專利名稱：在液體培養(yǎng)基中通過凝集實時檢測微生物的方法
在液體培養(yǎng)基中通過凝集實時檢測微生物的方法發(fā)明領(lǐng)域是臨床或工業(yè)微生物學(xué)檢測領(lǐng)域。更特別地，其涉及通過與富集樣品中 的微生物同時進行的凝集反應(yīng)鑒別一或多種微生物的方法。微生物學(xué)分析需要精確技術(shù)，其中獲得結(jié)果的時間應(yīng)該盡可能短在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，需要預(yù)測和診斷感染風(fēng)險診斷越快及越精確，患者治療越有效及傳 播風(fēng)險越低。該方法對于動物健康是類似的。在食品加工領(lǐng)域，規(guī)范是相同的。但是這些規(guī)范區(qū)分病原微生物及其毒素，這種研 究適用于上市產(chǎn)品，非病原微生物，其沿生產(chǎn)線從初級產(chǎn)品至最終產(chǎn)品用作生產(chǎn)方法的質(zhì) 量指標(biāo)，及技術(shù)上如發(fā)酵感興趣的細菌。推測的污染物的快速精確檢測使得可以測試它們 并且因此啟動正確的措施。技術(shù)上，微生物學(xué)分析可以實施一或多個階段的預(yù)富集/富集 (pr6-enrichissement/enrichissement)，一或多個階段的檢測，一或多個階段的微生物計 數(shù)。對于特殊應(yīng)用如食品加工微生物學(xué)測試，也可能需要證實階段，以符合該領(lǐng)域中的強制 標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)富集/富集階段需要本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的選擇性或非選擇性培養(yǎng)基?；诔?規(guī)培養(yǎng)基配方的經(jīng)常為液體形式的現(xiàn)成使用的培養(yǎng)基是商業(yè)可獲得的。檢測階段基于證實待檢微生物的代謝特征。常規(guī)使用特異的酶底物。這些酶底 物通常由兩部分組成，第一部分特異于待揭示的酶活性，也稱為靶部分，第二部分作用為 標(biāo)記，也稱作標(biāo)記部分，通常由生色團或熒光團組成。通過選擇這些底物，根據(jù)是否有反 應(yīng)，可以鑒定微生物性質(zhì)或者區(qū)分各種微生物群。因此，顏色或熒光的出現(xiàn)或消失將是微 生物屬或類型的特征。關(guān)于這一點，使用生色培養(yǎng)基使得能同時檢測和鑒別待檢微生物。 其簡化了方法并且大大降低了獲得結(jié)果所需的時間。具體舉例可以提及的是申請人的 ChromID⑧培養(yǎng)基。這些生色培養(yǎng)基基于檢測特異于待檢微生物的代謝特征，例如大腸桿菌 (Escherichia coli)的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。但是，一些微生物或者一些亞型例如大 腸桿菌0157:Η7不顯示任何特異酶活性，因此不能用生色培養(yǎng)基檢測。證實階段部分更特別與食品加工領(lǐng)域的微生物學(xué)分析相關(guān)。具體地，當(dāng)先前開發(fā) 方法的結(jié)果是陽性時，需要證實存在待檢病原體。這意味著需要額外測試及使用不同于第 一次分析中使用的檢測原理?；诖龣z微生物的基因組特征的分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)成了用 于證實所述鑒別的一種手段。