專利名稱：微陣列及設(shè)計陰性對照探針的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供有陰性對照探針的微陣列及設(shè)計陰性對照探針的方法。
背景技術(shù)：
用微陣列檢測中，應(yīng)建立用于評估背景信號水平的陰性對照探針(也通常被稱 為 NC 探針)(〃 Baio-Jikken Cho-Kihon Q&A" (Bio-Experimental Super-Fundamentals Q&A)，pp. 58-61，Yodosha)。通常，在建立NC探針時，選擇不可能與分析物交叉反應(yīng)的特定 核苷酸序列，然后固定于基體及用于評估背景信號水平。近些年，發(fā)現(xiàn)基因序列跨越廣泛的動物及植物中的種障礙而動態(tài)交換。例如，一定 可發(fā)生一部分微生物基因序列整合進植物基因。因此，由建立NC探針的常規(guī)方法得到的以 不可能與待檢測靶標(biāo)交叉反應(yīng)的特定核苷酸序列的理念設(shè)計的NC探針難以避免指示跨越 種障礙的基因序列交換的不期望的交叉反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供可更精確評估微陣列中的背景信號水平的手段。用于達到上述目的的手段是(1)用于核酸檢測的微陣列，其含 基體， 陰性對照探針組，其■被固定于基體的第一區(qū)域，及■提供有多個具有不同序列的第一探針，及 第二探針，其■被固定于基體的第二區(qū)域，及■含互補于靶核酸的序列，其中所述陰性對照探針組的第一探針的類型數(shù)是由所述陰性對照組與完全匹配 于所述陰性對照組所含的所述第一探針的一部分的核酸之間的反應(yīng)得到的雜交信號小于 閾值時的數(shù)；及(2)設(shè)計⑴的微陣列所含的陰性對照探針組的方法，其包括 通過允許相同分析物作用于具有多個第一探針的微陣列來重復(fù)測量雜交信號， 所述多個第一探針被施加于陰性對照組，所述陰性對照組被固定于分開的區(qū)域， 測定所測雜交信號中散布的最大值， 通過所述散布的最大值乘以安全因數(shù)來測定閾值，及 測定通過與完全匹配于所述陰性對照組所含的所述第一探針的一部分的核酸 反應(yīng)得到的雜交信號小于所述閾值時所述第一探針的濃度。本發(fā)明提供了可更精確評估微陣列中的背景信號水平的手段。


圖1是本發(fā)明的一個方面的模式圖。圖2是顯示本發(fā)明的原理的坐標(biāo)圖。圖3是顯示本發(fā)明的一個方面中得到的雜交信號的坐標(biāo)圖。
圖4是顯示本發(fā)明的一個方面的的視圖。實施方式本發(fā)明的微陣列基本上是用被固定于基體上的檢測探針固定區(qū)域的靶核酸檢測 探針來檢測靶核酸的裝置。此裝置是檢測靶核酸與具有互補于所述靶核酸的序列的靶核 酸檢測探針之間的雜交信號的裝置，由此測定所述靶核酸是否存在于含核酸分析物的樣品 中。本發(fā)明的微陣列不僅提供所述靶核酸檢測探針，還提供陰性對照探針組。所述陰性對 照探針組是用于檢測背景信號的探針組，且此組被固定于排列于已固定所述靶核酸檢測探 針的基體表面的陰性對照探針固定區(qū)域。本文中的術(shù)語〃微陣列〃同義于通常所用術(shù)語，例如〃核酸芯片〃、‘‘DNA芯 片〃及〃 DNA陣列〃，且彼此互換使用。用于本發(fā)明的基體可為本領(lǐng)域已知的任何類型的微陣列基體，例如電化學(xué)檢測型 (一般為電流檢測型)、熒光檢測型、化學(xué)發(fā)光型或放射性檢測型?？赏ㄟ^本身已知的任何方法制造任何類型的微陣列。電流檢測型微陣列的情況 中，例如，陰性對照探針固定區(qū)域及檢測探針固定區(qū)域可排列于不同電極。本文中的"雜交信號"是探針與其互補序列雜交后產(chǎn)生的信號，且總的指檢測為 電流值、熒光強度及發(fā)光強度的檢測信號，取決于微陣列檢測系統(tǒng)。陰性對照探針的核苷酸序列可為任何人工隨機合成的和/或選擇的核苷酸序列， 或者可為任何通常及自然存在的核苷酸序列。