專利名稱：線形病毒組載體及方法
技術領域：
本公開內容涉及線形病毒組和其用作植物基因遞送載體的領域。
背景技術：
葡萄樹(葡萄屬)是主要的全球性水果類作物，具有巨大的經濟和文化意義，尤其 是歐洲葡萄(Vitis vinifera)，其用于葡萄酒發(fā)酵。因為植株是雜合的并且不純種傳代，所 以相對少量的歐洲葡萄栽培種在商業(yè)上用于保持果實的一致性。因此，因為如此多的商用 葡萄作物依賴于這些栽培種(其具有有限的多樣性)，所以主要關心的是抗病性。為提高 抗病性的傳統(tǒng)育種技術通常削減水果質量，使得葡萄樹成為遺傳操作提高抗病性的主要候 選者。然而，轉基因葡萄樹的生產已證明是困難的，因為木本多年生植物例如葡萄樹以對轉 化具有抗性而知名，且由于未轉化細胞的外來競爭作用，農桿菌介導轉化所需的選擇方法 顯著地更苛刻，這導致高度易變的成功率(Mullins等，Meth. Mol. Bio. 344 =273-285,1990 ； Bouquet等，Methods Mol. Biol. 344 =273-285,2006)。因此，對可靠的、有效的方法存在需 求，該方法用于給葡萄樹遞送基因用于疾病治療和為了所需形狀修飾葡萄樹。過去二十年中，用于植物和動物中蛋白瞬時表達的病毒載體成為分子生物學和生 物醫(yī)學必不可少的工具(Pogue 等，Annu. Rev. Phytopathol. 40 :45_74，2002 ；Gleba 等，Curr Opin Biotechnol 18 :134_141，1007)。隨著 RNA 干擾(RNAi)或 RNA 沉默的出現(xiàn)，病毒載 體也被開發(fā)用于病毒誘導的基因沉默或VIGS (Godge等，Plant Cell R印27 (2) =209-219, 2008 ；e-pub ahead of print，2007)?？傊?，迅速地過表達或沉默目的基因的能力使得病毒 載體在功能性基因組學中成為重要的工具。多種植物病毒已被改造為病毒載體，每種都有局限性和植物特異性。多數(shù)僅適用 于雙子葉草本植物。基本上，二十面體病毒主要由于它們衣殼的有限大小而不適合容納 外來基因。一般，較長的病毒已表現(xiàn)出較好的容納重組基因并以極高水平表達它們的能 力。目前，最通常使用的載體為基于棒狀煙草花葉病毒(TMV，煙草花葉病毒組屬)的載體 (Pogue 等，Annu. Rev. Phytopathol. 40 :45_74，2002 ；Gleba 等，CurrOpin Biotechnol 18 134-141，1007)。這些載體的特征為高表達水平但相對低的遺傳穩(wěn)定性，尤其是遇到大的外 來插入片段時。另一系列的載體基于棒狀煙草脆裂病毒(TRV，煙草花葉病毒組屬)(Godge等， Plant Cell Rep 27(2) :209_219，2008 ；網上公開于出版前，2007)。從絲狀病毒獲得的載 體通?；隈R鈴薯X病毒(PVX，馬鈴薯X病毒組屬)(Chapman等，Plant J 2 =549-557, 1992)和煙草蝕斑病毒(TEV，馬鈴薯Y病毒組屬)(Dolja等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10208-10212，1992)。TMV、TRV和PVX載體包含具有亞基因組RNA啟動子的表達盒，而TEV 載體利用基于多蛋白加工的替代性蛋白表達原理。后者的特征提供遺傳穩(wěn)定性比含啟動子載體高得多的馬鈴薯Y病毒組載體(Dolja等，Virology 252 =269-274,1998)。已開發(fā)出基于甜菜黃化病毒(BYV，線形病毒組屬)的基因表達載體(Hagiwara等， J. Virol. 73 :7988_7993，1999 ；Peremyslov 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA96,14771-14776， 1999)。雖然線形病毒載體可實現(xiàn)的蛋白表達水平可能比TMV或TRV低，但是基于其額 外的異源亞基因組RNA啟動子或多蛋白加工，這些載體已證明在遺傳上極為穩(wěn)定且能容 納多個表達盒。線形病毒載體的這種多能性很可能是由于大的線形病毒基因組和存在 以下基因，其顯著增加基因組復制能力和基因表達能力并可提供增加的RNA復制保真性 (Dolja 等，Virus Res. 117 :38_51，2006)。RNAi 的強阻抑基因(Reed 等，Virology 306 203-209，2003 ；Chiba 等，Virology 346 :7_14，2006)和線形病毒組的前導蛋白酶(Peng 等，J.Virol. 75 (24) ,12153-12160，2001)是以下基因之一，其保證線形病毒組的高遺傳和 高進化性能并為容納額外的基因(病毒的或外來的)預處理它們的基因組。病毒載體的其中一個最關鍵特征是其宿主范圍，該范圍嚴重地限制其對所需作物 的潛在應用。上述所有載體都僅能感染雙子葉草本植物。換言之，給單子葉植物或木本作 物例如葡萄樹產生病毒載體的需求支配著將天然感染這種植物的病毒用作載體開發(fā)平臺 的需求。至今，非常少潛在適合于木質植物的病毒載體已被開發(fā)出，資料顯示的表達通常 局限于狹窄范圍的模型植物。這些載體的一種是基于蘋果潛隱球狀病毒RNA 2(ALSV，伴生 病毒科)(Li等，Arch. Virol. 149 1541-1558，2004)。雖然作者聲稱ALSV載體在機械接種 至蘋果樹苗時能通過多蛋白加工表達綠色熒光蛋白(GFP)，但是論文中沒有出現(xiàn)關于這種 能力的令人信服的實驗證據。同樣的，沒有數(shù)據可用于支持近來宣稱的基于番茄黃色卷葉 雙生病毒(Tomato yellow leaf curl geminivirus)的“通用”載體，據說其能系統(tǒng)地感 染多種植物從雙子葉植物至單子葉植物直至樹和藤。(Peretz等，Plant Physiol. 145(4) 1251-1263,2007)。另一種載體為使用葡萄病毒A(GVA，葡萄病毒屬)開發(fā)的。在煙草上 展示了其表達外來蛋白的能力(Haviv等，J.Virol· Meth. 132 :227-231，2006)，但依然未 對葡萄樹證明。另一種載體基于柑桔衰退病毒(CTV)，一種與BYV緊密相關的線形病毒組 (Folimonov 等，Virology 368(1) =205-216, 2007) 然而，CTV 僅用于柑桔屬，且在用分離 的病毒體裂口接種柑桔樹前，其繁殖涉及在原生質體中進行循環(huán)的麻煩方法。因此，對適于 轉化木質植物的特別是葡萄樹的病毒載體存在強烈需求。發(fā)明概述本公開內容涉及復制型的植物基因轉移載體，所述載體包含核酸，該核酸編碼來 自葡萄卷葉伴隨病毒_2 (LR-2)的選自甲基轉移酶、RNA解旋酶、RNA依賴性RNA聚合酶和 P24的病毒基因；前導蛋白酶Ll和L2 ；及有效連接至啟動子的異源多核苷酸，其中異源多 核苷酸在植物細胞中表達；其中所述載體在植物細胞中能感染性復制。本公開內容還包括條件復制型植物基因轉移載體，所述載體包含核酸，該核酸編 碼來自葡萄卷葉伴隨病毒_2 (LR-2)的選自甲基轉移酶、RNA解旋酶、RNA依賴性RNA聚合酶 和P24的病毒基因；前導蛋白酶Ll和L2，其中至少一個前導蛋白酶是失活的，使得載體不 能獨立地感染性復制；及有效連接至啟動子的異源多核苷酸，其中異源多核苷酸在植物細 胞中表達。任選地，本文提供的載體也可包括來自葡萄卷葉伴隨病毒_2 (LR-2)的一個或多個病毒基因，該基因涉及病毒體組裝和/或植物內轉運。這種基因包括例如p6、Hsp70h、 p63、CPm、CP和pl9。在特定實施方案中，所有這些基因包含在載體內，從而促進系統(tǒng)性感 染。這種載體可指全長載體；在本文中描述了這種載體的實例。在所述載體中的異源多核苷酸可編碼一個或多個報道分子、選擇標記或治療基 因，治療基因可編碼所需蛋白例如用于改善植物的營養(yǎng)特征或美感性，或編碼抗病性基 因，其可為抗真菌、抗細菌或抗病毒的基因。所述治療基因可用于皮爾斯病(Pierce’ s disease)的治療，例如引發(fā)病毒誘導的基因沉默或編碼溶菌酶多肽的多核苷酸。所述前導蛋白酶可為來自LR-2的Ll和/或L2。該前導蛋白酶(例如SEQ ID NO 4或6)可由SEQ ID N0:3和/或SEQ ID N0:5編碼。該前導蛋白酶之一或兩者可通過載 體中前導蛋白酶編碼序列的置換、插入、部分缺失或完全破壞而失活。所述載體還可包含用于轉化植物細胞的T DNA序列。該載體可包含甜菜黃化病毒 或其它相關線形病毒組的啟動子或天然LR-2啟動子?？梢攵嘤谝环N載體進入植物，例如 編碼治療基因的載體和編碼p24RNAi阻抑基因的載體。也設想了包含本文中所述載體的植物細胞或植物，例如葡萄樹細胞或葡萄樹。也提供制備所述載體的方法，包括培養(yǎng)包含該載體的細胞和從細胞或培養(yǎng)細胞的 培養(yǎng)基中回收載體。該載體可任選在質粒中，例如適于細菌擴增的質粒和/或適于農桿菌 接種的雙元質粒。另一個實施方案為在植物細胞中表達異源基因的方法，包括將本發(fā)明的載體引入 植物細胞中。在一個實施方案，所述植物細胞為葡萄樹細胞。在另一個實施方案，所述載體 為通過農桿菌接種法引入。另一個實施方案為在植物細胞中表達異源基因的方法，包括將復制型載體引入植 物細胞使得所述載體隨后復制并感染至少一個其它的植物細胞。該方法還包括系統(tǒng)性感染 選自組織、葉、莖、根、果實、種子或整株植株的植物結構。另一個實施方案為引入抗病性的方法，包括將本發(fā)明的載體引入植物細胞。該載 體可引入多于一次。該載體可包含異源多核苷酸，其編碼賦予對疾病抗性的基因。這種異 源多核苷酸可為例如引發(fā)病毒誘導的基因沉默、Riml多核苷酸或編碼溶菌酶多肽的多核苷酸。另一個實施方案為在葡萄樹中治療或預防皮爾斯病或白粉病的方法，包括將本發(fā) 明的載體引入葡萄樹細胞。該載體可通過農桿菌接種法引入并可引入多于一次。另一個實施方案為修飾美感性(例如汁液的味道和香味)、或提高植物的營養(yǎng)或 其它農業(yè)特性的方法，包括將本發(fā)明的載體引入植物細胞。另一個實施方案為制備轉基因植物的方法，包括將本發(fā)明的載體引入植物細胞和 在促進植物生長的條件下培養(yǎng)植物細胞，其中異源基因在轉基因植物中表達。轉基因植物 可為葡萄樹。根據下面參照附圖進行詳述的幾個實施方案，前述的和其它的特征和優(yōu)點將變得 更顯而易見。附圖簡述

圖1A-1C為GLRaV-2基因組的基因圖，表明病毒基因的功能(圖1A)、用于重組基 因表達的盒(圖1B)和包含帶有ER-GFP插入物的全長GLRaV-2基因組的雙元載體(圖1C)。(圖1A)依據所編碼的蛋白命名基因(圖1B)LR-2CP啟動子，啟動CP基因表達的天然LR-2 啟動子；ER-GFP，內質網靶向型綠色熒光蛋白；BYV CP啟動子，源自甜菜黃化病毒的工程異 源啟動子，啟動CP基因的表達；Pac I和Fse I，相應限制性核酸內切酶的工程位點。(圖 1C)按順時針方向從左起35S，源自花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus)的35S RNA聚合酶II啟動子(箭頭)； 17，500nts,約17，500核苷酸長、通過插入ER-GFP標記 的LR-2的全長cDNA克隆(矩形，標注為 17，500nts) ；RZ，定制的核酶，當插入的DNA在 植物細胞核內轉錄時其促進自催化釋放LR-r RNA的3’-端(帶箭頭的矩形，標注為RZ)； RNA聚合酶II的NOS終止子；右緣，識別序列，質粒DNA由農桿菌在此切割以傳遞進植物細 胞(彎曲箭頭)；Ori，質粒復制起點(箭頭)；KanK，卡那霉素抗性基因；左緣，識別序列，質 粒DNA由農桿菌在此切割以傳遞進植物細胞(彎曲箭頭)。圖2顯示了使用共聚焦激光掃描顯微鏡在不同比例下的以農桿菌接種法用 GLRaV-2/ER-GFP感染的煙草本塞姆氏(N. benthamiana)細胞。由于病毒表達ER-GFP標記， 綠顏色標出該受病毒感染細胞的內質網。紅色背景是由于葉綠體的自身熒光。線段，50mm。圖3顯示了通過表面熒光顯微鏡取得的組織圖像，該組織來自以農桿菌接種法用 GLRaV-2/ER-GFP系統(tǒng)性感染的煙草本塞姆氏的植株，該植株(底排)與未感染的植株對照 (頂排)相比較。綠顏色高亮突出被病毒感染并表達ER-GFP的韌皮細胞。在顯微成像前將 莖和葉柄人工橫向切開。紅色背景是由于葉綠體的自身熒光。