專利名稱：使用提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法和/或化學(xué)療法敏感性的物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法和/或化學(xué)療法敏感性的物質(zhì)。
背景技術(shù)：
用放射線和/或細(xì)胞抑制劑(化學(xué)療法)殺滅人體癌細(xì)胞是人類與癌癥作斗爭最 重要的療法。但是，如今人們還不能完全靶向地殺滅腫瘤組織，在治療過程中健康的組織也 受到損害，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，降低了患者痊愈的可能性。因此，人們需要這樣一種療 法可以靶向地、持續(xù)時(shí)間盡可能短地實(shí)施治療，從而使副作用盡可能小。現(xiàn)代的放射療法 可以達(dá)到這些要求，這種療法可以殺滅腫瘤內(nèi)部最重要的細(xì)胞群體，即腫瘤細(xì)胞，并有效地 防止其在治療后重新生長(腫瘤復(fù)發(fā))。但是在某些臨床條件下無法使用這種放射劑量，因 此必須同時(shí)使用化學(xué)療法和/或新型的分子療法，才能消滅腫瘤干細(xì)胞。下面所介紹的一 些臨床活體外和活體內(nèi)試驗(yàn)表明，究竟是針對(duì)某種特定分子的分子療法單獨(dú)使用就可以殺 滅腫瘤干細(xì)胞，還是需要與放射療法結(jié)合才能殺滅腫瘤干細(xì)胞。如果成功使用這種療法，患 者就可以治愈，并且腫瘤不會(huì)復(fù)發(fā)。評(píng)價(jià)靶向分子療法治療效果的另一個(gè)決定性標(biāo)準(zhǔn)是了 解腫瘤組織中是否有目標(biāo)分子。利用人體腫瘤活組織進(jìn)行的這些試驗(yàn)，目的是檢驗(yàn)相關(guān)的 分子究竟是表達(dá)還是高表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提高腫瘤細(xì)胞在放射治療和/或化學(xué)治療中的敏感性，從而縮短 放射治療和/或化學(xué)治療的時(shí)間，降低其強(qiáng)度，從而最終減小其副作用。根據(jù)本發(fā)明，通過施用可以鎖定或限制PINCH-I蛋白的功能的物質(zhì)達(dá)成了這 個(gè)目的。PINCH-I蛋白在有關(guān)文獻(xiàn)中還被稱為LIMSl或者“LIM and senescent cell antigenlike domains 1”。根據(jù)本發(fā)明，向腫瘤細(xì)胞施用本發(fā)明所述的物質(zhì)。本發(fā)明中所指 的腫瘤細(xì)胞既可以是在各種形式的惡性腫瘤疾病中出現(xiàn)在血液系統(tǒng)腫瘤中的，也可以是出 現(xiàn)在固體腫瘤中的。本發(fā)明令人驚訝地表明，鎖定腫瘤細(xì)胞中的PINCH-I蛋白(的功能或 者表達(dá))可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射和化學(xué)治療的敏感性。用放射線和/或細(xì)胞抑制劑(化 學(xué)療法)治療后的檢查結(jié)果表明，癌細(xì)胞的存活率比沒有鎖定PINCH-I蛋白時(shí)要低的多。在化學(xué)療法中例如可以使用順鉬或絲裂霉素C，但是也可以根據(jù)需要治療的腫瘤 病使用所有其它的化學(xué)療法。化學(xué)療法中所使用的物質(zhì)主要是5'-脫氧-5-氟尿苷、 5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、9-氨基喜樹堿、阿巴瑞克、阿扎胞苷、放線菌素D、阿 地白介素、阿侖單抗(MabCampath )、阿利維A酸、六甲蜜胺、雙氫胺蒽醌、氨磷汀、氨基 苯乙哌啶酮、安吖啶、氯咪喹酮、阿那曲唑、砒霜、天冬酰胺酶、阿曲生坦(Xinlay )、咪唑硫 嘌呤、注射卡介苗(Theracys)、鹽酸苯達(dá)莫司汀、貝伐單抗、貝沙羅丁、比卡魯胺、Biolimus A9 (雷帕霉素衍生物)、博來霉素、硼替佐米、乙基酰胺、白消安、烯二炔類高效抗腫瘤抗生 素、卡魯睪酮、喜樹堿、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、氯乙胺、鹽酸西那卡塞、順鉬、克拉屈濱、環(huán)磷酰胺、抗雄性激素制劑、胞嘧啶阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、氮 烯唑胺、放線菌素D、阿法達(dá)貝泊汀、達(dá)沙替尼(Sprycel )、道諾霉素、地尼白介素、右丙亞 胺、多西他奇、阿霉素(Adriamycin)、甲雄烷酮、埃利奧、表柔比星(4_EpiAdriamycin)、埃 羅替尼(Tarceva )、紅細(xì)胞生成素、雌氮芥、依托泊苷、依維莫司(Certicane )、依西美 坦、優(yōu)保津、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、氟他胺、福美坦、磷雌酚、氟維司群、粒細(xì)胞集落 刺激因子、吉非替尼(Iressa )、2、2-二氟脫氧胞嘧啶核苷、吉妥單抗、戈舍瑞林、羥基脲 (Hydroxyurea)、替伊莫單抗(Zevalin )、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、干擾素α、依 立替康、伊沙匹隆、蘭瑞肽、拉帕替尼(Tykerb )、來拉度胺(Revlimid )、來曲唑、甲酰四 氫葉酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、Lonafarnib (Sarasar )、11-2、洛莫司汀、美登醇、鹽酸氮 芥、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、巰乙磺酸鈉、密都錠、甲氧沙林、甲基強(qiáng)的松龍、米替福新、 絲裂霉素C、米托鬼白胼、米托坦、米托蒽醌、苯丙酸諾龍、奈拉濱、尼洛替尼(Tasigna )、 尼莫司汀、諾非單抗、奧利默森納、醋酸奧曲肽、奧普瑞白介素、奧沙利鉬、氧氮雜膦、紫杉 醇和紫杉醇衍生物、帕米膦酸二鈉、帕尼單抗、培加酶、培門冬酶、聚乙二醇非格司亭、培美 曲塞、噴司他丁、哌血生、普卡酶素、鬼白毒素衍生物、聚苯丙生、P卜吩姆鈉、潑尼松、丙卡 巴胼、奎納克林、雷替曲塞、雷帕霉素(Sirolimus)、拉布立酶、視黃醇、紫紅霉素D、美羅華 (MabThera )、沙格司亭、索拉非尼(Nexavar )、鏈佐星、舒尼替尼(Sutent )、他莫昔 芬、替加氟、替莫唑胺、坦羅莫司、替尼泊甙、睪內(nèi)酯、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、替吡法尼 (Zamestra )、拓?fù)涮婵?拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑)、托瑞米芬、百克沙、曲貝替定、曲妥單抗 (Herceptin )、曲奧舒凡、維甲酸、曲普瑞林、曲磷胺、烏拉莫司汀、戊柔比星、異長春花堿、 長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱和唑來膦酸鹽。放射方式主要使用光子放射(X線放射，y放射)、電子放射、質(zhì)子放射或重離子放 射(l-H,2-He,7-Li,9-BeUl-B, 12-C, 14-N 16-0) 本發(fā)明的主要內(nèi)容是使用可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射和/或化學(xué)療法敏感性的物 質(zhì)，其方法是在基因表達(dá)層面或者蛋白層面上鎖定或限制PINCH-I蛋白的功能。此外，本發(fā)明還包括了一種治療腫瘤患者的方法，也就是首先通過施用在基因表 達(dá)層面或者蛋白層面上鎖定或限制PINCH-I蛋白功能的物質(zhì)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法和/ 或化學(xué)療法的敏感性，然后用放射療法和/或化學(xué)療法進(jìn)行治療。治療人體組織上的良性 或惡性腫瘤的方法包括下列步驟a)在患有腫瘤疾病的生物全身或局部施用一種或多種在基因表達(dá)層面或者蛋白 層面上鎖定或限制PINCH-I蛋白功能的物質(zhì)，從而提高腫瘤對(duì)在b)步驟實(shí)施的放射和/或 化學(xué)治療的敏感性。b)然后用放射和/或化學(xué)療法治療腫瘤。生物既可以是動(dòng)物，也可以是人。本發(fā)明所述的方法尤其適用于人體。在本發(fā)明中，可以鎖定或限制PINCH-I蛋白功能的物質(zhì)涵蓋的范圍十分廣泛。其 中既包括在蛋白層面上通過直接捆綁而抑制PINCH-I蛋白的物質(zhì)，例如抗體、自然配體或 改性配體，也包括在轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后層面上阻斷或大幅減少基因表達(dá)，從而不形成PINCH-I 蛋白或者減少PINCH-I蛋白形成量的物質(zhì)，例如RNA干擾素或者轉(zhuǎn)錄因子。使用本發(fā)明所述的物質(zhì)特別適合所有類型存在PINCH-I蛋白的腫瘤，尤其是PINCH-I蛋白在其中過度表達(dá)的腫瘤。鎖定PINCH-I蛋白功能的物質(zhì)，在本發(fā)明中指的是適用于在基因表達(dá)層面或者蛋 白層面上減弱、抑制或者阻斷PINCH-I蛋白功能的物質(zhì)。主要包括有機(jī)化合物、肽類似物、 模擬肽、核酸、寡核苷酸、多聚核苷酸、抗體等。