本發(fā)明的陰性對照探針可產(chǎn)生本身已知的任何方法通過或可從自然存在的核酸 制備。所述陰性對照探針可具有一些固定于期望基體必需的本身已知的修飾。本發(fā)明可提供測定試劑盒，其獨立提供有基體及陰性對照探針。此情況中，還可提 供檢測探針和/或固定劑的組合。根據(jù)本發(fā)明，即便在將經(jīng)歷突變或基因重組的核酸分析物用作樣品的情況中產(chǎn)生 不期望的交叉反應(yīng)，也可更精確評估背景信號水平。本文中的檢測探針可由本身已知的任何核酸構(gòu)成，或者也可具有本身已知的任何 特征。本發(fā)明的第一實施方式如圖1(a)所示，微陣列1提供有基體2 ；陰性對照探針組5，其具有多個第一探針 4a 4χ (χ :2或更大的整數(shù))，所述多個第一探針4a 4x具有被固定于陰性對照探針固定 區(qū)域3 (其為基體2的第一面上的第一區(qū)域)的不同序列；及第二探針7，其由被固定于檢 測探針固定區(qū)域6 (其為第二區(qū)域)的檢測探針構(gòu)成。所述第二探針7可為任何互補于靶核酸的序列，且可具有例如互補于預(yù)計存在于 樣品中的核酸分析物序列的序列。當(dāng)含核酸分析物的樣品與微陣列1反應(yīng)時，在樣品中的 靶核酸與所述第二探針7雜交處產(chǎn)生雜交信號。可通過檢測此雜交信號來實現(xiàn)用微陣列1 檢測。盡管圖1中的檢測探針固定區(qū)域6的數(shù)是1，多個檢測探針固定區(qū)域6還可排列為第三，第四及第五區(qū)域，如在常規(guī)微陣列中。此情況中，被固定于各區(qū)域的探針在檢測探針固定區(qū)域中可具有相同序列或不同序列。一方面，所述陰性對照探針組5被用于測量用各微陣列裝置的測量中的背景信 號。在固定于微陣列中的陰性對照固定區(qū)域3之后提供所述陰性對照探針組5。所述陰性 對照探針組5可通過固定于多個陰性對照探針固定區(qū)域3來提供。當(dāng)需要更精確測定背景信號水平時，被固定于陰性對照固定區(qū)域3的所述陰性對 照探針組5的總量期望等于被固定于所述檢測探針固定區(qū)域6的所述第二探針的量。本文 中的"等量"可為例如所述陰性對照探針的量相對于所述第二探針的量的比例為1/10或 以上 10倍或以下。但是，被固定于陰性對照固定區(qū)域3的所述陰性對照探針組5的總量可不等于被 固定于所述檢測探針固定區(qū)域6的所述第二探針的量，但可固定于預(yù)定比例之間。此情況 中的背景(或雜交)信號可通過獲自各探針固定區(qū)域的信號乘以合適的任意值(例如上述 預(yù)定比例的倒數(shù))來計算。例如，當(dāng)被固定于陰性對照固定區(qū)域3的所述陰性對照探針組5的總量相對于被 固定于所述檢測探針固定區(qū)域6的所述第二探針的量為1/2時，則(1)待與獲自所述檢測 探針固定區(qū)域6的雜交信號比較的背景信號可通過倍增獲自陰性對照固定區(qū)域3的信號來 計算?；蛘撸?2)獲自所述檢測探針固定區(qū)域6的雜交信號除以2，然后與獲自陰性對照固 定區(qū)域3的背景信號比較。所述陰性對照探針組5由具有彼此不同的核苷酸序列的多種類型的探針構(gòu)成。即 第一探針可為由探針4a 4x(x 是任意2或更大的整數(shù))構(gòu)成的探針組，且也可排列相同 類型的多個序列。優(yōu)選地，第一探針?biāo)奶结樀暮塑账嵝蛄谢旧喜煌诨パa于待檢測 靶核酸的序列。但是，本發(fā)明的陰性對照探針被設(shè)計為即便通過不期望的交叉反應(yīng)及施加 于所述陰性對照探針組產(chǎn)生具有互補于所述陰性對照探針組所含序列的序列的核酸，雜交 信號強度仍低于閾值。因此，所述陰性對照探針組所含的探針序列未必不同于核酸分析物 的互補鏈。即便構(gòu)成所述陰性對照探針組5的探針之一與具有與其完全匹配的核苷酸序列 的核酸雜交，以所述陰性對照探針組5作為整體未檢測到雜交信號。即所述陰性對照探針 組5被設(shè)計為低于閾值，用于區(qū)分有效信號強度與低于其的信號強度，即便所述陰性對照 探針組5所含的多種類型的探針之一和與其完全匹配的序列反應(yīng)?？