專利名稱：生產(chǎn)生物活性hiv-1 tat蛋白的方法
生產(chǎn)生物活性HIV-1TAT蛋白的方法本發(fā)明涉用于疫苗的生物活性HIV-lTat、其衍生物和其前體，包括所有HIV-I分 化體-特異性形式的生產(chǎn)。人免疫缺陷病毒(HIV)，S卩，AIDS的病原體，持續(xù)在世界范圍內(nèi)快速傳播。WHO和 UNAIDS估計(jì)自開(kāi)始流行以來(lái)，已有超過(guò)六千萬(wàn)人感染了該病毒。在2004年年末，有超過(guò) 四千萬(wàn)人，大部分生活在發(fā)展中國(guó)家，感染了 HIV。發(fā)展中國(guó)家中HIV流行病的無(wú)情傳播和 由AIDS導(dǎo)致的發(fā)病率和死亡率加強(qiáng)對(duì)針對(duì)AIDS的有效、安全且廉價(jià)的疫苗的急需性。在過(guò)去的15-20年中，HIV疫苗開(kāi)發(fā)中的大部分努力集中在通過(guò)利用產(chǎn)生能夠防 止感染的中和抗體(NA)的基本原理，靶向負(fù)責(zé)病毒結(jié)合和進(jìn)入的HIV包膜蛋白(Env)而獲 得消除性免疫(Wahren，2002)。然而，來(lái)自臨床前和臨床試驗(yàn)的結(jié)果，包括最初的III期試 驗(yàn)(VaxGen的AIDSVAX)，其中在白種人中沒(méi)有觀察到對(duì)原發(fā)性感染的保護(hù)作用，這些結(jié)果 是非常令人失望的。這可以通過(guò)所述疫苗不能激發(fā)保護(hù)性NA來(lái)解釋，其歸因于Env的高可 變性(Myers，1995)，并且阻止NA對(duì)相關(guān)的、主要是構(gòu)象表位的識(shí)別；且還可以通過(guò)gpl20 的嚴(yán)重糖基化來(lái)解釋，其有助于隱藏關(guān)鍵的(中和)erw-表位(在Burton 1997中綜述)。最近以來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了其它方法，其目的是誘導(dǎo)針對(duì)其它HIV抗原的T細(xì)胞介導(dǎo)的 反應(yīng)。這些方法目的在于控制病毒復(fù)制，其在不存在消除性免疫的條件下實(shí)現(xiàn)，提供保護(hù)以 避免疾病進(jìn)展，并因此減少病毒傳播至健康個(gè)體。然而，這些方法也都失敗了。其中的一個(gè) 實(shí)例是Merck最近基于三種HIV基因進(jìn)行的試驗(yàn)。這種疫苗使用三種成分的混合物產(chǎn)生， 每種成分用一種常見(jiàn)的感冒病毒，即5型腺病毒(Ad5)的復(fù)制缺陷型版本制成，所述5型腺 病毒(Ad5)作用為HIV gag、pol和nef基因的載體或遞送載體。該疫苗不能預(yù)防感染在 接受三劑量疫苗系列中的至少一劑量的志愿者中，在接受疫苗的741名志愿者中觀察到24 例HIV感染，在安慰劑組的762名參與者中觀察到21例HIV感染。另外，該疫苗不減少被 感染的那些人血流中的病毒的量；診斷感染后約8-12周的HIV RNA水平在疫苗和安慰劑組 中相似。一種根本不同的方法是基于關(guān)鍵的HIV調(diào)控基因tat以及其蛋白產(chǎn)物tat作為 疫苗候選物。作為非常早期的調(diào)控蛋白并且在HIV-I復(fù)制和發(fā)病機(jī)理中起著主要作用， Tat代表疫苗開(kāi)發(fā)的最佳候選物(Ensoli, 1990，1993和1994 ；Chang, 1997)。Tat是一種 在感染后非常早，甚至在HIV整合之前產(chǎn)生的重要的病毒調(diào)控蛋白，并且是病毒基因表達(dá) (Arya, 1985 ；Fisher, 1986 ；Ensoli, 1993 ；Wu, 2001)、以及細(xì)胞-到-細(xì)胞病毒傳播和疾病 進(jìn)展所必需的。事實(shí)上，在不存在Tat時(shí)，沒(méi)有或可以忽略量的結(jié)構(gòu)蛋白得到表達(dá)，并且因 此，不形成傳染性病毒。此外，Tat由被感染的T淋巴細(xì)胞釋放在細(xì)胞外環(huán)境中(Ensoli， 1990和1993 ；Chang，1997)，并且進(jìn)入感染的細(xì)胞和未感染的細(xì)胞，在感染的細(xì)胞中，其促 進(jìn)HIV-I復(fù)制，在未感染的細(xì)胞中，其引起控制細(xì)胞周期的細(xì)胞因子和細(xì)胞基因的激活或 抑制(Frankel和Pabo, 1988 ；Ensoli, 1993 ；Chang, 1995)。這一方法的目的在于誘導(dǎo)中和 細(xì)胞外Tat的抗體和針對(duì)病毒感染的細(xì)胞的T細(xì)胞反應(yīng)。