專利名稱：在醛脫氫酶存在下產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將植物來源的材料發(fā)酵為所期望發(fā)酵產(chǎn)物的方法。該發(fā)明亦涉及使用 一種或多種發(fā)酵生物自植物材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法；可用于本發(fā)明方法和/或工藝中的 組合物；轉(zhuǎn)基因植物；和修飾的發(fā)酵生物。
背景技術(shù)：
大量難以人工產(chǎn)生的商業(yè)產(chǎn)品現(xiàn)在通過發(fā)酵生物產(chǎn)生。上述產(chǎn)品包括醇類(例 如，乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、 葡糖酸鹽、乳酸、琥珀酸、2，5-二酮-D-葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨 酸)；氣體(例如，H2和CO2),以及更加復(fù)雜的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉屬和 四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、Β12、β-胡蘿卜素)；以及激素。發(fā)酵亦常用于消費(fèi)醇 類(例如，啤酒和葡萄酒)、乳類制品(例如，用于生產(chǎn)酸奶和奶酪)、皮革和煙草工業(yè)。大量通過發(fā)酵由含淀粉和/或木素纖維素材料降解提供的糖產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物(如乙 醇)的方法是本領(lǐng)域已知的。然而，自植物材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)仍然成本太高昂。因此，需要提供可增 加所述發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量從而減少產(chǎn)生成本的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用發(fā)酵生物將植物材料來源的糖發(fā) 酵成為發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中一種或多種醛脫氫酶存在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及自含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括下述步驟i)將含淀粉材料液化；ii)糖化所述經(jīng)液化的材料；和iii)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵；其中發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法進(jìn)行。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及自含淀粉材料 產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括下述步驟(a)在所述含淀粉材料的起始糊化溫度以下的溫度糖化含淀粉材料；和(b)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵；其中發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法進(jìn)行。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及自含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括下述 步驟(a)預(yù)處理含木素纖維素材料；(b)將所述材料水解；(c)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵；其中發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法進(jìn)行。在第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含一種或多種醛脫氫酶的組合物。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明涉及在本發(fā)明的發(fā)酵方法或工藝中使用醛脫氫酶或本發(fā)明 的組合物。在第七個(gè)方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物材料，其中該植物材料用編碼醛脫氫酶的 多核苷酸序列轉(zhuǎn)化。在第八個(gè)方面，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的發(fā)酵生物，其中所述發(fā)酵生物用編碼醛脫氫 酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，其中所述發(fā)酵生物能夠在發(fā)酵條件下表達(dá)醛脫氫酶。附圖簡述

圖1是關(guān)于醛脫氫酶如何能夠在過量乙酸和NADH+存在下在發(fā)酵過程中逆轉(zhuǎn)乙 醛-至-乙酸平衡的示意2說明了在同時(shí)糖化和發(fā)酵過程中醛脫氫酶對(duì)乙醇得率(yield)的作用。發(fā)明詳述乙醇發(fā)酵是氧化還原中性的(redox neutral) 0然而，在其他細(xì)胞過程中產(chǎn)生的 過量NAD (P) H必須由下述機(jī)理來平衡，在所述機(jī)理中，NAD (P) H重新氧化為NAD (P) +以避免 NAD (P)+/NAD (P) H比例的不平衡。過量乙酸和NAD (P) H的存在可促進(jìn)產(chǎn)生乙醛的逆反應(yīng)，而 乙醛可隨即轉(zhuǎn)化為乙醇(參見圖1)。因此，在發(fā)酵過程中醛脫氫酶的存在/添加可導(dǎo)致數(shù) 種積極作用，包括1)重新產(chǎn)生NAD(P)+，并增加發(fā)酵產(chǎn)物得率(例如，乙醇)，和2)增強(qiáng)發(fā) 酵生物(例如，酵母)的生長。