赏ㄟ^增加所述陰性對照組5所含的探針類型來達到此類設(shè)計。從被固定于陰性 對照固定區(qū)域3的所述陰性對照探針組5的雜交信號(例如，電化學(xué)信號、熒光信號或化 學(xué)發(fā)光信號)中，所述陰性對照探針組中通過不期望的交叉反應(yīng)產(chǎn)生的雜交信號可通過適 宜增加存在于所述陰性對照探針固定區(qū)域3中的核苷酸序列類型來保持低。例如，由于探 針對照組所含的探針類型增加，不期望的雜交信號變得更低。這是由于一個陰性對照探針 固定區(qū)域3所含的一種類型的核苷酸序列的相對降低的濃度，即相對降低的一種類型的核 苷酸序列分子數(shù)。所述陰性對照探針可由此充當(dāng)確定背景。即圖1(b)顯示，當(dāng)所述陰性對 照探針組5所含的相同類型的多核苷酸探針量低于特定濃度時，即臨界濃度或臨界分子量 (在圖1(b)中的虛線箭標(biāo)左側(cè)的濃度)時，即便雜交了完全匹配的核酸分析物，雜交信號也 具有確定低值。因此，重要的是，相同類型的多核苷酸探針降低至所述濃度。通過此類設(shè)計，即便將完全匹配于樣品中所含的核酸的一部分的核苷酸序列用作第一探針，從核苷酸序列 的信號也不被檢測為雜交信號。因此，所述陰性對照探針組5作為整體可充當(dāng)所述陰性對 照探針。優(yōu)選所述陰性對照探針組所含的更大探針類型數(shù)。隨著其中所含的探針類型增 加，產(chǎn)生假陽性信號的概率可有利地降低。從下列描述中可知，所述陰性對照探針組所含的更大探針類型數(shù)是優(yōu)選的。參照圖2(a)。圖2(a)是顯示1種類型的探針和與其具有100%互補性的核酸在已 固定有由1種類型、2種類型、3種類型、4種類型及5種類型的探針構(gòu)成的陰性對照探 針組 的微陣列上反應(yīng)后的雜交信號檢測結(jié)果的坐標(biāo)圖。無關(guān)于構(gòu)成探針組的探針序列類型數(shù)， 作為整體的探針量或分子數(shù)相同。此坐標(biāo)圖中，被固定探針的類型數(shù)顯示在橫軸上，及檢測 的雜交信號顯示在縱軸上。如坐標(biāo)圖所示，隨著所述陰性對照探針組所含的探針類型數(shù)增 力口，雜交信號降低。5種類型的探針用于此坐標(biāo)圖，且各探針是含分別示于SEQ IDNO :1 5的任何多 核苷酸的探針。即一種類型的本文中的探針是含SEQ ID NO :1的多核苷酸的探針。2種類 型的本文中的探針是含SEQID NO 1的多核苷酸的探針及含SEQ ID NO 2的多核苷酸的探 針。3種類型的本文中的探針是含SEQ ID NO :1的多核苷酸的探針，含SEQ ID NO :2的多 核苷酸的探針及含SEQ ID NO :3的多核苷酸的探針。4種類型的本文中的探針是含SEQ ID NO 1的多核苷酸的探針，含SEQ ID NO 2的多核苷酸的探針，含SEQ ID NO 3的多核苷酸 的探針及含SEQ ID NO :4的多核苷酸的探針。5種類型的本文中的探針是含SEQ ID NO 1 的多核苷酸的探針，含SEQ ID NO :2的多核苷酸的探針，含SEQ ID NO :3的多核苷酸的探 針，含SEQ IDNO 4的多核苷酸的探針及含SEQ ID NO 5的多核苷酸的探針。SEQ ID NO :1 5的多核苷酸是源于人乳頭瘤病毒(圖中表示為〃 HPV"；下文中 也稱為"HPV")的多核苷酸。圖2(a)中的坐標(biāo)圖顯示分析結(jié)果，其中這些多核苷酸被固 定于電流檢測型微陣列，互補于SEQ ID NO :1的多核苷酸被用作分析物，及將產(chǎn)生的雜交信 號檢測為電流值。坐標(biāo)圖中，實心菱形顯示用濃度IO12拷貝/ml的分析物的電流值，實心正 方形顯示用5倍稀釋的樣品的電流值，及實心三角形顯示用10倍稀釋的樣品的電流值。圖2(b)是坐標(biāo)圖，其中上述數(shù)據(jù)不用探針類型顯示，而用所述陰性對照探針組所 含的一種類型的核酸濃度顯示。圖2(b)中的坐標(biāo)圖將一種類型的核酸濃度顯示在橫軸上， 及將雜交信號顯示在縱軸上。