專利名稱：新型過氧化氫生成型nadh氧化酶及編碼其的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶及其制造方法。更具體 而言，本發(fā)明涉及在氧氣分子(O2)存在下底物特異性地將NADH氧化、生成過氧化氫(H2O2)、 從短桿菌(Brevibacterium)屬微生物獲得的、對(duì)NADH測(cè)定等有用的NADH氧化酶及其制造 方法。
背景技術(shù)：
將還原型輔酶(NADH)再生為氧化型輔酶(NAD+)的酶，由于其通過與氧化還原酶 的組合而能夠氧化各種酒精，因此非常有用。關(guān)于NADH氧化酶，有各種報(bào)道(參考專利文 獻(xiàn)1 11) O專利文獻(xiàn)1特開平7-163378號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開2003-116585號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3國際公開第W02004/011670號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)4歐州專利公開第1285962號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5特開平8-196281號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6歐州專利公開第623677號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7特開平5-344890號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8特開平5-84072號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9特開平4-365478號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)10歐州專利公開第385415號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)11特開平2-107186號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供來自短桿菌屬微生物的、pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性優(yōu)異的、對(duì) 新型NADH氧化酶進(jìn)行編碼的DNA。已知有大量從各種微生物分離出的氧化酶。然而，還沒有從短桿菌屬微生物分離 出的例子。通常，進(jìn)行酒精的氧化反應(yīng)的氧化還原酶的最佳pH為弱堿性的9 10左右。因 此，希望進(jìn)行NAD+的再生的NADH氧化酶的最佳pH也與其為同等范圍。然而，來自乳酸菌 的NADH氧化酶(Evonik DegussaGmbH專利)的最佳pH為6附近，其不適合作為再生性酶。 另外，作為再生性酶要求具有高的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明人等對(duì)于獲得上述優(yōu)異的特性的酶進(jìn)行了反復(fù)研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由本發(fā) 明人等新分離出的來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶具有偏堿性的最佳pH，且其熱穩(wěn)定 性也較高，由此完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明如下所述。[1] 一種NADH氧化酶，其為具有下述的酶學(xué)性質(zhì)的、來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶(1)以氧氣作為受體而催化NADH的氧化反應(yīng)，生成NAD+與過氧化氫；(2)最佳pH為8 10附近；(3)即使在70°C進(jìn)行1小時(shí)的熱處理也不失活且具有80%以上的殘存活性；(4)最佳溫度為50 70°C ；(5)通過銨鹽而被活化；以及(6)在通過SDS-PAGE測(cè)定的情況下，分子量為50 60kDa。[2]如[1]所述的酶，進(jìn)一步具有以下的酶學(xué)性質(zhì)(7)對(duì)于NADPH的氧化活性小，且不能認(rèn)定由FAD或FMN引起的活化；以及(8) Km 為約 0. 022mM。