這些物質(zhì)既可以直接作為活性物質(zhì)施用，也 可以通過身體內(nèi)部的新陳代謝形成“前藥”。本發(fā)明所述的、可以鎖定或限制PINCH-I蛋白功能的物質(zhì)，主要是PINCH-I蛋白抗 體、PINCH-l-dsRNA、PINCH-l-siRNA、PINCH-I-短發(fā)夾狀 RNA 和 PINCH-I-嗎啡啉(也稱為 注射嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸、phosphorodiamidate morpholino oligos或PMOs)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用了 PINCH-I蛋白抗體，這種抗體能夠靶向地識(shí) 別和捆綁PINCH-I蛋白。在向腫瘤細(xì)胞施用這種抗體之后，用放射和/或化學(xué)療法治療腫 瘤細(xì)胞?？贵w通過與PINCH-I蛋白的捆綁鎖定了其功能，從而提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射和/ 或化學(xué)療法的敏感性。從而大大降低了用放射和/或化學(xué)療法治療后的癌細(xì)胞存活率。在此主要使用單克隆PINCH-I抗體，尤其是人化抗體。人化單克隆抗體包括本發(fā) 明所述單克隆抗體捆綁PINCH-I蛋白的超變區(qū)和人體抗體輕鏈和重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū) 的構(gòu)架區(qū)。人們已經(jīng)知道了生產(chǎn)人化抗體的方法，主要是由Morrison (1984)、Jones (1986)、 Verhoeyen (1988)、Riechmann (1988)、Queen (1989)和 Tempest (1991)等科學(xué)家闡述的。本發(fā)明所指的抗體此外還可以是抗體的不同改性形式，例如抗體片段，也就是FV 片段、Fab片段、(Fab) ‘ 2片段或者單鏈抗體(利用基因技術(shù)生產(chǎn)的雙重特殊抗體，由兩個(gè) 通過短鏈連接的結(jié)合區(qū)域組成)。人們已經(jīng)知道了 F(ab2)或F(ab)片段的生產(chǎn)工藝，主要 是在《免疫學(xué)》一書(John Wiley & Sons，http://www.wiley.com/legacy/cp/cpi/)的實(shí) 驗(yàn)室操作指南中闡述的。本發(fā)明所述的抗體例如IgGl同型的鼠抗單克隆PINCH-I蛋白抗體(Klon PINCH-C58 ；Sigma-Aldrich, DE)、IgM 同型的鼠抗單克隆 PINCH-1 蛋白抗體(Klon PINCH-N173 ；Sigma-Aldrich, DE)和 IgG2a 同型的鼠抗單克隆 PINCH 蛋白抗體(Klon 49 ； Becton Dickinson, DE)。在本發(fā)明的另一種實(shí)施形式中，通過使用RNA干擾素(RNAi)抑制PINCH-I編碼基 因的表達(dá)。RNA干擾指的是一種機(jī)制，即通過使用可以識(shí)別目標(biāo)的RNA分子抑制基因的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過RNA干擾而抑制PINCH-I蛋白表達(dá)的分子是 siRNA-(小干涉RNA)分子。siRNA分子是短的單鏈或雙鏈RNA分子，可以靶向抑制目標(biāo)基因 的表達(dá)。通過施用PINCH-1-siRNA可以防止腫瘤細(xì)胞表達(dá)PINCH-I基因，從而形成PINCH-I 蛋白。這樣就提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法和/或化學(xué)療法的敏感性。本發(fā)明優(yōu)先使用的siRNA是18到30核苷酸的寡核苷酸，尤其是21到23核苷 酸的寡核苷酸，它們或者由一個(gè)與人體PINCH-l-cDNA(SEQ ID No. 1，Genbank Accession Number匪004987)的序列相同的RNA單鏈組成，或者由一個(gè)RNA雙鏈組成，其中一鏈與 PINCH-l-cDNA(SEQ ID No. 1)的序列相同，另一鏈與第一鏈互補(bǔ)。序列相同意思是兩個(gè)序列 至少有80%完全一致，最好是超過90%或者95%。PINCH-1-cDNA是DNA鏈條，制備方法是將從PINCH-I基因中轉(zhuǎn)錄而得的成熟mRNA 通過反轉(zhuǎn)錄酶制劑轉(zhuǎn)錄到一個(gè)與這個(gè)mRNA互補(bǔ)的DNA鏈條。
5