如所示圖2 (b)，雜交信號隨著濃度降低而降低。即可增加所述陰性對照探針組所 含的探針類型，以升高存在于其中的相同類型的探針濃度，由此降低待檢測的雜交信號。本 發(fā)明的陰性對照探針組采用此類原理，根據(jù)此原理，具有不同類型序列的探針含于所述陰 性對照探針組中，從而可使其檢測的雜交信號低于有效信號強度，即可使其信號低于預(yù)定 閾值。例如，說到被固定于相同陰性對照固定區(qū)域3的探針類型，待被固定于相同基體 的相同區(qū)域的探針類型可為例如3種類型或以上、4種類型或以上、5種類型或以上、6種類 型或以上、7種類型或以上、8種類型或以上、9種類型或以上、10種類型或以上、50種類型或 以上、或者100種類型或以上，優(yōu)選50種類型或以上或者60種類型或以上，更優(yōu)選100種 類型或以上及4n種類型或以下，其中η是探針中的堿基數(shù)。
一個陰性對照組所含的探針長度可相同或不同。但是，所述探針優(yōu)選具有與所述檢測探針相同的長度。不同類型探針濃度可相同或不同。參照圖3。圖3顯示由2種濃度的100%互補的靶核酸與作為被固定于電流檢測 型微陣列基體的陰性對照探針的 HPV18 (SEQ ID NO 1)、HPV33 (SEQ ID NO :2)、HPV58 (SEQ ID NO 3)及HPV68(SEQ ID NO 4)反應(yīng)得到的雜交信號(以電流值)的檢測結(jié)果。各探針 在純水中溶解至0. 05 μ M、0. 1 μ M、0. 5 μ M、1 μ Μ、2 μ M及3 μ M的濃度，及將各IOOnL產(chǎn)生的 探針溶液固定于電極。無關(guān)于被固定核酸的類型，雜交信號隨著濃度降低而降低。因此，所述陰性對照組所含的所述探針，即便具有完全匹配于核酸分析物的序列， 也可被固定為相同類型的待被固定于相同區(qū)域的探針，例如以ΙμΜ或以下，0.5 μΜ或以 下，優(yōu)選0. 1 μ M或以下或者0. 05 μ M或以下的濃度，為了使所得信號強度低于有效信號強 度，即低于特定閾值。所述陰性對照組的固定中，混合不同類型探針，例如由此，其中相同類 型的探針達到上述濃度，而被固定陰性對照探針總量濃度達到與所述第二探針相同的量， 以制備陰性對照探針組溶液，然后將其用于將所述探針固定在基體的陰性對照固定區(qū)域。 此類陰性對照探針組溶液也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，及可提供為例如含所述溶液的試劑盒。為使上述濃度可應(yīng)用，待被固定于相同基體的相同區(qū)域的不同核苷酸序列類型可 為例如3種類型或以上、4種類型或以上、5種類型或以上、6種類型或以上、7種類型或以 上、8種類型或以上、9種類型或以上、10種類型或以上、50種類型或以上、或者100種類型 或以上，優(yōu)選50種類型或以上或者60種類型或以上，更優(yōu)選100種類型或以上及4η種類 型或以下，其中η是探針中的堿基數(shù)。無關(guān)于微陣列檢測型，所述閾值可如下測定。即具有被固定于分開的區(qū)域的多種 類型的探針的微陣列與互補于各探針的相同分析物重復(fù)反應(yīng)，以測量雜交信號量。測定對 各探針重復(fù)測量的雜交信號量的所測值的散布范圍，及使散布的最大值乘以安全因數(shù)，由 此測定閾值。如此可測定任何檢測型的微陣列的閾值。為了產(chǎn)生低于所測閾值的雜交信號，可測定各探針濃度。然后，可混合各濃度的探 針，或為了達到各濃度，可混合所述探針，以形成所述陰性對照探針組。在非電流檢測型檢測模式的微陣列的情況中，靈敏性可隨所述模式而變化。此情 況中，閾值也是通過方法上述測定，及混合低于所述閾值的雜交信號必需的類型探針，以制 備陰性對照組?；蛘?，測定低于所述閾值的雜交信號必需的探針濃度作為臨界濃度，及混合 含多種類型的多核苷酸的探針，至低于所述臨界濃度的濃度，以形成基體上的陰性對照探 針組。本發(fā)明也提供設(shè)計所述陰性對照探針組的方法。