一些研究表明針對(duì)Tat的免疫反應(yīng)具有保護(hù)作用，并且可以在體內(nèi)控制疾病的進(jìn) 展(Reiss, 1990 ；Rodman, 1993 ；Re, 1995 ；Zagury, 1998 ；Re, 2001)。特別地，與疾病晚期階段的患者相比較，在無(wú)癥狀HIV-感染個(gè)體中(Krone 1988，Demirhan 2000，Re 2001)和與 快速進(jìn)展者相比較，在非進(jìn)展者中(Zagury 1998)，已經(jīng)顯示了更高的抗-Tat抗體流行性。 我們最近在一組252名個(gè)體中進(jìn)行了橫向和縱向的研究，該組個(gè)體具有準(zhǔn)確估測(cè)的血清轉(zhuǎn) 化日期和平均7.2年的隨訪(Rezza，待出版)。這一研究的結(jié)果揭示在抗-Tat抗體的存在 和疾病的較緩慢進(jìn)展之間的強(qiáng)相關(guān)性。事實(shí)上，對(duì)于抗-Tat陽(yáng)性個(gè)體，發(fā)展AIDS或嚴(yán)重免 疫缺陷的危險(xiǎn)比抗-Tat陰性個(gè)體低60%。縱向分析還表明持久為抗-Tat陽(yáng)性的個(gè)體具有 最低的疾病進(jìn)展危險(xiǎn)，而持久為抗-Tat陰性的那些個(gè)體具有最高的發(fā)展嚴(yán)重免疫缺陷的 危險(xiǎn)。特別地，暫時(shí)為抗-Tat陽(yáng)性/陰性的個(gè)體與持久為陰性的個(gè)體相比具有幾乎70%更 低的危險(xiǎn)，這提供了抗-Tat抗體的存在預(yù)示較緩慢的疾病進(jìn)展的證據(jù)(Rezza，待出版)。Tat的免疫原區(qū)在所有的表位M亞型中是保守的(B和T細(xì)胞)(Myers，1995)。實(shí)際 上，我們最近的數(shù)據(jù)表明來(lái)自HTLVIIIB實(shí)驗(yàn)室-適應(yīng)病毒株的分化體B毒株-來(lái)源(BH-10) Tat蛋白的有效交叉識(shí)別(Butt0，2003)，所述HTLVIIIB實(shí)驗(yàn)室-適應(yīng)病毒株在約20年前 (Ratner, 1985)由在非洲傳播并屬于不同的HIV-I分化體的病毒感染的個(gè)體分離，由此反 映出相對(duì)應(yīng)的Tat區(qū)的高保守程度。具體地，來(lái)自主要感染了 A，B，C和D以及較輕程度的 F和G HIV-I亞型的意大利、烏干達(dá)和南非患者的血清以相似的水平(S卩，抗-Tat抗體的流 行性和滴度)識(shí)別BH-IOTat蛋白。這一觀察得到序列保守分析結(jié)果的進(jìn)一步證實(shí)，這表明 預(yù)測(cè)的Tat氨基酸序列在屬于不同HIV-I分化體的不同傳播病毒中是充分保守的，并且表 現(xiàn)出與BH-IOTat序列相對(duì)較高程度的同源性(Butt0，2003)。在Tat的第一外顯子編碼的部分，并且特別是在1-58區(qū)，同源性特別高，在1_58 區(qū)中包含Tat的功能結(jié)構(gòu)域和大部分目前鑒定的B、T-輔助和CTL表位(Butt0，2003)。此 外，使用來(lái)自相同BH-IOTat序列的線性肽對(duì)來(lái)自意大利、烏干達(dá)和南非患者的Tat-陽(yáng)性血 清的表位作圖研究表明相同的識(shí)別模式，并且證實(shí)氨基末端區(qū)包含Tat的主要B細(xì)胞表位， 盡管大部分抗-Tat抗體表現(xiàn)為構(gòu)象抗體，其不取決于感染的病毒毒株(Butt6，2003)。這 些發(fā)現(xiàn)表明Tat的總體性質(zhì)在構(gòu)象水平上也是保守的，并且提供有力的正式證據(jù)表明基于 Tat的疫苗確實(shí)可以表現(xiàn)為針對(duì)HIV的“通用”工具，原因在于其能夠誘導(dǎo)有效針對(duì)不同病 毒分化體的廣譜的免疫反應(yīng)。我們已經(jīng)通過(guò)在不同動(dòng)物模型中進(jìn)行的臨床前研究證實(shí)了這一假說(shuō)，所述不同的 動(dòng)物模型包括小鼠和食蟹猴，證明用生物活性Tat蛋白或tatDNA接種是安全的，引發(fā)廣譜 且特異性的免疫反應(yīng)，并且最重要的是，在接種的猴子中誘導(dǎo)針對(duì)高度致病性病毒(SHIV 89. 6P)感染的長(zhǎng)期保護(hù)，所述高度致病性病毒在這些猴子中引起AIDS和死亡(Cafaro， 1999,2000 和 2001)。特別地，天然Tat蛋白誘導(dǎo)Th-I和⑶8+CTLs細(xì)胞免疫反應(yīng)和高滴度的抗-Tat 抗體，并且阻斷猿/人免疫缺陷病毒(SHTV) 89. 