圖4(圖4A)使用CP特異性抗體對提取物的免疫印跡分析，該提取物來自野生型 病毒和修飾為表達ER-GFP的病毒感染的植株(如圖下方所示)。初始葉片提取物的稀釋度 顯示在上方。(圖4B) RNA的RT-PCR分析，RNA分離自被野生型病毒和修飾為表達ER-GFP 的病毒感染的煙草本塞姆氏植株。RT-PCR產物在的瓊脂糖凝膠中分離并用溴化乙錠染 色。M，DNA大小標記；用箭頭標示的條帶相應為Ikb和2kb DNA。圖5上部，顯示雙元載體的設計圖，該載體表達p24，24-kDa的RNA沉默的LR-2阻 抑基因，其克隆至雙元載體PCB302上。TEV前導，cDNA序列相當于煙草蝕斑病毒的5’ -非 翻譯區(qū)并用于增強P24的翻譯。下部，被miniBYV-GFP單獨感染(左欄)及miniBYV-GFP 和p24共表達感染(右欄)的罕見細胞的共聚焦圖。圖像來自Chiba等(Virology 346 7-14，2006)。圖6在煙草本塞姆氏16c系中病毒載體LR-GFP的GFP轉基因沉默。在對照中，由 于轉基因GFP的產生，所有細胞為綠色。在感染植株，亮綠色細胞為病毒在其中制造額外 GFP的那些細胞。紅色區(qū)域包含以下細胞在其中由于病毒誘導的RNA干擾，轉基因GFP被沉默。圖7(圖7A)在微繁殖的品麗珠(Cabernet franc)葉中GFP的最大表達，GFP利 用農桿菌通過超聲處理引入。(圖7B)較不易感的葉，然而其顯示在葉脈中表達GFP。GFP 直接從如(圖7C)所示改造的雙元載體表達。圖8由農桿菌滲入法產生的用miniLR-2-GFP感染的葡萄樹，顯示了接種葉和單個 GFP表達型綠色細胞的圖像(頂行)及miniLR-GFP復制子的基因圖。Ll和L2，前導蛋白 酶；MET，甲基轉移酶功能區(qū)；HEL，RNA解旋酶功能區(qū)；P0L，RNA-依賴性RNA聚合酶；GFP，綠 色熒光蛋白；p24，24-kDa蛋白。圖9由農桿菌滲入法產生的用全長LR-2-GFP感染的葡萄樹，顯示了接種葉和單個GFP表達型綠色細胞的圖像。圖10 (圖10A)GLRaV-2病毒、全長載體(LR_GFP)和微載體(mLR-GFP/⑶S)的示意 圖。(圖10B)具有蛋白水解加工、基因表達和感染的前導蛋白酶Ll和L2的結構域導致所 示的煙草本塞姆氏。圖11如圖示以HA-標記(圖11A)和放射性同位素標記(圖11B)處理載體。圖12(圖12A)載體的長距離轉運和系統(tǒng)性感染煙草本塞姆氏葉。(圖12B)GFP在 煙草本塞姆氏葉中積累。(C)接種后煙草本塞姆氏的上葉中基因表達的缺失。圖13梯度的免疫印跡分析，該梯度來自分離自被感染煙草本塞姆氏葉的病毒體 的蔗糖分級分離。圖14GLRaV_2載體的煙草本塞姆氏衍生(Nb ；上道)變體和歐洲葡萄衍生(Vv，下 道)變體的核苷酸序列比對。兩種分離物中不同的核苷酸以粗體和下劃線表示。序列表列于本文中的核酸和/或氨基酸序列和/或隨附的序列表是以核苷酸堿基的標準 字母縮寫和氨基酸的三字母碼(定義于37C.F.R. § 1.822)顯示的。各核苷酸序列僅顯示 一條鏈，但是互補鏈應理解為通過對展示鏈的任何引用而包含于其中。隨附序列表中SEQ ID NO :1為p35S_LR_2/ERGFP的核酸序列，其為全長的葡萄卷葉病毒_2衍 生的基因表達和沉默載體，包含編碼ER-靶向型GFP報道基因的重組基因。該序列包含雙 元載體PCB301 (1-3305)及整個病毒表達盒(3306-21957)。顯示于圖IC的下列特征也反 映在序列中35S啟動子(3306-4063)、包含GFP報道基因表達盒(18648-19439)的病毒序 列(4064-21643)、異源 BYV CP 啟動子(18440-19723)、核酶(21644-21698)和 NOS 終止子 (21705-21957)。SEQ ID NO 2 為 MiniLR-GFP/⑶S 的核酸序列。SEQ ID NO :3和4為蛋白酶Ll的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :5和6為蛋白酶L2的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :7為全長的葡萄卷葉伴隨病毒_2衍生的基因表達和沉默載體的核苷 酸序列，所述載體包含編碼ER-靶向型GFP報道基因的重組基因(LR2-Vitis)。所有葡萄 卷葉伴隨病毒_2的核苷酸序列對應于天然存在于黑比諾葡萄樹中的病毒分離群的共有序 列。不同于出現(xiàn)在最初煙草本塞姆氏衍生病毒核苷酸(SEQ ID NO 1)的核苷酸在圖14中 突出顯示。病毒表達盒外的核苷酸序列與SEQ ID NO 1中的相同。SEQ ID NO :8為典型的歐洲葡萄染色體基因組序列，包含推定的韌皮部特異性啟 動子、AtSUC2 直向同源啟動子(GSVIVT00002302001_VvSUC27_AF021810_Genomic)和適于 韌皮部特異性表達的LR-2載體。SEQ ID NO :9為典型的歐洲葡萄染色體基因組序列，包含推定的韌皮部特異性 啟動子、AtAHA3 直向同源啟動子(VV78X258876_VITISV_014422_AM487422_CAN64375_ Genomic)和適于韌皮部特異性表達的LR-2載體。SEQ ID NO :10為典型的歐洲葡萄染色體基因組序列，包含推定的韌皮部特異性 啟動子、AtAsusl 直向同源啟動子(VV78X051063_CAN82840_VITISV_024563_GI147856448_ Genomic)和適于韌皮部特異性表達的LR-2載體。SEQ ID NO 11為血凝素表位(HA)標記的氨基酸序列。
發(fā)明詳述除非另有指出，按照習慣用法使用技術術語。分子生物學常用術語的定義可見 Benjamin Lewin, Genes V，牛津大學出版社出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew 等(eds. ), The Encyclopedia of Molecular Biology, 由 Blackwell Science Ltd. 出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology :aComprehensive Desk Reference,由 VCH 出版社出版，Inc., 1995(ISBNl-56081-569-8)o為了幫助閱讀本發(fā)明的各實施方案，本文提供具體術語的說 明。術語“葡萄樹” “葡萄植物”或“葡萄樹植物”指葡萄屬或圓葉葡萄(Muscadinia) 屬的任何植物(例如歐洲葡萄、美洲葡萄(V. Iabrusca)、河岸葡萄(V. riparia)、圓葉葡萄 (V. rotundifolia)、夏葡萄(V. aestivalis))，及其種。所述葡萄樹可為接穗、根莖、栽培種 或雜交株。術語“葡萄”為葡萄樹的漿果或果實，其可吃整個或可從其榨出汁液用于喝和/ 或發(fā)酵成酒。葡萄樹其它可吃的部分包括葉和種子。除非另有說明，本文所使用的所有技術術語和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通 技術人員通常理解的意思相同。除非上下文明顯指出，所述單數(shù)術語“一” “一個”和“這” 包括復數(shù)所指對象。同樣的，除非上下文明顯指出，“或”意在包括“和”。因此“包括A或 B”意思為包括A、或B或A和B。也應該理解的是，對核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨 基酸大小和所有分子量值或分子質量值都是大概的，只是用于說明。盡管在本發(fā)明的實施 或測試中能使用與本文所描述的類似或等同的方法和材料，但在下面描述適合的方法和材 料。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利或其它參考文獻都通過整體引用結合。在沖 突的情況下，以本說明書(包括術語的任何說明)為準。另外，所述材料、方法和實例僅為 說明性，并不意在限制。幾個實施方案的綜述本公開內容提供基因轉移載體，其至少包括葡萄卷葉伴隨病毒-2(LR_2)的復制 基因。LR-2已測序(Meng等，Virus Genes 31 =31-41,2005)并已與其它已知線形病毒組在 功能上比較(Dolja等，Virus Res. 117(1) :38_51，2006)。兩篇參考文獻都通過引用結合到 本文。LR-2的核心病毒基因包括Met (甲基轉移酶)、Hel (RNA解旋酶)和Pol (RNA-依賴性 RNA聚合酶)，而與BYV的同源基因比較，Ll、L2和p24在基因組復制上起輔助作用。其它基 因也可包含在本發(fā)明載體中，例如p6、Hsp70h、p63、CPm、CP和pl9 (參見，例如Peremyslov 等，J. Virol. 72 =5870-5876,1998，其通過引用結合到本文中)。本公開內容涉及包含前導蛋白酶Ll和L2的載體，和其中一個或兩個前導蛋白酶 失活的載體。本領域的技術人員能立即認識到有無數(shù)的方法能令蛋白酶失活，且本文已設 想了所有這些方法。對相關的線形病毒組BYV，相應的前導蛋白酶L-Pro對有效的RNA擴 增和病毒的長距離轉運是必需的，這些以前已有說明(Peng等，J.Virol. 77, 2843-2849, 2003 ；Peng & Dol ja，J. Virol. 74，9766-9770，2000)。令人感興趣的是，用來自其它線形病 毒組(Peng等，J.Virol. 75 (24) ,12153-12160，2001)或甚至動物動脈炎病毒屬(Peng等， Virology 294，75-84，2002)的蛋白酶代替L-Pro能拯救RNA擴增，但不能拯救前導蛋白酶 的轉運功能。葡萄卷葉伴隨病毒_2(GLRaV-2)在線形病毒組屬中是BYV近親，其遺傳構成 與 BYV 幾乎一樣(Zhu 等，J. Gen. Virol. 79 1289-1298，1998)。然而，不像 BYV 含有一個前導蛋白酶，GLRaV-2編碼兩個前導蛋白酶Ll和L2(Meng等，Virus Genes 31，31-41，2005 ； Peng 等，J. Virol. 75 (24)，12153-12160，2001)(圖 1A，上圖)。本文第一次表明 Ll 和 L2 在 最初接種的細胞中建立GLRaV-2感染和系統(tǒng)性轉運中具有互補功能。引人注意的是，與實 驗性草本宿主煙草本塞姆氏相比，在天然病毒宿主葡萄樹中Ll和L2對病毒感染的總體貢 獻是更為關鍵的。因此，利用Ll和L2的特性，用于將異源基因引入葡萄樹的載體可構建為 復制型的(包含Ll和L2兩者)或條件復制型的(具有失活的一個或兩個前導蛋白酶)。復制型載體為在轉運中不需提供額外的因子就能產生侵染性病毒體的載體。在 接種或轉導進入植物細胞后，這種載體產生侵染性的病毒體并感染其它細胞。因為所述載 體可傳播到最初的轉導細胞外并增加總體轉導作用，這種載體在當需要系統(tǒng)性感染植物時 可能很有用。例如，所述載體可在組織內傳播、組織間傳播、貫穿整株植株傳播或甚至植株 間傳播。例如，所述載體可感染整片葉、多于一片葉、一片或多片葉和植物的莖或果實，以及 根。條件復制型載體缺乏獨立產生侵染性病毒體所必需的病毒因子。本公開內容包括 以下載體，其具有一個或兩個失活的前導蛋白酶，使得所述載體不能產生侵染性病毒體，在 接種或轉導后也不能感染其它細胞。當不需要傳播載體或有限傳播是有益的時候，這種載 體可能有用。由于載體的傳播以及異源基因的表達不會超出最初的轉導，所述載體可增加 安全性。在具體實施方案中，本文所提供的植物轉化載體包括一個或多個來自葡萄卷葉伴 隨病毒-2(LR-2)的病毒基因，其涉及病毒體組裝和/或植物內轉運。這些基因包括例如 p6、Hsp70h、p63、CPm、CP和pl9。在特定實施方案，所有這些基因都包括于載體內，從而促 進系統(tǒng)性感染。這種載體可指全長載體。整個LR-2基因組(或基本所有基因組，或其相等物)可包括于載體內。所述載體 可包含額外的異源序列，例如促進繁殖或轉化的序列。這種序列可為農桿菌感染的控制元 件，例如雙元載體，這為本領域眾所周知。所述載體可具有如本文提供的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的核苷酸序列，或可用不同異源序列代替作為實例提供的報道基因(GFP和GUS)。 所述載體的前導蛋白酶可為來自LR-2的Ll (SEQ IDNO 4)和/或L2 (SEQ ID NO 6)，也可 分別由SEQ ID NO :3和5編碼。此外，RNA沉默的阻抑基因也可用載體引入。這種阻抑基 因可為來自甜菜黃化病毒的LR-2 p24或p21 (Chiba等，Virology 346 :7_14，2006)。所述載體包括有效連接至啟動子的異源多核苷酸。所述啟動子可為天然LR-2啟 動子，例如LR-2CP啟動子，或其也可為異源啟動子，例如來自屬于線形病毒組屬其它病毒 (例如甜菜黃化病毒)的啟動子，例如BYV CP啟動子、甜菜黃矮病毒(Beet yellow stunt virus)啟動子、香石竹黃點病毒(Carnation yellow fleck virus)啟動子、柑桔衰退病毒 啟動子、薄荷病毒l(Mint virus 1)啟動子等。盡管這些病毒的CP啟動子通常提供最高表 達水平，但是來自這些病毒的一些其它啟動子可能有用。很多適合的啟動子為本領域已知。 所述異源多核苷酸可編碼報道分子、選擇標記和/或治療基因。報道分子的實例包括熒光 蛋白，例如綠色熒光蛋白、熒光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和其它本領域已 知的報道分子。選擇標記的實例也包括抗生素耐受標記、對親和純化有用的表位標記等。治 療基因的實例包括那些賦予對病狀或疾病抗性的基因。本公開內容包括以下方法，其通過將本公開內容的植物基因表達載體引入細胞而在植物或植物細胞中誘導出疾病抗性。葡萄植物的這種疾病包括但不限于真菌性疾 病、細菌性疾病、病毒性疾病、寄生蟲和環(huán)境脅迫。真菌性疾病的實例包括葡萄球座菌 (Guignardia bidwellii)(黑腐病)、葡萄屬單軸霉(Plasmopara viticola)(霜霉病)、葡 萄白粉病(Erysiphe necator)(白粉病，前稱葡萄鉤絲殼(Uncinula necator))、灰葡萄