例如，可提及的是常規(guī)擴增技術(shù)如PCR(聚合酶鏈反應(yīng))和 NASBA(基于核酸序列的擴增)，它們可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實時檢測技術(shù)結(jié)合。免疫測定構(gòu)成另一種用于證實測試的技術(shù)。它們利用待檢微生物的免疫原性特 征。非限制性例子為競爭或夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)技術(shù)或者免疫凝集技術(shù)，檢測 待檢微生物的表位。后一方法利用功能化固體支持物如用單克隆抗體或多克隆抗體包被的 珠(例如膠乳顆粒)，所述功能化支持物與生物學(xué)樣品接觸，如授權(quán)的歐洲專利EP 0 701 624及EP 1 199567所述?；蛘撸鐚＠鸘S-4，659，658所述，固體顆粒可以用與位于給定微 生物表面上的糖特異結(jié)合的凝集素包被。在任何情況下，凝集的出現(xiàn)使得可以明確鑒別待 檢微生物。
樣品中微生物的完整精確鑒別因此需要若干步驟順序富集、檢測、證實。日常使 用的測試的標(biāo)準(zhǔn)化已能使檢測方法自動化，但是其進行起來還是很慢。現(xiàn)有技術(shù)的一個缺 點是事實上這些步驟依次進行。另一個缺點是用于證實步驟的特異相互作用反應(yīng)，其是免 疫學(xué)反應(yīng)或者分子雜交反應(yīng)，通常在“終點”讀取。在這期間，在食品加工業(yè)，終產(chǎn)品的完整 批次被阻斷而等待證實結(jié)果，在臨床時期，相關(guān)抗生素治療和預(yù)防措施的建立被延遲。考慮到現(xiàn)有技術(shù)，因此缺少組合了富集、檢測和精確鑒別步驟的方法。具體地，這 種方法能將快速、特異性和靈敏性組合在一起。本發(fā)明因此通過在液體培養(yǎng)基中同時使用微生物培養(yǎng)物和至少一種凝集反應(yīng)而 克服了上述缺點更具體地，本發(fā)明首先涉及檢測和鑒別可能存在于樣品中的至少一種微生物的方 法，包括步驟a)在容器中將能生長和/或檢測微生物的培養(yǎng)基、所述樣品及敏化固體支持物接 觸；b)將所述全部物質(zhì)置于促進微生物的生長和/或檢測的溫度；及c)當(dāng)步驟b)已完成時，實時觀察凝集的出現(xiàn)，其中當(dāng)在所述培養(yǎng)基中檢測所述微 生物時所述凝集的出現(xiàn)指示所述微生物的存在或者證實所述存在。本發(fā)明的另一個主題涉及檢測和鑒別可能存在于樣品中的至少一種微生物的方 法，包括步驟a)在容器中將能生長和/或鑒別微生物的培養(yǎng)基、所述樣品及敏化固體支持物接 觸；b)將所述全部物質(zhì)置于促進微生物生長和/或鑒別的溫度；及c)當(dāng)步驟b)已完成時，實時觀察凝集的出現(xiàn)，其中當(dāng)在所述培養(yǎng)基中鑒別所述微 生物時所述凝集的出現(xiàn)使得能鑒別所述微生物或者證實所述鑒別。另外，本發(fā)明涉及檢測和鑒別可能存在于樣品中的至少一種微生物的方法，包括 步驟a)在容器中將能生長和鑒別微生物的培養(yǎng)基、所述樣品及敏化固體支持物接觸；b)將所述全部物質(zhì)置于促進微生物生長和鑒別的溫度；及c)當(dāng)步驟b)完成時，實時觀察凝集的出現(xiàn)，從而能補充進行的微生物鑒別。術(shù)語“補充鑒別，，是指提供額外信息，使得能詳述微生物的鑒別。例如，在步驟a) 中，使用的培養(yǎng)基可以是特異于大腸桿菌屬的細菌，并且可以包含特異于這一細菌屬的底 物，從而這種細菌在測試樣品中的存在由培養(yǎng)基的修飾而鑒定，例如如果使用的底物是生 色底物，則顏色變化。步驟c)中觀察到的凝集可以例如使得能夠證實大腸桿菌屬的特定菌 株，如大腸桿菌0157:H7，其是腸道致病菌。促進微生物生長的溫度在20和44°C之間，樣品保持在這個溫度一段足以實現(xiàn)微 生物檢測的時間，即在6和96小時之間的一段時間。這些不同技術(shù)在單個容器中的組合應(yīng)用使得可以節(jié)約時間及限制操作，因此限制 操作人或樣品的污染，后者導(dǎo)致假陽性。另外，可以自動化進行本發(fā)明。還注意到節(jié)約的時 間歸因于將兩個步驟并成一個步驟及實時檢測凝集而不再是如上述證實技術(shù)在終點時檢 測。