6P的原發(fā)性感染，這如由在食蟹猴中CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)的維持和疾病發(fā)作的缺乏所示(Cafaro，1999，2000和2001)。當(dāng)然，保護(hù)是長(zhǎng)期 的，因?yàn)樵趦赡甑碾S訪過(guò)程中，在被保護(hù)動(dòng)物的外周血單核細(xì)胞或在淋巴結(jié)中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn) 病毒復(fù)制的跡象。此外，當(dāng)用破傷風(fēng)類毒素兩次加強(qiáng)時(shí)，在任何被保護(hù)的獼猴中，無(wú)論是在 血漿中還是在淋巴結(jié)中，均沒(méi)有檢測(cè)到靜息細(xì)胞中隱藏的殘留病毒，破傷風(fēng)類毒素為已知 的激活病毒復(fù)制的刺激物。長(zhǎng)期的保護(hù)作用與針對(duì)Tat的高且穩(wěn)定的體液和細(xì)胞(CD4和 CD8T-細(xì)胞反應(yīng))的存在相關(guān)。最后，在SHIV感染的獼猴中進(jìn)行的試驗(yàn)性研究表明用TatDNA或蛋白接種在患有AIDS的猴子中也是安全的。除了表現(xiàn)為關(guān)于HIV/AIDS疫苗的有價(jià)值的抗原之外，生物活性Tat還表現(xiàn)出免疫 調(diào)節(jié)性特征，使其成為用于其它抗原的有吸引力的佐劑。事實(shí)上，我們最近已經(jīng)表明，單核 細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(MDDC)，和更小程度上巨噬細(xì)胞，而非B類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系或T細(xì)胞 胚細(xì)胞，有效且快速地?cái)z取天然的而不是氧化-失活的Tat (Fanales-Belasio，2002)。當(dāng)攝 取時(shí)，天然Tat促進(jìn)MDDC成熟和活化(增加MHC抗原和共刺激分子的表達(dá)、生成Th-I細(xì)胞 因子和趨化因子)，導(dǎo)致異源和外源可溶抗原更有效的呈遞(Fanales-Belasio，2002)。更 近的數(shù)據(jù)表明這些作用均由天然Tat對(duì)TNFci表達(dá)的誘導(dǎo)所介導(dǎo)(Fanales-Belasio，已投 稿)。此外，我們已經(jīng)表明，在表達(dá)Tat或用外源生物活性Tat蛋白處理的B和T細(xì)胞中， Tat修飾免疫蛋白酶體的催化亞基組成。特別地，Tat上調(diào)潛伏膜蛋白7和多催化性內(nèi)肽酶 復(fù)合物樣1亞基，并且下調(diào)潛伏膜蛋白2亞基。這些改變與蛋白酶體的所有三種主要的蛋 白水解活性的增加相關(guān)，并且導(dǎo)致異源抗原亞結(jié)構(gòu)域MHC-I-結(jié)合CTL表位更有效的產(chǎn)生和 呈遞(Gavioli，2004)。因此，Tat對(duì)抗原加工和CTL表位產(chǎn)生的修飾可能在HIV-I感染過(guò) 程中的病毒感染的細(xì)胞的控制和Tat用于接種策略的應(yīng)用具有影響。綜上所述，存在日益增長(zhǎng)的表明生物活性Tat作用為抗原和有效的佐劑的證據(jù)實(shí) 體，原因在于i)其誘導(dǎo)向Thl誘導(dǎo)的表型的MDDCs成熟和活化，ii)其得到主要組織相容 性復(fù)合物(MHC)種類I呈遞途徑的通路(Moy等，Mol Biotechnol (分子生物技術(shù))，1996 ； Kim等，J Immunol (免疫學(xué)雜志)1997)，和iii)其調(diào)節(jié)蛋白酶體催化亞基組成，所述蛋白 酶體催化亞基組成修飾有利于亞結(jié)構(gòu)域和隱藏表位呈遞的CTL表位的序位。綜合看來(lái)，這 些特征使得單獨(dú)的Tat或與其它抗原結(jié)合的Tat成為HIV疫苗的最佳候選者。在血清陽(yáng)性患者中，這應(yīng)該有助于減少HIV-I復(fù)制和疾病進(jìn)展。在接種后暴露 于病毒的個(gè)體中，疫苗可以在感染的一開(kāi)始時(shí)改變病毒-宿主的動(dòng)力學(xué)，并且這將影響重 要的免疫細(xì)胞的消耗和感染的進(jìn)展，原因在于累積的證據(jù)表明在感染開(kāi)始時(shí)病毒負(fù)荷的水 平是向疾病進(jìn)展的強(qiáng)指示(Mellors，1996 ；Watson, 1997 ；Lifson, 1997 ；Ten Haaft, 1998 ； Staprans,1999)。