(Botrytis cinerea) ( H^^tg^if^l)(Sclerotinia sclerotiorum) (
lift^iiS ) > Eutypia armenicae (Eutypia dieback)(Elsinoe ampelina) ( ^lil
_)、lilH"i包(Alternaria alternata) (alternia rot)、ff胃; 口十包· (Pseudopezicula tetraspora) ^Μ^ΜΙ (Cercospora brachypus)、^fl|!ij|l|i包(Sphaceloma ampelinum) > 殼二抱屬棘抱曲霉(Ascochyta sp. Aspergillus aculeatus)、芽枝霉屬(Cladosporium spp.)、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)、長螺孢屬(Helminthosporium spp.)、念珠菌屬 (Monilia sp.)、匍柄霉(Stemphylium botryosumv)、遲熟格抱腔菌(Pleospora tarda)、 串珠菌屬(Torula sp. )、Greeneria uvicola、Botryosphaeria stevensii、平截色二 包(Diplodia mutila) > 青 β 菌屬(Penicillium spp.) > Botryotinia fuckeliana> Anthostomella pullulans、芽抱梭菌屬(Clostridium spp. )、Libertella blepharis、柯 Ml^ife二(Lasiodiplodia theobromae)、！Ij^M冑(Rosellinia necatrix)、自習習胃 絲菌(Dematophora necatrix)、Roesleriasubterranea、葡萄褐斑病菌(Mycosphaerella personata)、葡萄假尾抱(Pseudocercospora vitis)、褐斑擬棒束抱(Isariopsis clavispora) >Briosia amp elophaga> Iflj^ ^lif (Phymatotri chops is omnivora) > 束絲菌(Dematophora necatrix)、Cristulariella moricola、Grovesinia pyramidalis> 頭抱屬(Cephalosporium spp.)、火木層孑L菌(Phellinus igniarius)、毛韋刃革菌(Stereum hirsutum)、白蘞殼銹菌(Physopella ampelopsidis)禾口葡萄慢害Ij 病菌(Phompopsis viticola)(擬點霉屬葉(phomopsis leaf)禾口蓮斑點疾病(cane spot disease))。細菌性疾病的實例包括苛養(yǎng)木桿菌(Xylella fastidiosa)(皮爾斯病)、根癌農 桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(冠癭病)、假單胞菌(Pseudomonas syringae)禾口葡萄 Bf ^Kff (Xylophilus ampelmus) ( MM&'M (bacterial blight))。病毒性疾病的實例包括葡萄卷葉伴隨病毒、葡萄扇葉病毒、葡萄病毒Α、葡萄病毒 B、番爺環(huán)斑病毒、莖痘伴隨病毒(Rupestris stempitting associated virus)、煙草環(huán)斑 病、南芥菜花葉病毒、菊芋意大利潛病病毒(Artichoke Italian latent virus)、苜?；ㄈ~ 病毒、布拉迪斯拉發(fā)花葉病毒(Bratislava mosaic virus)、蠶豆束枯萎病毒、葡萄草莓潛 隱環(huán)斑病毒(grapevine strawberry latent ringspot virus)、煙草壞死病毒、煙草花葉病 毒、葡萄鉻黃花葉病毒、矮牽牛星狀花葉病毒和番茄黑環(huán)病毒。害蟲的實例包括葡萄根疣蚜(Daktulosphaira vitifoliae)、鱗翅目 (Lepidoptera)、葡萄黑耳喙象(Otiorhynchus sulcatus)、半穿刺線蟲(Tylenchulus semipenetrans)、劍線蟲屬(Xiphinema spp.)、短體線蟲(Pratylenchus spp·)、長針線蟲 屬(Longidorus spp.)、_#線蟲(Paratylenchus hamatus)、線蟲(Paratylenchus hamatus)、腎形線蟲屬(Rotylenchulus spp·)、薄葉小環(huán)線蟲(Criconemella xenoplax)、 根結線蟲屬(Meloidogyne spp·)、螺方寵線蟲屬(Helicotylenchus spp. )、Paratrichodorus christiei 禾口矮化線蟲屬(Tylenchorhynchus spp.)。環(huán)境脅迫的實例包括干旱、熱脅迫、鹽脅迫、鐵缺乏、鋅缺乏、臭氧和環(huán)境毒素?；蛘撸景l(fā)明載體可用于賦予對除草劑、殺真菌劑、殺蟲劑和殺病毒劑的抗性。因細菌苛養(yǎng)木桿菌感染引起的皮爾斯病(PD)對葡萄栽培種的種植者特別重要。 該細菌在木質部繁殖，引起水移動的堵塞及特征性的葉枯病或葉壞死，尤其在熱脅迫或缺 水時。處理法目前集中于通過針對在攝食時從植物到植物傳播細菌的昆蟲載體而預防感 染。已知許多昆蟲載體，包括各種神射手(sharpshooter)，例如透明羽翼的神射手。很多商 業(yè)上重要的栽培種易感染PD，因此急需控制這種疾病。這種疾病的治療可包括表達治療蛋白(例如致病生物或侵染性生物的基因)或 抑制宿主基因以減少非所需的反應。治療蛋白的實例包括直接靶向致病生物或致病物的 蛋白，例如降解防護性真菌壁的幾丁質酶(例如Adams，Microbiology 150 =2029-2035, 2004)、抑制復制的復制酶(例如WO 98/052964)、攻擊細菌壁的溶菌酶或發(fā)現(xiàn)于抗病性植 物的基因。已表明溶菌酶具有抗細菌性質，可能有效用于抗木質部小菌屬。通過引用結合 到本文中的美國申請第20020104126號表明在極低pH下有活性的牛溶菌酶可在煙草植物 中表達，并在體外試驗中保持活性。然而，未試驗在木質植物即葡萄樹中表達溶菌酶的可行 性或其抗木質部小菌屬或治療PD的有效性。葡萄白粉病抗性基因Riml，當其通過假回交 (pseudo-backcross)策略轉化及使用細菌的人工染色體遞送時，已表明能對易感歐洲葡萄 賦予抗性(Barker 等，Theor. Appl. Genet. Ill :370_377，2005)。因此，Runl 和其它與抗病 性有關的基因適用于本文描述的方法和構建物/載體中?；蛘?，本發(fā)明載體可用于誘導RNA沉默(病毒誘導基因沉默或VIGS)而抑制不需 要的基因表達，例如來自致病生物或不需要的宿主基因的基因表達。作為用于檢驗植物基 因功能的機理，VIGS為本領域周知的現(xiàn)象(Godge等，Plant Cell Rep 27(2) =209-219, 2008 ；網上公開于出版前，2007)。為誘導VIGS，所述載體可編碼來自目標基因的一部分核 苷酸序列。該核苷酸序列可來自基因表達轉錄產物的任何部分，包括蛋白編碼區(qū)或未翻譯 序列。本公開內容的另一個實施方案為將本發(fā)明的載體用于引入以下基因，其涉及轉導 或轉基因植物可食用部分的美味修飾，例如汁液的味道或香味。這種可食用部分包括植物 的根、莖、葉、花、種子和/或果實，或源自其中的任何可食用物質。特別的是，可修飾葡萄 或源自其中的汁液使得影響味覺受體的物質能阻斷或增強某種味道，例如苦味、甜味、酸味 等?；蛘?，所述物質增強在葡萄或汁液中發(fā)現(xiàn)的芳香化合物。這種物質可為蛋白，例如莫內 林、竹芋蛋白、味轉導素、類萜和其它本領域已知的這種蛋白。為了美味修飾，本公開內容的 載體可改造為編碼美味修飾分子例如蛋白，然后該載體用于轉入植物細胞，該細胞隨后表 達所述分子。本公開的方法和載體也可用于引入與葡萄新陳代謝途徑(代謝物組學)有關的基 因以改進營養(yǎng)特征。例如，已發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)于葡萄中的多酚化合物(3，4’，5-三羥基二苯乙烯) 白藜蘆醇具有某種健康益處，例如抗癌特性并與心血管疾病的減少關聯(lián)。發(fā)現(xiàn)于葡萄中有 潛在健康益處的其它化合物包括植物營養(yǎng)素例如櫟精、兒茶酚、花青素和原花色素。黑比諾 葡萄品種的測序以及代謝型分析技術(例如核磁共振分光技術)的發(fā)展對開發(fā)適合與本文 所述載體和表達系統(tǒng)一起使用的基因提供了有價值的信息。其它感興趣的基因涉及到成熟 過程(例如fib基因)，以及植物生長、發(fā)育和可能所需的農業(yè)生產的任何方面。本公開內容包括通過將所述植物基因表達載體引入細胞而用于在植物細胞中表達異源基因的方法。所述植物基因轉移載體可通過任何本領域已知的方法引入植物細胞 中，例如通過真空侵入法、超聲處理法、彈射法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、聚乙二醇融合 法、直接轉化法(Lorz等，Mol. Genet. 199 =179-182,1985)和其它方法。所述載體可以 以侵染性病毒顆?；蛞苑乔秩拘院塑账嵋?。一種方法是農桿菌接種法，例如使所述載 體插入具有適合控制元件的雙元質粒中以在農桿菌屬種(例如根癌農桿菌、發(fā)根農桿菌 (A. rhizogenes)和葡萄農桿菌(A. vitis))中表達所述載體。這種方法為本領域已知，例如 描述于 Leiser 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :9136_9140，1992 和 Bouquet 等，Methods in Mol. Bio. 344 :273-285，Agrobacterium Protocols, 2d ed. vol. 2, Wang ed(2006)的方 法，這兩篇都通過引用結合。農桿菌屬可通過真空侵入或超聲處理的方法引入到整株微繁 殖的葡萄樹植株中。改造為表達病毒載體的農桿菌菌株可與改造為表達RNAi病毒阻抑基 因的另一種菌株混合以增加載體感染性(Chiba等，Virology 346 :7_14，2006)?？梢胨鲚d體用于穩(wěn)定表達或瞬時表達。