有利地，上述方法的步驟a)和C)使用生色化合物(也稱為生色團)或熒光化合 物(也稱為熒光團)。更特別地，檢測和鑒別兩種方法可以優(yōu)選使用著色或者熒光的出現(xiàn)或者消失。另 外，在本發(fā)明的所有方法中，凝集可以有利地通過著色或者熒光的出現(xiàn)或者消失證實優(yōu)選地，容器選自微量培養(yǎng)板、microcupule、微管、毛細管或者多孔卡(cartes multipuits)組成的組中。有利地，本發(fā)明方法還可以包括計數(shù)微生物的步驟，優(yōu)選根據(jù)申請人專利EP 1 105 457中解釋的最可能數(shù)方法進行。根據(jù)一個特定實施方案，步驟C)進行的凝集反應(yīng)是免疫凝集反應(yīng)，證實抗原_抗 體反應(yīng)。根據(jù)另一個特定實施方案，步驟C)進行的凝集反應(yīng)是噬菌體_細菌反應(yīng)。更特定 地，其是特異于細菌類型的噬菌體的重組蛋白和相應(yīng)細菌分子之間的反應(yīng)。這種相互作用 在專利EP 1 198 713中描述。根據(jù)另一個特定實施方案，步驟C)中進行的凝集反應(yīng)是配體/抗配體反應(yīng)。根據(jù)另一個特定實施方案，上述任一實施方案的步驟C)中進行的凝集反應(yīng)的實 時檢測可以檢測凝集出現(xiàn)之前的沉降。另外，本發(fā)明的一個主題是用于進行上述各種實施方案的方法的診斷試劑盒。所 述試劑盒包括-容器；-選擇性或非選擇性培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基任選含有特異于待檢測微生物屬或物種 的代謝的底物；及-敏化固體支持物。有利地，所述容器選自微量培養(yǎng)板、microcupule、微管、毛細管或者多孔卡組成的 組中。根據(jù)第一個優(yōu)選的實施方案，敏化支持物是固體支持物-抗原復(fù)合物或者固體支 持物-抗體復(fù)合物。根據(jù)第二個優(yōu)選的實施方案，所述敏化支持物是固體支持物_配體復(fù)合物或者固 體支持物_抗配體復(fù)合物。所述配體可以包含噬菌體的全部或部分。本發(fā)明的診斷試劑盒還可以包含至少一種生色或者熒光化合物。最后，本發(fā)明最后的主題涉及本發(fā)明的診斷試劑盒用于檢測和/或鑒別可能存在 于樣品中的至少一種微生物的應(yīng)用。本發(fā)明通過閱讀詳細描述和下述非限制性實施例和附圖而更清楚理解，其中-

圖1代表用于在保溫前鑒別乳腺炎/乳房炎的細菌起源的測試條。-圖2代表保溫后的測試條，對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)反應(yīng)陽 性。-圖3代表保溫后的測試條，對鏈球菌(Str印tococcusspp.)反應(yīng)陽性。-圖4代表保溫后的測試條，對大腸桿菌反應(yīng)陽性。-圖5代表保溫后的測試條，對克雷伯氏菌(Klebsiellaspp.)反應(yīng)陽性。本發(fā)明所述方法可以用于食品、環(huán)境或者臨床來源的樣品。樣品被定義為分離自用于分析的實體的小部分或少量食品來源的樣品可提及的非限制性的是奶制品(酸奶、奶酪等)樣品、肉樣品、魚 樣品、蛋樣品、水果樣品、蔬菜樣品、水樣品或飲料(牛奶、果汁、蘇打水等)樣品。