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用發(fā)酵生物將來源于植物材料 的糖發(fā)酵為發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中在發(fā)酵產(chǎn)物中存在一種或多種醛脫氫酶。所述醛脫氫酶可在發(fā)酵之前和/或過程中添加/導(dǎo)入。所述醛脫氫酶可來自外源， 和/或可以，例如，在原位通過由所述發(fā)酵生物過表達(dá)醛脫氫酶來產(chǎn)生。后者可通過制備經(jīng) 修飾能夠表達(dá)ALDH的發(fā)酵生物(例如酵母)來實(shí)現(xiàn)，例如通過用一種或多種ALDH編碼基 因轉(zhuǎn)化該酵母或?qū)朐黾觾?nèi)源ALDH基因表達(dá)的啟動(dòng)子來進(jìn)行。將ALDH基因?qū)氚l(fā)酵生物 (如酵母)和/或在發(fā)酵生物中過表達(dá)ALDH基因的技術(shù)，是本領(lǐng)域已知的。醛脫氫酶亦可 以含有和/或表達(dá)醛脫氫酶的轉(zhuǎn)基因植物材料的形式存在于/導(dǎo)入所述發(fā)酵培養(yǎng)基。醛脫氫酶(ALDH)根據(jù)本發(fā)明，所謂醛脫氫酶(ALDH)可為任何來源，如哺乳類或微生物來源，如細(xì) 菌或真菌來源的任何單獨(dú)的醛脫氫酶，或兩種或更多ALDH的組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案 中，所述ALDH是真菌來源的，優(yōu)選酵母來源。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ALDH來源于酵 母屬(Saccharomyces),如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。ALDH 為 EC 1. 2. 1. 3(醛脫氫酶 NAD⑴)、EC 1.2. 1.4(醛脫氫酶(NADP(+))和 EC 1.2. 1.5醛脫氫酶(NAD(P) (+))分類下的酶。EC分類基于國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián) 合會(huì)(IUBMB)命名委員會(huì)的推薦。對(duì)EC分類的描述可見于互聯(lián)網(wǎng)，例如，在“expasv. org/ enzyme/”。ALDH是催化下列反應(yīng)的酶ECl. 2. 1. 3 :S+NAD(+) +H2O O 酸+NADHEC1. 2.1. 4 醛+NADP(+) +H2O 酸+NADPHECl. 2· 1. 5 醛+NAD(P)(+)+H2O 酸+NAD(P)H多種形式存在于哺乳類的胞質(zhì)溶膠、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。其歸類為1類(胞質(zhì)溶膠)、2類(線粒體)和3類(腫瘤和其他同工酶)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述ALDH歸類為ECl. 2. 1. 3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述ALDH歸類為ECl. 2. 1.4。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述ALDH 歸類為ECl. 2. 1.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述ALDH為1類ALDH。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 ALDH為2類ALDH。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述ALDH為3類ALDH。ALDH的實(shí)例可見于下列參 考文獻(xiàn)Saigal 等，1991，J. Bacteriology 173(10) 3199-3208, concerns cloning ofmitochondrial ALDH gene of Saccharomyces cerevisiae。Farres 等(1989) discloses the primary structure of rat and bovine livermitochondrial ALDH。Guan 等(1990) discloses the sequence of precursor bovine livermitochondrial ALDH。Hsu φ, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :3771-3775discloses cloning ofcDNAs for human ALDH land 2。Jones 等，1988，Proc. Nail. AcacL Sci. USA 85 :1782_1786concerns cloningand complete nucleotide sequence of a full-length cDNA encoding a catalyticallyfunctional rumor-associated ALDH。Hempel 等，1984, Eur. J. Biochem. 141 :21_25, discloses the primary structure of ALDH from human liver。Johansson^, 1988,Eur. J. Biochem. 172 :527-533, concerns mitochondrialALDH from horse liver?？墒匈彽腁LDH包括來自釀酒酵母的，可從SIGMA，USA得到(產(chǎn)品#A6338)。發(fā)酵培養(yǎng)基短語“發(fā)酵培養(yǎng)基”指進(jìn)行發(fā)酵的環(huán)境，包括發(fā)酵底物，S卩，由發(fā)酵生物代謝的碳 源，且可包括發(fā)酵生物。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可包括供發(fā)酵生物的營養(yǎng)物和生長刺激劑。營養(yǎng)物和發(fā)酵刺激劑 廣泛用于發(fā)酵領(lǐng)域，且包括氮源，如氨、維生素和礦物質(zhì)，或其組合。