可通過各種已知方法獲得穩(wěn)定表達， 例如使用Bouquet等(Methods Mol. Biol. 344 =273-285,2006)的方法將胚芽期的葡萄組織 與包含所述載體的農桿菌共培養(yǎng)。也可通過各種已知方法獲得瞬時表達，例如描述于本說 明書實施例中的方法。其它方法包括但不限于葉滲入法、真空侵入法和用包被DNA的粒子 轟擊目標組織。也可通過施用含所述載體的溶液(例如通過噴灑)將載體施用于葡萄樹或其任何 部位。這種溶液包含作為DNA、包被DNA的粒子或包含于農桿菌的載體以及鹽和緩沖液。所 述溶液可包含例如0. IM pH7的磷酸緩沖液或其可包含煙堿。這種配方為本領域眾所周知， 可用作適用于本方法的配方。所述溶液還可包含研磨劑，例如金剛砂(例如500目金剛沙、 高嶺土或Celite .硅藻土)。所述溶液也可包含表面活性劑，例如本領域所周知的Triton 或Tween。所述溶液可通過抹、滴、浸泡、噴灑或其它的方法應用于所述植物。參見，例如 Graft transmissible diseases of grapevines. Martelli ed. 1993，Rome，Italy, Food and Agriculture Organization of the United Nations publ。本公開進一步包括包含本文所述載體的組合物。除載體和任選的其它功能性成分 (例如研磨劑和/或表面活性劑)外，這種組合物可包括適用于將載體引入植物細胞中的賦 形劑，例如鹽(例如氯化鎂)和緩沖液(例如MES或磷酸鹽緩沖液)，并且這種組合物通常為 水溶液。參見，例如 Graft transmissible diseases of grapevines. Martelli ed. 1993， Rome，Italy, Food and Agriculture Organization of the United Nations publ?？擅咳?、每月、每季或每年應用所述載體?？稍诩膊“l(fā)作或疾病載體侵襲期間 或之前應用所述載體。例如，一年可觀察到兩次疾病的癥狀暮春時葉和莖的變形和壞 死，秋天時異常色素沉著和其它畸形(Graft transmissible diseases of grapevines. Martelli ed. 1993, Rome, Italy, Food and Agriculture Organization of the United Nations publ)。一旦辨明癥狀，可施用所述載體，例如通過噴灑含研磨劑的溶液?；蛘?， 在疾病的已知載體(例如某種線蟲類或葡萄葉蟬)侵襲時，或在已知誘導疾病有利條件的 某種天氣條件或季節(jié)(例如潮濕天氣和白粉菌)時，可噴灑于植物。這種情形的指南和 目錄為本領域眾所周知，例如加利福尼亞大學害蟲管理指南(University of California Pest Management Guidelines)、全州綜合害蟲管理系統(tǒng)(Statewide Integrated Pest Manage-ment Systems) ( ^ifitN at. ipm. ucdavis. edu/PMG/r302101211. html ( 方于2008年1月27日)可獲得)，其通過引用結合到本文中。此外，本發(fā)明載體可與其它已 知抗病劑(例如油類、殺真菌劑等)一起施用。本公開內容包括轉化植物的方法，包括引導所述植物基因一次或多次轉入所述植 物。可將所述載體引入所述植物2、3、4、5、6、7、8、9、10次或多于10次。所述植物可系統(tǒng)地 或局部地表達所述異源多核苷酸。所述植物細胞可培育成轉基因植物，例如使用Bouquet等(Methods Mol. Biol. 344 =273-285,2006)的方法?；蛘?，所述植物細胞可為多細胞植物的部分，使得植物 僅部分轉化。例如根狀莖、莖或葉可為轉化的?？稍诩膊“l(fā)作前將所述載體引入以賦予抗 性，或可在觀測到疾病后將所述載體引入以減少或減輕疾病、保護植物未感染的部分或防 止疾病傳播至別的植物。其它引用Agranovsky 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (7)，2470-2473，1995Alzhanova 等，Virology 268 (1)，192-200，2000Alzhanova, EMBO J. 20，6997—7007，2001Alzhanova 等，Virology 359，220—226，2007Barrett & Rawlings, Biol. Chem. 382，727—733，2001Boyko 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89，9156-9160，1992de Ios Santos 等，J. Virol. 80，1906-1914，2006Ding & Voinnet，Cell 130，413-426，2007Donson 等，Proc Natl Acad Sci USA 88 :7204_7208，1991Dougherty & Semler，Microbiol. Rev. 57(4)，781-822，1993Gabrenaite-Verkhovskaya 等，J. Gen. Virol. 89，829—838，2008Gorbalenya 等，F(xiàn)EBS Lett 243，103-114，1989Gorbalenya 等，Virus Res. , 117(1) 17-37, 2006Gorbalenya 等，F(xiàn)EBS Lett. 288 (1-2)，201-5，1991Karasev, Annu. Rev. Phytopathol. 38，293-324，2000Kasschau 等，Virology 228 (2)，251-62，1997Koonin & Dol ja，Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28 (5)，375—430，1993Koonin & Dolja, Virus Res 117，1-4，2006Lakatos 等，EMBO J. 25，2768-2780，2006Lu et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101，15742—15747，2004Marillonnet 等，Nat. Biotechnol. 23 :718_723，2005Napuli 等，J. Virol. 77，2377-2384，2003Ng & Falk，Annu.Rev. Phytopathol. 44，183-212，2006Satyanarayana 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101，799-804，2004Satyanarayana 等，Virology 278 (1)，253-265，2000Segers 等，Eukaryot. Cell 5，896-904，2006Susaimuthu 等，Virus Res. 131，145-151，2008Tian 等，J. Gen. Virol. 80，1111-1117，1999
Tijms 等，J. Virol. 81，10496-10505，2007Torrance 等，J. Mol. Biol. 357，1-8, 2005Valli 等，J. Virol. 80，10055-10063，2006Ziebuhr 等，J. Virol. 81，3922-3932，2007Ziebuhr 等，J. Gen. Virol. 81，853-879，2000提供以下實例用于闡明某些具體特征和/或實施方案。不應將這些實例理解為限 制本發(fā)明至描述的具體特征或實施方案。
實施例尋找本地病毒分離群。進行本地葡萄園的調查以確定LR-2是否天然存在于俄 勒岡州，發(fā)現(xiàn)展示早期葉變紅的LR-2類似癥狀的葡萄樹。用市售LR-2免疫檢測試劑盒 (Bioreba AG, Reinach，瑞士；Cat. Nol20775)和定制抗體進行免疫印跡分析，該抗體使用 分離自如下所述的煙草本塞姆氏的LR-2病毒體產生。RT-PCR分析也證明葡萄樹確實包含 所述病毒，該分析使用設計用于擴增LR-2基因組約2kb區(qū)域的包含病毒衣殼蛋白基因的引 物。分子克隆和核苷酸測序。為促進LR-2的積累和分離，使用來自感染葡萄樹的物質 機械地接種煙草本塞姆氏。利用純化的病毒顆粒得到病毒的RNA，通過RT-PCR擴增，并將 cDNA產物克隆進pBlueScript載體質粒。使用RLM-RACE克隆病毒基因組的末端序列。測 序大量的獨立克隆以提供病毒基因組的多重覆蓋。所得到的共有核苷酸序列第一次包括整 個病毒基因組并包含正確的5’ -末端和3’ -末端區(qū)域。該序列的比對分析顯示與先前公 開的紐約LR-2分離群的不完整序列在重疊區(qū)域上99. 9%—致(Zhu等，J. Gen. Virol. 79 1289-1298,1998)。圖IA表示了約16，500核苷酸長的LR-2基因組的功能圖。如Goszczynski等描述，用LR-2進行煙草本塞姆氏的初始接種(Vitis 35: 133-135，1996)。隨后，將煙草本塞姆氏的感染葉用于制備接種物以使病毒在此實驗性病毒 宿主上繁殖。常規(guī)的，將Ig感染組織在5ml pH7. 00. 05磷酸鈉緩沖液中磨碎，并在金剛砂 的幫助下用于新植株的人工接種。如 Peremyslov 禾口 Dolja(Curr. Protocols Microbiol. ,"Cloning of Large Positive-Strand RNA Viruses" Suppl. 7.，Coico, ed.，11 月，2007)中所述(通過引用結 合到本文中)，進行全長cDNA克隆的RT-PCR擴增、克隆和組裝?；虮磉_盒的插入。將在LR-2近親甜菜黃化病毒(BYV)中啟動主要衣殼蛋白表 達的強亞基因RNA啟動子克隆，并連同Pac I和Fse I單一限制位點插入到部分LR_2cDNA 克隆之一中的同功LR-2啟動子的下游。將編碼靶向內質網的綠色熒光蛋白(ER-GFP)的報 道基因插入兩個啟動子間(圖1B)。預期該設計導致來自可靠LR-2啟動子的ER-GFP的高 水平生產，以及來自重組BYV啟動子的LR-2衣殼蛋白的高水平生產，如(Agranovsky等， J. Gen. Virol. 72 15-23，1991)中描述和 SEQ ID NO 1 中闡明的。LR-2全長cDNA克隆的產生。使用重疊的部分cDNA克隆，在噬菌體SP6RNA聚合酶 啟動子的控制下，于pBlueScript (Stratagene，La Jolla, CA)中組裝數(shù)個包含表達盒的 原型全長LR-2克隆。在體外得到相應的加帽RNA轉錄產物，并用于轉染煙草懸浮培養(yǎng)的原 生質體和接種煙草本塞姆氏植株。因為這些實驗沒有一個是導致病毒增殖和感染的，所以重新測序克隆的病毒基因組。檢測到多個有害的突變遍及基因組，暗示著在RT-PCR擴增基 因組片段的過程中引入了差錯。為了可服這個主要障礙，從cDNA片段重組裝整個LR-2基 因組，該cDNA片段使用逆轉錄和Klenow DNA聚合酶代替PCR而得到。盡管這個方法導致 致命突變數(shù)量的顯著減少，但所得到的克隆中沒有一個是完全沒有致命突變的。這些結果 表明有功能、無突變形式的LR-2cDNA很可能對用于克隆的大腸桿菌有毒。可減輕重組DNA毒性的其中一個方法為使用低拷貝數(shù)質粒用于克隆。為了測試這 種可能性，使用pCB-302 (Xiang等，Plant Mol. Biol. 40 :711-717，1999)和適合在大腸桿菌 和根癌農桿菌中克隆的微雙元載體。已將該載體修飾為容納所有對隨后使用農桿菌接種法 在植物中表達LR-2基因組所必需的控制元件。這些元件包括35S RNA聚合酶啟動子、NOS 終止子和專門設計用于在LR-2RNA轉錄時釋放其真正3’-末端的核酶。后一加工事件對病 毒RNA在植物中復制的能力是關鍵性的。在這些修飾之后，將全長LR-2cDNA克隆進pCB_302 并命名為質粒 pCB-LR-GFP (SEQ ID NO :1)。所述LR-2cDNA克隆到質粒pCB_302的T-DNA右緣和左緣之間。所得到的質粒圖 示于圖1C。整個克隆病毒基因組的核苷酸測序顯示沒有有害突變。在煙草本塞姆氏中的感染性測定。