專利名稱：胞外基質(zhì)組合物的制作方法
胞外基質(zhì)組合物發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及胞外基質(zhì)組合物的產(chǎn)生和應(yīng)用，更具體涉及通過在低氧條件下于 合適的生長培養(yǎng)基中在表面上培養(yǎng)細(xì)胞得到的蛋白質(zhì)。背景信息胞外基質(zhì)(ECM)是圍繞和支持細(xì)胞的復(fù)雜結(jié)構(gòu)實(shí)體，其被體內(nèi)發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物組 織中。ECM通常稱作結(jié)締組織。ECM主要由三種主要類型的生物分子組成，包括如膠原蛋 白和彈性蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白，如肌原纖蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白的特化蛋白質(zhì)，和蛋白聚 糖。本領(lǐng)域已述及ECM組合物的體外生長及其在各種治療和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的使用。此類 ECM組合物的一種治療應(yīng)用包括軟組織和皮膚缺陷的治療和修復(fù)，如皺紋和疤痕。由如痤瘡、手術(shù)疤痕或衰老的缺陷引起的軟組織缺陷的修復(fù)和加強(qiáng)已被證實(shí)非常 困難。許多材料已經(jīng)用于校正軟組織缺陷，取得了不同程度的成功，但是，沒有材料完全安 全和有效。例如，硅引起各種生理和臨床問題，包括長期副作用，如小結(jié)、復(fù)發(fā)性蜂窩組織炎 和皮膚潰瘍。膠原蛋白組合物也已經(jīng)用作軟組織加強(qiáng)的可注射材料。膠原蛋白是結(jié)締組織的主 要蛋白質(zhì)和哺乳動(dòng)物中最豐富的蛋白質(zhì)，構(gòu)成總蛋白質(zhì)含量的約25%。文獻(xiàn)中目前述及觀 種膠原蛋白(詳細(xì)的清單，參見，如以下表1和表2)。但是，體內(nèi)超過90%的膠原蛋白是膠 原蛋白I、II、III和IV。不同的膠原蛋白材料已經(jīng)用于軟組織缺陷的治療，如重構(gòu)可注射牛膠原蛋白、交 聯(lián)的膠原蛋白或其它異源膠原蛋白。但是，這些膠原蛋白存在幾個(gè)問題。常見的問題包括為 去除潛在免疫原性物質(zhì)以避免對象體內(nèi)過敏反應(yīng)制備植入材料的復(fù)雜性和高成本。此外， 利用這些膠原蛋白治療的長期持久性還未被證實(shí)。也已述及其它可用于軟組織修復(fù)或加強(qiáng)的材料，如，含水凝膠中的生物相容性陶 瓷顆粒(美國專利號5，204，382)、熱塑性和/或熱硬化性材料(美國專利號5，278，202)和 乳酸基共混聚合物(美國專利號4，235，312)。此外，也已述及天然分泌的ECM組合物(美 國專利號6，284, 284)。但是，這些材料經(jīng)證實(shí)均有局限性。因此，需要新材料用于軟組織修復(fù)和加強(qiáng)，克服前述材料的缺陷。這種需要在于提 供安全、可注射、長期持久性、可生物吸收的軟組織修復(fù)和加強(qiáng)材料。體外培養(yǎng)的ECM組合物可另外用于治療受損組織，如，受損心肌及相關(guān)組織。該組 合物可用作植入物或植入裝置上的生物涂層，裝置如支架；促進(jìn)如心臟及相關(guān)組織的器官 內(nèi)血管化的人造血管；和在疝氣修復(fù)、盆底修復(fù)、創(chuàng)面修復(fù)和肩袖修復(fù)中有用的裝置，如膜 片(或補(bǔ)片，patch)和類似物。冠心病(CHD)，也被稱作冠心病(CAD)、缺血性心臟病和動(dòng)脈粥樣硬化心臟病，其 特點(diǎn)是供給血液和氧氣到心臟的小血管窄化。冠心病通常由稱作動(dòng)脈硬化的病癥引起，其發(fā)生于脂肪物質(zhì)和斑塊積聚在動(dòng)脈壁上引起動(dòng)脈窄化時(shí)。由于冠狀動(dòng)脈窄化，流向心臟的 血液可減慢或停滯，引起胸痛(穩(wěn)定性心絞痛)、氣短、心臟病發(fā)作及其它癥狀。在美國冠心病(CHD)是引起男性和女性死亡的主要原因。根據(jù)美國心臟協(xié)會(huì) (American Heart Association)，1500萬人以上有某些形式的該病癥。盡管冠心病的癥狀 和體征在疾病晚期明顯，大多數(shù)冠心病患者在心臟病突然發(fā)作之前數(shù)十年沒有隨疾病進(jìn)展 而表現(xiàn)出疾病。該疾病是引起突然死亡最普遍的原因，也是年齡20歲以上男性和女性死亡 最普遍的原因。根據(jù)美國的目前趨勢，一半健康的40歲男性會(huì)在將來患有CHD，三分之一健 康的40歲女性同樣如此。在患病心臟或其它受損心臟中改善血流的當(dāng)前方法包括創(chuàng)傷性外科手術(shù)技術(shù)， 如，冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)、血管成形術(shù)和動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)。這些方法自然在手術(shù)中和手術(shù)后具 有高度的固有風(fēng)險(xiǎn)，并且通常僅為心肌缺血提供臨時(shí)治療。因此，需要新的治療選擇以增加 當(dāng)前可用技術(shù)治療CHD和相關(guān)癥狀的成功。體外培養(yǎng)的ECM組合物可另外用于修復(fù)和/或再生受損細(xì)胞或組織，如軟骨或骨 軟骨細(xì)胞。骨軟骨組織是有關(guān)或包含骨或軟骨的任何組織。本發(fā)明所述的組合物對以下骨 軟骨缺陷的治療有用，如退化性結(jié)締組織病，如類風(fēng)濕和/或骨關(guān)節(jié)炎，及由于外傷具有軟 骨缺陷的患者的缺陷。當(dāng)前修復(fù)骨軟骨損傷的嘗試包括植入在生物相容和生物可降解水凝膠移植物中 的人軟骨細(xì)胞，試圖提高恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的可能性。此外，已述及在藻酸鹽珠子或包括聚 硫酸化藻酸鹽的基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，生成透明型軟骨組織。但是，通過人自體軟骨 細(xì)胞的植入來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的軟骨內(nèi)損傷的嘗試取得了有限的成功。因此，需要新的治療 選擇以增加當(dāng)前可用技術(shù)治療骨軟骨缺陷的成功。體外培養(yǎng)的ECM組合物也在組織培養(yǎng)體系中有用，用于生成工程化組織植入物。 組織工程化領(lǐng)域包括利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生成新的生物組織或修復(fù)受損組織。在干細(xì)胞 革命的部分推動(dòng)下，組織工程技術(shù)為損傷后組織再生和替換或退化性疾病的治療提供了希 望。其也可用于美容過程領(lǐng)域中。組織工程技術(shù)利用各種細(xì)胞類型和培養(yǎng)技術(shù)可用于生成自體或異源組織或細(xì)胞。 在構(gòu)建自體植入物中，可以獲得供體組織并將其解離成單個(gè)細(xì)胞，隨后附著于待植入在功 能組織期望位點(diǎn)的基底上并在其上培養(yǎng)。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，許多分離的細(xì)胞類型可在體 外擴(kuò)增，但是依賴貼壁細(xì)胞需要特殊環(huán)境，通常包括三維支架的存在，其起生長模板的作用。當(dāng)前組織工程技術(shù)一般提供人造植入物。成功的細(xì)胞移植療法依賴于用于體內(nèi)和 體外組織培養(yǎng)的合適的基底的發(fā)展。因此只包含天然材料并適于植入的ECM的發(fā)展會(huì)有更 多內(nèi)源組織特性。因此，天然ECM材料的生成是組織工程領(lǐng)域中持續(xù)的挑戰(zhàn)。發(fā)明_既述本發(fā)明部分基于如下基本發(fā)現(xiàn)，在刺激早期胚胎環(huán)境(如，低氧和減少的重力)的 條件下培養(yǎng)于表面(如，二維或三維表面)的細(xì)胞產(chǎn)生具有胎兒特性的ECM組合物。通過 在低氧條件下于包含一種或多種胚胎蛋白質(zhì)的表面上培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的ECM組合物具有多 種有益的應(yīng)用。