在siRNA的3'末端，此外還連接了兩個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷殘余物。humane PINCH-l-cDNA (SEQ IDNo. 1)1tagttcaagacaacagagacaaagctaagatgaggaagttctgtacagtttaggaaatag
61aggctttcaaagataattcgcagtgatgtgaaactggcctcccaagccctgataacaaca
121tggccaacgccctggccagcgccacttgcgagcgctgcaagggcggctttgcgcccgctg
181agaagatcgtgaacagtaatggggagctgtaccatgagcagtgtttcgtgtgcgctcagt
241gcttccagcagttcccagaaggactcttctatgagtttgaaggaagaaagtactgtgaac
301atgactttcagatgctctttgccccttgctgtcatcagtgtggtgaattcatcattggcc
361gagttatcaaagccatgaataacagctggcatccggagtgcttccgctgtgacctctgcc
421aggaagttctggcagatatcgggtttgtcaagaatgctgggagacacctgtgtcgcccct
481gtcataatcgtgagaaagccagaggccttgggaaatacatctgccagaaatgccatgcta
541tcatcgatgagcagcctctgatattcaagaacgacccctaccatccagaccatttcaact
601gcgccaactgcgggaaggagctgactgccgatgcacgggagctgaaaggggagctatact
661gcctcccatgccatgataaaatgggggtccccatctgtggtgcttgccgacggcccatcg
721aagggcgcgtggtgaacgctatgggcaagcagtggcatgtggagcattttgtttgtgcca
781agtgtgagaaaccctttcttggacatcgccattatgagaggaaaggcctggcatattgtg
841aaactcactataaccagctatttggtgatgtttgcttccactgcaatcgtgttatagaag
901gtgatgtggtctctgctcttaataaggcctggtgcgtgaactgctttgcctgttctacct
961gcaacactaaattaacactcaagaataagtttgtggagtttgacatgaagccagtctgta
1021agaagtgctatgagaaatttccattggagctgaagaaaagacttaagaaactagctgaga
1081ccttaggaaggaaataagttcctttattttttcttttctatgcaagataagagattacca
1141acattacttgtcttgatctacccatatttaaagctatatctcaaagcagttgagagaaga
1201ggacctatatgaatggttttatgtcatttt 3.3. 3.3.3.aaagaaaaattcatataatc
1261gtgtttaaaacacaaatgaagtcagtatttgcctttgttaacccttatccatttgttgac
1321atgtagactgtttacaaaaaaaaaacacatggttaaatgt 3.3.3.3.3.ttaaggcccc
1381C 3.3.3.3.3.3.3.atataactttttaaaatgaaaggagtcaccttttacatgactcaggtgaa
1441aaaacagtataaacattaatttactttgtgttcaaaagaaaattccaactgctgttgggg
1501aaggacacagtaaccaccca
PINCH-1-cDNA指的是所有與SEQ ID No. 1的序列95%或以上相同，最好是98%或
以上相同的序列。用一種專業(yè)人員熟悉的方法制備siRNA。本發(fā)明所述PINCH-1-siRNA 的實(shí)例例如是 SEQ ID No. 2、SEQ IDNo. 3、SEQ ID No. 4 和SEQ ID No. 5的多聚核苷酸及其基因序列只有少許不同、但是也能鎖定PINCH-I蛋白功 能的變體(同源性)。SEQ ID No.2至5的多聚核苷酸同源變體與多聚核苷酸的區(qū)別最多 不超過1到4個(gè)核苷酸，最好不超過1到2個(gè)核苷酸。1)GGACCUAUAUGAAUG⑶UUtt(SEQIDNo.2)
2)GGACUCUUCUAUGA⑶UUGtt(SEQIDNo.3)
3)GGAAGAAAGUACUOTGAACtt(SEQIDNo.4)
4)GCUAUAUCUCAAAGCA⑶Utt(SEQIDNo.5) 本發(fā)明還闡述了具有改性骨架的互補(bǔ)序列。具有改性骨架的核苷酸序列這個(gè)概念