這些食品 來源的樣品還可以來自制成的菜肴或沙司。最后，食品樣品可衍生自動物飼料，如特別是動 物膳食。還可以提及環(huán)境相關(guān)樣品，如取自表面、取自水或取自空氣的樣品。臨床來源的樣品可以相應(yīng)于取得的生物學(xué)液體(全血、血清、血漿、尿、腦脊液)樣 品，取得的糞便樣品，取自鼻、咽喉、皮膚、傷口、器官、組織或者分離的細胞等的樣品。微生物學(xué)測試相應(yīng)于分析樣品，目的在于分離和/或鑒別和/或計數(shù)潛在存在的 微生物，如細菌或酵母。技術(shù)上，這種分析包括在培養(yǎng)基中體外生長微生物。術(shù)語“培養(yǎng)基” 是指包含微生物存活和/或生長必需的所有組分的介質(zhì)。培養(yǎng)基可以含有任選的添加劑， 例如胨、一或多種生長因子、碳水化合物、一或多種選擇劑、緩沖劑、一或多種膠凝劑等。這 種培養(yǎng)基可以是即用的液體或凝膠形式，即準(zhǔn)備用于接種試管或燒瓶或培養(yǎng)皿。為本發(fā)明目的，術(shù)語“微生物”包括革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌、酵母及更廣泛 地肉眼不可見的單細胞生物體，其可以在實驗室中操作和繁殖。通常，培養(yǎng)基可以額外含有用于通過直接或間接可檢測信號而檢測靶微生物的酶 活性或者代謝活性的底物。為直接檢測，這種底物可以與作為標(biāo)記的部分連接，標(biāo)記部分可 以是熒光的或生色的。對于間接檢測，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以額外包含PH指示劑，其對由底 物消耗誘導(dǎo)的PH變化敏感并揭示靶微生物的生長。所述pH指示劑可以是生色團或者熒光 團。作為生色團的例子，可以提及的是中性紅、苯胺藍和溴酚藍。熒光團包括例如4-甲基 傘形酮、氨基香豆素衍生物和試商靈衍生物。為本發(fā)明目的，應(yīng)該證實待檢微生物的鑒別，潛在地通過搜索其代謝特征而進行。 這種證實可以利用凝集反應(yīng)。術(shù)語“凝集”是指微生物與顆粒之間相互作用的結(jié)果，所述顆?？梢允翘烊粊碓吹?如免疫球蛋白M，或者是固體支持物類型的如聚合物。通過這種相互作用，微生物和顆粒聚 集，互相附著并形成網(wǎng)絡(luò)。所述網(wǎng)絡(luò)能沉降或者沉淀。微生物和顆粒之間的相互作用可以 導(dǎo)致預(yù)先沉降，實時觀測可以在網(wǎng)絡(luò)完全形成之前即可進行檢測。凝集反應(yīng)包括免疫學(xué)反 應(yīng)，如抗原-抗體反應(yīng)或者更一般地蛋白質(zhì)之間的特異相互作用。然后肉眼或者通過光學(xué) 系統(tǒng)自動化檢測由所述特異相互作用形成的網(wǎng)絡(luò)或者復(fù)合物。或者，可以確定形成的復(fù)合 物的量。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的進行凝集反應(yīng)的任何方法。固體支持物選自天然 材料、任選化學(xué)修飾的合成材料及特別選自膠乳，聚(氯乙烯)、聚乙烯、聚苯乙烯或者聚丙 烯酸酯類型的聚合物，及那些基于苯乙烯的共聚物。這種固體支持物可以是顆粒形式。術(shù)語“敏化支持物”是指所述固體支持物結(jié)合有功能化合物，包括抗原、抗體、全噬 菌體或者噬菌體蛋白質(zhì)。術(shù)語“抗原”是指能由其經(jīng)免疫應(yīng)答誘導(dǎo)合成的抗體識別的化合物。術(shù)語“抗體”包括多克隆或者單克隆抗體，由基因重組獲得的抗體及抗體片段。噬菌體是僅感染細菌的病毒；它們也被稱為細菌病毒。在凝集反應(yīng)中，使用它們的 蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)以高特異性和高靈敏性識別給定的細菌菌株或物種。