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備包含一種或多種胚胎蛋白質(zhì)的ECM組合物的方法。該方法包括在低氧條件下于合適的生長培養(yǎng)基中在表面(如，二維或三維表面)上培 養(yǎng)細(xì)胞，產(chǎn)生可溶和不可溶的部分。在不同方面，該組合物單獨(dú)包括可溶或不可溶的部分， 及可溶和不可溶部分的組合。在不同方面，產(chǎn)生的組合物包括層粘連蛋白、膠原蛋白和Wnt 因子的基因表達(dá)的增量調(diào)節(jié)和產(chǎn)生。在其它方面，產(chǎn)生的組合物包括層粘連蛋白、膠原蛋白 和Wnt因子的基因表達(dá)的減量調(diào)節(jié)。在其它方面，該組合物是物種特異性的并包括來自單 個(gè)動(dòng)物物種的細(xì)胞和/或生物材料。盡管體外培養(yǎng)的ECM組合物在人類治療中有用，該組 合物也可用于動(dòng)物的其它物種。因此，該組合物非常適合獸醫(yī)應(yīng)用。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供產(chǎn)生Wnt蛋白質(zhì)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的方 法。該方法包括在低氧條件下于合適的生長培養(yǎng)基中在表面(如，二維或三維表面)上培 養(yǎng)細(xì)胞，從而產(chǎn)生Wnt蛋白質(zhì)和VEGF。在不同方面，生長培養(yǎng)基無血清且低氧條件為1-5% 氧。在相關(guān)方面，與約15-20%氧的氧條件下產(chǎn)生的培養(yǎng)基相比，Wnt種類被增量調(diào)節(jié)。在 示例性方面，Wnt種類是wnt 7a和wnt 11。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括通過用本文所述的ECM組合物接觸要被修復(fù)或再 生的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)和/或再生的方法。在一方面，該細(xì)胞是骨軟骨細(xì)胞。因此，該方法 考慮骨軟骨缺陷的修復(fù)。在另一實(shí)施方式中，ECM組合物可用作植入物或植入裝置上的生物涂層。在不同 方面，本發(fā)明的組合物包括在植入物中或用作可植入裝置——如支架和人造血管——上的 生物涂層，以促進(jìn)如心臟及相關(guān)組織的器官內(nèi)的血管化作用。在相關(guān)方面，該組合物包括在 組織再生膜片或植入物中，用于疝氣修復(fù)、盆底修復(fù)、創(chuàng)傷修復(fù)、肩袖修復(fù)和類似修復(fù)。還有另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包括對象皮膚表面的改善方法，包括向?qū)ο蟀櫦y 部位給予本文所述的ECM組合物。還有進(jìn)一步實(shí)施方式中，本發(fā)明包括對象軟組織修復(fù)或 加強(qiáng)的方法，包括向?qū)ο蟀櫦y部位給予本文所述的ECM組合物。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括組織培養(yǎng)體系。在不同方面，培養(yǎng)體系由本文所述 的ECM組合物組成，如包含于二維或三維支持材料中。另一方面，本文所述的ECM組合物作 為不同類型細(xì)胞生長的支持物或二維或三維支持物。例如，該培養(yǎng)體系可用于支持干細(xì)胞 的生長。一方面，干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)元干細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物可用于提供表面涂層，與裝置在對象體內(nèi)的 植入聯(lián)合，用來促進(jìn)內(nèi)皮化和血管化作用。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物可用于提供治療受損組織的方法。該方法包 括在受損組織的治療允許的條件下用組合物接觸受損組織，該組合物通過在低氧條件下于 包含一種或多種胚胎蛋白質(zhì)的二維或三維表面上培養(yǎng)細(xì)胞而生成。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于細(xì)胞運(yùn)送或在運(yùn)送位點(diǎn)維持的包含本文所述 ECM組合物的生物載體。該載體可用于這樣的應(yīng)用中，如將細(xì)胞——諸如干細(xì)胞——注入受 損心肌，或用于腱和韌帶的修復(fù)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供刺激或促進(jìn)毛發(fā)生長的方法。該方法包括用本文 所述的ECM組合物接觸細(xì)胞。在一示例性方面，該細(xì)胞是毛囊細(xì)胞。在不同方面，可體內(nèi)或 體外接觸該細(xì)胞。附圖簡述

圖1顯示hECM包被的聚丙烯篩網(wǎng)植入2周后FBGC形成的圖形表示。圖IA顯示未包被(第一柱)和hECM包被(第二柱)的纖維植入2周后每纖維FBGCs的數(shù)量。圖IB 顯示未包被(1-3柱)和hECM包被柱)的纖維植入2周后每纖維FBGCs的數(shù)量。*表 示 ρ < 0. 05。圖2顯示hECM包被的聚丙烯篩網(wǎng)植入2周后FBGC形成的圖形表示。圖2A顯示 未包被(第一柱)和hECM包被(第二柱)的纖維植入5周后每纖維FBGCs的數(shù)量。圖2B 顯示未包被(1和3柱)和hECM包被(2和4柱)的纖維植入5周后每纖維FBGCs的數(shù)量。圖3顯示人毛囊細(xì)胞的圖像表示。圖3A是人毛囊細(xì)胞在hECM存在下細(xì)胞培養(yǎng)4 周后移植入小鼠并又生長4周后的圖像，而圖;3B是對照囊細(xì)胞(濾泡細(xì)胞)的圖像。圖4表示對胞外基質(zhì)組合物(小鼠ECM和人ECM)的成纖維代謝反應(yīng)的圖形表示， 如MTT檢測所示。圖5是響應(yīng)于人成纖維細(xì)胞暴露于hECM的細(xì)胞數(shù)量的圖形表示，如Pico Green Assay所測。圖6是對41個(gè)人類對象取激光治療后3、7和14天的紅斑評價(jià)的圖形表示。于范 圍0(無)到4(嚴(yán)重)評價(jià)紅斑的嚴(yán)重性。4個(gè)數(shù)據(jù)集(0. IXhECM、IXhECM、10XhECM和 對照，從左到右)的各組表示第3天(左)、第7天(中)和第14天(右)的評價(jià)。圖7是對41個(gè)人類對象取激光治療后3、7和14天的水腫評價(jià)的圖形表示。于范 圍0(無)到2.5(嚴(yán)重)評價(jià)水腫的嚴(yán)重性。4個(gè)數(shù)據(jù)集(0. IXhECM、IXhECM、10XhECM 和對照，從左到右)的各組表示第3天(左)、第7天(中)和第14天(右)的評價(jià)。圖8是對41個(gè)人類對象取激光治療后3、7和14天的結(jié)痂評價(jià)的圖形表示。于范 圍0(無)到3.5(嚴(yán)重)評價(jià)紅斑的嚴(yán)重性。4個(gè)數(shù)據(jù)集(0. IXhECM、IXhECM、10XhECM 和對照，從左到右)的各組表示第3天(左)、第7天(中)和第14天(右)的評價(jià)。圖9是對41個(gè)人類對象取激光治療后3、7和14天的經(jīng)表皮失水(TWEL)值的圖形 表示。于范圍0(無)到4(嚴(yán)重)評價(jià)TWEL的嚴(yán)重性。4個(gè)數(shù)據(jù)集(0. IXhECM、IXhECM、 IOXhECM和對照，從左到右)的各組表示第3天(左)、第7天(中)和第14天(右)的 評價(jià)。圖10是眼周區(qū)域硅復(fù)制品的三維輪廓圖像分析的圖形表示。對22個(gè)對象在激光 治療前、治療后4周和治療后10周取數(shù)據(jù)點(diǎn)。數(shù)據(jù)集A表示hECM給藥值；數(shù)據(jù)集B表示對 照。圖11是激光手術(shù)后的礦脂使用分析的圖形表示。圖12是用在激光手術(shù)后0、3、5、7、10和14天取的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行的皮膚紅斑分析的 圖形表示。圖13是用在激光手術(shù)后0、3、5、7、10和14天取的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行的mexameter分析 的圖形表示。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及制備包括一種或多種胚胎蛋白質(zhì)的ECM組合物的方法。