[3]如[1]或[2]所述的NADH氧化酶，其來自短桿菌sp. KU1309(保藏編號(hào)FERM P-21008)。[4] [1] [3]的任一項(xiàng)所述的NADH氧化酶的制造方法，包括培養(yǎng)短桿菌屬微生 物、從培養(yǎng)物中回收NADH氧化酶。[5]如[4]所述的NADH氧化酶的制造方法，短桿菌屬微生物為短桿菌 sp. KU1309 (保藏編號(hào)FERM P-21008)。[6]以下(a)或(b)的來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶(a)含有由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列的NADH氧化酶。(b)在由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列中，含有缺失、置換或添加1個(gè)或多個(gè)氨基 酸的氨基酸序列，且具有NADH氧化酶活性的NADH氧化酶。[7]對(duì)以下(a)或(b)的來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶進(jìn)行編碼的DNA，(a)含有由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列的NADH氧化酶，(b)在由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列中，含有缺失、置換或添加1個(gè)或多個(gè)氨基 酸的氨基酸序列，且具有NADH氧化酶活性的NADH氧化酶。[8]對(duì)以下(c)或(d)的來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶進(jìn)行編碼的DNA，(c)含有由序列號(hào)17所表示的堿基序列的DNA，(d)含有由序列號(hào)17所表示的堿基序列的DNA與含有互補(bǔ)序列的DNA在嚴(yán)格的條 件下雜交，對(duì)具有NADH氧化酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA。[9]含有[8]的DNA的表達(dá)載體。[10]利用[9]所述的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。[11] 一種NADH氧化酶的制造方法，其包括將[10]所述的宿主細(xì)胞在DNA可表 達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)以產(chǎn)生NADH氧化酶、并回收該NADH氧化酶。[12]如[11]所述的制造方法，其中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌，通過使[9]所記載的表 達(dá)載體與蛋白伴侶質(zhì)粒共表達(dá)而制造可溶性NADH氧化酶。[13]使用[1] [3]及[6]的的任一項(xiàng)所述的NADH氧化酶制造光學(xué)活性扁桃酸 或D-苯丙氨酸的方法。本說明書包含作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2008-008062號(hào)的說明 書以和/或附圖中所記載的內(nèi)容。


圖IA表示使用Butyl toyopearl色譜柱的、本發(fā)明的酶的精制結(jié)果的圖。圖IB為表示本發(fā)明的酶的SDS-PAGE結(jié)果的圖。圖2為表示本發(fā)明的酶的pH特性的圖。圖3為表示本發(fā)明的酶的pH穩(wěn)定性的圖。圖4為表示本發(fā)明的酶的溫度穩(wěn)定性的圖。圖5A為表示各種鹽對(duì)于本發(fā)明的酶的效果的圖。圖5B為表示銨鹽對(duì)本發(fā)明的酶的效果的圖。圖6為表示本發(fā)明的酶的由酸所導(dǎo)致的抑制的7為表示本發(fā)明的酶的動(dòng)力學(xué)的圖。圖8A為表示由本發(fā)明的酶決定氧分子的還原狀態(tài)的方法的圖。圖8B為表示由本發(fā)明的酶引起的氧分子的還原狀態(tài)的圖。圖9A為表示本發(fā)明酶與扁桃酸脫氫酶的偶聯(lián)反應(yīng)的圖。圖9B為表示本發(fā)明的酶與L-苯丙氨酸脫氫酶的的偶聯(lián)反應(yīng)的圖。圖10為表示本發(fā)明的酶基因在克隆中的兼并PCR的結(jié)果的圖。圖11為表示使用本發(fā)明的酶基因的片斷的瑟慎印跡雜交(southernblotting)的 結(jié)果的圖。圖12為表示使用本發(fā)明的酶基因的反向PCR的結(jié)果的圖。圖13A為表示本發(fā)明的酶基因的堿基序列的圖。