所述方法的例子如下第一，相同 分析物用具有被固定于分開的區(qū)域的多種類型的探針的微陣列重復(fù)測量，以測定雜交信號 量測量中的散布范圍。然后，所測散布的最大值乘以安全因數(shù)(取決于測量手段)，以測定 閾值。然后，測定探針的濃度條件，以所述濃度條件，應(yīng)用其100%互補鏈后的雜交信號量低 于所述閾值。為了符合所述條件，選擇多種類型的探針濃度。如此，可設(shè)計所述陰性對照探 針組。此類設(shè)計方法可應(yīng)用于本身已知的任何檢測型微陣列上的陰性對照組。所述安全因 數(shù)是，相對于從理論值及實驗值測定的使用的上限的使用條件下數(shù)值的倍率。用微陣列的檢測結(jié)果可通過從獲自所述檢測探針固定區(qū)域的雜交信號減去獲自 陰性對照固定區(qū)域的雜交信號來計算。
本發(fā)明的第二實施方式再一實施方式中，如圖1(c)所示，微陣列11含基體12;第一探針14，其為被固定 于陰性對照探針固定區(qū)域13 (其為第一區(qū)域)的陰性對照探針；及第二探針17，其為被固 定于檢測探針固定區(qū)域16 (其為第二區(qū)域)的檢測探針。類似于第一實施方式中的第二探針，所述第二探針17具有互補于靶核酸的序列， 例如，預(yù)計存在于分析物中的互補于核酸分析物的序列。當(dāng)分析物與微陣列11反應(yīng)后，含 核酸的分析物中的靶核酸與所述第二探針17雜交，產(chǎn)生雜交信號。通過檢測此雜交信號， 實現(xiàn)用微陣列11的檢測。所得數(shù)據(jù)經(jīng)從所得數(shù)據(jù)減去雜交信號(獲自所述陰性對照探針 的背景)的加工。盡管圖1(c)中僅顯示1個檢測探針固定區(qū)域16，但可排列多個檢測探針 固定區(qū)域16，如在常規(guī)微陣列中，及被固定其上的檢測探針可在各區(qū)域具有相同序列或不 同序列。如上所 述，第一探針14(其為陰性對照探針)被用于測定用各微陣列裝置的測量 中的背景。在固定于微陣列的陰性對照探針固定區(qū)域13之后提供所述陰性對照探針14。所述陰性對照探針14是具有核苷酸15的多核苷酸，所述核苷酸15具有經(jīng)修飾堿基。本文中的"經(jīng)修飾堿基"指具有不導(dǎo)致與構(gòu)成核苷酸的堿基部分核苷酸序列特 異性雜交的修飾的堿基。此類經(jīng)修飾堿基包括但不限于2'-脫氧肌苷及2'-脫氧水粉 蕈素。通過使用經(jīng)修飾堿基，從所含完全匹配的核苷酸序列交叉反應(yīng)的信號不被檢測為雜 交信號，因此，所述陰性對照探針可履行其作用。被固定于相同陰性對照固定區(qū)域13的所述陰性對照探針可為由多種類型的核苷 酸構(gòu)成的含經(jīng)修飾堿基的多核苷酸或由相同類型的核苷酸構(gòu)成的含經(jīng)修飾堿基的多核苷酸。本實施方式中提供為陰性對照探針的含經(jīng)修飾堿基的多核苷酸可通過本身已知 的方法合成。所述探針也可提供為具有任何本身已知的修飾的探針，所述修飾是固定于期 望基體所必需的。一個陰性對照所含的探針長度可相同或不同。但是，所述探針優(yōu)選具有 與所述檢測探針相同的長度。不同類型探針濃度可相同或不同?？赏ㄟ^從獲自所述檢測探針固定區(qū)域的雜交信號量減去獲自陰性對照固定區(qū)域 的雜交信號量來測定從微陣列檢測的結(jié)果。
實施例以下，通過參照實施例更詳細(xì)說明本發(fā)明。實施例1 描述實施例，其中將電流檢測型核酸芯片用作微陣列，及將30聚體探針用作陰性 對照探針。在此系統(tǒng)中，判斷有效信號的閾值設(shè)為15nA或以上，假設(shè)小于15nA的弱信號放 大在測量誤差范圍內(nèi)。首先為檢驗不給出有效雜交信號的水平的核酸量和/或分子數(shù)的條件，混合具有 不同序列的200種類型的30聚體合成寡核酸，以制備陰性對照探針組。這些核苷酸序列示 于序列表的SEQ ID NO :1 200。為固定于微陣列基體，提供有金電極，這些探針是已于其 3’端導(dǎo)入巰基的探針。