6指的是所有其它線性聚合體，腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)，鳥嘌呤(G)和尿嘧啶(U)或胸腺激素 (T)在其中按照相應(yīng)的順序排列，例如具有由寡核苷酸、氨基磷酸酯或0-甲基衍生骨架的 核苷酸序列、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、具有混合骨架的核酸或者用嗎啡啉以及熒光燃 料(綠色/紅色/等，fluororescence proteins)標(biāo)記的核苷酸序列，這些物質(zhì)都可以抑 制PINCH-I基因的表達(dá)。在siRNA轉(zhuǎn)染(也就是將靶向RNA分子植入真核細(xì)胞)后，用放射和/或化學(xué)療 法治療腫瘤細(xì)胞in vitro.放射源最好使用傳統(tǒng)的200kVX射線管(13mA，-1. 3Gy/min)。細(xì)胞抑制劑例如可以使用順鉬(Platinex ，Bristol-Myers-Squibb公司，慕尼 黑)和絲裂霉素 C(Mitomycin medac , klinische SpezialprSparate公司，韋德爾)。


下面按照附圖借助本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施形式來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，其 中圖1為蛋白質(zhì)印跡；圖2為治療機(jī)理示意圖；圖3為蛋白質(zhì)印跡；圖4為治療機(jī)理示意圖；圖5為治療機(jī)理示意圖；圖6為腫瘤生長和放射后的腫瘤重現(xiàn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 在永生化的胎鼠成纖維細(xì)胞中，使PINCH-I編碼基因沉默。制備轉(zhuǎn)基因老鼠的標(biāo) 準(zhǔn)方法例如在專利W0/1999/036528中已作闡述。通過使PINCH-I基因沉默，大大提高了細(xì)胞對(duì)X射線治療或細(xì)胞抑制劑的敏感性， 也就是說與表達(dá)PINCH-I擔(dān)保的對(duì)照組細(xì)胞相比，這些細(xì)胞在用放射療法或化學(xué)療法治療 后的存活率明顯降低。將細(xì)胞放入二維或三維培養(yǎng)模型，用X射線(200kV，13mA， 1，3 Gy/ min，O-IOGy)或濃度O-lOumol/1的細(xì)胞抑制劑順鉬(Platinex )或絲裂霉素C (Mitomycin medac ) (1小時(shí)或24小時(shí))進(jìn)行治療。測量細(xì)胞群落存活率，也就是經(jīng)過治療細(xì)胞的完 整性。將增長的細(xì)胞群落固定并染色，用顯微鏡測定群落數(shù)量。圖1展示了一個(gè)蛋白質(zhì)印跡，表明在PINCH-I編碼基因已經(jīng)沉默的老鼠細(xì)胞中沒 有形成PINCH-I蛋白(圖右)，與之相反，在對(duì)照組細(xì)胞中有PINCH-I蛋白(圖左)。圖2展示了在二維(圖2a、b、c)或三維(圖2d)培養(yǎng)模型中用放射治療或者細(xì)胞 抑制劑順鉬(圖2b)、絲裂霉素C(圖2c)治療后，PINCH-I編碼基因已經(jīng)沉默的老鼠細(xì)胞的 群落存活率，以及野生型對(duì)照組細(xì)胞的群落存活率。實(shí)施例2 將HCT-116 (ATCC 編號(hào) CCL-247)和 DLD-I (ATCC 編號(hào) CCL-221)類型的人體結(jié)腸 直腸細(xì)胞株用SEQ ID No. 5的PINCH-1-siRNA轉(zhuǎn)染。為此，各自將3x105個(gè)腫瘤細(xì)胞放 到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(BD公司，海德堡)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，卡爾斯魯厄)中，播散Glutamax-I (丙氨酰谷氨酰胺)、10%的血清(FCS ；Biochrom公司，柏林)和的非必需氨 基酸(Gibco公司，卡爾斯魯厄)，然后在溫度37°C、C02濃度7%的條件下培養(yǎng)。在24小時(shí) 后，用Opti-MEM I (Invitrogen公司，卡爾斯魯厄)洗滌這些細(xì)胞，然后用Oligofectamine 試劑(0. 2% )和20nmol/lPINCH-l-siRNA在無血清的條件下在Opti-MEM I中轉(zhuǎn)染8小時(shí)。 接著加入10%的血清，將細(xì)胞在溫度37°C、C02濃度7%的條件下繼續(xù)孵育16小時(shí)。