圖13B為表示本發(fā)明的酶基因的堿基序列的圖(圖13A的續(xù)圖)。圖13C為表示本發(fā)明的酶基因的堿基序列的圖(圖13B的續(xù)圖)。圖14為表示使用本發(fā)明的酶的重組大腸桿菌的、用于表達(dá)的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)的圖。圖15為表示與蛋白伴侶共表達(dá)引起的本發(fā)明的酶的表達(dá)(可溶性餾分)的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的酶可以從在土壤中生息的短桿菌屬微生物中分離。短桿菌屬微生物的 分離可以通過公知的方法進(jìn)行。作為短桿菌屬微生物，可以舉出短桿菌sp. KU1309，短桿菌 sp.KU1309在2006年8月29日(保藏編號(hào)FERM P-21008)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù) 綜合研究所、特許生物保藏中心(日本國、茨城縣茨城市東1 丁目1番地1中央第6)。短桿菌sp. KU1309的菌學(xué)性質(zhì)如下所示。(a)形態(tài)(1)細(xì)胞的大小:0. 8X1.0 1.5ym(24h)、0. 8X0. 8 1.0ym(72h)的桿菌。有 桿球菌周其月(Rod-coccus cycle)。(2)革蘭氏染色性陽性。(3)有無孢子無。(4)運(yùn)動(dòng)性無。(5)菌落形態(tài)(培養(yǎng)基=Nutrient Agar，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí))圓形，整個(gè)邊緣光滑，低凸?fàn)?，有光澤，黃色。(6)生育溫度37°C為 +、45°C為 _。
(7)過氧化氫酶陽性。(8)氧化酶陰性。(9)產(chǎn)生酸/氣體(葡萄糖)-/_。(10)0/F 試驗(yàn)(葡萄糖):-/_。另外，序列號(hào)1表示16S rDNA堿基序列。根據(jù)上述的菌學(xué)性質(zhì)，鑒定了本發(fā)明的短桿菌sp. KU1309是新種微生物。本發(fā)明的酶通過上述微生物培養(yǎng)物可以作為具有高的酒精氧化活性的NADH氧 化酶而精制。微生物的培養(yǎng)可以通過公知的方法而進(jìn)行。例如，可以使用含有普通肉湯 20g(極東制藥工業(yè))、酵母提取物5g(極東制藥工業(yè))的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)上述微生 物1 2天，破壞菌體，從菌體提取液可以精制本發(fā)明的酶。本發(fā)明酶的精制也可以通過公 知的方法進(jìn)行。例如，使用超聲波破壞、使用玻璃珠的機(jī)械破壞、弗式壓碎器、表面活性劑、 溶菌酶等，將菌體破壞，得到提取液，可進(jìn)一步對(duì)提取液通過硫酸胺或十水硫酸鈉等的鹽析 法、氯化鎂或氯化鈣等金屬凝集法、精蛋白或乙烯亞胺聚合物等的凝集法、熱處理、離子交 換色譜法等進(jìn)行精制。例如可以使用Butyl toyopearl色譜柱(東麗)來進(jìn)行。本發(fā)明的酶的酶活性可以通過利用吸光光度計(jì)測(cè)量NADH被氧化成NAD+時(shí)所減少 的340nm的吸光度進(jìn)行測(cè)定。以每一分鐘氧化1 μ摩爾NADH的酶的量為1個(gè)單位(U)。本發(fā)明的酶有時(shí)也稱作Ν0Χ。本發(fā)明的NADH氧化酶具有以下性質(zhì)。(1)本發(fā)明的酶通過下述反應(yīng)式以氧氣作為受體催化NADH的氧化反應(yīng)，生成NAD+ 與過氧化氫NADH+H++02 — NAD++H202 ；(2)本發(fā)明的酶的最佳pH為8 10附近，適合用于與氧化還原酶一起進(jìn)行酒精的 氧化反應(yīng)；(3)本發(fā)明的酶的溫度穩(wěn)定性優(yōu)異，在70°C熱處理1小時(shí)也不會(huì)失去活性，且還具 有80%以上、優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步幾乎100%的殘存活性。該性質(zhì)在物質(zhì)生產(chǎn)工序中是 理想的；(4)本發(fā)明的酶的最佳溫度為50 70°C，優(yōu)選為約60°C ；(5)本發(fā)明的酶由銨鹽而被活化。將反應(yīng)體系保持為弱堿性時(shí)如果使用氨水，則酶 也被活化，因而是理想的；(6)本發(fā)明的酶被 Zn2+(39% Cu2+(42% )、Ag+(37% )等弱酸抑制；(7)本發(fā)明的酶對(duì)NADPH的氧化活性小，且不能認(rèn)定由FAD或FMN所導(dǎo)致的活化。 