將pCB-LR-GFP轉化進農桿菌中，培養(yǎng)、誘導所 得菌株，并用于煙草本塞姆氏植株的農桿菌滲入。一般在接種后2-3周，一些植株表現(xiàn)出典 型的感染癥狀。共聚焦激光掃描顯微鏡在滲入葉的表皮細胞中檢測到強GFP表達。正如所 料，GFP熒光被限制在內質網(ER)和ER源病毒復制復合體的特征網絡中(圖2)。檢查有 癥狀植物的上葉、莖和葉柄，顯示在整株植株的韌皮組織高水平的ER-GFP積累，這是LR-2 和其它線形病毒組的典型(圖3)。感染組織的超微結構分析證實在韌皮細胞尤其在環(huán)繞木 質部和篩分子的維管束鞘細胞中有大量的絲狀LR-2病毒體的積累。此外，免疫印跡分析證 實LR-2衣殼蛋白的有效積累(圖4A)。這些實驗表明克隆的重組LR-2是高侵染性的、能系 統(tǒng)性傳播和在實驗性宿主煙草本塞姆氏中表達重組蛋白。農桿菌感染效率的改進。盡管LR-2感染一致地出現(xiàn)于農桿菌接種時，但在接種葉 中初始感染的細胞數(shù)量少且僅部分接種植株形成系統(tǒng)性感染。為了增強重組病毒建立感 染的能力，使用基于在接種時表達RNAi的病毒阻抑基因的方法(Chiba等，Virology 346 7-14，2006)。此外，已證明LR-2編碼RNAi的非常有效的阻抑基因p24。因此，將改造為表 達p24的農桿菌加至接種物。此技術導致由農桿菌產生的病毒特異感染性增加約5000倍 (圖5) (Chiba等，Virology 346 :7_14，2006)。現(xiàn)在常規(guī)地就能得到農桿菌接種的煙草本 塞姆氏植株的100%感染。LR-2基因表達載體的遺傳穩(wěn)定性。為了測試LR-2載體是否能保留完整的編碼報 道蛋白的外來插入物，已從4株單獨感染的煙草本塞姆氏植株的頂部葉中分離出RNA。使用 這些RNA和位于ER-GFP表達盒下游和上游的引物完成RT-PCR。所得到的PCR產物為預期 大小，表明在各測試植株中保留了完整盒(圖4B)。重要的是，沒有檢測到可能源自所述盒 部分丟失或全部丟失的較短產物。這些數(shù)據證實所述工程載體是遺傳穩(wěn)定的且能用于重組 蛋白的有效表達。用于功能性基因組學和病毒控制的基因沉默載體的開發(fā)。為了測試LR-2載體的 病毒誘導基因沉默(VIGS)的潛力，使用GFP轉基因型煙草本塞姆氏16c系和GFP表達型 LR-2。在用LR-2-GFP接種之后，在系統(tǒng)性感染的16c植株的葉上觀察到強GFP沉默(圖
166)。此實驗證明LR-2-GFP與已知VIGS載體的作用類似，通過響應病毒同源基因的過量表 達誘導轉基因的RNAi，這為利用LR-2載體的VIGS這個概念提供了證據。微繁殖葡萄樹并遷移至土壤。為了測試新載體，使用以下技術形成全年穩(wěn)定供應 的實驗性葡萄樹植株，該技術為在無菌條件下于使用瓊脂基生長培養(yǎng)基的塑料盒中微繁殖 葡萄樹。這種植株可直接用于感染性測定。此外，有未證實的報道指出微繁殖植株對病毒 感染具有增加的易感性?；蛘撸蓪⑽⒎敝持仓赀w移至土壤并在溫室中培養(yǎng)以得到木本植 株，其在易感性上更類似于在開放土壤中生長的植株。將這種遷移的條件最優(yōu)化，得到持續(xù) 供應的微繁殖葡萄樹植株和溫室葡萄樹植株。簡而言之，將具有至少兩個芽的12英尺插枝捆成20-30根一組，在10%漂白溶液 中浸泡10分鐘，在水中洗滌三次，然后浸入水中12-24小時。然后將所述捆浸在生根溶液 中(Dip，N Grow,Dip'N Grow Inc.，Clackamas，OR)，然后種植在溫熱至 85° F 的潮濕的蛭 石中。生根出現(xiàn)于3-4周內。然后將所述插枝在設為3秒每8個太陽單位(日間)和3秒 每2個小時(夜間)的噴霧床下于盆栽土中植入4-6英尺深。一旦大概2周內出現(xiàn)葉子， 減少噴霧以防止霉菌生長。為了在組織培養(yǎng)中形成葡萄樹，摘下新嫩枝并從嫩枝尖摘掉除一片葉外的所有 葉。所述嫩枝在 0.05% Ivory 液體皂(Proctor and Gamble, Cincinnati, OH)中培養(yǎng) 10 分鐘，在水中洗滌1個小時，然后在超聲水浴中超聲處理10分鐘。在5%漂白液中表面消 毒該嫩枝6分鐘，并移至層流凈化罩以消毒處理。在無菌去離子水中洗滌該嫩枝，在堿中平 衡并種植于OH瓊脂培養(yǎng)基中。在生長室中培養(yǎng)該嫩枝2周；加入GSl液，再培養(yǎng)2周，然后 移至GSl瓊脂培養(yǎng)基。每2周加入新培養(yǎng)基，1個月后將該嫩枝換至下一階段培養(yǎng)基(GS2，
GS3)中。根在GS3培養(yǎng)基中形成。
葡萄OH培養(yǎng)基
成分濃度g/L
M&S鹽3. 22g
硫胺素0. 8ml 母液(0. 5mg/ml)
肌醇0. 100g
蔗糖7g
NaH2PO40. 170g
硫酸腺嘌呤0. 08g
調節(jié)pH至5. 7
瓊脂3g
高壓滅菌20分鐘，在50°C水浴冷卻30分鐘，然后加入抗生素頭孢噻肟0. 2g。過
慮除菌至冷的培養(yǎng)基并混合。分裝至無菌的測試管。
0144]葡萄階段I(GSl)培養(yǎng)基
0145]成分濃度g/L
0146]M&S 鹽3.22g
0147]硫胺素0. 8ml 母液(0. 5mg/ml)
0148]肌醇0. Ig
0149]蔗糖20g0150]BAP2ml 母液(0. 5mg/ml)
0151]高壓滅菌20分鐘，在50°C水浴冷卻30分鐘，然后加入抗生素頭孢噻肟0. 2g。過 慮除菌至冷的培養(yǎng)基并混合。分裝至24只無菌的Magenta盒。
0152]葡萄階段2培養(yǎng)基0153]成分濃度g/L0154]M&S鹽3. 22g0155]硫胺素0. 8ml 母液(0. 5mg/ml)0156]肌醇.025g0157]蔗糖15g0158]NaH2PO40. 05g0159]BAP4ml 母液(0. 5mg/ml)0160]IAA0. 5mls IAA 母液(lmg/ml)0161]調節(jié)pH至5. 30162]瓊脂2g0163]Gelrite 結冷膠 1. 2g0164]高壓滅菌20分鐘，在50°C水浴冷卻30分鐘，然后加入抗生素頭孢噻肟0. 2g。過
慮除菌至冷的培養(yǎng)基并混合。分裝至24無菌的Magenta盒。
0165]葡萄階段3(GS3)培養(yǎng)基0166]成分濃度g/L0167]M&S鹽3. 22g0168]硫胺素0. 8ml 母液(0. 5mg/ml)0169]肌醇.025g0170]蔗糖12. 5g0171]NaH2PO4 0.050172]IAAIml 母液(lmg/ml)0173]調節(jié)pH至5. 30174]瓊脂Ig0175]Gelrite 結冷膠 Ig0176]高壓滅菌20分鐘，在50°C水浴冷卻30分鐘，然后加入抗生素頭孢噻肟0. 2g。過
濾除菌至冷的培養(yǎng)基并混合。分裝至24只無菌的Magenta盒或12只雙層的Magenta盒。正在微繁殖很多葡萄品種并檢測它們對農桿菌滲入的易感性和外來蛋白表達。品 麗珠和西哈(Sirah)品種已表明所需的特征。此外，已初步發(fā)現(xiàn)轉移至無抗生素培養(yǎng)基的 無菌植物對農桿菌滲入更易感。農桿菌制備。為了制備農桿菌，將土壤成分劃線至的LB卡那霉素(50yg/ml)瓊 脂平板上并在28°C培養(yǎng)3天。挑出單菌落并加至LB卡那霉素(50 μ g/ml)、MES (IOmM)和 乙酰丁香酮(20 μ M)的5ml培養(yǎng)物中，并在220rpm和28°C下振蕩。如果使用土壤菌株 C58GV2260,則加入利福平(50 μ g/ml)。將初始培養(yǎng)物轉移至500ml LB卡那霉素(50 μ g/ ml)、MES(IOmM)和乙酰丁香酮(20 μ M)中，并在28 °C振搖過夜(1_20小時)。在室溫 6000rpm離心培養(yǎng)物10分鐘，將細胞團懸浮于20ml誘導緩沖液中，通過與阻抑基因p24的0. 1-0. HOD600混合并加入額外的誘導緩沖液，對全病毒構建物達到終濃度為2. 00D_，或對 僅GFP標記構建物達到終濃度為0. 70D_。為了制備所述阻抑基因p24構建物，如上述制備土壤儲液，然后懸浮于20ml誘導 緩沖液至終濃度0. IOD600,以與全病毒構建物懸浮液混合，或至終濃度0. HOD600,以與僅GFP 標記懸浮液混合。誘導緩沖液IOmM MgCl2 = 2ml 的 0. 5MgCl2IOmM MES pH 5. 85 = 2ml 的 0. 5M pH 5. 85 的 MES/100ml150 μ M乙酰丁香酮=100 μ 1的150mM乙酰丁香酮微繁殖的葡萄葉或整株植株的農桿菌滲入。通過用31g針刺大葉脈和葉面損傷來 自微繁殖植株的健康葉。將單片葉放置在含5-10ml誘導懸浮液的管中，或將整株植株松弛 地放在含200ml誘導懸浮液的燒杯中。將所述葡萄樹/ 土壤懸浮液在Branson 3510超聲 處理水浴中超聲處理10分鐘，超聲處理后在誘導懸浮液中浸泡2-3小時。在無菌紙巾上吸 干所述葡萄葉或植株，然后將葉放置在水瓊脂平板(7g瓊脂/IL水)上，而將整株栽入含盆 栽混合物的4英尺盆并自由澆水。將塑料杯緊緊地放置在植株上以減少在生長室的蒸騰。 在兩周的周期內通過傾斜杯子的角度將周圍的空氣逐漸引至盆栽植株，直至最終移去塑料 杯。對僅GFP標記構建物在4天后，對全病毒/GFP構建物12_14天后，通過顯微鏡監(jiān) 測葉的GFP表達。類似的技術可用于植株的其它部分，例如根莖。利用農桿菌在葡萄樹中表達GFP。在盡力產生LR-2的感染性克隆同時，進行以下 實驗，目標是開發(fā)在葡萄樹中重組基因的農桿菌介導瞬時表達技術。設計這些實驗用于促 進未來在葡萄樹中的感染性測試。利用改造用于表達自由GFP報道基因的農桿菌(圖7C) 和細菌懸浮液真空侵入葉或整株植株的技術，展示了在微繁殖植株中GFP的積累。為此， 在22°C的植株生長室中將分離的農桿菌滲入葉保存在Petri皿水瓊脂上4天，并用配備著 GFP2濾鏡和數(shù)碼照相機的表面熒光立體顯微鏡Leica MZ 16F(如圖7A和B所示)或共聚 焦激光顯微鏡篩選GFP表達。使用配備著488nm激發(fā)濾鏡和508nm發(fā)射濾鏡的ZeissLSM 510META(Zeiss，德國)顯微鏡進行共聚焦激光掃描顯微。將制造商提供的軟件包用于圖像 處理。如上述也測試使用將植株與細菌懸浮液浸入超聲水浴中的農桿菌接種替代技術。 證明該方法跟滲入法是同樣成功的，且具有額外的簡單性好處(圖7A)。此外，超聲處理導 致在脈管葉組織頻繁表達GFP (圖7B)。因為LR-2將優(yōu)先絡合韌皮部，所以此技術有望促進 感染。利用葡萄農桿菌(Agrobacterium vitis)分離物和發(fā)根農桿菌(A. rhizogenes) 分離物正在進行補充的測試，以確定與傳統(tǒng)的根癌農桿菌相比這些細菌是否可在葡萄中提 供更高效的農桿菌接種。此外，為了最優(yōu)化農桿菌滲入和超聲處理的方案，正在進行測試農 桿菌感染法結合嫁接法(用細菌懸浮液處理ω嫁接插條)及剝皮愈合農桿菌接種技術(將 細菌懸浮液應用于被剝皮暴露的韌皮部)的效用以改進轉化。在葡萄樹中測定感染性。將兩不同的LR-2克隆用于農桿菌接種法i)