在轉(zhuǎn)染 24小時(shí)后，用PBS磷酸鹽緩沖液(PBS ；PAA, Colbe )洗滌這些細(xì)胞，然后用胰蛋白酶/EDTA 溶液溶解。一部分細(xì)胞用于測定放射治療后的細(xì)胞群落存活率(細(xì)胞群落生成率試驗(yàn))， 另一部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。為了檢測蛋白質(zhì)印跡中的敲除效果，由這個(gè)餾分生成蛋白 裂解液，用SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)染到一個(gè)硝酸纖維膜上，用鼠抗PINCH-I蛋白抗體(Klon 49 ;BDHeidelberg)、連接過氧化酶的山羊抗鼠第二抗體和ECL系統(tǒng)(GE Healthcare，慕尼 黑)進(jìn)行檢測。如圖3所示，蛋白質(zhì)印跡表明成功地通過靶向siRNA序列阻止了 PINCH-I蛋 白的形成。用非靶向的對(duì)照組SiRNA(Co)或者只用轉(zhuǎn)染試劑(Oligo，Oligofectamin)治療 這些細(xì)胞，PINCH-I蛋白的表達(dá)沒有任何變化。圖4表明，用PINCH-1-siRNA治療過的腫瘤 細(xì)胞在放射治療后的存活率比帶有對(duì)照組siRNA(Co或C0 siRNA)的腫瘤細(xì)胞低得多。用 20nmol/l的濃度轉(zhuǎn)染siRNA，在48小時(shí)后用0_6Gy的劑量照射這些細(xì)胞。實(shí)施例3 通過用靶向PINCH-I抗體鎖定PINCH-I蛋白，可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射或化學(xué) 療法的敏感性。為了測定用PINCH-I抗體治療后的單基因存活率，將腫瘤細(xì)胞放到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(BD公司，海德堡)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，卡爾斯魯厄)中，播散 Glutamax-I (丙氨酰谷氨酰胺)、10%的血清(FCS ；Biochrom公司，柏林)和的非必需 氨基酸(Gibco公司，卡爾斯魯厄)。在37°C和C02濃度7%的條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，加 入50ug/ml PINCH-I抗體或者非靶向?qū)φ战M抗體(Santa Cruz公司，海德堡)，然后繼續(xù)孵 育24小時(shí)。然后用240kV的X射線進(jìn)行照射(Yxlon Y. TU 320，Yxlon，哥本哈根，丹麥； 20mA， 1. 3Gy/min)。在播散8天后，將這些細(xì)胞用80%的乙醇固定30分鐘，用考馬斯亮 藍(lán)溶液染色，然后對(duì)具有超過50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群落進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖5展示了人體結(jié)腸直腸細(xì)胞株(HCT-116，DLD-1)的存活率，這些細(xì)胞株在 放射治療(O 或 4Gy)前 24 小時(shí)用 PINCH-I 抗體(Klon PINCH-C58 (Sigma P8896)、Klon PINCH-N173 (Sigma P9371)、Κ1οη 49 (Beckton-Dickinson 目錄編號(hào) 612711)或者非靴向?qū)?照組抗體(Co)進(jìn)行了處理。用靶向PINCH-I抗體處理過的腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性 比對(duì)照組腫瘤細(xì)胞大大提高。實(shí)施例4 為了檢驗(yàn) Pinch 1 fl/fl (Pinch 1 floxed/floxed)相對(duì)于 Pinchl-/-腫瘤細(xì)胞 在活體內(nèi)的放射敏感性，在免疫抑制NMRI (nu/nu)小鼠身上植入同種異體腫瘤。這些腫瘤 細(xì)胞的特征是對(duì)放射的反應(yīng)、生長率、增殖、氧氣供應(yīng)(Hypoxie)、血管對(duì)其的供應(yīng)以及供 血。通過腫瘤體積以及直到局部重現(xiàn)治療的時(shí)間測定腫瘤對(duì)放射的反應(yīng)。為此，將7至14周大的雄性和雌性免疫抑制NMRI (基因型nu/nu ；沒有胸腺和毛 發(fā))小鼠(德累斯頓大學(xué)醫(yī)學(xué)系實(shí)驗(yàn)中心)在移植腫瘤的1到5天前，采用全身照射(1x4 Gy,200kV X射線，0. 5mm銅濾鏡，lGy/min))方法繼續(xù)進(jìn)行免疫抑制處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房12小 時(shí)有燈光照明，12小時(shí)無照明(燈光在每天早上7點(diǎn)鐘打開)，溫度恒定保持在26°C，相對(duì)
