體上的SEDl基因啟動 子下游的酵母進(jìn)行確認(rèn)。首先，用基因組DNA提取試劑盒Gen匕U (TakaraBio公司 制)制備轉(zhuǎn)化株的基因組DNA，通過以其作為擴增模板，以寡核苷酸(序列號11，12)作為引 物對的PCR，確認(rèn)獲得了約2. 9kb的擴增DNA片段。而且，非轉(zhuǎn)化株中，通過上述PCR獲得了 約1. 4kb的擴增DNA片段。(其4)向酵母染色體TDH3基因座導(dǎo)入LDH對向TDH3基因座的導(dǎo)入，制作了將pTRS102的TDH3終止子變成ADHl終止子的質(zhì)粒。首先，用基因組DNA提取試劑盒Gen i 3 <九(TakaraBio公司制)從NBRC10505 株中提取基因組DNA，通過以提取的基因組DNA作為模板，以寡核苷酸(序列號13，14)作為 引物對的PCR，擴增出含有ADHl啟動子的PCR片段。這里，序列號13被制作成在5末端側(cè) 添加NotI識別序列，序列號14被制作成在3末端側(cè)添加HindIII識別序列。純化PCR擴增片段，用T4多核苷酸激酶(TakaraBio公司制)對末端磷酸化后，連 接到PUC118載體(用限制性酶HincII切斷，對切斷面進(jìn)行脫磷酸化處理)中。用連接溶 液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α的感受態(tài)細(xì)胞(TakaraBio公司制)，接種到含50 μ g/mL抗生素氨 芐青霉素的LB板上，培養(yǎng)一晚。生長的菌落，用小型制備法回收質(zhì)粒DNA，用限制性酶NotI 和HindIII切斷，選擇出插入了 ADHl終止子的質(zhì)粒。制作的質(zhì)粒稱為pUC118_ADHlt。然后，用限制性酶NotI和HindIII切斷pUC118_ADHlt，通過1 %瓊脂糖凝膠電泳 分離DNA片段，按照常規(guī)方法純化含有ADHl終止子的片段。獲得的含有ADHl終止子的片 段連接到PTRS102的Notl/Hindlll切斷部位，用與上述相同方法回收質(zhì)粒DNA，通過用限制 性酶NotI和HindIII切斷，選擇出TDH3終止子變化為ADHl終止子的質(zhì)粒。以后將這樣制 備的質(zhì)粒稱為PTRS150。以該PTRS150作為模板，通過以寡核苷酸(序列號15，16)作為引物對的PCR，擴增 出含有蛙類來源的L-LDH基因和ADHl終止子序列的1. 3kb的PCR片段。這里，序列號16 的引物被設(shè)計成添加了對應(yīng)于TDH3基因的起始密碼子上游60bp的序列。
然后，以質(zhì)粒pRS426作為擴增模板，通過以寡核苷酸(序列號17，18)作為引物對 的PCR，擴增出含有作為酵母選擇標(biāo)記的URA3基因的1. 2kb的PCR片段。這里，序列號18 的引物被設(shè)計成添加了對應(yīng)于TDH3基因的終止密碼子下游60bp的序列。用瓊脂糖凝膠電泳分離各個DNA片段，按常規(guī)方法純化。以混合了此處獲得的 各1.3kb片段、1.2kb片段的混合物作為擴增模板，通過以寡核苷酸(序列號16，18)作為引 物對的PCR法，擴增出了連接有XLDH、ADHl終止子和URA3基因的約2. 5kb的PCR片段。用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR片段，按常規(guī)方法純化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，用 尿嘧啶非添加培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇出XLDH導(dǎo)入在染色體上的TDH3基因啟動子的下游的 轉(zhuǎn)化株。按下述方式對用上述方式獲得的轉(zhuǎn)化株為XLDH導(dǎo)入在染色體上TDH3基因啟動子 下游的酵母進(jìn)行確認(rèn)。首先，用基因組DNA提取試劑盒Gen tU (TakaraBio公司制) 制備轉(zhuǎn)化株的基因組DNA，通過以其作為擴增模板，以寡核苷酸(序列號19，20)作為引物對 的PCR，確認(rèn)獲得了約2.8kb的擴增DNA片段。而且，非轉(zhuǎn)化株中，通過上述PCR獲得了約 2. Ikb的擴增DNA片段。(其5)PDC5基因具有溫度感受性變異的酵母的獲得溫度感受性變異的給予，通過特開2008-048726號公報中記載的使pdc5基因中具 有溫度感受性變異的酵母SW015株與想給予溫度感受性變異的酵母接合獲得。使該2倍體 酵母在子囊形成培養(yǎng)基中形成子囊，用顯微操作器解剖子囊，獲得各個單倍體細(xì)胞，研究各 個單倍體細(xì)胞的營養(yǎng)需求性，從獲得的單倍體細(xì)胞中，選擇出在PDCl基因、SEDl基因、TDHl 基因座任意一個中插入了 XLDH，且PDC5基因中具有溫度感受性變異的(34°C不能生長) 株。接著，說明營養(yǎng)需求性的恢復(fù)方法。