19miniLR-GFP/⑶S (此微基因組僅包括對復制必需的基因加GFP/⑶S報道基因，缺乏對病 毒組裝和植株中轉運所必需的基因；SEQ ID NO :2)。所述GFP/⑶S報道基因代表GFP和 GUS ( β -葡糖醛酸糖苷酶)的融合，該GFP可用表面熒光顯微鏡檢測，該GUS具有酶促活性 以在原位和體外測定中提供敏感性。miniLR-GFP/GUS的圖譜示于圖8 ；相對應的核苷酸序 列提供為SEQ ID NO 2 ；和ii)全長LR-2-GFP (SEQ ID NO :1)。當篩選用與p24表達質粒混 合的miniLR2-GFP/GUS進行農桿菌接種的微繁殖植株時，觀察到大量的在ER中表達ER-GFP 報道基因的感染細胞(圖8)，表明所述微載體在葡萄葉細胞中復制和表達報道蛋白的能 力。因此，表面熒光或共聚焦激光掃描顯微鏡檢測到的各GFP陽性細胞代表成功的事件，其 中發(fā)送病毒載體并得到病毒載體(在本發(fā)明中由微復制子表示)報道基因的表達。然而，全長載體的類似實驗導致有限數(shù)量細胞的感染(圖9)。事實上，在先前 BYV的工作中，就發(fā)現(xiàn)用農桿菌感染時微基因組具有高很多的感染性(Chiba等，Virology 346 7-14,2006)。全長LR-2載體的進一步開發(fā)。使用LR-2基因組RNA產生所述最初的全長LR-2 克隆，該LR-2基因組RNA分離自繁殖于煙草本塞姆氏的病毒。為了提高葡萄樹感染性和減 少因病毒適應實驗性宿主而可能的突變，從cDNA片段重新組裝全長克隆，該cDNA片段直接 源于得自俄勒岡州本地葡萄園的LR-2感染的黑比諾葡萄。使用Plant RNeasy試劑盒(QIAGEN)自葉中純化總RNA，并將總RNA用作隨機引物 cDNA構建的模板。然后自該cDNA PCR擴增2至4kb鄰接片段?；贕RLaV-2的公開序列 和存在于該病毒cDNA中的重疊獨特克隆位點設計PCR的寡聚核苷酸。然后將擴增的PCR 片段克隆至攜帶LR-2cDNA最初變體的雙元質粒，以用源自葡萄樹中存在病毒的片段代替 現(xiàn)有的部分。對各片段，測序至少4個克隆以推導共有序列，該共有序列相當于葡萄樹中存 在的LR2基因組的主要和全部生物活性變體。再次重新組裝由共有片段組成的完整基因組 cDNA。新雙元質粒命名為LR2-Vitis，其攜帶葡萄樹源病毒的cDNA，該病毒源于黑比諾且從 未給煙草本塞姆氏傳代。該葡萄樹源LR2_Vitis表達盒的全部核苷酸序列示于SEQ ID NO :7。該序列包含 74個不同于最初煙草本塞姆氏源病毒盒的核苷酸(圖14)。似乎很可能這些差異反映了病 毒為系統(tǒng)性感染天然(葡萄樹)或實驗性(煙草本塞姆氏)宿主植株所作的適應。因此， 可預期到葡萄樹源LR2-Vitis載體在葡萄樹中將具有增加的繁殖能力。歐洲葡萄韌皮部特異性啟動子的利用。利用在農桿菌接種時啟動病毒RNA轉錄的 CaMV 35S RNA聚合酶II (POL II)啟動子啟動LR-2載體和LR2_Vitis載體。盡管35S啟動 子通常用于這種目的，但對使用LR-2載體感染葡萄樹其可為次優(yōu)的。確實，LR-2天然感染 葡萄樹并限于韌皮組織，相反35S啟動子對葡萄樹或韌皮部沒有特異性。因此，我們利用生 物信息學鑒定候選葡萄樹韌皮部特異性啟動子，該啟動子可用于代替35S啟動子以便提高 LR2-Vitis的葡萄樹感染。g/鑒定出三種高表達型韌皮部特異性擬南芥(A.thaliana)基 因，并使用相應的蛋白序列和BLASTP搜索鑒定明顯的歐洲葡萄直向同源物。建議相應蛋白 編碼序列(SEQ ID NO :8-10)上游的歐洲葡萄基因組序列用作韌皮部特異性啟動子，代替在 LR2-Vitis盒中的范例35s啟動子。歐洲葡萄啟動子的具體性質和特征在下面略述。1.擬南芥蔗糖轉運蛋白2 (SUC2蔗糖-H+協(xié)同轉運物)基因(Atlg22710)的啟動 子最先由Truernit和Sauer鑒定出(Plantal96 :564_570，1995)。在擬南芥中，該啟動子在充分發(fā)育葉的整個葉脈網絡中調節(jié)韌皮部伴胞特異性AtSUC2蔗糖-H+協(xié)同轉運物基因 的表達(Imlau等，Plant Cell 11:309-322,1999)。Imlau等也發(fā)現(xiàn)該啟動子的939個核 苷酸的3'片段足以啟動報道基因的韌皮部特異性高水平表達。2.擬南芥基因At5g57350編碼質膜對+)41 酶3(質子泵)并遍及植株在韌皮部 表達(DeWit等，Plant J. 1，121-128，1991)。該ORF的2，467-kb啟動子片段足以啟動存 在于葉、莖和根的韌皮部伴胞中的基因表達(HongYu等，Chinese Science Bulletin, 52 1949-1956，2007)。3.擬南芥蔗糖合酶1基因(At5g20830)。該ORF的2kb啟動子區(qū)域與報道基因融 合，指導其在成熟葉韌皮部的表達(Bieniawska等，ThePlant Journal 49，810-828，2007)。 所述mRNA 5，-末端以很接近于LR-25’ -末端序列的ATCTTA為起點(Martin等，Plant J 4 367-377. 1993)，使得該啟動子成為提高LR2_Vitis在葡萄樹中感染性的極有吸引力的
候選者。位于葡萄樹ORF上游的葡萄樹啟動子的核苷酸序列編碼擬南芥基因Atlg22710、 At5g57350和At5g57350的明顯直向同源物，該核苷酸序列隨同提供它們各自在葡萄科葡 萄(V. vitis)基因組中位置的數(shù)據庫標識一起示于SEQ ID N0:8-10(分別地)。前導蛋白酶對復制影響的鑒定。通過插入熒光、酶和表位報道基因而標記的GLRaV-2復制子的產生產生GLRaV-2的克隆以確定Ll和L2的功能分布圖。測序完整的16，486核苷酸 長的GLRaV-2基因組(GenBank登記號FJ436234 ；基因標識為:gi =213958313 ；2009年1月 26號，通過引用結合于本文中)并與該病毒其它分離群比較，揭示與分離群94/970 (Meng 等，VirusGenes 31，31-41，2005)具有最近親緣關系(99. 6%核苷酸一致)。使用雙元載體 和初代常規(guī)的cDNA克隆組裝最初的全長克隆，以避免引入PCR產生的突變，并測序以確認 其與病毒基因組的共有核苷酸序列的對應。為了促進通過農桿菌接種引起的病毒感染，分 別將核酶序列和花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S RNA聚合酶啟動子插入GLRaV-2序列的下 游和上游。進一步修飾所得的全長GLRaV-2克隆，以在CP開放閱讀框緊接上游容納報導基因 表達盒。所述盒包含GFP開放閱讀框，該閱讀框后面為BYV CP亞基因RNA啟動子。結果是， 后面的啟動子指導GLRaV-2CP的表達，而真正GLRaV_2CP啟動子表達GFP報道基因。該標 記的全長GLRaV-2復制子命名為LR-GFP(圖10A，中圖)。在個體細胞中缺失對病毒RNA擴增非必須的基因促進實驗編碼前導蛋白酶、RNA 復制酶和RNAi阻抑基因的剩余基因。就GLRaV-2而言，通過缺失從p6跨越至pl9開放閱 讀框基因區(qū)域的基因塊并保留報導基因，產生這種微復制子。為了表達GFP和b-葡糖醛酸 糖苷酶的融合體，進一步修飾所述報道基因表達盒以產生標記的GLRaV-2微復制子，其命 名為 mLR-GFP/GUS (圖 10A，下圖)。為了允許使用市售HA特異性單克隆抗體去免疫化學檢測L2ha，通過插入三重的血 凝素表位(HA)標記至L2的N端結構域修飾LR-GFP和mLR-GFP/⑶S兩者(圖IOB和11A)。 使用煙草本塞姆氏GLRaV-2的系統(tǒng)性實驗性宿主的葉農桿菌滲入，測試全長變體和微復制 子變體的感染性(Goszczynski 等，Vitis 35，133-133，1996)。對于 mLR-GFP/GUS，這種農 桿菌滲入導致在最初接種細胞中微復制子RNA的積累和發(fā)熒光、酶促活性GFP/GUS報道基
21因的高效表達(圖10B)。重要的是，在HA標記的變體中⑶S活性水平約為最初mLR-GFP/ ⑶S中的85%。因為該略微減少在統(tǒng)計上僅略微顯著(P值約0.001)，所以推斷HA標記插 入至L2中不明顯影響病毒基因組的擴增。插入HA標記到Ll中的嘗試產生非傳染性的復 制子，放棄了該嘗試。全長LR-GFP的最初變體和HA標記變體在煙草本塞姆氏都為系統(tǒng)性感染的；農桿 菌滲入底葉3周后，在非接種上葉檢測到病毒感染的典型癥狀和GFP熒光(圖10A)。因此， 產生了一系列侵染性標記的GLRaV-2復制子，其可被發(fā)送至煙草本塞姆氏并用于指明Ll和 L2在病毒感染周期中的功能。Ll和L2在煙草本塞姆氏最初接種細胞中的蛋白質加工功能和RNA積累功能的變 異分析。為了指明Ll和L2的功能，引入七個點突變和缺失至相應編碼區(qū)(圖10B)。具體地 說，為了確定在Ll和L2各自C端對自加工的需求，用丙氨酸殘基代替各蛋白酶的預測催化 性半胱氨酸殘基(Cys493和Cys767)，以分別產生Ml和M2變體(圖10B)。利用加帽mRNA (包 括5’-末端非翻譯區(qū)、整個L1-L2開放閱讀框和編碼部分甲基轉移酶功能域的短下游區(qū)域) 的體外翻譯，研究各變體的加工能力(圖10B)。使用免疫印跡和HA特異性抗體(圖11A) 或35S-甲硫氨酸標記(圖11B)分析所得的翻譯產物。正如所料，標記的非突變型變體產生 單一 HA陽性條帶，對應于完全加工的HA標記的L2(圖IOB和圖11A，道L2m)以及還有同 位素標記的完全加工的Ll (圖IOB和圖11B，道L2ha)。相反，Ml變體的翻譯導致相當于L1-L2融合體的單一主要產物的積累(圖IB ；圖 2A和2B，道Ml)。類似的，L2中預測的催化半胱氨酸的突變取代導致L2自加工的缺失，但 并不影響自催化釋放Ll (圖IOB ；圖IlA和11B，道M2)。因為預測的活性位點殘基的突變 的確使各前導蛋白酶自體蛋白水解失活，所以推斷Ll和L2確實為具催化活性的木瓜蛋白 酶樣蛋白酶。為了確定Ll和L2的加工是否為病毒RNA擴增所必需，將mLR-GFP/⑶S的Ml和M2 變體用于農桿菌滲入煙草本塞姆氏葉，并確定所得的GUS活性。正如以前BYV微復制子表 明的，GUS活性為測定病毒RNA在感染細胞中的積累提供了可靠的替代標記(Peng &Dolja, J. Virol. 74，9766-9770，2000)。使用該標記，意外地發(fā)現(xiàn)Ll切割的失活導致更有效的⑶S 表達；在三個獨立的實驗中檢測到⑶S活性幾乎增加至2倍(圖10B)。相反，L2切割的失 活實質上消除了微復制子感染力相應的GUS表達水平少于親本mLR-GFP/GUS的0.5% (圖 10B)。該結果與BYV微復制子感染性對L-Pro切割的嚴格要求是一致的(Peremyslov等， J. Virol. 72，5870-5876，1998)；的確L-Pro或L2與復制酶的融合很可能干擾病毒RNA的合 成。為了確定Ll和L2在RNA積累中各自的作用，產生缺失L1、L2或兩者的編碼區(qū)的突 變體。有意思的是，盡管相應的GUS活性水平約為親本mLR-GFP/GUS變體的1/5，但無Ll的 突變體DLl能復制(圖10B)。出乎意料的是，在DL2變體中缺失L2導致GUS表達的輕微增 加，表明L2對在分離的煙草本塞姆氏細胞中積累微復制子為非必需的(圖10B)。然而，同 時缺失Ll和L2得到微復制子DL1/2，其僅表達親本mLR-GFP/⑶S變體中觀測到的1 %⑶S 活性(圖10B)?？傊@些結果表明，盡管Ll在病毒RNA擴增中的作用比L2的更顯著，但 后者蛋白酶能拯救Ll缺陷突變體的RNA積累，因此Ll和L2在這個過程中具有部分重疊的
22功能。Ll和L2都具有C端木瓜蛋白酶樣蛋白酶結構域(分別為Prol和2)和N端結構 域(分別為NTDl和NTD2 ；圖10B)。為了確定NTDl和Prol在Ll功能中的相對作用，缺失 這些結構域產生DNTDl和DProl變體(圖10B)。這些微復制子的前者顯示在⑶S積累上減 少了 2/3，而后者卻產生比親本變體更多的⑶S(圖10B)。這些數(shù)據表明是Ll的非蛋白水 解結構域而不是蛋白酶區(qū)域對煙草本塞姆氏細胞中病毒RNA積累提供主要的貢獻。應該強 調的是，最佳RNA積累對NTDl的表觀需求可反映蛋白結構域的作用、或在RNA水平相應編 碼區(qū)域的作用、或兩者。Ll和L2在病毒體感染力和在煙草本塞姆氏中系統(tǒng)性傳播GLRaV-2的作用為了明確Ll和L2在病毒的細胞間移動和長距離轉運中的潛在作用，將DLl和DL2 缺失體引入全長LR-GFP變體的本底中。在農桿菌滲入之后，從接種葉中分離出病毒體，將 等濃度的病毒體懸浮液用于人工接種煙草本塞姆氏葉，并在接種8天后用GFP熒光鑒定所 得感染灶。對親本LR-GFP變體，接種率為每片葉9. 9 士 5. 6感染灶，平均直徑為4. 3 士 1. 4個 細胞。對LR-GFPDL2得到極相似的結果(每片葉8. 2士4. 8病灶；平均直徑4. 1 士 1. 3個細 胞)，表明在煙草本塞姆氏中L2對GLRaV-2的感染性和細胞間移動是非必需的。驚奇的是， Ll的缺失導致LR-GFPDL1變體的特異性感染性顯著地減少至1/25 (每片葉0. 4個細胞)。 此外，所述極少檢測到的GFP陽性病灶為單細胞，表明Ll或相應的編碼區(qū)域對病毒體在最 初接種細胞中建立感染和移至臨近細胞的能力是必需的。為了確定Ll和L2是否涉及GLRaV-2的系統(tǒng)性轉運，在使用農桿菌滲入法將全長 LR-GFP發(fā)送至煙草本塞姆氏植株的前提下，測試六種復制型變體。接種3、4和5周后，篩選 有癥狀、GFP和CP表達的接種植株。有意思的是，多數(shù)或全部用Ml和DL2變體接種的植株 變?yōu)橄到y(tǒng)性感染，表明L2或L1、L2間切割對病毒在煙草本塞姆氏中的長距離轉運都不是必 需的(圖IOB和圖12A)。