特別地，該組 合物通過在低氧條件下于合適的生長培養(yǎng)基中在表面(如，二維或三維表面)上培養(yǎng)細(xì)胞 生成。該培養(yǎng)方法產(chǎn)生可溶和不可溶部分，其可分開或結(jié)合使用，得到生理上可接受的組合 物，具有各種應(yīng)用。本發(fā)明的組合物具有各種應(yīng)用，包括但不限于促進(jìn)受損細(xì)胞或組織的修復(fù)和/或再生，用于膜片和植入物中以促進(jìn)組織再生(如疝氣修復(fù)、盆底修復(fù)、肩袖修復(fù)和創(chuàng)面修 復(fù))，用于組織培養(yǎng)體系中以培養(yǎng)如干細(xì)胞的細(xì)胞，用于與植入裝置(如，起搏器、支架、支 架移植物、人造血管、心臟瓣膜、支路、送藥口或?qū)Ч?、疝氣和盆底修?fù)膜片)結(jié)合使用的表 面涂層，促進(jìn)軟組織修復(fù)、加強(qiáng)和/或諸如皺紋的皮膚表面的改善，用作生物防粘劑或用于 細(xì)胞運(yùn)送或在運(yùn)送位點(diǎn)維持的生物載體。本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)在血管發(fā)生前刺激早期胚胎環(huán)境(低氧和減少的重 力)條件下培養(yǎng)于二維或三維表面上的細(xì)胞產(chǎn)生具有胎兒特性的ECM組合物，包括胚胎蛋 白質(zhì)的生成。細(xì)胞在低氧條件下的生長證明了具有胎兒特性和生長因子表達(dá)的獨(dú)特的ECM。 不同于在常規(guī)培養(yǎng)條件下的ECM培養(yǎng)，超過5000個(gè)基因在低氧條件下培養(yǎng)的ECM中差異表 達(dá)。這造成了具有不同特性的培養(yǎng)的ECM和不同的生物組合物。例如，低氧條件下產(chǎn)生的 ECM類似于胎兒間充質(zhì)組織，原因是膠原蛋白III、IV和V型和如纖連蛋白、SPARC、血小板 反應(yīng)蛋白和透明質(zhì)酸的糖蛋白相對豐富。低氧也加強(qiáng)調(diào)節(jié)傷口愈合和器官發(fā)生的因子的表達(dá)，如VEGF、FGF-7和TGF-β及 多種Wnt因子，該因子包括wnts 2b、4、7a、10a和11。培養(yǎng)的人胚胎ECM也體外刺激人成纖 維細(xì)胞中代謝活性的增加，如通過增加的酶活性所測定的。此外，響應(yīng)于培養(yǎng)的胚胎ECM細(xì) 胞數(shù)量有所增加。在描述本發(fā)明的組合物和方法之前，要理解的是本發(fā)明不限于所述的特定組合 物、方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些組合物、方法和條件可以變化。也要理解的是本文所用的術(shù) 語是僅以描述特定實(shí)施方式為目的，非意欲限制性的，而本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利 要求限定。如本說明書和所附的權(quán)利要求所用，除非上下文明確指出，否則單數(shù)形式的“a”、 “an”和“the”包括復(fù)數(shù)參考。因此，例如，參考“the method”包括一個(gè)或多個(gè)方法和/或 本文所述類型的步驟，其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容等的基礎(chǔ)上將是顯而易見 的。不同實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備包含一種或多種胚胎蛋白質(zhì)的ECM組合物的方 法及其應(yīng)用。特別地，通過在低氧條件下于合適生長培養(yǎng)基中在二維或三維表面上培養(yǎng)細(xì) 胞而生成該組合物。通過在二維或三維構(gòu)架上使細(xì)胞生長獲得組合物，從而產(chǎn)生多層細(xì)胞 培養(yǎng)體系。根據(jù)本發(fā)明，生長于構(gòu)架支持體的細(xì)胞在多層上生長，形成細(xì)胞基質(zhì)。由于低氧 培養(yǎng)條件，培養(yǎng)的細(xì)胞在低氧條件下的生長相對于常規(guī)培養(yǎng)導(dǎo)致差異基因表達(dá)。ECM是蛋白質(zhì)和生物聚合物的組合物，該生物聚合物實(shí)質(zhì)上包括由細(xì)胞培養(yǎng)生成 的組織?；|(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞，是依賴貼壁型細(xì)胞，當(dāng)附于適于細(xì)胞培養(yǎng)的材料和表面 時(shí)要生長。由培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的ECM材料沉積在三維結(jié)構(gòu)中，為組織樣結(jié)構(gòu)的形成提供空間。提供三維結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)材料稱為支架結(jié)構(gòu)。ECM沉積的空間是例如編織篩網(wǎng)或由稱 作微載體的球形珠緊密構(gòu)型產(chǎn)生的間隙空間內(nèi)的開口的形式。如本文所用，“胞外基質(zhì)組合物”包括可溶和不可溶部分(fraction)或其任意部分 (portion)。不可溶部分包括那些沉積在支持物或支架上的分泌的ECM蛋白質(zhì)和生物組分。 可溶部分包括涉及培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中已經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞并且細(xì)胞已經(jīng)分泌活性劑(多種)于 其中，并包括那些沒有沉積在支架上的蛋白質(zhì)和生物組分。兩部分可收集并任選進(jìn)一步處 理，單獨(dú)使用或結(jié)合本文所述的各種應(yīng)用使用。
用于培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞的支持體或支架可以是任何材料和/或形狀，其(a)允許細(xì)胞 附著到其上(或可改性成允許細(xì)胞附著到其上)；和(b)允許細(xì)胞生長一層以上(即，形成 三維組織)。其它實(shí)施方式中，實(shí)質(zhì)上二維的片或膜或珠可用于培養(yǎng)充分三維形式的細(xì)胞。一方面，生物相容材料形成結(jié)構(gòu)或支架，其中該結(jié)構(gòu)具有間隙空間，用于細(xì)胞附著 并生長稱為三維組織。在一些實(shí)施方式中，構(gòu)架的開口和/或間隙空間具有適當(dāng)?shù)某叽纾?許細(xì)胞橫跨該開口或空間。保持活躍生長細(xì)胞橫跨構(gòu)架看來促進(jìn)了負(fù)責(zé)本文所述活性的生 長因子庫(repertoire)的生成。如果開口太小，細(xì)胞可能迅速完成匯合，但是不能輕松脫 離篩網(wǎng)。這些被捕獲的細(xì)胞可能呈現(xiàn)接觸抑制和停止適當(dāng)因子的產(chǎn)生，該因子對于支持增 殖和保持長期培養(yǎng)是必要的。如果開口太大，則細(xì)胞可能不能橫跨開口，造成適當(dāng)因子的基 質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量減少，該因子對于支持增殖和保持長期培養(yǎng)是必要的。一般地，間隙空間至少約 lOOum、至少140um、至少約150um、至少約180um、至少約200um或至少約220um。當(dāng)使用篩 網(wǎng)型基質(zhì)，如本文示例，我們發(fā)現(xiàn)開口范圍約100 μ m到約220 μ m會(huì)令人滿意地地工作。但 是，取決于構(gòu)架結(jié)構(gòu)和復(fù)雜性，其它尺寸也允許。根據(jù)本文所述的方法，允許細(xì)胞橫跨和繼 續(xù)復(fù)制和長時(shí)期生長的任何形狀或結(jié)構(gòu)可發(fā)揮功能以精心產(chǎn)生細(xì)胞因子。在一些方面，構(gòu)架由聚合物或線形成，該線經(jīng)編織、機(jī)織、針織或其它方式編排形 成構(gòu)架，如篩網(wǎng)或織物。該材料也可通過澆鑄材料或構(gòu)造成泡沫、基質(zhì)或海綿狀支架而形 成。在其它方面，構(gòu)架是纏結(jié)纖維的形式，該纖維通過共同擠壓聚合物或其它纖維，生成有 間隙空間的材料。在培養(yǎng)中，構(gòu)架可以采用任何形式或幾何學(xué)用于細(xì)胞生長。因此，其它形 式的構(gòu)架，如下進(jìn)一步說明，可滿足產(chǎn)生適當(dāng)條件培養(yǎng)基的需要。