在發(fā)酵后，所述發(fā)酵培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物術(shù)語“發(fā)酵生物”指任何適于產(chǎn)生所期望的發(fā)酵產(chǎn)物的生物，包括細(xì)菌和真菌生 物，包括酵母和絲狀真菌。所述發(fā)酵生物可為C6或C5發(fā)酵生物，或其組合。C6和C5發(fā)酵 生物在本領(lǐng)域均眾所周知。根據(jù)本發(fā)明合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⒖砂l(fā)酵的糖(如葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、 甘露糖或阿拉伯糖)直接或間接發(fā)酵(即轉(zhuǎn)化)為所期望的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物的實(shí)例包括真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces) 白勺，牛寺另Oi酉良(Saccharomyces cerevisiae) ^C^^i'f## (Saccharomyces uvarum)的菌株，畢赤酵母屬(Pichia)，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的菌株 如樹干畢赤酵母CBS 5773或巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)的菌株；假絲酵母屬 (Candida)的菌株，特別是產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)，阿糖發(fā)酵假絲酵母(Candidaarabinofermentans),ii^f ESjix^if^fiJ (Candida diddensii), Candida sonorensis,^Ρ^ 塔假絲酵母(Candida shehatae)，熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假絲 酵母(Candida boidinii)的菌株。其他發(fā)酵生物包括漢遜酵母屬(Hansenula)，特別是多 形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)或異常漢遜酵母(Hansenula anomala)；克魯維酵母 (Kluyveromyces)，特別是脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)或馬克斯克魯維酵 母(Kluyveromyces marxianus)；裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces),特別是粟酒裂殖酵 母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。優(yōu)選的細(xì)菌發(fā)酵生物包括埃希氏菌屬(Escherichia)，特別是大腸桿 菌(Escherichia coli)的菌株，發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，特別是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞 菌(Zymomonas mobilis)的菌株，發(fā)酵細(xì)菌屬(Zymobacter)，特別是棕櫚發(fā)酵細(xì) 菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，特別是產(chǎn)酸克雷伯 氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌屬(Leuconostoc)，特別是腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌屬 (Clostridium)，特別是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，腸桿菌屬(Enterobacter),特別是產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)的菌株，以及熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)的菌株，特別是熱厭氧桿菌BGlLl (App 1. Microbiol. Biotech. 77 :61_86)和乙醇熱厭氧桿 菌(Thermoanarobacter ethanolicus),，熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterther mosaccharoIyticum)或 Thermoanaerobacter mathrani 的菌株。還想到的是乳桿菌屬 (Lactobacillus)以及谷氨酸棒狀桿菌 R(Corynebacterium glutamicum R)，熱葡糖苷 酶芽孢桿菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵生物為C6糖類發(fā)酵生物，例如，釀酒酵母的菌株。對(duì)于發(fā)酵木素纖維素來源材料，涵蓋了 C5糖發(fā)酵生物。大多數(shù)C5糖發(fā)酵生物也 發(fā)酵C6糖。C5糖發(fā)酵生物的實(shí)例包括畢赤酵母，例如樹干畢赤酵母菌種的菌株。C5糖發(fā) 酵細(xì)菌也是已知的。而且，一些釀酒酵母菌株發(fā)酵C5(和C6)糖。實(shí)例為能夠發(fā)酵C5糖 的酵母屬菌種的經(jīng)遺傳修飾的菌株，包括，例如，Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology, p. 1852—1859 禾口 Karhumaa 等，2006，Microbial Cell Factories 5 18 禾口 Kuyper 等，2005，F(xiàn)EMS YeastResearch 5925-934 中涉及的菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述發(fā)酵生物添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中從而使得每ml發(fā)酵培 養(yǎng)基的中活的發(fā)酵生物(如酵母)計(jì)數(shù)為IO5至1012，優(yōu)選IO7至IOki的范圍內(nèi)，特別是約 5xl07。