在DProl突變體的情況中發(fā)現(xiàn)類似的系統(tǒng)性傳播能力。然而，缺 失Ll或其N端結構域導致復制子建立系統(tǒng)性感染能力的完全丟失(圖IOB和12A)。對系統(tǒng)性感染葉片的觀察揭示了實驗性變體間在GFP積累上的明顯差異(圖 10A)。為了進一步評估這些差異，評估在非接種上葉中GLRaV-2CP的積累。顯著的是，發(fā)現(xiàn) 僅DProl突變體能積累到與親本變體相當?shù)乃?圖12B)。剩下的兩種突變型變體Ml、尤 其是DL2各自在接種3和4周后積累的水平明顯都比親本LR-GFP變體低(圖3B)。總之， 這些結果表明L2本身和Li、L2間切割對GLRaV-2在煙草本塞姆氏中的最佳系統(tǒng)性傳播是 必需的。另外，因為甚至在接種五周后在用DNTDl或DLl變體接種的植株上葉中都沒檢測 到GFP或病毒的CP (圖12C和12D)，所以Ll和其N端非蛋白水解結構域或相應編碼區(qū)對 GLRaV-2建立系統(tǒng)性感染的能力是不可缺少的。在BYV中，p20和L-Pro都涉及病毒的系統(tǒng)性傳播(Peng等，J. Virol. 77， 2843-2849，2003 ;Prokhnevsky 等，J. Virol. 76，11003-11011，2002)。其中，p20 是病毒體 尾部必需的成分(Peremyslov 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA101，5030-5035，2004)，然而 由于無法獲得L-Pro特異性抗體，不清楚L-Pro是否存在于病毒體中。由于產生了有功能 的HA標記L2變體，所以其用于確定該蛋白酶是否關聯(lián)病毒體。從系統(tǒng)性感染的葉中分離 GLRaV-2病毒體，并用蔗糖濃度梯度分級。使用CP特異性抗體在級分12-14中檢測到病毒 體的峰(圖13)。然而，使用HA特異性抗體對相同梯度級分的免疫印跡分析顯示L2的峰在級分15-17中，表明存在于病毒體懸浮液的L2并不是物理上結合病毒體(圖13)。用于檢 測存在于L2的HA表位的免疫金特異性電鏡法進一步支持該結論。實際上，在含大量病毒 體的級分12-14中僅發(fā)現(xiàn)很微弱的金標記。此外，在這些級分中檢測到的少量金微球為非 直接結合該病毒體的(圖13，上圖)。L2峰的級分15-17包含更大量的金微球，但實際上沒 有病毒體(圖13，下圖)，表明L2并不直接關聯(lián)GLRaV-2病毒體。Ll和L2對歐洲葡萄的微復制子感染是關鍵的普遍認為煙草本塞姆氏也許是各種植物病毒最混雜的宿主。為了確定由Ll和 L2在該實驗性宿主的GLRaV-2感染中所起的表面上非必需的和很大程度上多余的作用是 否如實地反映它們在葡萄樹感染中的作用，將四種微復制子變體農桿菌滲入至歐洲葡萄 (Grenache)葉(表1)。用親本mLR-GFP/GUS變體接種8天后，觀察到每片葉約300個單細 胞的GFP熒光感染灶。驚奇的是，使用DLl和DL2變體滲入導致病灶數(shù)量分別降至1/100和 1/7，表明各前導蛋白酶對微復制子在葡萄樹細胞中建立感染的能力是必需的(表1)。然 而，與煙草本塞姆氏中觀察到的類似，Ml變體的感染性與親本變體沒有顯著差異。引人注目的是，在滲入葉中測量到的GUS活性與感染細胞數(shù)量的數(shù)據很相關(表 1)，表明前導蛋白酶的主要功能為幫助病毒感染的建立而不是在感染細胞中增加病毒RNA 的積累。因為與煙草本塞姆氏中的相比，缺失Ll和L2在歐洲葡萄中的影響更顯著得多，所 以推斷各蛋白酶為GLRaV-2感染其天然宿主植物提供顯著的和特異的貢獻。表1. mLR-GFP/ GUS微復制子變體在歐洲葡萄中的感染性和GUS表達
實驗變體感染灶的中值數(shù)量 (親本變體的％)中值GUS活性 (親本變體的％)1mLR-GFP/GUS100.00100.001ALl1.034.161AL214.9610.031Ml104.44103.112mLR-GFP/GUS100.00100.002ALl1.582.932AL210.4410.872Ml133.43118.08討論不囿于任何特定的理論，提供下列討論。本公開內容允許描述Ll和L2在GLRaV-2 感染周期中的三個主要功能i)多蛋白加工；ii)病毒在初始感染細胞中的積累；和iii) 感染的系統(tǒng)性轉運。具體地說，發(fā)現(xiàn)Ll和L2都是活性蛋白酶，具有保守的催化半胱氨酸(圖IOB和 11)。對病毒RNA復制酶多蛋白的甲基轉移酶結構域上游的切割對GLRaV-2生存力是必不 可少的(圖10B)。令人驚訝的是，盡管Ll確實在體外(圖11)和體內(圖13)都切割其C 端，但由來自Ml和DProl變體表型的證據，該切割和Ll蛋白酶結構域本身在煙草本塞姆氏 中的系統(tǒng)性感染都不是不可缺少的(圖IOB和12)。然而，這些突變體在非接種葉中較慢的 病毒積累(圖12A和12B)暗示Ll介導的切割對系統(tǒng)性感染的最優(yōu)發(fā)展是必需的。
缺失分析表明Ll和L2在初始接種細胞中的病毒RNA積累中起部分重疊的作用。 當通過農桿菌滲入法發(fā)送病毒微復制子時，完全缺失Ll導致RNA的積累和表達降至1/5。 缺失Ll的非蛋白水解N端結構域時觀察到類似的結果，表明其在Ll功能中的主要作用(圖 10B)。盡管缺失L2不會影響RNA積累，但組合缺失Ll和L2導致實際上非成活的微復制子， 表明L2在缺失Ll時為病毒感染性提供顯著的貢獻。有意思的是，當將含全長基因組的分離病毒體用于植物接種時，DL2變體的感染性 和細胞間移動與親本變體沒有區(qū)別，而DLl變體的病毒體已喪失感染性。缺失Ll編碼區(qū)但 保留L2編碼區(qū)可影響病毒體結構、穩(wěn)定性和感染性。因此，有可能除由微復制子農桿菌接 種揭示的Ll在RNA積累上的功能外，相應編碼區(qū)也在RNA水平起作用，以促進形成能局部 和系統(tǒng)性轉運的有尾病毒體。與后者假設一致，在使用全長復制子的農桿菌滲入時，DLl和DNTDl突變體不能建 立系統(tǒng)性感染(圖12C)。相反，DProl變體中蛋白酶結構域的缺失不會影響系統(tǒng)性感染， 表明病毒體尾部形成可能未受影響。缺失L2產生系統(tǒng)性感染的DL2變體，然而其顯示在上 葉中慢得多的積累(圖IlA和11B)。該結果表明L2對煙草本塞姆氏中有效地系統(tǒng)性傳播 GLRaV-2是必需的。當將微復制子變體農桿菌接種至GLRaV-2的天然宿主葡萄樹的葉上時，得到可能 是本研究最有意義的結果。與許可的實驗性宿主煙草本塞姆氏(其中L2對微復制子感染 性是多余的)形成強烈對比，在以農桿菌滲入歐洲葡萄葉時，DL2變體顯示RNA積累降至 1/10(表1)。DL2變體的特異感染性(以每片葉中的GFP熒光感染細胞中值數(shù)來衡量)也 降至1/10。微復制子RNA的積累和感染細胞數(shù)量的這種相關性明顯指出L2在病毒的侵襲 力(即在接種細胞中建立感染的能力)中的關鍵作用。在Ll的情形中，其在GLRaV-2侵 襲葡萄樹中的作用更為顯著。的確，Ll缺失導致DLl變體的RNA積累和特異感染力降至約 1/100 (表1)。推斷Ll和L2都對葡萄樹最佳的GLRaV-2感染是必不可少的。前導蛋白酶在GLRaV-2中重復和多樣化的特殊功能性意義是什么？看來該答案， 至少部分答案，在于Ll和L2的宿主特異性作用，它們的功能協(xié)作在感染葡萄樹而不是煙 草本塞姆氏時是必需的。換言之，串聯(lián)的病毒蛋白酶可能已進化為促進單一蛋白酶的功 能，以破壞多年生木本宿主對病毒感染潛在的頑拗作用。該假設與以下事實是一致的除 GLRaV-2外，在各自感染木本和/或多年生宿主的CTV (Karasev等，Virology 208，511-520， 1995)、懸鉤子斑駁病毒(Raspberry mottle virus) (Tzanetakis 等，Virus Res. 127， 26-33,2007)和草莓褪綠斑點病毒(Strawberry chlorotic fleck virus) (Tzanetakis & Martin, Virus Res. 124，88-94，2007)中發(fā)現(xiàn)了蛋白酶重復，卻沒在感染草本年生宿主的 BYV、薄荷病毒l(Tzanetakis等，Virus Res. 127，26-33，2007)或香石竹黃點病毒中發(fā)現(xiàn)。Ll和L2促進GLRaV-2感染的可能機理是什么？這些前導蛋白酶各自以宿主特異 性方式起促進病毒感染力的作用，該事實表明Ll和L2可能涉及抑制抗病毒的防御反應。一 種可能性是Ll和L2獨立或協(xié)同RNAi阻抑基因p24涉及RNA干擾(RNAi)的抑制(圖1A) (Chiba等，Virology 346 -J-U, 2006)。然而，在幾個模型系統(tǒng)中鑒定GLRaV_2Ll和L2或 BYV L-Pro對RNAi反應作用的嘗試都失敗了。此外，發(fā)現(xiàn)L-Pro與報導基因的異位共表達 減少了后者的積累，表明前導蛋白酶可能在RNA或蛋白水平涉及基因調節(jié)。通過類比冠狀病毒的木瓜蛋白酶樣蛋白酶(Lindner，Virology 362,245-256,2007)，可假定線形病毒的蛋白酶充當脫遍在蛋白酶(DUB)，由此影響植物防御的調節(jié)。唯一 與DUB假設不一致的事實為，在Ml變體中Ll蛋白水解活性的失活對病毒感染具有很小的 影響。如果Ll介導結合而非切割宿主防御相關的蛋白就足以發(fā)揮Ll的功能，則可解析該 明顯矛盾。通過插入報導基因或表位標記產生GLRaV-2的全長復制子或微復制子，突出了該 病毒作為葡萄樹基因表達載體的潛能。通常，線形病毒組源載體具備相對大的遺傳容量和 穩(wěn)定性的強烈優(yōu)點(Dolja 等，Virus Res. 117 :38_51，2006 ；Folimonov et al.，Virology 368(1) :205-216，2007)。通過共表達同源RNAi阻抑基因(其中GLRaV-2的p24看來是最 強的)顯著增加載體的感染力，這進一步增加了線形病毒載體的用途(Chiba等，Virology 346 :7-14，2006)。全面實現(xiàn)GLRaV-2載體的潛能要求開發(fā)有效的葡萄樹接種技術。材料與方法GLRaV-2的GFP標記全長cDNA克隆的產生如較早描述，在煙草本塞姆氏植株上繁殖得自俄勒R州本地葡萄園的GLRaV-2分 離群(Goszczynski 等，Vitis 35，133-133，1996)。將病毒體分離(Napuli 等，Virology 274(1)，232-239，2000)并根據制造商的方案使用TRIzol試劑(Invitrogen)得到病毒 RNA。病毒基因組的核苷酸測序及中間體和全長病毒cDNA克隆產生的策略如對BYV的描述 (Peremyslov & Dolja,Curr. Protocols Microbiol. (Suppl. 7)，16F. 1. 1-16F. 1. 26,2007)。 將所得GLRaV-2RNA序列保存于GenBank(登記號FJ436234 ；2009年1月26日，通過引用結 合到本文中)。各種用于克隆方法中的引物可根據請求提供?？傊褂胮CB301微雙元載體組裝GLRaV-2的全長cDNA克隆(Xiang等，Plant Mol. Biol. 40 :711-717. 1999)，而使用逆轉錄和常規(guī)雙鏈(ds) cDNA合成法或PCR擴增完成 cDNA克隆。利用Sac I和KpnI單一位點將NOS終止子加入pCB301并將含Sac I、Bam HI、 AatI I、Bbvc I、Rsr II、Bst EII和SmaI限制位點的多位點接頭插入到SacI位點和NOS 終止子間，以得到PCB301-N0S-PL。為了加入融合至病毒cDNA 5，-片段(核苷酸1_2，034) 的CaMV 35S RNA聚合酶啟動子，使用PCR介導的DNA剪接技術。進行單獨的PCR以擴增 35S啟動子和GLRaV2cDNA的5’末端并產生有重疊末端的產物。合并這些產物并用作另一 輪RCR的模板，該PCR使用互補于全長產物5’ -末端和3’ -末端的引物。利用Sac 1(加 至35S啟動子5’末端的)和BamHI (核苷酸2034)將后一產物克隆進pCB301-N0S_PL以產 生p35S5， LR0為了將核酶加入到病毒cDNA的3’末端，將具有互補于病毒cDNA 3’ -末端的病 毒特異性部分的大引物與常規(guī)引物聯(lián)合用于擴增GLRaV-2cDNA的3’ -末端區(qū)域(核苷酸 14，842-16，486)，該大引物后接如(Prokhnevsky 等，J. Virol. 