這一途徑還具有這樣的優(yōu)點(diǎn)不使用在目前的HIV檢測(cè)中出現(xiàn)的HIV成分，并且患 者檢測(cè)為HIV-陰性。重要的是使用Tat的生物活性形式，原因在于天然構(gòu)象的保持允許誘導(dǎo)有效的 Thl細(xì)胞免疫反應(yīng)；誘導(dǎo)針對(duì)構(gòu)象表位的抗體；并且對(duì)于保留Tat的佐劑性質(zhì)是重要的。HIV-1(HTLV-IIIB毒株，克隆BH-10)的Tat蛋白是由兩個(gè)外顯子編碼的86個(gè)氨基 酸的分子。第一外顯子的產(chǎn)物對(duì)于HIV-I啟動(dòng)子的反式激活是充分的。該區(qū)域包含4個(gè)結(jié) 構(gòu)域，包括氨基端結(jié)構(gòu)域(aa 1-21)，富含半胱氨酸(cystein)的結(jié)構(gòu)域(aa 22_37)，核心 (aa 38-48)和堿性結(jié)構(gòu)域(49_57)。富含半胱氨酸的區(qū)域是鋅離子介導(dǎo)的二聚體形成所必 需的，并且代表反式激活結(jié)構(gòu)域。堿性區(qū)域，富含賴氨酸和精氨酸殘基，是核定位必需的，并 且可以特異性結(jié)合其RNA靶標(biāo)，所述RNA靶標(biāo)為L(zhǎng)TR中的反式激活反應(yīng)元件(TAR) (Hauber, 1989 ；Ruben, 1989 ；Roy, 1990 ；Chang, 1995)。由外顯子 2 編碼的 Tat C 端 14 個(gè)氨基酸不是 HIV-ILTR反式激活所必需的，但是包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，這是在胞外 基質(zhì)蛋白中存在的基序(Bari 1 Iari，1993 ；Brake，1990)。這一區(qū)域和堿性結(jié)構(gòu)域分別是胞外Tat與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用和胞外Tat與整聯(lián)蛋白家族的細(xì)胞表面分子的 相互作用所必需的，并且介導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞(DC)對(duì)Tat的攝入(Fanales-BelasiO，2002)。事實(shí)上，生物活性Tat被單核細(xì)胞來(lái)源的DC選擇性且有效地?cái)z入和加工，從而誘 導(dǎo)其成熟，并且促進(jìn)其呈遞抗原的能力，激發(fā)針對(duì)Thl模式的免疫反應(yīng)，并且增加針對(duì)其它 抗原的τ細(xì)胞反應(yīng)。這些功能僅由生物活性的Tat蛋白實(shí)施，并且在該蛋白氧化/失活后 消失或被極大地阻礙(Fanales-Belasio，2002)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所嘗試的通過(guò)重組宿主的常規(guī)培養(yǎng)生產(chǎn)Tat僅產(chǎn)生物失活的Tat，并且 因此對(duì)于以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)Tat是無(wú)用的，因?yàn)樯锾匦缘幕謴?fù)可能是僅在產(chǎn)物的完全變性 和正確重折疊之后獲得。變性和重折疊方法需要使用在對(duì)于人類應(yīng)用的目的生物制劑所不 允許的溶劑，以致這些方法是無(wú)用的，且它們也不能作用為生產(chǎn)生物活性Tat的指導(dǎo)。令人吃驚地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)在重組子即生產(chǎn)Tat的培養(yǎng)物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)程 中誘導(dǎo)Tat生產(chǎn)而生產(chǎn)生物活性的Tat是可能的。因此，在第一方面中，本發(fā)明提供用于制備生物活性Tat的方法，所述方法包括培 養(yǎng)在誘導(dǎo)時(shí)能夠表達(dá)Tat的宿主生物體，并且其中Tat的表達(dá)是在宿主生物體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期過(guò)程中誘導(dǎo)的。適當(dāng)?shù)乃拗魃矬w優(yōu)選是容易允許在商業(yè)條件下大體積培養(yǎng)的那些。因此，優(yōu)選 地盡可能地避免復(fù)雜的方法步驟。