對(duì)于乙醇發(fā)酵，酵母是優(yōu)選的發(fā)酵生物。優(yōu)選的是酵母屬的菌株，特別是釀酒酵母 種的菌株，優(yōu)選對(duì)高水平的乙醇(即，高至例如約10、12、15或20vol%或更高的乙醇)具有 抗性的菌株?？墒匈彽慕湍赴?，例如，RED STAR 和ETHANOL RED 酵母(可由Fermentis/ Lesaffre, USA 得到)，F(xiàn)ALI (可由 Fleischmann，s Yeast, USA 得到)，SUPERSTART 和 THERMOSACC 新鮮酵母(可由 Ethanol Technology, WI,USA 得到)，BI0FERM AFT 和 XR(可 由 NABC-North American BioproductsCorporation，GA，USA 得到)，GERT STRAND(可由 Gert Strand AB, Sweden 得到)，以及 FERMI0L(可由 DSM Specialties 得到)。
根據(jù)本發(fā)明能夠自可發(fā)酵的糖類，包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、甘露糖或阿拉 伯糖產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵生物，優(yōu)選在準(zhǔn)確的條件下以特定的生長速率生長。當(dāng)將 所述發(fā)酵生物導(dǎo)入/添加入所述發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，接種的發(fā)酵生物經(jīng)過許多階段。起初，生長 并未發(fā)生。該期間稱為“遲滯期”，且可看作適應(yīng)期。在下一個(gè)稱為“指數(shù)期”的階段，生長 速率逐漸增加。經(jīng)過一個(gè)最大生長的期間，生長速率停止，且所述發(fā)酵生物進(jìn)入“穩(wěn)定期”。 又一段時(shí)間后所述發(fā)酵生物進(jìn)入“死亡期”，其間活細(xì)胞數(shù)減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述發(fā)酵生物處于遲滯期時(shí)，將所述醛脫氫酶添加至所述
發(fā)酵培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述發(fā)酵生物處于指數(shù)期時(shí)，將所述醛脫氫酶添加至所 述發(fā)酵培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述發(fā)酵生物處于穩(wěn)定期時(shí)，將所述醛脫氫酶添加至所 述發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵產(chǎn)物術(shù)語“發(fā)酵產(chǎn)物，，意指使用發(fā)酵生物通過包括發(fā)酵的方法或工藝生成的產(chǎn)物。根 據(jù)本發(fā)明所包括的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇類(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙 酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例 如，吐和0)2)；抗生素(例如，青霉屬和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、Β12、β-胡蘿卜 素)；以及激素。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，例如，燃料乙醇；飲用乙醇(即， 可飲用的中性酒)；或工業(yè)乙醇或用于消費(fèi)醇類工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工業(yè) (例如，發(fā)酵的乳制品)、皮革和煙草工業(yè)的產(chǎn)物。優(yōu)選的啤酒類型包括愛兒啤酒(ale)、 烈性啤酒(stout)、缽爾透黑啤酒(porters)、陳貯啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麥
(malt liquors)、happoushu(胃夕包胃)、冑酉享口卑胃(high-alcohol beer)、f氏酉享口卑胃 (low-alcohol beer)、低熱量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。使用的 優(yōu)選發(fā)酵工藝包括醇發(fā)酵工藝。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)可優(yōu)選用作燃 料。然而，對(duì)于乙醇，其亦可用作飲用乙醇。發(fā)酵用于本發(fā)明方法或工藝的植物起始材料可為含淀粉材料和/或含木素纖維素材 料。發(fā)酵條件基于例如，植物材料的種類、可用的可發(fā)酵糖類、發(fā)酵生物和/或期望的發(fā)酵 產(chǎn)物來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地確定合適的發(fā)酵條件。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵可在通常 使用的條件下進(jìn)行。優(yōu)選的發(fā)酵方法為厭氧方法。本發(fā)明的方法或工藝可作為分批或連續(xù)過程進(jìn)行。本發(fā)明的發(fā)酵可在超濾系統(tǒng)中 進(jìn)行，其中在存在固體、水和發(fā)酵生物的循環(huán)下保持滲余物，而滲透物為所期望的含有液體 的發(fā)酵產(chǎn)物。同樣涵蓋的是在具有超濾膜的連續(xù)膜反應(yīng)器中進(jìn)行的方法/工藝，其中在存 在固體、水和發(fā)酵生物的循環(huán)下保持滲余物，而滲透物為所期望的含有液體的發(fā)酵產(chǎn)物。在發(fā)酵后，發(fā)酵生物可自發(fā)酵漿料分離并再循環(huán)。