本酶的不能氧化NADPH的特性存在可以選擇性測(cè)定NADH與NADPH混存的生物材料中的 NADH量的優(yōu)點(diǎn)；(8)本發(fā)明的酶的Km為0. ImM以下、優(yōu)選為約0. 02mM例如0. 022mM ；(9)使用本發(fā)明的酶氧化Imol的NADH時(shí)，生成Imol的過氧化氫；以及(10)本發(fā)明的酶形成同型二聚體，亞基的分子量通過SDS-PAGE進(jìn)行測(cè)定時(shí)為 50kDa 60kDa、優(yōu)選為約57kDa。通過凝膠過濾所推測(cè)的同型二聚體分子量為約102kDa。 另外，從氨基酸序列所推定的亞基的分子量為約49kDa。對(duì)本發(fā)明的酶進(jìn)行編碼的DNA的堿基序列示于圖3及序列號(hào)17。另外，本發(fā)明的酶的氨基酸序列示于圖3及序列號(hào)18。本發(fā)明的酶，只要由其氨基酸序列所形成的蛋白質(zhì)具有NADH氧化酶的酶活性，則 對(duì)于該氨基酸序列而言，在至少1個(gè)、優(yōu)選為1個(gè)或多個(gè)氨基酸上可發(fā)生缺失、置換、添加等 變異。例如，由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列的至少1個(gè)，優(yōu)選為1個(gè)或多個(gè)(例如1 10個(gè)、較優(yōu)選為1 5個(gè))氨基酸可以發(fā)生缺失，或者由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列中 的至少1個(gè)、優(yōu)選為1個(gè)或多個(gè)(例如1 10個(gè)、較優(yōu)選為1 5個(gè))的氨基酸可以發(fā)生 添加，或者由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列中的至少1個(gè)、優(yōu)選為1個(gè)或多個(gè)(例如1 10個(gè)、較優(yōu)選為1 5個(gè))的氨基酸可以置換成其它的氨基酸。作為在上述的序列號(hào)18的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、置換或添 加的氨基酸序列，可以舉出使用序列號(hào)18的氨基酸序列與BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiological Information ( mLfflf 息中心的基本局部序列檢索工具))等(例如默認(rèn)或初始化參數(shù))進(jìn)行計(jì)算時(shí)，具有至少為 85%以上、優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、特別優(yōu)選為97%以上的同源性的氨 基酸序列。在上述的序列號(hào)18的氨基酸序列中具有1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、置換或添加 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)與具有序列號(hào)18的氨基酸序列的蛋白質(zhì)在實(shí)質(zhì)上是相同的。另外，作為由序列號(hào)17所示堿基序列形成的DNA與由互補(bǔ)序列形成的DNA在下述 嚴(yán)格的條件下可發(fā)生雜交的DNA、對(duì)具有NADH氧化酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA也包含 在本發(fā)明的DNA內(nèi)。即指的是使用固定有DNA的過濾器，在0. 7 1. OM的NaCl的存在下在 68°C進(jìn)行雜交后，使用0. 1 2倍濃度的SSC溶液(1倍濃度的SSC是指包含150mM NaCl, 15mM檸檬酸納)，通過在68°C進(jìn)行洗滌而能夠鑒定的條件?；蛘咄ㄟ^瑟慎印跡(southern blotting)雜交法將DNA轉(zhuǎn)錄、固定至硝化纖維素膜上后，在雜交緩沖液〔50%甲酰胺， 4XSSC,50mMHEPES(pH7. 0), 10X 鄧哈特溶液(Denhardt，s)溶液、100 μ g/ml 三文魚精子 DNA)中在42°C下反應(yīng)一夜，由此而能夠形成雜交的DNA。進(jìn)一步，相對(duì)于上述DNA的RNA、或能夠與該RNA在嚴(yán)格的條件下發(fā)生雜交的且對(duì) 具有NADH氧化酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的RNA也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的重組載體可以通過在適當(dāng)?shù)妮d體上連接(插入)本發(fā)明的DNA而得到。 