與固體支持物的結(jié)合可以相應(yīng)于直接或者間接固定化術(shù)語“直接固定化”是指 通過共價或者被動吸附的結(jié)合；直接固定化可以通過與所述固體支持物化學(xué)結(jié)合的配體進 行。術(shù)語“間接固定化”是指結(jié)合于抗原的配體、抗體或者噬菌體(更廣泛地，功能化合物) 和結(jié)合于固體支持物的抗配體或者互補配體之間的配體/抗配體相互作用配體/抗配體配對是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可以提及的是例如下述配對生物 素/鏈霉抗生物素蛋白，半抗原/抗體，抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素，多核苷酸/與 其互補的多核苷酸。馬來酐同聚物或者共聚物的水溶性衍生物如授權(quán)專利EP 0 561 722 中申請人開發(fā)的那些也可以用于固定化生物學(xué)分子。這些固體支持物可以以各種形式分布 于反應(yīng)中凍干的、在液體懸浮液中、以珠形式如以商標(biāo)BioBall 市售的那些等等。凝集 可以肉眼檢測或者通過自動化光學(xué)分析儀根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種原理檢測，可提 及的非限制性例子為(1)通過有色膠乳沉降檢測熒光的出現(xiàn)，所述膠乳吸收最初存在于培養(yǎng)基中的熒 光；(2)通過將有色膠乳顆粒與潛在有色基質(zhì)混合而檢測顏色變化；(3)通過熒光膠乳顆粒的凝集集中熒光，導(dǎo)致培養(yǎng)基中彌漫熒光消失；(4)通過沉降存在于培養(yǎng)基中的有色膠乳而消失顏色。可以使用的熒光團在以上提及并且包括4-甲基傘形酮、氨基香豆素衍生物或者 試鹵靈衍生物。以兩步描述的培養(yǎng)/鑒別及隨后在終點的凝集的操作根據(jù)本發(fā)明組合成一個單 步驟，被實時檢測的特異性凝集。舉例而言，可提及的是在食品來源的樣品中能鑒別單核細 胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)血清型4b 單核細胞增生利斯特氏菌的檢 測可以用含有一或多種特異于該細菌的代謝的底物的培養(yǎng)基進行，血清型4b的鑒別通過 實時檢測的凝集反應(yīng)而同時進行。在一個特定實施方案中，本發(fā)明可以在如微量培養(yǎng)板、microcupule、微管、毛細管 等容器中進行。有利地，本發(fā)明的方法可以與申請人開發(fā)的ΤΕΜΡΟι 型的自動化微生物學(xué)檢測裝 置組合，并且可以任選地能計數(shù)檢測的微生物。本發(fā)明的方法可以用試劑盒進行，所述試劑盒包括含有營養(yǎng)基、敏化顆粒及任 選地含有特異于待檢微生物的生色底物的反應(yīng)培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基重懸待分析樣品的等 份。有利地，進行本發(fā)明方法的試劑盒還可以含有微量培養(yǎng)板、微管、microcupule、毛細管、 VITEK 卡或者TEMPO 卡類型的固體容器。
實施例實施例1 通過組合表型及免疫學(xué)反應(yīng)對大腸桿菌spp和大腸桿菌0157雙重計數(shù)這個分析的目的是用申請人上市的ΤΕΜΡ0Ι 系統(tǒng)同時對大腸桿菌spp進行酶學(xué)計 數(shù)及對大腸桿菌0157進行免疫學(xué)計數(shù)。程序步驟1 用待分析樣品的等份重懸反應(yīng)培養(yǎng)基反應(yīng)培養(yǎng)基含有