一些不同材料可用于構(gòu)成支架或構(gòu)架。這些材料包括非聚合和聚合材料。聚合 物，當(dāng)使用時(shí)，可以是任何類型的聚合物，如同聚物、無規(guī)聚合物、共聚物、嵌段聚合物、共嵌 段聚合物(如，二嵌段聚合物、三嵌段聚合物等)、線性或分支聚合物和交聯(lián)或非交聯(lián)聚合 物。用作支架或構(gòu)架的非限制性材料實(shí)例包括玻璃纖維、聚乙烯、聚酰胺(如，尼龍)、聚酯 (如，滌綸)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(如，聚氯乙烯；PVC)、聚碳酸酯、聚四氟 乙烯(PTFE ；TEFLON) Uhermanox(TPX)、硝化纖維、多糖(如，纖維素、殼聚糖、瓊脂糖)、多肽 (如，絲、凝膠、膠原蛋白)、聚乙二醇酸(PGA)和葡聚糖等。在一些方面，構(gòu)架或珠子可由在使用條件下隨時(shí)間降解的材料制成。生物降解也 指當(dāng)體內(nèi)或在體外條件下施用時(shí)化合物或組合物的吸收或降解。生物降解可通過生物試劑 的作用直接或間接發(fā)生。生物降解材料的非限制性實(shí)例包括聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚 (三亞甲基碳酸鹽)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(即，PLGA)、聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、 聚己酸內(nèi)酯、獸腸線縫合材料、膠原蛋白(如，馬膠原蛋白泡沫)、聚乳酸或透明質(zhì)酸等。例 如，這些材料可編織成三維構(gòu)架，如膠原蛋白海綿或膠原蛋白凝膠。在其它方面，當(dāng)長時(shí)期冷藏維持培養(yǎng)物和/或當(dāng)需要額外的結(jié)構(gòu)完整性，該構(gòu)架 可由非生物降解材料組成。如本文所用，非降解材料指在培養(yǎng)基條件下不明顯降解或分解 的材料。示例性非降解材料包括——作為非限制性實(shí)例——尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯 酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、膨脹型PTFE(ePTFE)和纖維素。示例性非降解構(gòu)架包括 尼龍網(wǎng)——可以商品名Nitex 獲得，具有平均孔徑140 μ m和平均尼龍纖維直徑90 μ m的尼 龍濾網(wǎng)(#3-210/36, Tetko, Inc.，N. Y.)。在其它方面，珠子、支架或構(gòu)架是生物降解和非生物降解材料的結(jié)合物。非生物降
9解材料在培養(yǎng)期間為支架提供穩(wěn)定性，而生物降解材料使足以生成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的間隙空間形 成，該細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生足以用于治療應(yīng)用的細(xì)胞因子。生物降解材料可包被于非生物降解材 料上或機(jī)織、編織或形成為篩網(wǎng)?？墒褂蒙锝到夂头巧锝到獠牧系母鞣N結(jié)合物。示例性 結(jié)合物是用生物降解聚合物薄膜包被的聚(聚對苯二甲酸乙二酯)(PET)織物、聚(D-L-乳 酸-共-乙醇酸)，以獲得極性結(jié)構(gòu)。在不同方面，可以在接種細(xì)胞前預(yù)處理支架或構(gòu)架材料，提高細(xì)胞的粘附力。例 如，在一些實(shí)施方式中，在接種細(xì)胞前，尼龍網(wǎng)用0. IM的乙酸處理，并溫育于聚賴氨酸、胎 牛血清和/或膠原蛋白中，以包被該尼龍。也可同樣用硫酸處理聚苯乙烯。其它實(shí)施方式 中，在支持構(gòu)架存在下細(xì)胞生長可通過如下方法進(jìn)一步加強(qiáng)于構(gòu)架上添加或包被蛋白質(zhì) (如，膠原蛋白、彈性蛋白纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、糖胺聚糖(如，硫酸乙酰肝素、4-硫酸軟 骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素等)、纖連蛋白和/或糖聚物(聚[N-對乙烯 苯甲基-D-乳酸酰胺]，PVLA)，以提高細(xì)胞的粘附力。當(dāng)其材料是對細(xì)胞的粘附力差的基 底時(shí)，對支架或構(gòu)架的處理有用。一方面，篩網(wǎng)用于ECM的產(chǎn)生。篩網(wǎng)是6種材料平紋形式的編織尼龍，具有約 100 μ m的孔和約125 μ m厚。在培養(yǎng)中，成纖維細(xì)胞通過帶電蛋白質(zhì)的相互作用附于尼龍并 生長于篩網(wǎng)空隙中而生成和沉積ECM蛋白質(zhì)。過大或過小的篩網(wǎng)孔可能效率不高，但可與 沒有實(shí)質(zhì)上改變生成或沉積ECM的能力的以上那些區(qū)分開來。另一方面，其它編織材料用 于ECM制備，如聚烯烴材料，是編織構(gòu)型為細(xì)胞生長和ECM沉積提供足夠幾何空間。例如，通過以下方法制備尼龍網(wǎng)用于本發(fā)明的任何步驟的培養(yǎng)切割成所需尺寸， 用0. 1-0. 5M乙酸洗滌，接著用高純度水漂洗，然后蒸汽滅菌。為了用作ECM生成的三維支 架，篩網(wǎng)尺寸設(shè)為約IOcmX IOcm的正方形。但是，篩網(wǎng)可以是適于意欲應(yīng)用的任何尺寸，并 可用于本發(fā)明的任何方法，包括接種、細(xì)胞生長和ECM生成的培養(yǎng)方法和最終形式的制備。在其它方面，用于產(chǎn)生培養(yǎng)組織的支架由微載體——其為珠子或顆?！M成。 該珠子可以是微觀的或宏觀的及可進(jìn)一步成形為需要的尺寸以允許向組織內(nèi)滲透，或進(jìn)一 步緊壓形成特定的幾何形狀。一些組織滲透實(shí)施方式中，用于細(xì)胞培養(yǎng)的構(gòu)架包括與細(xì)胞 結(jié)合形成三維組織的顆粒。細(xì)胞附于顆粒并彼此附著，形成三維組織。顆粒和細(xì)胞的復(fù)合 體大小足以進(jìn)藥入組織或器官，如通過注射或?qū)Ч?。一般考慮珠子或微載體為二維體系或 支架。如本文所用，“微載體”指具有納米級到微米級尺寸的顆粒，其中該顆粒可以是任 何形狀或幾何形狀，不規(guī)則形，非球形，球形或橢圓體形狀。適于此目的的微載體的尺寸可以是適于特定應(yīng)用的任何尺寸。一些實(shí)施方式中， 適于三維組織的微載體的尺寸可以是可通過注射進(jìn)藥的那些尺寸。一些實(shí)施方式中，微 載體具有至少約Ιμπκ至少約10 μ m、至少約25 μ m、至少約50 μ m、至少約100 μ m、至少約 200 μ m、至少約300 μ m，至少約400 μ m、至少約500 μ m、至少約600 μ m、至少約700 μ m、至少 約800 μ m、至少約900 μ m、至少約1000 μ m的顆粒尺寸范圍?！┓矫?，其中微載體由生物降解材料制成。一些方面，可使用包括兩層或多層不 同生物降解聚合物的微載體。一些實(shí)施方式中，至少外部第一層具有生物降解特性，以在培 養(yǎng)中形成三維組織，同時(shí)具有不同于第一層的特性的可生物降解的至少內(nèi)部第二層被制成 當(dāng)進(jìn)藥到組織或器官時(shí)腐蝕。