用于插入本發(fā)明的DNA的載體，只要是在細(xì)菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞等宿主細(xì)胞中能夠復(fù)制的 載體即可，沒有特殊的限制，例如，可以舉出質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA等。用于構(gòu)建表達(dá)載體的 載體DNA可以使用廣泛普及的容易獲得的物質(zhì)。例如可舉出pET載體、pQE載體、pCold載 體、PUC19載體等。本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建方法可以沒有特別限制地通過常規(guī)方法進(jìn)行。由本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞只要能夠表達(dá)本發(fā)明的DNA即可，沒 有特殊的限制，例如作為細(xì)菌可以舉出大腸桿菌、枯草菌等，作為酵母可以舉出釀酒酵母菌 等，作為動(dòng)物細(xì)胞可以舉出中國倉鼠卵巣(CHO)細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、小鼠纖維母細(xì)胞等。本發(fā)明包含一種NADH氧化酶的制造方法，該方法包括將含有上述DNA的宿主細(xì)胞 在DNA能夠表達(dá)的條件下培養(yǎng)，以產(chǎn)生NADH氧化酶，進(jìn)而回收該NADH氧化酶。在大腸桿菌上大量表達(dá)本發(fā)明的酶的情況下，不能良好地進(jìn)行蛋白質(zhì)的折疊，易
7于作為包涵體產(chǎn)生于不溶性餾分中。在此，優(yōu)選在大腸桿菌中使其與蛋白伴侶質(zhì)粒共表達(dá)， 促進(jìn)蛋白伴侶所導(dǎo)致的可溶化。作為蛋白伴侶質(zhì)?？梢耘e出pGr07、pKJE7、pTfl6等。由宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的NADH氧化酶例如可以單獨(dú)或組合使用凝膠過濾色譜、超濾、 離子交換色譜、親和層析、疏水層析、等電點(diǎn)電泳法、凝膠電泳法等公知的精制法而精制。本發(fā)明的酶可以將氧化反應(yīng)中所必需的還原型輔酶(NADH)再生為氧化型輔酶 (NAD+)。通過將本發(fā)明的酶與其他的氧化還原酶相組合，能夠氧化各種酒精。另外，例如通 過與扁桃酸脫氫酶或L-苯丙氨酸脫氫酶相組合進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，可以制造光學(xué)活性(S)-扁 桃酸或光學(xué)活性D-苯丙氨酸。另外，本發(fā)明的酶與H2O2定量法相組合，可以用于與NADH參 與的各種脫氫酶的活性測(cè)定以及以NAD為輔酶的各種脫氫酶的底物量的測(cè)定。另外，還期 待將其用于生物燃料電池或酶診斷試劑。通過下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地說明，但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1酶的精制(1)細(xì)胞的培養(yǎng)從土壤分離短桿菌屬微生物短桿菌sp. KU1309，通過以下的方法進(jìn)行培養(yǎng)。分離的 短桿菌sp. KU1309于2006年8月29日保藏(保藏編號(hào)FERM P-21008)于獨(dú)立行政法人 產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所、特許生物保藏中心(日本國茨城縣茨城市東1 丁目1番地1中央第 6)。培養(yǎng)基使用下述物質(zhì)，即將每升溶解有普通肉湯20g(極東制藥工業(yè))、酵母提取 物5g (極東制藥工業(yè))的物質(zhì)用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7. 0，繼而在120°C加熱滅菌20分鐘。向裝有培養(yǎng)基IOml的試驗(yàn)管中，通過白金勺接種固體培養(yǎng)基上的短桿菌，在30°C 下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將Iml該細(xì)胞懸濁液加入裝有IOOml培養(yǎng)基的500ml振蕩瓶中，在 30°C下進(jìn)行24小時(shí)的振蕩培養(yǎng)，通過離心分離回收細(xì)胞。