作為基體，制備了提供有多個金電極的玻璃基體。制備了任何探針，由此，總核酸終濃度達到3 μ M。將具有一種類型的核苷酸序列的一個多核苷酸在無菌蒸餾水中溶解至3 μ M的濃度。類似地，分別制備2種類型的多核苷 酸(SEQ ID NO :1及2)至1. 5 μ M的終濃度，從而核酸終濃度總的(即2種多核苷酸的總濃 度)達到3 μ Μ。此外，分別制備各含3種類型(SEQ ID NO :1 3) 200種類型(SEQID NO :1 200)的多核苷酸的溶液至3 μ M的終濃度(以核酸總濃度)。即將一種至多種類型 的多核苷酸用以制備一系列含連續(xù)遞增的探針類型的探針混合物。將產(chǎn)生的混合探針數(shù)不 同的核酸溶液滴在相同基體的不同金電極上。將基體置于常規(guī)溫度1小時，然后用水洗滌 及干燥，以將所述探針固定在金電極上。另外，制備了具有100%互補于200種類型的探針(其通常含于混合溶液中)之一 的序列的約200聚體核酸片段，及用作靶核酸。將各探針溶液用以將所述探針固定在基體上，以制備微陣列，然后將已以1/9的 量加入20XSSC緩沖液的靶核酸滴在微陣列上，然后于35°C雜交1小時。雜交之后，基體用0. 2 X SSC洗滌15分鐘，及最終測量H0eChst33258的電流反應(yīng)。對照區(qū)段中，將被固定于基體的不互補于任何所述探針序列的核酸序列用作對照 核酸，及通過類似反應(yīng)從各電極得到電流值，以獲得數(shù)據(jù)。將所述數(shù)據(jù)用作背景，用于計算 與靶雜交后電流量的增加。結(jié)果，當(dāng)混合了所述探針核酸的溶液中與靶核酸具有100%互補 性的靶探針濃度為約0. 05 μ M或以下時，即當(dāng)混合了約60種類型或以上的核酸種類時，在 所述探針與待評估靶核酸的任何組合中產(chǎn)生的信號強度低于所述閾值，及從而證實不可產(chǎn) 生有效雜交信號。給定此評估結(jié)果，混合病毒核酸檢測探針，從而混合了所述探針核酸的溶液中各 序列濃度為0. 05 μ M或以下，以制備探針固定電極作為測試區(qū)段。另一方面，將含互補于所述探針的序列的靶核酸與20XSSC緩沖液以1/9的量混 合，以制備終濃度IO12拷貝/mL的溶液，然后將其滴在各探針固定電極上。所述樣本于35°C 雜交1小時，及用0. 2XSSC洗滌15分鐘。此后，測量Hoechst 33258的電流反應(yīng)。作為對 照區(qū)段，在相同基體上也制備了各具有一種類型的被以3μΜ的濃度固定的探針的電極。結(jié) 果，在對照區(qū)段觀察到電流值的顯著增加。另一方面，未在測試區(qū)段觀察到指示雜交的電流 值及信號的增加。此實施例顯示了使用電流檢測型核酸芯片的例子，但本發(fā)明的應(yīng)用不限于此，且 可應(yīng)用于其他檢測系統(tǒng)中的核酸芯片，特別是熒光檢測系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)及珠陣列。顯示了一個實施例，其中將源于病毒的序列用作本實施例的對象，但照例，本發(fā)明 的應(yīng)用不限于此。顯示了將30聚體合成寡核酸用作探針的實施例，但所述探針的長度及序 列及其固定方法可根據(jù)檢測對象及期望用途適宜選擇，且不限于實施例中描述的條件下的 那些。如需要，可混合不同長度的探針。綜上發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法，即便將具有100%互補于所述探針之一的序列的靶 核酸用作分析物，也可保護所述陰性對照探針組免于產(chǎn)生有效雜交信號，從而使提供可精 確評估背景信號水平的陰性對照探針組成為可能。此實施例顯示了方法，其中混合了多個探針序列，以測定不給出有效雜交信號的 水平的核酸量和/或分子數(shù)。但是，這需要實際上混合許多類型的探針。為簡化操作，可通過使用相當(dāng)少的類型(例如2種類型左右)，隨后改變混合了所述探針的溶液中的對象探針 濃度或分子數(shù)來將僅一種類型的探針序列作為對象；如此，已證實可獲得與所述混合的探 針的相同結(jié)果用其變化的類型數(shù)使用。實施例2 如圖4所示，將實施例1中得到的陰性對照探針組65固定在電流檢測型微陣列61 中的基體62的陰性對照固定區(qū)域63上。此外，將檢測探針66固定在檢測探針固定區(qū)域64 上。由此提供本發(fā)明的微陣列。實施例3