發(fā)酵源自淀粉的糖不同類型的發(fā)酵生物可用于發(fā)酵來源于含淀粉材料的糖。發(fā)酵通常使用酵母，如 釀酒酵母作為發(fā)酵生物進(jìn)行。然而，細(xì)菌和絲狀真菌亦可用作發(fā)酵生物。一些細(xì)菌與，例如 釀酒酵母相比較，具有較高的最適發(fā)酵溫度。因此，在這樣的情況下，發(fā)酵可在高達(dá)75°C，例如，40-70°C，如50-60°C的溫度進(jìn)行。然而，亦已知最適溫度顯著較低，低至大約室溫(約 20°C)的細(xì)菌。合適的發(fā)酵生物的實(shí)例可見于上面的“發(fā)酵生物”部分。對(duì)于使用酵母產(chǎn)生乙醇，發(fā)酵可在一個(gè)實(shí)施方案中持續(xù)24至96小時(shí)，特別是35 至60小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵在20至40°C，優(yōu)選26至34°C，特別是約32°C的溫度 進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH為pH3至6，優(yōu)選約pH4至5。其他發(fā)酵產(chǎn)物可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適于該發(fā)酵生物的溫度下進(jìn)行。發(fā)酵通常在3至7，優(yōu)選pH 3.5至6的范圍的？禮如約？!1 5進(jìn)行。發(fā)酵通常持續(xù) 24-96小時(shí)。發(fā)酵木素纖維素來源的糖不同類型的發(fā)酵生物可用于發(fā)酵來源于含木素纖維素材料的糖。發(fā)酵通常由酵 母、細(xì)菌或絲狀真菌進(jìn)行，包括在上面“發(fā)酵生物”中提及的那些。如果目標(biāo)是C6可發(fā)酵的 糖，條件通常類似于上述的淀粉發(fā)酵。然而，如果目標(biāo)是發(fā)酵C5糖(例如，木糖)或C6和 C5可發(fā)酵的糖的組合，發(fā)酵生物和/或發(fā)酵條件可能會(huì)不同。細(xì)菌發(fā)酵可在比通常的酵母發(fā)酵更高溫度，如高至75°C，例如，40_70°C，如 50-60°C進(jìn)行，而后者通常在20-40°C的溫度進(jìn)行。然而，亦已知在低至20°C溫度的細(xì)菌發(fā) 酵。發(fā)酵通常在3到7范圍的pH，優(yōu)選pH 3.5到6，如約pH 5進(jìn)行。發(fā)酵通常持續(xù)24-96 小時(shí)。Ml^在發(fā)酵之后，可自發(fā)酵培養(yǎng)基中分離發(fā)酵產(chǎn)物?？烧麴s發(fā)酵培養(yǎng)基以提取期望的 發(fā)酵產(chǎn)物，或可自發(fā)酵培養(yǎng)基中通過微濾或膜過濾技術(shù)提取期望的發(fā)酵產(chǎn)物?；蛘?，可通過 氣提(stripping)回收發(fā)酵產(chǎn)物?；厥占夹g(shù)在本領(lǐng)域?yàn)楸娝苤?。自含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物自經(jīng)糊化的含淀粉材料中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法在此方面，本發(fā)明涉及自含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物(特別是乙醇)的方法，所述方 法包括液化步驟，以及順序或同時(shí)進(jìn)行的糖化和發(fā)酵步驟。本發(fā)明涉及自含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括下述步驟i)液化含淀粉材料；ii)糖化所述經(jīng)液化的材料；iii)使用一種或多種發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵，其中發(fā)酵在一種或多種醛脫氫酶的存在 下進(jìn)行。糖化步驟ii)以及發(fā)酵步驟iii)可順序或同時(shí)進(jìn)行。醛脫氫酶可在同時(shí)糖化和 發(fā)酵步驟或發(fā)酵步驟iii)之前(例如，在液化步驟i)或單獨(dú)的糖化步驟ii)過程中)和 /或過程中添加。所期望的發(fā)酵產(chǎn)物，如特別是乙醇，可任選地在發(fā)酵后回收，例如，通過蒸餾進(jìn)行。 合適的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵蓋的酶列于下面“酶”部分。液 化步驟優(yōu)選在α-淀粉酶，優(yōu)選細(xì)菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶存在的條件下 進(jìn)行。所述發(fā)酵生物優(yōu)選是酵母，優(yōu)選釀酒酵母菌株。合適的發(fā)酵生物列于上面“發(fā)酵生 物”部分。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，本發(fā)明的方法在步驟(i)之前還包括下述步驟
χ)減小含淀粉材料的粒度；y)形成包含含淀粉材料和水的漿料。減少所述含淀粉材料的粒度的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。特別涵蓋的是將 所述含淀粉材料磨制(milling)以減少粒度。含水漿料可含有10_55wt%含淀粉材料的干固體(DS)，優(yōu)選25_45wt%的干固體 (DS)，更優(yōu)選30-40%干固體(DS)。將漿料加熱到糊化溫度以上，并可添加α-淀粉酶，優(yōu) 選細(xì)菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化(或稀化(thinning))。在一個(gè)實(shí)施方案中， 在進(jìn)行本發(fā)明步驟i)中的α-淀粉酶處理前，漿料可經(jīng)噴射蒸煮(jet-cooked)以進(jìn)一步 使其糊化。液化過程可作為三步熱漿方法來進(jìn)行。將漿料加熱至60-95°C，優(yōu)選80-85°C，并 添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。然后可將漿料在95-140°C，優(yōu)選105-125°C的溫度噴 射蒸煮約1-15分鐘，優(yōu)選約3-10分鐘，特別是約5分鐘。