將所得到的細(xì)胞通過磷酸緩沖液 進(jìn)行洗滌，再次通過離心分離回收細(xì)胞。上述物質(zhì)在-20°C下可以相當(dāng)長(zhǎng)期地保存。(2)酶精制無細(xì)胞提取液的調(diào)制將濕潤(rùn)的細(xì)胞(20g)懸浮于IOOmM磷酸緩沖溶液(pH7. 0) 5mM 2-巰基乙醇，由戴 諾磨(Willy A. Bachofen Co.)進(jìn)行破壞。對(duì)該混合物進(jìn)行離心分離，回收上清，以此作為 無細(xì)胞提取液。(3)酶活性的測(cè)定酶活性通過以吸光光度計(jì)測(cè)定NADH被氧化為NAD+時(shí)所減少的340nm的吸光度進(jìn) 行評(píng)價(jià)。反應(yīng)為向0. ImM NADHUOOmM Tris-鹽酸(pH8. 8)、500mM硫酸銨中加入酶溶液而 進(jìn)行。將每分鐘氧化1 μ摩爾NADH的酶的量定義為1單位。(4)硫酸銨分餾在0°C下攪拌無細(xì)胞提取液的同時(shí)，用15分鐘的時(shí)間逐漸加入硫酸銨至35%飽和 濃度。此后進(jìn)一步攪拌1小時(shí)。通過離心分離除去沉淀，在上清中用15分鐘的時(shí)間逐漸加 入硫酸銨至65%飽和濃度。從加入結(jié)束開始至攪拌1小時(shí)后，通過離心分離回收沉淀。將 該沉淀溶解在含有IOmM磷酸緩沖溶液、5mM的2-巰基乙醇、30%飽和硫酸銨的IOmM磷酸緩 沖溶液(pH7. 0)中。(5)層析
將試料置于用含有5mM 2_巰基乙醇、30%飽和硫酸銨的IOmM磷酸緩沖溶液(= 緩沖溶液A)進(jìn)行過平衡的Phenyl toyopearl色譜柱(東麗、色譜柱體積150ml)上。使用 Econo梯度泵(Bio Rad)進(jìn)行層析(流速1. 5ml/min)。在用450ml的緩沖溶液A洗滌后，通 過450ml的緩沖溶液A與450ml的含有5mM的2-巰基乙醇、20%飽和硫酸銨的IOmM磷酸 緩沖溶液B(pH7.0)的硫酸胺線性梯度使蛋白質(zhì)析出。研究各餾分的酶活性，收集活性餾分 并于IOmM磷酸緩沖溶液(pH7. 0)進(jìn)行透析。將該餾分池置于用含有5mM的2-巰基乙醇、 200mM NaCl的IOmM磷酸緩沖溶液(pH7. 0)(緩沖溶液C)進(jìn)行過平衡化的DEAE toyopearl 色譜柱(東麗、色譜柱體積50ml)上。用150ml的緩沖溶液C洗滌后，通過150ml的緩沖溶 液C與150ml的含有5mM的2-巰基乙醇、300mM NaCl的IOmM磷酸緩沖溶液(pH7. 0)(緩沖 溶液D)所產(chǎn)生的NaCl線性梯度使蛋白質(zhì)析出(流速lml/min)。從其中回收具有活性的餾 分，加入硫酸銨直至達(dá)到30%飽和。將該溶液置于用含有5mM的2-巰基乙醇、30%飽和硫 酸銨的IOmM磷酸緩沖溶液(pH7. 0)(=緩沖溶液E)進(jìn)行過平衡化的Butyl toyopearl色 譜柱(東麗、色譜柱體積10ml)中。用30ml的緩沖溶液E洗滌后，通過30ml的緩沖溶液E 與30ml的含有5mM的2-巰基乙醇、300mM NaCl的IOmM磷酸緩沖溶液(pH7. 0)(緩沖溶液 F)的硫酸銨線性梯度使蛋白質(zhì)析出(流速lml/min)。回收活性的餾分，于IOmM的磷酸緩 沖溶液(PH7.0)進(jìn)行透析。由Butyl toyopearl色譜柱得到的各餾分的酶活性示于圖IB。 如圖IA所示確認(rèn)了單一的峰。進(jìn)一步，在精制后進(jìn)行SDS-PAGE。由CBB染色時(shí)在50kDa附 近(56. SkDa)能夠確認(rèn)均勻的譜帶(圖1A)。另外作為凝膠過濾色譜法的結(jié)果，在非變性狀 態(tài)下的分子量為102kDa，由此可知該酶作為二聚體而存在。另外，從所精制的酶的溶液為黃 色透明推測(cè)該酶為黃素酶。將精制過程中的酶活性、收率歸納于下述表1。表1精制過程中的酶活性、收率
權(quán)利要求
一種NADH氧化酶，其具有下述酶學(xué)性質(zhì)并來自短桿菌屬微生物(1)以氧作為受體而催化NADH的氧化反應(yīng)，生成NAD+與過氧化氫；(2)最佳pH為8～10附近；(3)即使在70℃進(jìn)行1小時(shí)的熱處理也不失活且具有80％以上的殘存活性；(4)最佳溫度為50～70℃；(5)通過銨鹽而被活化；以及(6)通過SDS PAGE測(cè)定的分子量為50～60kDa。
2.如權(quán)利要求1所述的酶，進(jìn)一步具有以下的酶學(xué)性質(zhì)(7)相對(duì)于NADPH的氧化活性小，且不能認(rèn)定由FAD或FMN引起的活化；以及⑶Km為 約 0. 022mM。