優(yōu)選的生物體通常是真核生物體，包括細(xì)菌和酵母?？梢允褂萌魏文軌虮晦D(zhuǎn)化從 而表達(dá)Tat的生物體。實(shí)例包括釀酒酵母(S. cerevisiae)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、 和大腸桿菌(E. coli)。特別優(yōu)選的是大腸桿菌。優(yōu)選大腸桿菌BL21菌株，其已經(jīng)專門(mén)開(kāi)發(fā) 用于大體積生產(chǎn)。生物活性Tat —般是單體的(monomeric)，并且不被氧化，即，其以其還原形式存 在。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)的目的，氧化是不可能的，并且在晚期生長(zhǎng)期過(guò)程中的誘導(dǎo)導(dǎo)致產(chǎn)生二聚 體的、四聚體的、和/或多聚體的Tat。在不進(jìn)行處理的條件下，不可能由所述分子得到生物 活性的、單體形式的Tat，所述處理使得所得到的Tat不能用于治療制劑中。因此，在備選的方面中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)單體Tat的方法，所述方法包括培養(yǎng) 在誘導(dǎo)時(shí)能夠表達(dá)Tat的宿主生物體，并且其中Tat的表達(dá)是在所述宿主生物體對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期過(guò)程中誘導(dǎo)的。重組Tat蛋白的生物活性可以使用數(shù)種檢測(cè)評(píng)估，諸如通過(guò)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突 細(xì)胞(MDDC)的攝取，Tat-缺陷型原病毒的拯救，HIV-ILTR的反式激活，卡波西肉瘤細(xì)胞和 細(xì)胞因子-激活的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和侵入(Ensoli，1992和1993 ；Barillari 1993和 1999 ；Fiorelli, 1995 ；Fanales-Belasio, 2002) 然而，由于極好的重現(xiàn)性和靈敏性，以及 其對(duì)于疫苗功效的重要作用，由MDDC攝取是關(guān)于重組Tat蛋白的優(yōu)選潛力檢測(cè)。胞外Tat 被細(xì)胞攝取(Frankel 和 Pabo，1988 ；Ensoli 1993 ；Chang 1997 ；Tyagi 2001)，并且，與大 多數(shù)可溶蛋白不同，進(jìn)入I類MHC呈遞途徑，并且激發(fā)CTL活性(Moy 1996 ；Kim 1997)。已 經(jīng)表明，在大部分有效的APCs中，MDDCs比其它細(xì)胞類型如T細(xì)胞胚細(xì)胞和B類淋巴母細(xì)胞 細(xì)胞系更有效地?cái)z取Tat，且以時(shí)間_、劑量-和成熟-依賴性方式攝取(Fanales-Belasio 2002)。Tat被MDDCs以低至O.Olng/ml的劑量攝取，且攝取在5-10分鐘后最大。這種方法 顯著地被蛋白的氧化/失活和被低溫(Fanales-Belasio 2002)所妨礙，并且在本文用于表征具體的Tat樣品是否是生物活性的。生物活性Tat通常能夠在非免疫妥協(xié)的患者中誘導(dǎo)免疫學(xué)反應(yīng)，并且將具有上文 關(guān)于生物活性Tat所述的其它特征。對(duì)于生物活性Tat特別優(yōu)選的標(biāo)記是其被單核細(xì)胞來(lái) 源的樹(shù)突細(xì)胞攝取的能力。關(guān)于MDDC的Tat攝取的適當(dāng)?shù)臋z測(cè)記述在Fanales-Belasio Ε, Moretti S, Nappi F, Barillari G, Micheletti F, Cafaro Α,禾口 Ensoli B. “ Native HIV-ITat Protein Targets Monocyte-Derived Dendritic Cells And Enhances Their Maturation, Function And Antigen-Specific T Cell Responses (天然 HIV-lTat 蛋白 靶向單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞，并且提高其成熟、功能和抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng))"J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)2002，168 191-206 中。