使?jié){料冷卻至60-95°C并添加更 多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化方法通常在PH 4. 5-6. 5，特別是在ρΗ 5至 6進(jìn)行。糖化步驟(ii)中的可使用本領(lǐng)域眾所周知的條件進(jìn)行。舉例而言，完全的糖化步 驟可持續(xù)約24至約72小時(shí)，然而，亦通常僅在30-65°C，通常約60°C的溫度進(jìn)行通常40-90 分鐘的預(yù)糖化，然后是在同時(shí)發(fā)酵和糖化(SSF)方法中在發(fā)酵過程中的完全糖化。糖化通 常在20-75°C，優(yōu)選40-70°C，通常約60°C的溫度，在約ρΗ 4-5的pH，通常在約ρΗ 4. 5進(jìn)行。發(fā)酵產(chǎn)物，特別是乙醇生產(chǎn)中最廣泛使用的方法為同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)方法。 其中對(duì)糖化沒有保持階段，意思是發(fā)酵生物(如酵母)和酶，包括醛脫氫酶可一起添加。 當(dāng)發(fā)酵生物是酵母，如釀酒酵母菌株，而所期望的發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇時(shí)，SSF通常在20°C到 40 V，如28 V到35 °C，優(yōu)選約32 °C的溫度進(jìn)行。其他發(fā)酵產(chǎn)物可在本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知適于所用發(fā)酵生物的條件和溫度下 進(jìn)行發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)酵過程中溫度可上下調(diào)節(jié)。自未糊化的含淀粉材料產(chǎn)牛發(fā)酵產(chǎn)物的方法在此方面，本發(fā)明涉及自含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，而無含淀粉材料的糊化(通 常稱作“無烹制”)的方法。根據(jù)本發(fā)明，可產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇，而不液化含有含 淀粉材料的含水漿料。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在起始糊化溫度以下，優(yōu)選在 α -淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下對(duì)(例如，經(jīng)磨制的)含淀粉材料，例如粒狀淀粉進(jìn) 行糖化以產(chǎn)生糖類，所述糖類可由合適的發(fā)酵生物發(fā)酵成期望的發(fā)酵產(chǎn)物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，期望的發(fā)酵產(chǎn)物(優(yōu)選乙醇)自未糊化的(即，未烹制 的)，優(yōu)選經(jīng)磨制的谷類谷粒，如玉米(corn)產(chǎn)生。因此，在此方面，本發(fā)明涉及自含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括下述步驟(a)在所述含淀粉材料的起始糊化溫度以下的溫度糖化含淀粉材料；(b)使用一種或多種發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵，其中發(fā)酵在一種或多種醛脫氫酶的存在 下進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(a)或(b)同時(shí)(即，一步發(fā)酵)或順序進(jìn)行。所述發(fā)酵產(chǎn)物，如特別是乙醇，可任選地在發(fā)酵后回收，例如，通過蒸餾進(jìn)行。合適 的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵蓋的酶列于下面“酶”部分。通常淀粉酶，如葡糖淀粉酶和/或其他糖原生成酶和/或α-淀粉酶存在于發(fā)酵過程中。術(shù)語“起始糊化溫度”意指淀粉發(fā)生糊化的最低溫度。通常，在水中加熱的淀粉在 約50°C _75°C開始糊化；糊化的準(zhǔn)確溫度取決于特定的淀粉，并可方便的由本領(lǐng)域技術(shù)人 員確定。從而，起始糊化溫度可根據(jù)植物物種，植物物種的特定變種以及生長條件而改變。 在本發(fā)明的上下文中，給定含淀粉材料的起始糊化溫度可確定為使用由Gorinstein. S.和 Lii. C.，1992Starch/Starke, 44(12) :461_466描述的方法5%的淀粉顆粒喪失雙折射的溫 度。在步驟(a)之前，可制備含淀粉材料，如粒狀淀粉的漿料，其具有10_55wt%含淀 粉材料的干固體(DS)，優(yōu)選25-45襯％干固體，更優(yōu)選30-40%干固體。漿料可包含水分和 / 或工藝水(process water)，例如釜溜物(逆流(backset))、洗滌水(scrubber water)、 蒸發(fā)器冷凝液或餾出物、來自蒸餾的側(cè)線汽提器水(side-stripper water)或來自其他發(fā) 酵產(chǎn)物設(shè)備(Plant)的工藝水。由于本發(fā)明的方法在起始糊化溫度以下進(jìn)行，因此不發(fā)生 顯著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜餾物。在一個(gè)實(shí)施方案中，含水漿料包含約1 至約70vol %，優(yōu)選15-60vol %，特別為約30至50vol %的水和/或工藝水，如釜餾物(逆 流)、洗滌水、蒸發(fā)器冷凝物或蒸餾物，來自蒸餾的側(cè)線汽提器水，或來自其他發(fā)酵產(chǎn)物設(shè)備 的工藝水，或其組合等?？赏ㄟ^優(yōu)選以干磨或濕磨將其粒度減小到0. 05至3. Omm,優(yōu)選0. 1-0. 5mm來制 備含淀粉材料。在進(jìn)行本發(fā)明的方法或工藝后，含淀粉材料中至少85%，至少86%，至少 87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少 95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，或者優(yōu)選至少99 %的干固體轉(zhuǎn)化為可溶的淀粉水解 物。