3.如權(quán)利要求1或2所述的NADH氧化酶，其來自短桿菌sp.KU1309 (保藏編號(hào)FERM P-21008)。
4.一種NADH氧化酶的制造方法，其用于制造權(quán)利要求1 3的任一項(xiàng)所述的NADH氧 化酶，包括培養(yǎng)短桿菌屬微生物、從培養(yǎng)物中回收NADH氧化酶。
5.如權(quán)利要求4所述的NADH氧化酶的制造方法，短桿菌屬微生物為短桿菌 sp. KU1309 (保藏編號(hào)FERM P-21008)。
6.一種NADH氧化酶，其為以下(a)或(b)的來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶(a)含有由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列的NADH氧化酶；(b)在由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列中，含有缺失、置換或添加了1個(gè)或多個(gè)氨基酸 的氨基酸序列，且具有NADH氧化酶活性的NADH氧化酶。
7.—種DNA，其對(duì)以下(a)或(b)的、來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶進(jìn)行編碼，(a)含有由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列的NADH氧化酶；(b)在由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列中，含有缺失、置換或添加了1個(gè)或多個(gè)氨基酸 的氨基酸序列，且具有NADH氧化酶活性的NADH氧化酶。
8.—種DNA，其對(duì)以下(c)或(d)的、來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶進(jìn)行編碼，(c)含有由序列號(hào)17所表示的堿基序列的DNA(d)含有由序列號(hào)17所表示的堿基序列的DNA與含有互補(bǔ)序列的DNA在嚴(yán)格的條件下 雜交，對(duì)具有NADH氧化酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA。
9.一種含有權(quán)利要求7或8所述的DNA的表達(dá)載體。
10.一種通過權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體而轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
11.一種NADH氧化酶的制造方法，包括將權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞在DNA可表達(dá) 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)以產(chǎn)生NADH氧化酶、并回收該NADH氧化酶。
12.如權(quán)利要求11所述的制造方法，其中所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌，通過使權(quán)利要求9 所記載的表達(dá)載體與蛋白伴侶質(zhì)粒共表達(dá)而制造可溶性NADH氧化酶。
13.使用如權(quán)利要求1 3及6的任一項(xiàng)所述的NADH氧化酶制造光學(xué)活性扁桃酸或 D-苯丙氨酸的方法。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供對(duì)來自短桿菌屬微生物的、pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性優(yōu)異的新型NADH氧化酶進(jìn)行編碼的DNA，本發(fā)明為對(duì)以下(a)或(b)的、來自短桿菌屬微生物的NADH氧化酶進(jìn)行編碼的DNA(a)含有由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列的NADH氧化酶；(b)在由序列號(hào)18所表示的氨基酸序列中，含有缺失、置換或添加了1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有NADH氧化酶活性的NADH氧化酶。
文檔編號(hào)C12N9/02GK101978055SQ20098010945
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月17日
發(fā)明者太田博道, 宮本憲二 申請(qǐng)人:學(xué)校法人慶應(yīng)義塾