因此，在一方面中，本發(fā)明提供用于制備生物活性的Tat的方法，所述方法包括培 養(yǎng)在誘導(dǎo)時(shí)能夠表達(dá)Tat的宿主生物體，并且其中Tat的表達(dá)是在宿主生物體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期過(guò)程中誘導(dǎo)的，其中生物活性的量度是Tat被單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞攝取的能力。實(shí)際上，在本發(fā)明的所有方面中，生物活性的量度可以是Tat被單核細(xì)胞來(lái)源的 樹(shù)突細(xì)胞攝取的能力。可以按照本發(fā)明生產(chǎn)表現(xiàn)出Tat的理想特性，特別是被MDDC攝取的能力的任何 Tat變體或突變體，并且其可以包括在"生物活性Tat"的定義中。所述變體和突變體可 以天然獲得，諸如由任何HIV毒株、或分化體獲得，或可以通過(guò)遺傳操作編碼Tat的核酸獲 得。所述操作可以是通過(guò)刪除、插入或倒置進(jìn)行，包括通過(guò)其組合進(jìn)行，條件是保留生物活 性Tat的特性。特別地，優(yōu)選保留在上文中鑒定為在分化體之間是保守的那些區(qū)域。例如， 可以結(jié)合前導(dǎo)序列和/或尾序列，例如，以輔助分泌和/或提供抗消化的保護(hù)水平。Tat編 碼序列可以包括兩個(gè)天然存在的外顯子，有或無(wú)間插內(nèi)含子，并且僅需要包含用于保留生 物活性的足夠序列信息。然而，通常優(yōu)選地使用盡可能多的天然存在的序列。Tat是本領(lǐng)域中公知的。然而，優(yōu)選的，tat蛋白是SEQ ID NOs. 2或3所示的那 些，尤其是在任何翻譯后修飾之后(諸如分裂掉N'端Met)。對(duì)于SEQ ID NO. s 5和6所 示的Tat遵循相同的內(nèi)容。在需要突變體或變體是tat的情形中，如優(yōu)選地，這些將具有生 物活性，并且優(yōu)選地其至少與"生物活性tat"相當(dāng)。適當(dāng)?shù)?，所述突變體或變體優(yōu)選地與 所述SEQ ID Nos所示的氨基酸序列、至少其中所示的編碼tat氨基酸序列的核苷酸序列、 或其中所示的全長(zhǎng)核苷酸序列有至少70%，更優(yōu)選地至少75%，更優(yōu)選地至少80%，更優(yōu) 選地至少85 %，更優(yōu)選地至少90 %，更優(yōu)選地至少95 %，更優(yōu)選地至少99 %，更優(yōu)選地至少 99. 5%，且最優(yōu)選地99. 9%的序列同源性。因此，特別優(yōu)選地是Tat是SEQ ID NOs. 2，35或 6所示的那些，或其具有生物活性且與所述序列具有至少70%的序列同源性的突變體或變 體。在這種情形中，上文提及的更高水平的序列同源性也是優(yōu)選的。任何核酸序列，諸如上文所述，可以用來(lái)編碼Tat，但是優(yōu)選的是，從培養(yǎng)的宿主獲 得的表達(dá)產(chǎn)物與本領(lǐng)域已經(jīng)證明是生物活性的且具有需要的特性的Tat是相同的、或基本 上相同的。宿主生物體可以被基因組轉(zhuǎn)化，或通過(guò)結(jié)合適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)化。為了成為可 誘導(dǎo)的，優(yōu)選地，Tat編碼序列應(yīng)該處于可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制之下?！翱烧T導(dǎo)啟動(dòng)子”意指不 是組成型的且僅在所選的環(huán)境下在其控制之下引起編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子通常分成兩類，第一類是其中通常組成型地存在聚合酶，但在不存在易化配體的條件下，將不識(shí)別該啟動(dòng)子，或僅以有限程度識(shí)別其。第二類是其中啟動(dòng)子僅 被特異性聚合酶識(shí)別，所述特異性聚合酶本身不是組成型表達(dá)的，并且可以是處在可誘導(dǎo) 啟動(dòng)子的控制之下。在大腸桿菌BL21菌株中，T7RNA聚合酶處在lac(IPTG可誘導(dǎo)的)啟動(dòng)子控制下， 以便這種聚合酶的產(chǎn)生可以容易地通過(guò)添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。