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一些方面，微載體是多孔微載體。多孔微載體指具有間隙的微載體，通過該間隙分 子從微粒中可擴(kuò)散進(jìn)來或出去。其它實(shí)施方式中，微載體是非多孔微載體。非多孔微粒指 這樣的微粒其中選定尺寸的分子不在微粒中擴(kuò)散進(jìn)來或出去。用于組合物中的微載體是生物相容的，且對細(xì)胞低毒或無毒性。合適的微載體的 選擇可取決于要治療的組織、要治療的受損類型、需要的治療長度、細(xì)胞培養(yǎng)物的體內(nèi)壽命 和形成三維組織所需的時(shí)間。微載體可包括各種聚合物，天然或合成的，帶電(即，陰性或 陽性)或不帶電的，生物降解或非生物降解的聚合物。聚合物可以是同聚物、無規(guī)共聚物、 嵌段共聚物、接枝共聚物和分支聚合物?！┓矫妫⑤d體包括非生物降解微載體。非生物降解微膠囊和微載體包括但不 限于由聚砜、聚(丙烯腈-共-氯乙烯)、乙烯乙酸乙烯酯、羥乙基甲基丙烯酸甲基丙烯酸 甲酯共聚物制成的那些。其可用于提供組織膨脹特性或用于微載體被機(jī)體去除的實(shí)施方式 中。一些方面，微載體包括可降解的支架。其包括從天然存在的聚合物制成的微載體， 其非限制性實(shí)例包括血纖蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、膠原蛋白、明膠、卵磷脂、殼聚糖、藻酸 鹽或諸如聚賴氨酸的聚氨基酸等。在其它方面，可降解的微載體由合成聚合物制成，其非限 制性實(shí)例包括聚丙交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚 (己酸內(nèi)酯)、聚二氧六環(huán)酮三亞甲基碳酸鹽、聚羥基烷基酸酯(如，聚(羥基丁酸酯)、聚 (乙基谷氨酸)、聚(DTH亞氨基碳(雙酚A亞氨基碳)、聚(鄰酯)和聚氰基丙烯酸酯等。—些方面，微載體包括水凝膠，其一般為充水的親水性聚合物網(wǎng)絡(luò)。水凝膠具有選 擇性觸發(fā)聚合物溶脹的優(yōu)勢。取決于聚合物網(wǎng)絡(luò)的組成，微粒的溶脹可以由各種刺激觸發(fā)， 包括PH、離子強(qiáng)度、熱、電、超聲和酶活性。在水凝膠組合物中有用的聚合物的非限制性實(shí)例 包括由以下的聚合物形成的那些聚合物聚(丙交酯-共-乙交酯) ’聚(N-異丙基丙烯酰 胺)；聚(甲基丙烯酸接枝聚乙二醇)；聚丙烯酸和聚(氧丙烯-共-氧乙烯)乙二醇；和天 然化合物，如硫酸軟骨素、殼聚糖、明膠、血纖蛋白原或合成聚合物和天然聚合物的混合物， 例如殼聚糖-聚(環(huán)氧乙烷)。聚合物可以可逆或不可逆地交聯(lián)，形成適于形成三維組織的 凝膠。在示例性方面，用于本發(fā)明的微載體或珠子的全部或部分由葡聚糖組成。根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)方法適用于不同類型的細(xì)胞的增殖，包括基質(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì) 胞，尤其原代人新生兒包皮成纖維細(xì)胞。在不同方面，接種于支架或構(gòu)架上的細(xì)胞可以是基 質(zhì)細(xì)胞，其包括成纖維細(xì)胞，有或無其它細(xì)胞，如以下進(jìn)一步說明。一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是 一般得自結(jié)締組織的基質(zhì)細(xì)胞，包括但不限于(1)骨；(2)松散的結(jié)締組織，包括膠原蛋白 和彈性蛋白；(3)形成韌帶和腱的纖維結(jié)締組織，(4)軟骨；(5)血液中的ECM ； (6)包括脂肪 細(xì)胞的脂肪組織；和(7)成纖維細(xì)胞?；|(zhì)細(xì)胞可得自不同組織或器官，如皮膚、心臟、血管、骨髓、骨骼肌、肝臟、胰腺、 腦、包皮，其可通過活組織檢查(如果合適)或尸體解剖獲得。一方面，胎兒成纖維細(xì)胞可 從包皮大量獲得，如新生兒包皮?！┓矫妫?xì)胞包括成纖維細(xì)胞，，其可來自胎兒源、新生兒源、成人源或其組合。 一些方面，基質(zhì)細(xì)胞包括胎兒成纖維細(xì)胞，其可支持各種不同的細(xì)胞和/或組織生長。如本 文所用，胎兒成纖維細(xì)胞指得自胎兒源的成纖維細(xì)胞。如本文所用，新生兒成纖維細(xì)胞指得
11自新生兒源的成纖維細(xì)胞。在適當(dāng)?shù)臈l件下，成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生其它細(xì)胞，如骨細(xì)胞、脂肪 細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞及中胚層起源的其它細(xì)胞。一些實(shí)施方式中，成纖維細(xì)胞包括皮膚成纖 維細(xì)胞，其是得自皮膚的成纖維細(xì)胞。普通的人皮膚成纖維細(xì)胞可以從新生兒包皮中分離。 這些細(xì)胞一般在原代培養(yǎng)結(jié)束時(shí)凍存。在其它方面，三維組織既可單獨(dú)又可結(jié)合本文探討的任何細(xì)胞類型用干細(xì)胞或祖 細(xì)胞制備。作為實(shí)例且非限制地，干細(xì)胞和祖細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)元干 細(xì)胞、表皮干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。一些實(shí)施方式中，“特定”三維組織可通過用細(xì)胞接種支架制備，該細(xì)胞得自特定 的器官，即，皮膚、心臟，和/或得自特定的個(gè)體，該個(gè)體隨后將接受按照本文所述方法在培 養(yǎng)中生長的細(xì)胞和/或組織。對于某些體內(nèi)應(yīng)用，優(yōu)選從患者本身的組織中獲得基質(zhì)細(xì)胞?；|(zhì)支持構(gòu)架存在 下細(xì)胞的生長可通過向構(gòu)架添加或?qū)?gòu)架支持體包被以如下物質(zhì)而進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)， 如，膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維、糖蛋白；糖胺聚糖，如，硫酸肝素、4-硫酸 軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素等；細(xì)胞基質(zhì)，和/或其它材料。因此，由于本文所述的二維或三維培養(yǎng)體系適合不同細(xì)胞類型和組織的生長，并 取決于將要培養(yǎng)的組織和需要的膠原蛋白類型，可選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)細(xì)胞接種構(gòu)架。盡管本發(fā)明的方法和應(yīng)用適用于不同細(xì)胞類型，如組織特異性細(xì)胞或本文討論的 不同類型的基質(zhì)細(xì)胞，本發(fā)明所用細(xì)胞的來源(derivation)也可以是物種特異性的。因 此，可生成物種特異性的ECM組合物。例如，本發(fā)明所用的細(xì)胞可包括人細(xì)胞。例如，該細(xì) 胞可以是人成纖維細(xì)胞。同樣，細(xì)胞來自另一物種的動(dòng)物，如馬(馬)、犬科(狗)或貓科 (貓)細(xì)胞。此外，來自一個(gè)物種或物種一個(gè)品系的細(xì)胞可用于生成用于其它物種或相關(guān)品 系(如，異源、同源和異種品系)的ECM組合物。也可以理解的是得自不同物種的細(xì)胞可結(jié) 合生成多物種ECM組合物。因此，本發(fā)明的方法和組合物適合涉及非人類動(dòng)物的應(yīng)用。如本文所用，“獸醫(yī)學(xué)” 指有關(guān)動(dòng)物——尤其是家畜——的內(nèi)科或外科治療或與之有關(guān)聯(lián)的醫(yī)藥科學(xué)。常見的獸醫(yī) 動(dòng)物可包括哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物和魚類。例如，典型的哺乳動(dòng)物可包括狗、 貓、馬、兔、靈長類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物和農(nóng)場動(dòng)物，如牛、馬、山羊、綿羊和豬。如上所述，培養(yǎng)中可能存在其它細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞在一起。這些其它的細(xì)胞可能具 有一些有益的效果，包括支持培養(yǎng)中的長期生長、增強(qiáng)生長因子的合成和促進(jìn)細(xì)胞對支架 的粘附等。作為非限制性實(shí)例，其它細(xì)胞類型包括平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。該細(xì)胞可隨成纖維細(xì)胞一起接種 于構(gòu)架上，或在一些方面，無成纖維細(xì)胞。這些基質(zhì)細(xì)胞可得自合適的組織或器官，作為實(shí) 例而非限制，包括皮膚、心臟、血管、骨髓、骨骼肌、肝臟、胰腺和腦。在其它方面，除了成纖維 細(xì)胞，一種或多種其它細(xì)胞類型被接種于支架。在還有其它方面，支架僅接種成纖維細(xì)胞。通過分解合適的器官或組織可容易分離出成纖維細(xì)胞，該器官或組織將充當(dāng)成纖 維細(xì)胞的來源。例如，組織或器官可經(jīng)機(jī)械分解和/或用削弱相鄰細(xì)胞間連接的消化酶和 /或螯合劑處理，使得能將組織分散成無明顯細(xì)胞破損的單個(gè)細(xì)胞的懸浮液。酶的解離可 通過切碎組織并用任何一些單獨(dú)或結(jié)合的消化酶處理組織糜完成。這些酶包括但不限于胰 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶、鏈霉蛋白酶和/或分