(其6)賴氨酸營養(yǎng)需求性恢復(fù)株的制作在使賴氨酸需求性恢復(fù)的情形使用以下方法。以Funakoshi公司制的BY4741的 基因組DNA作為模板，通過以寡核苷酸(序列號21，22)作為引物對的PCR，擴增出LYS2基 因的前半約2kb的PCR片段。用瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR片段，按常規(guī)方法純化 后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，解除LYS2基因的琥珀突變。用賴氨酸非添加培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇出賴氨酸 合成能力恢復(fù)的轉(zhuǎn)化株。按下述方式對用上述方式獲得的轉(zhuǎn)化株為解除了 LYS2基因的琥珀突變的酵母進(jìn) 行確認(rèn)。首先，使獲得的轉(zhuǎn)化體與具有野生型的LYS2基因的20GY77株接合，獲得2倍體細(xì) 胞。使該2倍體細(xì)胞在子囊形成培養(yǎng)基上形成子囊。用顯微操作器解剖子囊，獲得各個單 倍體細(xì)胞，研究各個單倍體細(xì)胞的營養(yǎng)需求性。確認(rèn)了獲得的所有單倍體細(xì)胞都具有賴氨 酸合成能力。而且，在不解除LYS2基因的變異而恢復(fù)賴氨酸合成能力的情形時，上述獲得 的單倍體細(xì)胞中，獲得了不具有賴氨酸合成能力的細(xì)胞。(其7)亮氨酸營養(yǎng)需求性恢復(fù)株的獲得在使亮氨酸需求性恢復(fù)的情形，使用以下方法。以質(zhì)粒TOS425作為模板，通過以 寡核苷酸(序列號23，24)作為引物對的PCR，擴增出LEU2基因的約2kb的PCR片段。用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR片段，按常規(guī)方法純化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，解除LEU2基因 的變異。用亮氨酸非添加培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇出亮氨酸合成能力恢復(fù)的轉(zhuǎn)化株。
按下述方式對用上述方式獲得的轉(zhuǎn)化株為解除了 LEU2基因變異的酵母進(jìn)行確 認(rèn)。首先，使獲得的轉(zhuǎn)化體與具有野生型的LEU2基因的釀酒酵母20GY7株接合，獲得2倍 體細(xì)胞。使該2倍體細(xì)胞在子囊形成培養(yǎng)基上形成子囊。用顯微操作器解剖子囊，獲得各 個單倍體細(xì)胞，研究各個單倍體細(xì)胞的營養(yǎng)需求性。確認(rèn)了獲得的所有單倍體細(xì)胞都具有 亮氨酸合成能力。而且，在不解除LEU2基因的變異而恢復(fù)亮氨酸合成能力的情形時，上述 獲得的單倍體細(xì)胞中，獲得了不具有亮氨酸合成能力的細(xì)胞。(其8)腺嘌呤營養(yǎng)需求性恢復(fù)株的獲得在使腺嘌呤需求性恢復(fù)的情形，使用以下方法。以質(zhì)粒TOS422作為模板，通過以 寡核苷酸(序列號25，26)作為引物對的PCR，擴增出ADE2基因的約2kbPCR片段。用 瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR片段，按常規(guī)方法純化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，解除LEU2基因的變 異。用腺嘌呤非添加培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇出腺嘌呤亮氨酸合成能力恢復(fù)的轉(zhuǎn)化株。按下述方式對用上述方式獲得的轉(zhuǎn)化株為解除了 AED2基因變異的酵母進(jìn)行確 認(rèn)。首先，使獲得的轉(zhuǎn)化體與具有野生型的ADE2基因的釀酒酵母20GY7株接合，獲得2倍 體細(xì)胞。使該2倍體細(xì)胞在子囊形成培養(yǎng)基上形成子囊。用顯微操作器解剖子囊，獲得各 個單倍體細(xì)胞，研究各個單倍體細(xì)胞的營養(yǎng)需求性。確認(rèn)了獲得的所有單倍體細(xì)胞都具有 腺嘌呤合成能力。而且，在不解除ADE2基因的變異而恢復(fù)腺嘌呤合成能力的情形時，上述 獲得的單倍體細(xì)胞中，獲得了不具有腺嘌呤合成能力的細(xì)胞。(其9)尿嘧啶營養(yǎng)需求性恢復(fù)株的獲得在使尿嘧啶需求性恢復(fù)的情形時，使用以下方法。以質(zhì)粒pRS426作為模板，通過 以寡核苷酸(序列號27，28)作為引物對的PCR，擴增出URA3基因的約2kb的PCR片段。用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR片段，按常規(guī)方法純化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，解除URA3基因 變異。