那么，對(duì)于控制外源序列所必 需的所有問(wèn)題是關(guān)于所述序列與T7啟動(dòng)子締合。向BL21大腸桿菌培養(yǎng)物中加入IPTG將 刺激T7RNA聚合酶生產(chǎn)，然后其可以在T7啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)錄該序列。在本發(fā)明中，在該 實(shí)例中，Tat編碼序列處在T7啟動(dòng)子的控制下。宿主生物體可以在任何適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，所述條件允許以本領(lǐng)域?qū)τ诒磉_(dá)外 源蛋白公知的方式進(jìn)行表達(dá)。對(duì)本領(lǐng)域公知技術(shù)的唯一顯著的背離是外源蛋白Tat的誘 導(dǎo)在對(duì)數(shù)期開(kāi)始至平臺(tái)期之前實(shí)施和終止。在常規(guī)蛋白生產(chǎn)培養(yǎng)物中，誘導(dǎo)之前，通常允 許OD達(dá)到1. 2或更高。盡管在該水平誘導(dǎo)產(chǎn)生與按照本發(fā)明獲得的相似量的Tat，但是該 Tat不是生物活性的。通過(guò)在對(duì)數(shù)期過(guò)程中而不是在對(duì)數(shù)期開(kāi)始顯著到達(dá)平臺(tái)期時(shí)進(jìn)行誘 導(dǎo)，可能獲得與在OD 1.2獲得相似的產(chǎn)率，但是其中Tat是生物活性的。優(yōu)選的OD' s在 0. 4-0. 9范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在0. 45-0. 8范圍內(nèi)，包括端點(diǎn)值。特別優(yōu)選地是用于誘導(dǎo)的OD 是0. 5-0. 7，包括端點(diǎn)值，并且發(fā)現(xiàn)OD約為6提供極好的生物活性Tat產(chǎn)率。通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的Tat是特別有利的，因?yàn)槠淇梢栽诎l(fā)酵步驟中不被動(dòng)物 來(lái)源的蛋白污染而獲得。其還具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即，由于溶劑不允許在用于人類的生物制劑 中使用，于是避免了溶劑的使用。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是按照本發(fā)明生產(chǎn)的Tat能夠進(jìn)行配制，從而 經(jīng)受住在低至-80°C或者低于-80°C的溫度下的保存。按照本發(fā)明獲得的Tat可以按需要使用。特別優(yōu)選的是將這種Tat用在疫苗制劑 中，如本領(lǐng)域所述，但是考慮了關(guān)于這樣生產(chǎn)的Tat的其它應(yīng)用，并且同等地在本領(lǐng)域技術(shù) 人員的能力范圍內(nèi)。在另一方面中，提供了按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的生物活性Tat?，F(xiàn)在，將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。本文引用的任何參考文獻(xiàn) 按其不與本發(fā)明沖突的程度結(jié)合于此作為參考。
實(shí)施例HIV-ITAT 基因tat基因的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過(guò)反式激活感受態(tài)cDNA，即pCV-Tat的分子克隆和核苷酸 測(cè)序鑒定(Ensoli，1993)。已經(jīng)顯示Tat蛋白由包含兩個(gè)編碼外顯子的雙剪切的RNA翻譯 (Aldovini，1986)。第一編碼外顯子(核苷酸5411-5625) (Ratner，1985)，其緊接著位于env 基因前并且限定72個(gè)氨基酸，已經(jīng)證明其是反式激活所必需的和充分的(Sodroski，1985 ； Seigel, 1986)。第二編碼外顯子編碼另外14個(gè)氨基酸，并且位于核苷酸7956和核苷酸8001 之間，使得Tat蛋白的總大小為86個(gè)氨基酸。在該方法中所用的tat基因來(lái)源于pCV-Tat質(zhì)粒(Ensoli，1993)。為了產(chǎn)生tat 表達(dá)質(zhì)粒pCV-Tat (全長(zhǎng)tat cDNA)，使用tat cDNA的-61至-41和+270至+289的引物通 過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。