12散酶等。機(jī)械破壞也可通過一些方法完成，該方法包括但不限于研磨器、攪拌器、濾網(wǎng)、均化 器、壓力盒或聲波儀(insonators)的利用，這僅僅例舉一小部分。一方面，離體的包皮組織 用消化酶處理，一般用膠原蛋白酶和/或胰蛋白酶處理以將細(xì)胞從被包圍結(jié)構(gòu)解離出來。成纖維細(xì)胞的分離，例如，可按如下實(shí)現(xiàn)徹底洗滌新鮮的組織樣品并在Hanks' 平衡鹽溶液(HBSS)中切碎以去除血清。組織糜在新制備的諸如胰蛋白酶的解離酶溶液 中溫育1-12小時(shí)。在該溫育后，解離的細(xì)胞懸浮，通過離心沉淀，并在培養(yǎng)皿上涂平板。 所有的成纖維細(xì)胞會(huì)在其它細(xì)胞之前粘附，因此合適的基質(zhì)細(xì)胞可以選擇性分離并生 長。分離的成纖維細(xì)胞然后可生長至匯合，從匯合的培養(yǎng)物挑起并接種于三維構(gòu)架上，參 見 Naughton et al.，1987，J. Med. 18 (3&4) :219_250。用高濃度基質(zhì)細(xì)胞——如約 IO6 至 5 X IO7個(gè)細(xì)胞/ml-接種三維構(gòu)架會(huì)導(dǎo)致三維基質(zhì)支持體在較短時(shí)間內(nèi)建立。一旦組織變成單個(gè)細(xì)胞的懸浮液，該懸浮液可分餾成亞群，從中可得到成纖維細(xì) 胞和/或其它基質(zhì)細(xì)胞和/或成分。這也可利用細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成，包括但不限于 特異性細(xì)胞類型的克隆和選擇、不需要的細(xì)胞的選擇性破壞(負(fù)選擇)、基于混合種群中差 異細(xì)胞可凝集性的分離、冷凍-解凍過程、混合種群中細(xì)胞的差異粘附特性、過濾、常規(guī)和 區(qū)帶離心、離心淘洗(逆流離心)、單位重力分離、逆流分配、電泳和熒光激活細(xì)胞分選?？?隆選擇和細(xì)胞分離技術(shù)的綜述，參見Freshney，Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed. , A. R. Liss, Inc. , New York，1987，Ch. 11 禾口 12，pp. 137—168。一方面，分離的成纖維細(xì)胞可生長產(chǎn)生細(xì)胞庫。創(chuàng)建細(xì)胞庫以允許起始不同數(shù)量 和時(shí)間安排的分批培養(yǎng)，并且允許對細(xì)胞污染物和特殊細(xì)胞特性進(jìn)行事前測試。來自細(xì)胞 庫的成纖維細(xì)胞隨后生長，增加細(xì)胞數(shù)量到達(dá)對于接種支架合適的水平。涉及細(xì)胞環(huán)境暴 露和細(xì)胞接觸材料的操作通過無菌實(shí)踐進(jìn)行，以減少外來材料或不需要的微生物污染的可 能性。本發(fā)明的另一方面，分離后細(xì)胞可通過幾代生長達(dá)到適于建立主細(xì)胞庫的數(shù)量。 然后可獲得細(xì)胞庫，填入適當(dāng)?shù)娜萜鞑⒈２卦诘蜏貤l件中。來自主細(xì)胞庫于冷凍瓶中的細(xì) 胞可解凍并通過額外幾代(通常兩代或多代)生長。然后該細(xì)胞可用于制備低溫保藏的工 作細(xì)胞庫。細(xì)胞擴(kuò)大步驟利用在工作細(xì)胞庫階段的細(xì)胞小瓶，進(jìn)一步增加細(xì)胞數(shù)量以接種支 架或支持體，如篩網(wǎng)(如，三維篩網(wǎng))或微載體(如，珠子，二維的)。每一代是一系列傳代 培養(yǎng)步驟，其包括接種細(xì)胞于生長表面、培育、飼養(yǎng)細(xì)胞和收獲。細(xì)胞庫和細(xì)胞擴(kuò)大的培養(yǎng)可通過接種培養(yǎng)容器進(jìn)行，如培養(yǎng)瓶、滾瓶或微載體?；?質(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞，附于目的生長表面并在培養(yǎng)基存在下生長。培養(yǎng)容器，如培養(yǎng)瓶、滾 瓶和微載體，為細(xì)胞培養(yǎng)特別配置，且通常由各種勝任目的應(yīng)用的塑料材料制成。微載體一 般是顯微可見或肉眼可見的珠子，且一般由各種塑料材料制成。但是，其也可由其它材料制 成，如玻璃或固體/半固體生物基材料，如膠原蛋白或其它材料，如葡聚糖，如上所述的改 性糖化合物。培養(yǎng)中，消耗的培養(yǎng)基在細(xì)胞生長期間定期用新培養(yǎng)基取代，以保持營養(yǎng)物足以 可用和培養(yǎng)中抑制性產(chǎn)物的去除。培養(yǎng)瓶和滾瓶為細(xì)胞生長于其上提供表面，一般用于依 賴貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。一方面，溫育在37°C加熱下的室中進(jìn)行。要求培養(yǎng)基和室環(huán)境相通的培養(yǎng)拓?fù)浣Y(jié)
13構(gòu)在室氣體空間內(nèi)使用空氣和5% CO2 ν/ν以助于調(diào)節(jié)ρΗ?？蛇x地，為保持培養(yǎng)溫度和ρΗ 而裝備的容器可用于細(xì)胞擴(kuò)大或ECM生成操作。低于35°C或高于38°C的溫度及低于3%或 高于12%的(X)2濃度可能不合適。從粘附表面收獲細(xì)胞可通過生長培養(yǎng)基的去除和用緩沖鹽溶液沖洗細(xì)胞進(jìn)行，以 減少酶競爭性蛋白質(zhì)、解離酶的應(yīng)用以及然后在細(xì)胞分離后酶的中和。收集收獲的細(xì)胞懸 浮液并通過離心分離收獲液?？蓪碜詡鞔囵B(yǎng)收獲的細(xì)胞懸浮液取樣以評價(jià)回收細(xì)胞的 量和其它細(xì)胞屬性，以及隨后與新培養(yǎng)基組合并用作接種物。用于制備細(xì)胞庫和支架接種 物的傳代數(shù)量對于取得合意的ECM特性是至關(guān)重要的。制備適當(dāng)?shù)闹Ъ芎?，其通過播種制備的基質(zhì)細(xì)胞接種。支架的接種可以多種方式 實(shí)施，如沉降。以與低氧生長篩網(wǎng)相同的方式制備為有氧條件下的ECM培養(yǎng)制備的篩網(wǎng)，除 了沒有用厭氧室產(chǎn)生低氧條件。例如，對于為有氧和低氧條件下的ECM培養(yǎng)制備的兩種篩網(wǎng)，將制備并滅菌的篩 網(wǎng)置于150mm直徑X 15mm深的無菌培養(yǎng)皿中并垛疊約10層厚。然后通過沉降接種篩網(wǎng)垛 疊。將細(xì)胞加入新培養(yǎng)基得到對接種物合適的細(xì)胞濃度。將接種物加入篩網(wǎng)垛疊，其中細(xì) 胞沉積在尼龍纖維上并在溫育條件下粘附。足夠的時(shí)間后，從垛疊中無菌分離分別接種的 篩網(wǎng)片，并無菌地分別置于單獨(dú)的150mmX15mm培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)皿包含約50ml的生長培養(yǎng) 基。接種培養(yǎng)物的培育在低氧條件下進(jìn)行，相比在正常培養(yǎng)條件下生成的ECM，發(fā)現(xiàn)其 生成了具有獨(dú)特性質(zhì)的ECM和周圍培養(yǎng)基。如本文所用，低氧條件被表征為相比環(huán)境空氣 的氧濃度(約15% -20%的氧)較低的氧濃度。一方面，低氧條件被表征為低于約10%的 氧濃度。一方面，低氧條件被表征為氧濃度約1 %到10 ^UW到9 ^UW到8 ^UW到7%、 1%到6%、1%到5%、1%到4%、1%到3%、或1%到2%。在某一方面，培養(yǎng)容器中體系保 持約1-3%的氧?？赏ㄟ^利用允許人控制環(huán)境氣體濃度的培養(yǎng)裝置產(chǎn)生和保持低氧條件，培 養(yǎng)裝置例如，厭氧室。細(xì)胞培養(yǎng)物的培育一般在具有15-20%氧氣和5% CO2的正常大氣中進(jìn)行以擴(kuò)增 和接種，在這點(diǎn)上分流低氧培養(yǎng)物到充滿95%氮?dú)?5% CO2的密閉室中，從而在培養(yǎng)基中 創(chuàng)造了低氧環(huán)境。例如，帶有為在低氧條件下產(chǎn)生ECM而培養(yǎng)的篩網(wǎng)的培養(yǎng)皿在37°C和95%空氣 /5% CO2溫育下開始生長2-3周。在接近大氣的培養(yǎng)期后，將篩網(wǎng)培養(yǎng)皿在設(shè)計(jì)用于厭氧 培養(yǎng)的室中溫育，該室用約95%氮?dú)夂?% CO2的氣體混合物清洗。在培養(yǎng)期中，消耗的生 長培養(yǎng)基在大氣氧水平下用新鮮培養(yǎng)基替換，并交換培養(yǎng)基后，將填滿篩網(wǎng)的培養(yǎng)皿置于 厭氧室，該室用95%氮?dú)?5% CO2清洗，然后在37°C溫育。當(dāng)其達(dá)到所需尺寸或包含所需 生物組分時(shí)，獲得培養(yǎng)的篩網(wǎng)。在溫育時(shí)期期間，基質(zhì)細(xì)胞在開始生長到構(gòu)架開口中之前，會(huì)沿直線生長并包圍 三維構(gòu)架。生長細(xì)胞產(chǎn)生大量生長因子、調(diào)節(jié)因子和蛋白質(zhì)，其中一些分泌在周圍培養(yǎng)基， 沉積在支持體上組成ECM的另外一些在下面更充分論述。生長和調(diào)節(jié)因子可添加到培養(yǎng)物 中，但非必需。基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)生不可溶和可溶部分。細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)某潭?，允許ECM 蛋白質(zhì)的充分沉積。在三維組織培養(yǎng)期間，增殖細(xì)胞可從構(gòu)架釋放并粘在培養(yǎng)容器壁上，在那其可繼