用尿嘧啶非添加培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇出尿嘧啶合成能力恢復(fù)的轉(zhuǎn)化株。按下述方式對用上述方式獲得的轉(zhuǎn)化株為解除了 URA3基因變異的酵母進(jìn)行確 認(rèn)。首先，使獲得的轉(zhuǎn)化體與具有野生型的URA3基因的釀酒酵母20GY7株接合，獲得2倍 體細(xì)胞。使該2倍體細(xì)胞在子囊形成培養(yǎng)基上形成子囊。用顯微操作器解剖子囊，獲得各 個單倍體細(xì)胞，研究各個單倍體細(xì)胞的營養(yǎng)需求性。確認(rèn)了獲得的所有單倍體細(xì)胞都具有 尿嘧啶合成能力。而且，在不解除URA3基因的變異而恢復(fù)尿嘧啶合成能力的情形時，上述 獲得的單倍體細(xì)胞中，獲得了不具有尿嘧啶合成能力的細(xì)胞。(其10)具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體株的獲得使通過組合其1 9的方法獲得的轉(zhuǎn)化體接合，獲得了沒有營養(yǎng)需求性的2倍體 原營養(yǎng)株。進(jìn)而使2倍體原營養(yǎng)株在子囊形成培養(yǎng)基上形成子囊，用顯微操作器解剖子囊， 獲得各個單倍體細(xì)胞。研究取得的各個單倍體細(xì)胞的營養(yǎng)需求性，對在SD培養(yǎng)基(表1) 上生長的株，判斷為營養(yǎng)需求性已恢復(fù)，作為單倍體原營養(yǎng)株。[表 2]
權(quán)利要求
通過連續(xù)發(fā)酵的乳酸的制造方法，其特征在于，用平均細(xì)孔徑為0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜過濾處理具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母的培養(yǎng)液，從濾液中回收生產(chǎn)物，同時使未濾過液保持在或返流到該培養(yǎng)液中，并在該培養(yǎng)液中追加發(fā)酵原料。
2.權(quán)利要求1所述的乳酸的制造方法，其特征在于，在多孔性膜的膜間差壓為0.IkPa 以上至不到20kPa的范圍內(nèi)進(jìn)行過濾處理。
3.權(quán)利要求1或2所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍體酵母是2倍體。
4.權(quán)利要求1 3任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍體酵母是營養(yǎng)非缺 陷型。
5.權(quán)利要求1 4任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，連續(xù)發(fā)酵的乳酸對糖收 率是70%以上。
6.權(quán)利要求1 5任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，連續(xù)發(fā)酵的培養(yǎng)液中的 乳酸蓄積濃度是40g/L以上。
7.權(quán)利要求1 6任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，連續(xù)發(fā)酵的乳酸生產(chǎn)速 度是7. 5g/L以上。
8.權(quán)利要求5 7任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，使連續(xù)發(fā)酵繼續(xù)400小 時以上。
9.權(quán)利要求1 8任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍體酵母屬于酵母屬 (Saccharomyces)0
10.權(quán)利要求1 9任一項所述的乳酸的制造方法，其特征在于，高倍體酵母是釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)。
全文摘要
通過采用連續(xù)發(fā)酵實施的乳酸的制造方法，能夠由長時間穩(wěn)定且低成本地發(fā)酵而顯著提高乳酸的生產(chǎn)效率，所述方法的特征在于，用平均細(xì)孔徑為0.01μm以上至不到1μm的多孔性膜過濾處理具有生產(chǎn)乳酸能力的高倍體酵母的培養(yǎng)液，從濾液中回收生產(chǎn)物，同時使未濾過液保持在或返流到該培養(yǎng)液中，并且在所述培養(yǎng)液中追加發(fā)酵原料。
文檔編號C12R1/865GK101939439SQ20098010408
公開日2011年1月5日 申請日期2009年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日
發(fā)明者佐佐木七生, 守田健, 山田勝成, 澤井秀樹, 耳塚孝 申請人:東麗株式會社