-特異于大腸桿菌物種的酶底物4-甲基傘形基-β-D-葡糖苷酸(4-m6thylumbe Iliferyl-β -D-glucuronide) (Biosynth ref. M-5700)在 TO 在 50mg/l (可以在 0. lmg/1 和1000mg/l之間變化)無熒光；-膠乳顆粒(Oxoi'd，ref.DR0620M)，藍色，用特異于大腸桿菌0157的抗體敏化， 干提取物(可以在0. 和10%之間變化)；-營養(yǎng)基濃度為10g/l的胨；-抑制劑系統(tǒng)濃度為1.5g/l的膽汁鹽重懸于樣品(例如4ml干線供水)中的反應(yīng)培養(yǎng)基然后加入TEMPO 卡中以進行 計數(shù)。在卡保溫之前，后者的孔是藍色并且無熒光。步驟2:卡的保溫TEMPO⑧卡然后在37°C保溫24小時。在保溫期間，當(dāng)靶細菌存在于TEMPO 卡的 孔中時，用抗大腸桿菌0157抗體敏化的顆粒的凝集反應(yīng)及酶反應(yīng)(大腸桿菌特異性底物的 降解)與細菌生長同時發(fā)生。步驟3 保溫24小時后讀取測試大腸桿菌0157陽性反應(yīng)形成抗大腸桿菌0157抗體/大腸桿菌0157細胞復(fù)合 物，導(dǎo)致膠乳顆粒凝集，結(jié)果在有關(guān)孔底部形成藍色沉淀之后藍色著色消失。大腸桿菌spp陽性反應(yīng)在大腸桿菌spp降解底物后在陽性孔中出現(xiàn)熒光(釋放 熒光4-甲基傘形酮分子)。大腸桿菌spp陽性且大腸桿菌0157陰性的孔熒光并且藍色。大腸桿菌spp及大腸桿菌0157均陽性的孔熒光并且無色(+孔底部藍色沉淀)大腸桿菌spp及大腸桿菌0157均陰性的孔無熒光并且藍色。然后計數(shù)大腸桿菌0157及大腸桿菌spp陽性孔以通過MPN表(內(nèi)部算法)計數(shù) 每克樣品的大腸桿菌0157和大腸桿菌spp的菌落形成單位(CFU)數(shù)。實施例2 乳牛/綿羊/山羊乳腺炎/乳房炎病例的細菌來源的鑒定，以便采取合 適有效的抗生素治療乳腺炎是由或多或少適于這種生物小區(qū)的細菌感染乳房導(dǎo)致的。若干細菌導(dǎo)致這 種類型的感染并且分為兩組乳腺reservoir細菌(例如金黃色葡萄球菌、鏈球菌)和環(huán)境 細菌(例如大腸桿菌，克雷伯氏菌)。測試原理在液體培養(yǎng)基懸浮液中通過敏化顆粒與靶細菌細胞(即金黃色葡萄球 菌、鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌)的凝集鑒定乳腺炎病例的細菌來源。程序步驟1 用待分析樣品(例如乳汁)的等份重懸反應(yīng)培養(yǎng)基測試呈條形式，包括4個含有反應(yīng)培養(yǎng)基的孔。反應(yīng)培養(yǎng)基組成如下-用特異于如下靶的噬菌體蛋白和/或抗體(Ab)敏化的藍色顆粒金黃色葡萄球 菌(孔1)、鏈球菌(孔2)、大腸桿菌(孔3)、克雷伯氏菌⑷；-營養(yǎng)基緩沖的胨水(Ref.bMx 51094)。每孔用500 μ 1樣品重懸。
保溫前條的最初狀態(tài)(不存在反應(yīng))條的所有孔均為藍色，鑒于凝集及抗靶敏化 的藍色顆粒在TO的沉降不存在(見圖1)。步驟2:條的保溫然后將條在37°C保溫4-16小時。在此保溫期間，在導(dǎo)致所研究的乳腺炎的靶細菌 污染孔的情況下，抗靶敏化的顆粒的凝集反應(yīng)與細菌生長同時發(fā)生。步驟3 在保溫4-16小時后讀取測試陽性反應(yīng)噬菌體蛋白/細菌或抗體/細菌抗原復(fù)合物的形成導(dǎo)致膠乳顆粒凝集 (在孔底部形成沉淀)，結(jié)果在所涉及孔中的藍色著色消失?？梢砸姷礁鞣N情況-在乳腺炎是由金黃色葡萄球菌所致情況中，藍色著色消失發(fā)生在孔1(見圖2)。