14續(xù)增殖并形成匯合單層。為了使這種可能影響細(xì)胞生長的事件最小化，可在加料期間或通 過將細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)容器而去除釋放的細(xì)胞。匯合單層的去除或培養(yǎng)組織向新容 器中的新培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移保持或恢復(fù)培養(yǎng)物的增殖活性。一些方面，去除或轉(zhuǎn)移可在培養(yǎng)容 器中進(jìn)行，該培養(yǎng)容器含有超過25 %匯合的培養(yǎng)細(xì)胞的單層?？蛇x地，在一些實(shí)施方式中培 養(yǎng)經(jīng)攪拌以防止釋放的細(xì)胞粘結(jié)；其它實(shí)施方式中，將新培養(yǎng)基連續(xù)輸注穿過體系。一些方 面，可同時(shí)或第二個(gè)接著第一個(gè)一起培養(yǎng)兩種或多種細(xì)胞類型(如，成纖維細(xì)胞和平滑肌 細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞)。支架接種后，將細(xì)胞培養(yǎng)物在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基和溫育條件——其支持細(xì)胞生 長為三維組織——下溫育。很多商用培養(yǎng)基，如Dulbecco' s Modified Eagles Medium (DMEM)、RPMI 1640、Fisher' s、Iscove' s和McCoy' s，可適用于支持細(xì)胞培養(yǎng)物生長。 可用額外的鹽、碳源、氨基酸、血清和血清組分、維生素、礦物質(zhì)、還原劑、緩沖劑、脂質(zhì)、核 苷、抗生素、粘附因子和生長因子補(bǔ)充培養(yǎng)基。技術(shù)人員可用的各種參考著作(如，Methods for Preparation of Media,Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures,Alan R. Liss,New York(1984) ；Tissue Culture-Laboratory Procedures,John Wiley & Sons,Chichester,England(1996) ；Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Techniques, 4th Ed. , Wiley-Liss (2000))中述及了不同類型培養(yǎng)基的配方。用于任何本發(fā)明培養(yǎng)步驟的生長培養(yǎng)基或培養(yǎng)基，無論在有氧或低氧條件下，可 包括血清或無血清。一方面，培養(yǎng)基是Dulbecco，s Modified Eagle Medium，其具有4. 5g/ L葡萄糖、丙氨酰-L-谷氨酰胺、Eq 2mM，并公稱補(bǔ)充10%的胎牛血清。另一方面，培養(yǎng)基是 無血清培養(yǎng)基，是Dulbecco，s Modified Eagle Medium，其具有4. 5g/L葡萄糖基培養(yǎng)基和 Glutamax ，補(bǔ)充0. 5 %血清白蛋白、2 μ g/ml肝素、1 μ g/ml重組堿性FGF、1 μ g/ml大豆胰 蛋白酶抑制劑、IX ITS補(bǔ)充劑(胰島素-運(yùn)鐵蛋白-硒，Sigma Cat. No. 13146)、1 1000 稀釋脂肪酸補(bǔ)充劑(Sigma Cat. No. 7050)和1 1000稀釋膽固醇。此外，同樣的培養(yǎng)基可 用于低氧和有氧培養(yǎng)。一方面，接種并生長第一周后生長培養(yǎng)基從血清基培養(yǎng)基改變?yōu)闊o 血清培養(yǎng)基。溫育條件將在適當(dāng)?shù)膒H、溫度和氣體(如，02、CO2等)條件下以保持低氧生長條 件。一些實(shí)施方式中，溫育期間細(xì)胞培養(yǎng)物可懸浮在培養(yǎng)基中以使增殖活性最大化并生成 促進(jìn)各部分的期望生物活性的因子。此外，可周期性“加料”該培養(yǎng)物以去除消耗的培養(yǎng)基， 減少釋放的細(xì)胞和添加新營養(yǎng)源。溫育期間，培養(yǎng)的細(xì)胞在開始生長到支架開口中前沿直 線生長并包圍三維支架絲。低氧條件下溫育期間，相比起約15-20%正常大氣氧濃度下的培育，數(shù)千基因被差 異表達(dá)。發(fā)現(xiàn)一些基因在這些組合物中被增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)，最顯著的是某些層粘連蛋 白種類、膠原蛋白種類和Wnt因子。在不同方面，可通過與普通條件生長相比由低氧條件下 生長特有的酶解圖譜(指紋圖譜)或細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞產(chǎn)物組限定三維ECM。本文具體示例 的ECM組合物中，通過各種因子的表達(dá)和/或分泌表征三維組織及周圍培養(yǎng)基。本文述及的三維組織和組合物含有存在于支架或構(gòu)架上的ECM。一些方面，由于低 氧條件下的生長和生長在支持體上的細(xì)胞的選擇，ECM包括各種層粘連蛋白和膠原蛋白類 型?？赏ㄟ^選擇產(chǎn)生適當(dāng)膠原蛋白類型的成纖維細(xì)胞和低氧條件下生長細(xì)胞來操縱或增加 沉積的ECM蛋白質(zhì)的比例，在該低氧條件下特定層粘連蛋白和膠原蛋白種類的表達(dá)被增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)。在一些方面，利用限定特殊膠原蛋白類型的適當(dāng)同種型或亞類的單克隆抗體實(shí)現(xiàn) 成纖維細(xì)胞的選擇。在其它方面，固體基底，如磁性小珠，可用于選擇或去除具有結(jié)合的抗 體的細(xì)胞。這些抗體的組合可用于選擇(正選擇或負(fù)選擇)表達(dá)所需膠原蛋白類型的成纖 維細(xì)胞?？蛇x地，用于接種構(gòu)架的基質(zhì)可以是合成所需膠原蛋白類型的細(xì)胞混合物。膠原 蛋白的示例性類型的分布和來源如表I所示。表1.各種類型膠原蛋白的分布和來源
權(quán)利要求
1.一種制備包含一種或多種胚胎蛋白質(zhì)的組合物的方法，包括在低氧條件下于適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中在表面上培養(yǎng)細(xì)胞，從而生成包含一種或多種胚 胎蛋白質(zhì)的可溶和不可溶組合物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基包括血清。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基無血清。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述低氧氧條件是1-5%氧。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中與約15-20%氧的氧條件下生成的培養(yǎng)基相比膠原蛋 白種類被增量調(diào)節(jié)。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述膠原蛋白選自Va1 ;ΙΧα 1 ;IXa2 ;VIa2 ； VIII α 1 ；IVa 5 ；VII a 1 ；XVIII a 1 ；或 XII a 1 型。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中與約15-20%氧的氧條件下生成的培養(yǎng)基相比Wnt種類被增量調(diào)節(jié)。