肌苷及2'-脫氧水粉蕈素作為堿基且具有導(dǎo)入其3'端用于 固定的巰基的30聚體合成寡核酸作為陰性對照探針。將具有經(jīng)修飾核酸作為構(gòu)成核酸的 此陰性對照探針以3 μ M的濃度溶解在無菌蒸餾水中。另外，制備提供有多個金電極的玻璃基體作為微陣列的基體。將3 μ M陰性對照探針溶液滴在金電極上，置于常規(guī)溫度1小時，用水洗滌及干燥。 由此得到提供有所述陰性對照探針的微陣列。將由各種序列構(gòu)成的靶核酸與1/9體積的20XSSC緩沖液混合，以制備終濃度IO12 拷貝/mL的溶液。將產(chǎn)生的溶液滴在如上制備的提供有所述陰性對照探針的微陣列上，及 測量Hoechst 33258的電流反應(yīng)。結(jié)果，無論應(yīng)用任何靶，均未觀察到電流值增加。即未觀 察到指示所述陰性對照探針與所述靶之間雜交的信號。此實施例顯示了使用電流檢測型核酸芯片的例子，但根據(jù)本發(fā)明，其他檢測系統(tǒng) (例如熒光檢測型芯片、化學(xué)發(fā)光型芯片及珠陣列)中的核酸芯片也提供為本發(fā)明的具有 顯著效應(yīng)的微陣列。其中顯示了使用30聚體合成寡核酸作為探針的實施例，但可根據(jù)檢測對象及期 望用途適宜選擇所述探針長度及經(jīng)修飾核酸類型，且不限于實施例中描述的條件下的那 些。如需要，可混合長度及核酸類型不同的探針。綜上發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法，即便將含具有100%互補于所述探針的靶核酸的分 析物用作樣品，也可保護所述陰性對照探針組在交叉反應(yīng)后免于產(chǎn)生有效雜交信號。由此 提供可精確評估背景信號水平的陰性對照探針。實施例4 如圖1 (c)所示，將實施例3中得到的陰性對照探針14固定在電流檢測型微陣列 11中的基體12的陰性對照區(qū)域13上。此外，將檢測探針17固定在檢測探針區(qū)域16上。 由此提供本發(fā)明的微陣列。實施例5 將電流檢測型核酸芯片用作微陣列以測定閾值。第一，制備具有于其3’端導(dǎo)入巰基的不同序列的15種類型的30聚體合成寡核酸 作為探針。作為基體，制備了提供有多個金屬電極的玻璃基體。制備了具有任何序列的探針，由此，總核酸濃度達到3μ M的終濃度，及將這些探 針溶液滴在相同基體的不同金電極上。將基體置于常規(guī)溫度1小時，用水洗滌及干燥，由此 提供具有被固定于金電極的探針的電流檢測型核酸微陣列。然后，將100%互補于被固定于DNA芯片上的各探針序列的核酸在1/9體積的20XSSC 緩沖液中溶解至 10 種濃度(ΙΟ2、ΙΟ4、ΙΟ6、ΙΟ8、ΙΟ1。、ΙΟ12、1014、IO16UO18 及 102° 拷貝 /ml)，且將產(chǎn)生的溶液滴在微陣列上，及于35°C雜交1小時雜交之后，將微陣列用0. 2 X SSC洗滌15分鐘，及最終測量Hoechst33258的電流 反應(yīng)。重復(fù)測量各實驗區(qū)段至少50次，及評估了指示裝置本身特征的測量結(jié)果的再現(xiàn)性及 測量值波動。對照區(qū)段中，將不互補于被固定于基體的任何探針序列的核酸序列用作對照核 酸。通過類似反應(yīng)從各電極得到電流值，以獲得數(shù)據(jù)。將所述數(shù)據(jù)用作背景，以用于計算與 所述靶雜交后電流量的增加。結(jié)果，在所述探針與待評估靶的任何組合中，獲自各探針的電流信號的散布范圍 為IOnA或以下。也類似評估了使用非所述探針及上述靶的序列(200種類型或以上的序列)的微 陣列。作為指示裝置本身特征的測量結(jié)果的再現(xiàn)性及測量值波動的評估結(jié)果，證實了當(dāng)使 用此裝置時，信號的最大波動是ΙΟηΑ。