-在乳腺炎是由鏈球菌所致情況中，藍色著色消失發(fā)生在孔2(見圖3)。-在乳腺炎是由大腸桿菌所致情況中，藍色著色消失發(fā)生在孔3(見圖4)。_在乳腺炎是由克雷伯氏菌所致情況中，藍色著色消失發(fā)生在孔4 (見圖5)。實施例3 在TEMPO⑧平臺上計數(shù)沙門氏菌這個分析的目的是用申請人上市的TEMPO 系統(tǒng)通過用重組噬菌體蛋白敏化的顆 粒的凝集而對沙門氏菌免疫學(xué)計數(shù)。稈序步驟1 抗沙門氏菌B Dl噬菌體蛋白的吸附這個步驟包括將噬菌體蛋白吸附在顆粒表面-參照抗-B-Dl噬菌體蛋白2.67mg/ml，-所用的膠乳，由Polymer Laboratories供應(yīng)Plain fluorescent yellow PL FY lot CD 222 :311nm噬菌體蛋白以140 μ g/ml濃度在20mM磷酸鹽緩沖液，pH7. 2中吸附。測試體積是 200 μ 1。膠乳顆粒以5mg/ml的比例導(dǎo)入培養(yǎng)基中。吸附使用旋轉(zhuǎn)輪振蕩進行15小時。吸附收率測試-離心50μ 1樣品并回收上清；-經(jīng)BCA蛋白質(zhì)測定法測定上清；-相對于標(biāo)準(zhǔn)曲線及相對于用于測試的噬菌體蛋白的最初濃度計算收率。這個收率是73%。顆粒大小在粒度儀上測量。PLFY膠乳是311nm，顆粒-噬菌體蛋白綴合物是315nm。步驟2 在TEMPO⑧卡中保溫反應(yīng)培養(yǎng)基含有-3. 5ml營養(yǎng)基濃度為10g/l的胨；-含有50CFU 的巴雷利沙門氏菌(Salmonella bareilly)06. 03. 927 IM1272 =C1 的
樣品-0. 5ml用0. 5%干提取物的沙門氏菌特異性噬菌體蛋白敏化的熒光膠乳顆粒。反應(yīng)培養(yǎng)基然后加入TEMPO⑧卡以進行計數(shù)。在卡保溫之前，后者的其孔是有熒光的。
TEMPO 卡然后在37°C保溫24小時。在保溫期間，當(dāng)靶細菌存在于TEMPO 卡的 孔中時，用抗B-Dl噬菌體蛋白敏化的顆粒的凝集反應(yīng)與細菌生長同時發(fā)生。步驟3 保溫24小時后讀取測試巴雷利沙門氏菌陽性反應(yīng)形成噬菌體蛋白/巴雷利沙門氏菌細胞復(fù)合物，導(dǎo)致 膠乳顆粒凝集和沉降。結(jié)果，觀測到熒光集中在有關(guān)孔底部并且閱讀窗熒光消失。陰性反應(yīng)熒光保持均勻在 整個孔中。然后計數(shù)陽性孔以通過MPN表(內(nèi)部算法)計數(shù)每克樣品的巴雷利沙門氏菌 06. 03. 927 IM1272 =C1的菌落形成單位(CFU)數(shù)。計數(shù)結(jié)果是llCFU/ml，即導(dǎo)入44CFU，符合理論50CFU。
權(quán)利要求
檢測可能存在于樣品中的至少一種微生物的方法，包括步驟a)在容器中將能生長和/或檢測微生物的培養(yǎng)基、所述樣品及敏化固體支持物接觸；b)將所述全部物質(zhì)置于促進微生物生長和/或檢測的溫度；及c)當(dāng)步驟b)完成時，實時觀察凝集的出現(xiàn)，其中當(dāng)在所述培養(yǎng)基中檢測所述微生物時所述凝集的出現(xiàn)指示所述微生物的存在或者證實所述存在。
2.檢測和鑒別可能存在于樣品中的至少一種微生物的方法，包括步驟 a)在容器中將能生長和/或鑒別微生物的培養(yǎng)基、所述樣品及敏化固體支持物接觸；b)將所述全部物質(zhì)置于促進微生物生長和/或鑒別的溫度；及c)當(dāng)步驟b)完成時，實時觀察凝集的出現(xiàn)，其中當(dāng)在所述培養(yǎng)基中鑒別所述微生物時 所述凝集的出現(xiàn)能鑒別所述微生物或者證實所述鑒別。