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中Wnt種類是wnt7a和wnt 11。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中與約15-20%氧的氧條件下生成的培養(yǎng)基相比層粘連 蛋白種類被增量調(diào)節(jié)。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述層粘連蛋白種類是層粘連蛋白8。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中透析、凍干并在緩沖劑中重構(gòu)所述無細(xì)胞上清液。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中透析、干燥并在緩沖劑中重構(gòu)所述無細(xì)胞上清液。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述成纖維細(xì)胞是新生成纖維細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面是三維的。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述表面包括篩網(wǎng)。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面是二維的。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述表面包括珠子。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是種特異性的。
20.一種權(quán)利要求1所述方法制備的組合物，其中所述組合物是可溶部分。
21.一種權(quán)利要求1所述方法制備的組合物，其中所述組合物是不可溶部分。
22.—種權(quán)利要求1所述方法制備的組合物，其中所述組合物是可溶和不可溶部分的 組合。
23.一種細(xì)胞修復(fù)和/或再生的方法，包括用權(quán)利要求20、21或22中任一項(xiàng)所述的組 合物接觸要修復(fù)或再生的細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞是骨軟骨細(xì)胞。
25.—種組織再生膜片，包括權(quán)利要求20、21或22中任一項(xiàng)所述的組合物。
26.—種組織培養(yǎng)體系，包括權(quán)利要求20、21或22中任一項(xiàng)所述的組合物。
27.權(quán)利要求沈所述的組織培養(yǎng)體系，其中所述體系用于支持干細(xì)胞的生長。
28.權(quán)利要求27所述的組織培養(yǎng)體系，其中所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞 或神經(jīng)元干細(xì)胞。
29.一種與裝置在對象體內(nèi)植入聯(lián)合使用的表面涂層，所述表面涂層包括權(quán)利要求 20,21或22中任一項(xiàng)所述的組合物。
30.權(quán)利要求四所述的涂層，其中所述裝置是起搏器、支架、支架移植物、人造血管、心 臟瓣膜、支路、送藥口、導(dǎo)管或膜片。
31.權(quán)利要求四所述的涂層，其中所述涂層用于調(diào)節(jié)傷口愈合，調(diào)節(jié)炎癥，調(diào)節(jié)纖維囊 形成，調(diào)節(jié)組織內(nèi)生長或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生長。
32.—種治療受損組織的方法，包括在使所述受損組織得到治療的條件下用權(quán)利要求 20,21或22中任一項(xiàng)所述的組合物接觸所述受損組織。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述組織是心臟組織。
34.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述組織是梗塞或缺血性組織。
35.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述組織是腸組織。
36.一種改善對象皮膚表面的方法，包括將權(quán)利要求20、21或22中任一項(xiàng)所述的組合 物給藥到對象的皺紋位置，從而提供改善的皮膚表面。
37.一種生物防粘劑，包括權(quán)利要求20、21或22中任一項(xiàng)所述的組合物。
38.一種用于細(xì)胞輸送或在輸送位點(diǎn)保持的生物載體，包括權(quán)利要求20、21或22中任 一項(xiàng)所述的組合物。
39.一種用于對象軟組織修復(fù)或加強(qiáng)的方法，包括將權(quán)利要求20、21或22中任一項(xiàng)所 述的組合物給藥到對象的皺紋位置，從而提供軟組織修復(fù)或加強(qiáng)。
40.一種促進(jìn)毛發(fā)生長的方法，包括用權(quán)利要求20、21或22中任一項(xiàng)所述的組合物接 觸細(xì)胞，從而促進(jìn)毛發(fā)生長。
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞是毛囊細(xì)胞。
42.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞被體內(nèi)接觸。
43.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞被離體接觸。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述細(xì)胞被移植到對象中。
45.一種生成Wnt蛋白和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的方法，包括在低氧條件下于適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中在表面上培養(yǎng)細(xì)胞，從而生成Wnt蛋白和VEGF。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基無血清。
47.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述低氧氧條件是1-5%氧。
48.權(quán)利要求47所述的方法，其中與約15-20%氧的氧條件下生成的培養(yǎng)基相比Wnt 種類被增量調(diào)節(jié)。
49.權(quán)利要求48所述的方法，其中所述Wnt種類是wnt7a和wnt 11。
50.權(quán)利要求45所述的方法，其中與約15-20%氧的氧條件下生成的培養(yǎng)基相比VEGF 種類被增量調(diào)節(jié)。
51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述VEGF種類是VEGF-A或其同種型。
52.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
53.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述表面是三維的。
54.權(quán)利要求53所述的方法，其中所述表面包括篩網(wǎng)。
55.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述表面是二維的。
56.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述表面包括珠子。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生包括胚胎蛋白質(zhì)的組合物的方法。該方法包括在低氧條件下在生物相容的二維或三維表面上體外培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)方法產(chǎn)生可溶部分和不可溶部分，它們可以分開使用或組合使用，以獲得生理上可接受的用于各種醫(yī)療和治療應(yīng)用的組合物。
文檔編號C12N5/071GK102066558SQ200980110464
公開日2011年5月18日 申請日期2009年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日
發(fā)明者F·捷格羅, G·K·諾爾頓, K·尼基, M·加特納 申請人:希斯托金公司