76，11003-11011，2002)中所 述設計的核酶序列和Sma I位點。利用限制位點BstE II (核苷酸14，842)和Sma I (在大 引物3’末端加入)將所得PCR產物克隆進p35S5’ LR以產生p35S5’ 3’ LR-Rib0為克隆病毒cDNA的內部區(qū)域(核苷酸2，029-10，827)，使用常規(guī)cDNA克隆和 superscript II逆轉錄酶的Gibco-BRL方案得到三個部分重疊的ds cDNA片段。使用限制 位點 Bam HI(核苷酸 2，029)、Aat II (核苷酸 3，394)、Bbv CI (核苷酸 6，281)和 Rsr 11(核 苷酸10，821)將這些片段插入p35S5，3，LR-Rib以產生p35S_5，BR3，LR-Rib。將病毒cDNA 剩余部分(核苷酸10，821-14，848)PCR擴增并克隆至中間載體pGEM-3Zf(+) (Promega)。將編碼內質網靴向型GFP (Haseloff 等，Proc Natl Acad Sci USA 94 (6)，2122-2127，1997)的 核苷酸序列(后接BYVCP啟動子)插入GLRaV-2CP ORF的5’-末端上游。利用Rsr II (核苷 酸10，821)和Bst EII (核苷酸14，842)位點將所得cDNA片段克隆入p35S5，-BR_3，LR-Rib， 以產生全長GLRaV-2cDNA克隆p35S_LR_GFP或簡稱LR-GFP。修飾和突變GLRaV-2變體的產生通過缺失從p60RF的起始密碼子(圖1A)至核苷酸14，185，和從GFP ORF 3’-末 端Fse I位點至核苷酸15，285 (核苷酸編號與原始GLRaV_2cDNA相對應)，修飾LR-GFP cDNA，改造所述微復制子變體mLR-GFP/⑶S。結果，編碼p6、Hsp70h、p63、CPm、CP和pl9的 GLRaV-20RF缺失了(圖ΙΑ)。然后利用在GFP ORF 5，-末端的PacI和在GUS ORF 3，-末 端的Fse I，用較早描述于(Peng等，Virology 294，75-84，2002)的雜合GFP/⑶S ORF代替 所述 GFP ORF。通過克隆相應PCR-擴增片段(圖1B)至pGEM_3Zf(+)，產生包含整個Ll和L2 編碼區(qū)和甲基轉移酶編碼區(qū)片段(核苷酸1-3，071)的兩種質粒，pGEM-35SLR-Pro和 pGEM-SP6LR-Pro。通過將三拷貝的血凝素表位(HA)標記(YPYDVPDYA ； SEQ ID NO 11)編碼 序列插入至L2編碼區(qū)內密碼子663的下游，將pGEM-35SLR-Pro和pGEM_SP6LR-Pro都用于 產生pGEM-35SLR-L2HA和pGEM-SP635SLR_L2m。這些質粒每種都用于引入下列突變至Ll或 L2。通過利用定點誘變將Ll的催化Cys493殘基用Ala代替產生突變1 (Ml)。類似地， 通過將L2 Cys767用Ala代替得到的突變2 (M2)。在DL2突變中，將整個L2編碼區(qū)缺失并將 L2易斷鍵下游的Lys848殘基用Gly代替，以再生真正Ll切割位點。通過缺失除5’ -末端 起始密碼子外的整個Ll編碼區(qū)得到突變DL1。在突變DNTDl中，同樣除起始密碼子外，Ll 的整個N端非蛋白水解區(qū)被缺失。在突變DProl中，Ll的C端蛋白酶結構域被缺失了，而 Ll的N端區(qū)域則與L2的N端區(qū)域融合。在最后的突變DLlA中，除與GLRaV-2復制酶的首 個Lys密碼子融合的起始密碼子外，Ll和L2都被缺失了，導致形成的復制酶僅因存在N端 Met而不同于蛋白水解加工的野生型復制酶。所有突變的圖示于圖1B。所述pGEM-SP6LR-L2HA變體用于在體外分析突變蛋白酶的蛋白水解活性。利用Sbf I (位于質粒的載體部分)和Stu I (核苷酸3，063)位點將來自pGEM-35SLR-L2HA突變衍生 物的DNA片段克隆進mLR-GFP/⑶S。利用Sfi I (位于質粒的載體部分)和Bbv CI (核苷酸 6，282)將來自p35S-miniV94-GFP⑶S突變衍生物的DNA片段克隆進全長cDNA克隆LR-GFP。Ll和L2蛋白水解活性的變異分析使用Sma I 線性化 pGEM_SP6LR-L2m 變體，使用 mMessage Machine 試劑盒 (Ambion)產生相應的體外RNA轉錄物。為了測定前導蛋白酶的蛋白水解活性，使用麥芽提 取物(Promega)和[35S]-Met (Amersham/Pharmacia Biotech)或未標記氨基酸混合物翻譯 所得加帽RNA轉錄物。在25°C接種1小時后，將產物通過PAGE分離、電轉染到PR0TRAN硝 酸纖維膜上，用于放射自顯影或免疫印跡(使用抗HA大鼠單克隆抗體(Roche)作為第一抗 體，山羊抗大鼠_過氧化物酶作為第二抗體)。在RNA積累中Ll和L2作用的變異分析通過電穿孔法用各mLR-GFP/⑶S變體轉化根癌農桿菌菌株C58GV2260。將相應培 養(yǎng)物在28°C振蕩培養(yǎng)過夜，離心沉淀和重懸于含IOmM MES-KOH(pH 5. 85) UOmM MgCl2和150mM乙酰丁香酮的緩沖液中。將各變體的細菌懸浮液與相應的轉化為表達蕪菁花葉病毒 RNAi阻抑基因Pl/HC-Pro的培養(yǎng)物混合，以增強微復制子感染力(Chiba等，Virology 346 7-14，2006)。微復制子表達型變體的最終細菌濃度為1.00D·，Pl/HC-Pro表達型變體的為 0. 10D_。將誘導的細菌培養(yǎng)物利用無針頭注射器滲入煙草本塞姆氏葉的底面或真空滲入 葡萄樹葉。在接種8天后，使用表面熒光立體顯微鏡Leica MZ16F (Deerf ield，IL)顯示GFP 熒光葉細胞。制備GUS測定的樣品，如先前所述(Dolja等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10208-10212，1992)，使用 Hoefer TK0100DNA 熒光計(Hoefer Scientific Instruments) 測量⑶S活性。局部和系統(tǒng)性病毒轉運的分析為測定GFP標記的病毒變體的細胞間移動，接種2周后從煙草本塞姆氏的農桿菌 滲入葉分離病毒體(Napuli等，Virology 274 (1)，232-239，2000)，重懸于含20mM磷酸鈉 (pH 7.4)和ImM Na2-EDTA的緩沖液中，人工接種至煙草本塞姆氏葉。在接種8天后使用表 面熒光立體顯微鏡分析有熒光的感染灶。為了研究在煙草本塞姆氏中的系統(tǒng)性傳播，在LR-GFP本底下將帶有相應 變體的質粒轉移至根癌農桿菌中，將所得細菌懸浮液與如上述的改造用于表達Pl/ HC-Pro的細菌懸浮液混合，然后滲入年幼的煙草本塞姆氏植株(6-8片葉階段)。3、 4或5周后，篩選形成癥狀的這些植株的上葉，而將表面熒光顯微鏡和點片照相機 MicroPublisher3. 3RTV(QImaging)用于記錄病毒表達的GFP的積累。將免疫印跡法和以 1 5，000稀釋的定制GLRaV-2特異性抗血清用于記錄CP的積累。病毒體分析為了確定HA標記的L2是否與病毒體相關聯(lián)，使用蔗糖梯度分級法，然后是免疫印 跡法。將如上述分離的病毒體重懸于含20mM磷酸鈉(pH 7.4)和ImM Na2-EDTA的緩沖液，加 至制備于同樣緩沖液中的10-40%蔗糖梯度頂部，并在Beckman SW40轉子中4°C 25，OOORPM 離心4小時。梯度被分離為25個級分，分別使用抗HA大鼠單克隆抗體(Roche)和GLRaV-2 特異性抗體進行免疫印跡分析以檢測CP?；救?Medina等，Virology 260(1)， 173-181，1999)所述，進行免疫金特異性電鏡法以檢測L2HA。顯而易見的是，所描述的方法和組合物的精確細節(jié)可變化或修改，而不會背離所 述發(fā)明的精神。我們要求保護所有落入下面權利要求范圍和精神內的這種修改和變化。
權利要求
一種復制型植物基因轉移載體，所述載體包含編碼以下的核酸a)來自葡萄卷葉伴隨病毒 2(LR 2)的選自甲基轉移酶、RNA解旋酶、RNA依賴性RNA聚合酶和p24的病毒基因；b)前導蛋白酶L1和L2；和c)有效連接至啟動子的異源多核苷酸，其中所述異源多核苷酸在植物細胞中表達，并且其中所述載體能在植物細胞中感染性復制。
2.一種條件復制型植物基因轉移載體，所述載體包含編碼以下的核酸a)來自葡萄卷葉伴隨病毒_2(LR-2)的選自甲基轉移酶、RNA解旋酶、RNA依賴性RNA 聚合酶和p24的病毒基因；b)前導蛋白酶Ll和/或L2，其中至少一個選自Ll和L2的前導蛋白酶為失活的，使得 所述載體不能獨立地感染性復制；和c)有效連接至啟動子的異源多核苷酸，其中所述異源多核苷酸在植物細胞中表達。
3.權利要求1或2的載體，所述載體包含來自葡萄卷葉伴隨病毒-2(LR-2)的甲基轉移 酶、RNA解旋酶和RNA依賴性RNA聚合酶病毒基因。
4.權利要求3的載體，所述載體進一步包含來自葡萄卷葉伴隨病毒-2(LR-2)的p24病 毒基因。
5.權利要求1-4中任一項的載體，所述載體進一步包含來自葡萄卷葉伴隨病 毒-2(LR-2)的涉及病毒體組裝和/或植物內轉運的病毒基因。
6.權利要求5的載體，其中所述病毒基因選自來自葡萄卷葉伴隨病毒-2(LR-2)的p6、 Hsp70h、p63、CPm、CP 和 pl9。
7.權利要求6的載體，所述載體包含來自葡萄卷葉伴隨病毒-2(LR-2)的p6、Hsp70h、 p63、CPm、CP和pl9病毒基因。
8.權利要求1-7中任一項的載體，其中所述異源多核苷酸編碼一個或多個報道分子、 選擇標記或治療基因。
9.權利要求8的載體，其中所述治療基因為抗真菌、抗細菌、抗病毒或味道修飾的基因。
10.權利要求8的載體，其中所述治療基因用于治療皮爾斯病(Pierce'sDisease)或 白粉病。
11.權利要求10的載體，其中所述治療基因為引發(fā)病毒誘導的基因沉默的多核苷酸、 Runl多核苷酸或編碼溶菌酶多肽的多核苷酸。
12.權利要求1或2的載體，其中所述Ll和L2蛋白酶來自LR-2。
13.權利要求1的載體，其中Ll蛋白酶具有示于SEQID NO 4的氨基酸序列。
14.權利要求1的載體，其中L2蛋白酶具有示于SEQID NO 6的氨基酸序列。
15.權利要求2的方法，其中所述失活的前導蛋白酶選自Li、L2或Ll和L2兩者。
16.權利要求2或15的載體，其中所述前導蛋白酶通過替換、插入、部分缺失或完全缺 失前導蛋白酶的編碼序列而失活。
17.權利要求1-16中任一項的載體，所述載體還包含用于轉化植物細胞的TDNA序列。
18.權利要求1-17中任一項的載體，其中所述啟動子為甜菜黃化病毒啟動子或天然 LR-2啟動子。
19.一種包含權利要求1-18中任一項的載體的植物細胞。
20.一種包含權利要求1-18中任一項的載體的植物。
21.—種生產權利要求1-18中任一項的載體的方法，所述方法包括培養(yǎng)包含所述載體 的細胞和從細胞或培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中回收所述載體。
22.—種在植物細胞中表達異源基因的方法，所述方法包括將權利要求1-18中任一項 的載體引入所述植物細胞。
23.權利要求22的方法，其中所述植物細胞為葡萄樹細胞。
24.權利要求22或23的方法，其中所述載體通過農桿菌接種法引入。
25.權利要求22或23的方法，其中所述載體為復制型載體，其中所述載體引入植物細 胞并隨后復制和感染至少一個其它的植物細胞。
26.權利要求25的方法，其中所述載體為復制型載體，其中所述載體系統(tǒng)性感染選自 組織、葉、莖、根、果實、種子或整株植株的植物結構。
全文摘要
本公開內容涉及開發(fā)和應用基于線形病毒組的載體用于遞送核苷酸至植物。具體地說，本公開內容提供基于葡萄卷葉伴隨病毒-2的載體用于在植物尤其是葡萄植物中遞送和表達基因。還設想了制造和使用這些載體的方法以及由這些載體轉化的植物。
文檔編號C12N15/00GK101978051SQ200980110781
公開日2011年2月16日 申請日期2009年1月29日 優(yōu)先權日2008年1月31日
發(fā)明者V·V·佩雷米斯洛夫, V·V·多爾亞 申請人:俄勒岡州高教委暨俄勒岡州大學