本發(fā)明該方面的方法在低于起始糊化溫度的溫度進(jìn)行。當(dāng)步驟(a)與發(fā)酵步驟 (b)分開進(jìn)行時(shí)，溫度通常位于30-75°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選45-60°C的范圍內(nèi)。然后下述單獨(dú)的 發(fā)酵步驟(b)在適于發(fā)酵生物的溫度進(jìn)行，當(dāng)所述發(fā)酵生物是酵母時(shí)，其通常為25-40°C的 范圍。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(a)和步驟(b)作為同時(shí)糖化和發(fā)酵方法進(jìn)行。在 這樣的實(shí)施方案中，當(dāng)所述發(fā)酵生物是酵母時(shí)，所述方法通常在25-40°C，如29-35°C，如 300C _34°C，如約32°C的溫度進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定何種方法條件是適合的。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行發(fā)酵從而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如 6wt%以下，如約3wt%以下，如約2wt%以下，如約Iwt %以下，如約0. 5%以下或0. 25wt% 以下，如約0. 以下。所述低水平的糖可通過簡單的使用經(jīng)調(diào)整量的酶和發(fā)酵生物來 實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地確定使用的酶和發(fā)酵生物的劑量/量。酶和發(fā)酵生物的 使用量也可經(jīng)選擇以保持麥芽糖在發(fā)酵液中的低濃度。舉例而言，麥芽糖水平可保持為約 0. 5wt%以下，如約0. 2wt%以下。本發(fā)明的方法可在pH約3-7，優(yōu)選pH 3. 5至6，或更優(yōu)選pH 4至5進(jìn)行。含淀粉材料根據(jù)本發(fā)明，可使用任何合適的含淀粉的起始材料，包括粒狀淀粉(未烹制的生 淀粉)。所述起始材料通?；谄谕陌l(fā)酵產(chǎn)物而選擇。適用于本發(fā)明方法或工藝的含 淀粉的起始材料的實(shí)例包括塊莖、根、莖、全谷粒、玉米、玉米穗軸、小麥、大麥、黑麥、買羅高粱、西米、木薯、樹薯、高粱、稻、豌豆(pea)、豆(bean)或甘薯，或它們的組合，或谷類。也涵 蓋蠟質(zhì)和非蠟質(zhì)類型的玉米和大麥。術(shù)語“粒狀淀粉”意指未烹制的生淀粉，S卩，以其天然形式存在于谷類、塊莖或谷粒 中的淀粉。淀粉在植物細(xì)胞中作為微小的不溶于水的顆粒形成。當(dāng)置于冷水中時(shí)，淀粉顆 粒可吸收少量液體并膨脹(swell)。在高至50°C至75°C的溫度，膨脹可為可逆的。然而，在 更高溫度開始稱為“糊化”的不可逆膨脹。待加工的粒狀淀粉可為高度精制的淀粉質(zhì)量，優(yōu) 選至少90 %，至少95 %，至少97 %或至少99. 5 %純，或者其可為更加粗制的含淀粉材料，其 含有包括非淀粉部分(例如胚殘余物和纖維)的(例如，經(jīng)磨制的)全谷粒。原材料(如 全谷粒)可通過例如磨制減小粒度以打開其結(jié)構(gòu)并允許進(jìn)一步的加工。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選兩 個(gè)方法，濕磨和干磨。在干磨中，將整粒磨碎并使用。濕磨給出胚和粗粉(淀粉顆粒和蛋白 質(zhì))的良好分離，并通常用于使用淀粉水解物產(chǎn)生，例如，糖漿的場(chǎng)合(location)。干磨和 濕磨在淀粉加工領(lǐng)域都是眾所周知的，并等同地涵蓋于本發(fā)明的方法中。在一個(gè)實(shí)施方案 中，粒度減少至約0. 05到3. Omm,優(yōu)選0. 1-0. 5mm,或使得至少30 %，優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選 至少70%，甚至更加優(yōu)選至少90%的含淀粉材料可穿過具有0. 05到3. Omm篩網(wǎng)，優(yōu)選0. 1 到0. 5mm篩網(wǎng)的篩。自軸蘭麵遍種舗內(nèi)勿在此方面，本發(fā)明涉及自含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。將含木素纖維 素材料轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇，具有大量原料(包括木材、農(nóng)業(yè)殘余物，草本作物，城市固 體廢物等)現(xiàn)成可用的優(yōu)勢(shì)。含木素纖維素材料通常主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組 成，并常常稱作“生物質(zhì)”。木素纖維素的結(jié)構(gòu)使其無法直接的接受酶水解。因此，含木素纖維素材料 必需經(jīng)預(yù)處理，例如，通過在足夠的壓力和溫度條件下的酸水解，這是為了打破木質(zhì) 素的密封(seal)并破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致半纖維素和纖維素組分的溶解 (solubilization)。所述纖維素和半纖維素可隨即用酶水解，例如通過纖維素分解酶和/ 或半纖維素分解酶，以將碳水化合物聚合物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖類，其可經(jīng)發(fā)酵成為所期望 的發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇。任選地，所述發(fā)酵產(chǎn)物可通過，例如，也如上所述的蒸餾加以回收。在此方面，本發(fā)明涉及自含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括下述步 驟 (a)預(yù)處理含木素纖維素材料；(b)將該材料水解；(c)使用一種或多種發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵，其中發(fā)酵在一種或多種醛脫氫酶存在的 情況下進(jìn)行。