8空氣濕度50-60%。用一種市面上常見的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物食譜和水喂養(yǎng)這些實(shí)驗(yàn)鼠。為了在活 體內(nèi)產(chǎn)生同種異體腫瘤，將免疫抑制的Pinchl-/-和Pinch 1 fl/fl胎鼠成纖維細(xì)胞從皮 下植入受體實(shí)驗(yàn)鼠的雙肩部位。在形成可以用觸覺感知到的腫塊之后，將腫瘤切開，從皮下 移植到一組實(shí)驗(yàn)鼠身上。從這些實(shí)驗(yàn)鼠中，將增長率達(dá)到平均值的腫瘤切開，分割成Imm大 小的小塊，加入介質(zhì)，為了接下來的試驗(yàn)將其保存在液態(tài)氮中。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，將得到的腫瘤小塊移植到5只實(shí)驗(yàn)鼠的后背(第一階段)。在形成了直 徑10到15mm的腫瘤后，將增長率達(dá)到平均值的腫瘤切開，分割成Imm大小的小塊，移植到 另外10只實(shí)驗(yàn)鼠的后背(第二和第三階段)。在實(shí)驗(yàn)過程中，將增長率達(dá)到平均值的第二 和第三階段腫瘤切開，分割成Imm大小的小塊，從皮下移植到右側(cè)后腿。切開的腫瘤特點(diǎn)是 隔絕了 DNA或蛋白。用PRC儀檢測在Pinchl-/-腫瘤中的Pinch 1敲除效果，以及在Pinch 1 fl/fl細(xì)胞中的Pinch 1 floxed序列。通過蛋白質(zhì)印跡檢測PINCH 1蛋白的表達(dá)。用200kV X射線(0. 5mm銅濾鏡，放射劑量IGy/min，放射儀Seifert)對(duì)右側(cè)后腿 實(shí)施局部照射。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到0. 10到0. 32cm3后，隨機(jī)地將每四只實(shí)驗(yàn)鼠分為一組，用不 同的劑量進(jìn)行照射。將實(shí)驗(yàn)鼠麻醉(腹腔內(nèi)注射120mg氯胺酮(腹腔內(nèi))/kg體重和16mg 甲苯噻嗪/kg體重)，將有腫瘤大腿的血管夾住從而抑制血流，在2分鐘后分別進(jìn)行26、32、 38、44、50、56或62Gy劑量的照射。Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-腫瘤平均地分配在不同的 劑量組中。用游標(biāo)卡尺每星期測量腫瘤直徑兩次。用球體體積計(jì)算公式(η /6ab2)計(jì)算腫瘤 的體積，其中a是最長的腫瘤軸，b是較短的、與其呈直角的腫瘤軸。從每個(gè)腫瘤的生長曲 線中，測定未經(jīng)照射和經(jīng)過照射的Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-腫瘤生長時(shí)間，也就是實(shí)驗(yàn) 開始后腫瘤體積達(dá)到初始體積2倍(TGTV2)或5倍(TGTys)所需的時(shí)間。用Marm-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)(GraphPad Prism軟件4. 03版)比較Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-腫瘤的生 長時(shí)間平均值。腫瘤體積的測量一直持續(xù)到腫瘤體積達(dá)到大約1.5cm3為止。如果腫瘤體 積通過連續(xù)三次測量發(fā)現(xiàn)達(dá)到最低點(diǎn)后重新升高，則測定腫瘤在放射后重新的頻率。對(duì)85Pinch 1 fl/fl和99 Pinchl-/-腫瘤的局部控制效果進(jìn)行評(píng)估。在有Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-腫瘤的實(shí)驗(yàn)鼠身上，在照射的210天后測定所有重新出現(xiàn)的腫瘤。結(jié) 果表明，所有照射劑量為38Gy的Pinchl-/-腫瘤被控制在局部。對(duì)于Pinch 1 fl/fl腫瘤 而言，無論使用哪種劑量的射線都沒有出現(xiàn)具備控制效果。根據(jù)Kaplan-Meier方法可以從 數(shù)學(xué)角度預(yù)估到局部重新出現(xiàn)腫瘤時(shí)的時(shí)間，然后用Log rank測試(GraphPad Prism軟件 4. 03版)進(jìn)行比較。