3.檢測和鑒別可能存在于樣品中的至少一種微生物的方法，包括步驟a)在容器中將能生長和鑒別微生物的培養(yǎng)基、所述樣品及敏化固體支持物接觸；b)將所述全部物質(zhì)置于促進微生物生長和鑒別的溫度；及c)在步驟b)完成時實時觀察凝集的出現(xiàn)，從而能補充進行的微生物鑒別。
4.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中在培養(yǎng)基中的檢測或者鑒別利用著色或熒光的出 現(xiàn)或消失。
5.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中凝集通過著色或熒光的出現(xiàn)或消失證實。
6.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述容器選自微量培養(yǎng)板、microcupule、微管、毛 細管或者多孔卡組成的組。
7.前述任一項權(quán)利要求的方法，還包括計數(shù)微生物的步驟。
8.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中凝集反應(yīng)通過抗原_抗體反應(yīng)進行。
9.權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中凝集反應(yīng)通過噬菌體-細菌蛋白反應(yīng)進行。
10.權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中凝集反應(yīng)通過配體/抗配體反應(yīng)進行。
11.用于進行前述任一項權(quán)利要求的方法的微生物學(xué)診斷試劑盒，包括-容器_選擇性或者非選擇性培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基任選含有特異于待檢測的微生物屬或物種 的代謝的底物；及-敏化固體支持物。
12.前述權(quán)利要求的診斷試劑盒，其中所述容器選自微量培養(yǎng)板、microcupule、微管、 毛細管或者多孔卡組成的組。
13.權(quán)利要求11或12的診斷試劑盒，其中所述敏化支持物是固體支持物-抗原復(fù)合物 或者固體支持物-抗體復(fù)合物。
14.權(quán)利要求11或12的診斷試劑盒，其中所述敏化支持物是固體支持物-配體復(fù)合物 或者固體支持物_抗配體復(fù)合物。
15.權(quán)利要求14的診斷試劑盒，其中所述配體包括噬菌體的全部或部分。
16.權(quán)利要求11-15任一項的診斷試劑盒，還包括至少一種生色或熒光化合物。
17.權(quán)利要求11-16任一項的診斷試劑盒用于檢測和/或鑒別可能存在于樣品中的至 少一種微生物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測可能存在于樣品中的至少一種微生物的方法，包括步驟a)在容器中將能生長和/或檢測微生物的培養(yǎng)基、所述樣品及敏化固體支持物接觸；b)將所述全部物質(zhì)置于促進微生物生長和/或檢測的溫度；及c)當(dāng)步驟b)完成時，實時觀察凝集的出現(xiàn)，其中當(dāng)在所述培養(yǎng)基中檢測所述微生物時所述凝集的出現(xiàn)指示所述微生物的存在或者證實所述存在。本發(fā)明還涉及檢測和鑒別可能存在于樣品中的至少一種靶微生物的方法。
文檔編號C12Q1/04GK101971032SQ200980109034
公開日2011年2月9日 申請日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者A·維蒙, B·科蘭, D·莫斯蒂科內(nèi), J-C·雷蒙, T·索菲亞 申請人:生物梅里埃公司