由于實際上使用的環(huán)境可包括可觀的不確定性，需要具有一定程度容錯的設(shè)計。 因此，將如上得到的IOnA的測量波動乘以1. 5的安全因數(shù)，及將所得值(即15nA)建立為 雜交信號的閾值。給定此評估結(jié)果，將小于15nA的信號弱增加認(rèn)為在測量誤差范圍內(nèi)。即將判斷有 效雜交信號的閾值設(shè)為15nA。此實施例顯示了使用電流檢測型核酸芯片的粒子，但本發(fā)明不限于此，且可應(yīng)用 于其他檢測系統(tǒng)(特別是熒光檢測系統(tǒng)及化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)或珠陣列)中的核酸芯片。散布范 圍，安全因數(shù)等隨著條件(例如裝置結(jié)構(gòu)，測量系統(tǒng)原理及測量對象)變化。上述實施例顯示了使用源于病毒的序列作為受試體的例子，但可用于建立閾值的 序列不限于此。本文顯示了使用30聚體合成寡核酸作為探針的實施例，但所述探針的長度 及序列可根據(jù)檢測對象及期望用途適宜選擇，且不限于實施例中描述的條件下的那些。如 需要，可混合不同長度的探針。
權(quán)利要求
用于核酸檢測的微陣列，其含●基體，●陰性對照探針組，其■被固定于基體的第一區(qū)域，及■提供有多個具有不同序列的第一探針，及●第二探針，其■被固定于基體的第二區(qū)域，及■含互補于靶核酸的序列，其中所述陰性對照探針組的第一探針的類型數(shù)是由所述陰性對照組與完全匹配于所述陰性對照組所含的所述第一探針的一部分的核酸之間的反應(yīng)得到的雜交信號小于閾值時的數(shù)。
2.權(quán)利要求1的微陣列，其中所述第一探針的核苷酸序列是不同于所述第二探針的核 苷酸序列的序列。
3.權(quán)利要求1的微陣列，其中所述微陣列選自電化學(xué)檢測型、熒光檢測型、化學(xué)發(fā)光 型及放射性檢測型。
4.權(quán)利要求3的微陣列，其中所述微陣列是電化學(xué)檢測型， 所述第一區(qū)域在第一電極上，及 所述第二區(qū)域在第二電極上。
5.設(shè)計權(quán)利要求1的微陣列所含的陰性對照探針組的方法，其包括 通過允許相同分析物作用于具有多個第一探針的微陣列來重復(fù)測量雜交信號，所述 多個第一探針被施加于陰性對照組，所述陰性對照組被固定于分開的區(qū)域， 眷測定所測雜交信號中散布的最大值， 通過所述散布的最大值乘以安全因數(shù)來測定閾值，及 測定通過與完全匹配于所述陰性對照組所含的所述第一探針的一部分的核酸反應(yīng) 得到的雜交信號小于所述閾值時所述第一探針的濃度。
6.微陣列，其含 基體， 陰性對照探針，其提供有被固定于基體的第一區(qū)域的多核苷酸，及 第二探針，其■被固定于基體的第二區(qū)域，及■含互補于靶核酸的序列，其中所述陰性對照探針是不參與核苷酸序列特異性雜交的含經(jīng)修飾堿基的多核苷酸。
7.權(quán)利要求6的微陣列，其中所述陰性對照探針是具有經(jīng)修飾堿基結(jié)合于其戊糖1' 位置的核苷酸的多核苷酸。
8.權(quán)利要求6的微陣列，其中所述經(jīng)修飾堿基選自2'-脫氧肌苷及2'-脫氧水粉蕈素。
全文摘要
用于核酸檢測的微陣列，其包括基體；陰性對照探針組，其被固定于基體的第一區(qū)域及提供有多個具有不同序列的第一探針；及第二探針，其被固定于基體的第二區(qū)域及含互補于靶核酸的序列，其中所述陰性對照探針組的第一探針的類型數(shù)是由所述陰性對照組與完全匹配于所述陰性對照組所含的所述第一探針的一部分的核酸之間的反應(yīng)得到的雜交信號小于閾值時的數(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK101970693SQ20098010912
公開日2011年2月9日 申請日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日
發(fā)明者堀內(nèi)秀紀(jì) 申請人:株式會社東芝