所述醛脫氫酶可在發(fā)酵之前和/或過程中添加。水解步驟(b)和發(fā)酵步驟(C)可 順序或同時(shí)進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟以SSF、SHF或HHF方法步驟進(jìn)行，所述步驟 進(jìn)一步在下面描述。預(yù)處理所述含木素纖維素材料可根據(jù)本發(fā)明在被水解和/或發(fā)酵之前經(jīng)預(yù)處理。在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，將經(jīng)預(yù)處理的材料在發(fā)酵之前和/或過程中水解，優(yōu)選酶催化水解。預(yù)處 理的目標(biāo)為分離和/或釋放纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素，且該方法改善了酶水解的速率。根據(jù)本發(fā)明，預(yù)處理步驟(a)可為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)預(yù)處理步驟。預(yù)處 理可在含水漿料中進(jìn)行。含木素纖維素材料可在預(yù)處理期間以IO-SOwt%，優(yōu)選20-50wt% 的量存在?；瘜W(xué)、機(jī)械和/或生物預(yù)處理所述含木素纖維素材料可根據(jù)本發(fā)明在水解和/或發(fā)酵前經(jīng)化學(xué)、機(jī)械和/或生 物預(yù)處理。機(jī)械處理(常常稱作物理預(yù)處理)可單獨(dú)使用或和后續(xù)或同時(shí)的水解(特別是 酶水解)組合使用，從而促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。優(yōu)選的，所述化學(xué)、機(jī)械和/或生物預(yù)處理在水解和/或發(fā)酵之前進(jìn)行?；蛘撸?述化學(xué)、機(jī)械和/或生物預(yù)處理可與水解，如與添加一種或多種纖維素分解酶或下面提及 的其他酶同時(shí)進(jìn)行，以釋放可發(fā)酵的糖類，例如葡萄糖和/或麥芽糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)處理的含木素纖維素材料在水解步驟(b)之 前或之后經(jīng)洗滌和/或解毒。這可能改善，例如，稀酸水解的含木素纖維素材料(例如，玉 米秸桿(corn stover))的可發(fā)酵性。解毒可以任何合適的方式進(jìn)行，例如，通過蒸汽氣提、 蒸發(fā)、離子交換、樹脂或木炭處理液體級(jí)分或洗滌所述經(jīng)預(yù)處理的材料來進(jìn)行。化學(xué)預(yù)處理根據(jù)本發(fā)明“化學(xué)預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/ 或釋放的任何化學(xué)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理步驟的實(shí)例包括用，例如稀酸、石灰、堿、 有機(jī)溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳進(jìn)行處理。進(jìn)一步，濕法氧化和控制PH的水熱解 (hydrothermolysis)也是期望的化學(xué)預(yù)處理。優(yōu)選的，所述化學(xué)預(yù)處理為酸處理，更優(yōu)選，為連續(xù)的稀酸和/或弱酸(mildacid) 處理，例如，用硫酸，或其他有機(jī)酸，如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物處理。也可 使用其他酸。弱酸處理在本發(fā)明的上下文中意為處理的PH在1-5，優(yōu)選pH在1-3的范圍內(nèi)。 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述酸濃度在0. 1到2. 0襯％酸(優(yōu)選硫酸)的范圍內(nèi)。該酸可與 根據(jù)本發(fā)明方法待發(fā)酵的材料混合或相接觸，且混合物可保持在160-220°C，如165-195 范圍內(nèi)的溫度，處理時(shí)間為數(shù)分鐘到數(shù)秒，例如，1-60分鐘，如2-30分鐘或3-12分鐘?？商?加強(qiáng)酸(如硫酸)來移除半纖維素。這增強(qiáng)了纖維素的可消化性。根據(jù)本發(fā)明也涵蓋纖維素溶劑處理，顯示其可將約90%的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。 也顯示當(dāng)木素纖維素結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，極大增強(qiáng)了酶水解。堿、H2O2、臭氧、有機(jī)溶劑(使用水 性醇中的路易斯酸，F(xiàn)eCl3, (Al)2SO4)、甘油、二ρ惡烷，苯酚或乙二醇屬于已知破壞纖維素結(jié) 構(gòu)并促進(jìn)水解的溶劑(Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96 :673_686)。使用堿，例如NaOH，Na2CO3和/或氨等的堿性化學(xué)預(yù)處理也在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。使用氨的預(yù)處理方法描述于 WO 2006/110891、WO 2006/110899、W02006/110900、WO 2006/110901，其通過提述并入本文。濕氧化技術(shù)涉及使用氧化劑，如，基于亞硫酸鹽的氧化劑等。溶劑預(yù)處理的實(shí)例包 括用DMSO (二甲亞砜)等的處理?；瘜W(xué)預(yù)處理通常進(jìn)行1到60分鐘，如5到30分鐘，但可 依賴于待進(jìn)行預(yù)處理的材料進(jìn)行較短或較長的時(shí)間。其他合適的預(yù)處理方法的實(shí)例描述于Schell等，2003，Appl. Biochem andBiotechn. 105—108 :69_85 禾口 Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96 :673_686，
12以及美國專利申請(qǐng)
發(fā)明者劉繼銀, 宋子良 申請(qǐng)人:諾維信公司