用逐漸增大的X射線劑量(26_62Gy)照射腫瘤，在210天后進(jìn)行觀察。與活體內(nèi) 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，Pinchl-/-同種異體與Pinch 1 fl/fl同種異體相比具有更高的放射敏 感性，無論是細(xì)胞生長的延遲還是不重現(xiàn)新腫瘤的腫瘤存活現(xiàn)象都說明了這一點(diǎn)。圖6a表 明了在接受放射后的腫瘤體積，圖6b是Kaplan-Meier分析，也就是對(duì)于免疫抑制實(shí)驗(yàn)鼠的 皮下增長Pinchl fl/fl和1-/-同種異體腫瘤而言，不重現(xiàn)新腫瘤的腫瘤存活現(xiàn)象。對(duì)于 腫瘤體積(圖6a)而言，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都表示10到18只實(shí)驗(yàn)鼠的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。關(guān)于 非放射性標(biāo)記物BrdU、血管形成、氧氣供應(yīng)和壞死現(xiàn)象(用免疫組化方法進(jìn)行檢測；數(shù)據(jù)在 此不顯示)無法測出Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-腫瘤之間有明顯區(qū)別。PINCH-I對(duì)于接 受照射時(shí)的細(xì)胞存活率有決定性影響，與細(xì)胞外基質(zhì)、生長條件在活體外還是在活體內(nèi)以在的微環(huán)境無關(guān)。
權(quán)利要求
使用可以鎖定或限制PINCH 1蛋白功能的物質(zhì)，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射和/或化學(xué)療法的敏感性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)，其特征是，這種物質(zhì)是PINCH-I抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的物質(zhì)，其特征是，PINCH-I抗體是名為KlonPINCH-C58的 IgGl 同型鼠抗單克隆 PINCH-I 蛋白抗體(Sigma-Aldrich，DE)、名為 Klon PINCH-N173 的 IgM同型鼠抗單克隆PINCH-I蛋白抗體(Sigma-Aldrich，DE)和名為Klon 49的IgG2a同 型鼠抗單克隆PINCH蛋白抗體(Becton Dickinson，DE)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)，其特征是，這種物質(zhì)可以抑制PINCH-I基因的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)，其特征是，這種物質(zhì)可以在轉(zhuǎn)錄后抑制PINCH-I基因的 表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)，其特征是，這種物質(zhì)是PINCH-1-siRNA，并且siRNA既可以由a.一個(gè)由一個(gè)與人體PINCH-l-cDNA(SEQ ID No. 1)序列相同的單鏈組成，或者b.由一個(gè)RNA雙鏈組成，其中一鏈與PINCH-I基因(SEQID No. 1)的部分序列相同，另一鏈與第一鏈互補(bǔ)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)，其特征是，從SEQID No. 2、SEQ IDNo. 3、SEQ ID No. 4 和/或SEQ ID No. 5的序列中選擇使用PINCH-1-siRNA。
全文摘要
本發(fā)明指的是使用提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法和/或化學(xué)療法敏感性的物質(zhì)。這是通過使用可以鎖定或限制PINCH-1蛋白功能的物質(zhì)，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法和/或化學(xué)療法的敏感性而實(shí)現(xiàn)的。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101970495SQ200980105841
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者尤里克·科赫, 尼爾斯·科德斯, 維特·桑德福特, 艾麗絲·艾科, 邁克爾·鮑曼 申請(qǐng)人:德累斯頓工業(yè)大學(xué)