引物在5'末端設(shè)計(jì)有Pstl位點(diǎn)作為連接體。然后， 將PCR擴(kuò)增的片段用Pstl消化，并且克隆到pCVO的Pstl位點(diǎn)。通過(guò)核苷酸序列分析驗(yàn)證構(gòu)建體的序列和方向。tat基因，原始來(lái)源于HTLV-III-感染的細(xì)胞系，后來(lái)鑒定為來(lái)源于 HTLV-IIIB分離體BH-10克隆(分化體B)。表達(dá)系統(tǒng)pET系統(tǒng)是用于在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的有力系統(tǒng)?；谧畛跤?Studier及同事(Studier，1986和1990 ；Rosenberg, 1987)開(kāi)發(fā)的T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的系統(tǒng)， Novagen的pET系統(tǒng)已經(jīng)用于表達(dá)數(shù)以千計(jì)的不同蛋白。pET系統(tǒng)提供能夠調(diào)整基礎(chǔ)表達(dá) 水平以最優(yōu)化靶基因表達(dá)的載體-宿主組合(Rosenberg，1987)。在非表達(dá)宿主中建立質(zhì) 粒后，通常將其轉(zhuǎn)化到攜帶T7RNA聚合酶基因的宿主(XDE3溶原體)中，用于表達(dá)靶蛋白。 在λ DE3溶原體中，T7RNA聚合酶基因處于lacUV5啟動(dòng)子控制下。這允許在非誘導(dǎo)狀態(tài)的 某種程度的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于更嚴(yán)格的控制，可以使用攜帶PLysS的宿主。pLys質(zhì)粒編碼T7溶菌 酶，其是T7RNA聚合酶的天然抑制劑，并且因此減少T7RNA聚合酶在非誘導(dǎo)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄靶 基因的能力。對(duì)于重組Tat的表達(dá)，細(xì)菌菌株BL21(DE3)用pET-TAT和pLysS質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)化。BL21 細(xì)胞是最廣泛使用的宿主。這些細(xì)胞缺少Ion蛋白酶，并且缺乏ompT外膜蛋白酶(表1)。 BL21細(xì)胞對(duì)利福平敏感，pLyS表達(dá)T7溶菌酶，其抑制基礎(chǔ)T7RNA聚合酶。
細(xì)菌菌株 BL21(DE3)pLysS菌株基因型F一 ompThsdS^ (r_ m_ ) gal dcm (DE3) pLysS (CmR)細(xì)菌菌株遺傳標(biāo)記F"=不包含F(xiàn)附件體 ompT 二缺乏外膜蛋白酶 hsdS =在特定位點(diǎn)(r_ m")消除DNA限制性和甲 基化 gal=不能利用半乳糖 dcm =在序列CCWGG中沒(méi)有胞嘧啶的甲基化 CmR=氯霉素抗性表1.用于表達(dá)Tat蛋白的細(xì)菌菌株的特征pET載體來(lái)源于pBR322，并且是許多pET家族載體的前體。pET-3a-d載體攜帶N 端T7 Tag序列和BamHI克隆位點(diǎn)。在本研究中使用pET_3c載體(

圖1)。pET_3c載體的 序列在序列表中以SEQ ID NO. 7提供。pET-3c的圖譜與pET_3a (顯示的)的圖譜除下述例外之外相同pET_3c是4638bp 的質(zhì)粒，在510處BamHI外每個(gè)位點(diǎn)減去2bp ；Nco位點(diǎn)替換Nde I位點(diǎn)，在pET_3c的位置 550處具有凈bp缺失。質(zhì)粒pLysS是4886bp質(zhì)粒，其通過(guò)在pACYC184的BamHI位點(diǎn)插入T7溶菌酶基因 而構(gòu)建(Studier，1986和1990)。這種質(zhì)粒不是克隆質(zhì)粒，并且用在ADE3溶原性宿主中， 以通過(guò)產(chǎn)生T7溶菌酶來(lái)抑制來(lái)自T7啟動(dòng)子的基礎(chǔ)表達(dá)，T7溶菌酶為T(mén)7RNA聚合酶的天然 抑制劑(圖2)。pLyS載體的序列提供在SEQ ED NO. 8中。
構(gòu)建表達(dá)載體并制備產(chǎn)物細(xì)胞系pET-TAT通過(guò)將來(lái)自pCV-Tat表達(dá)質(zhì)粒的261bp Tat克隆到pET_3c的5 ‘ NdeI 和3' BamHl位點(diǎn)而構(gòu)建(圖3和SEQ ID NO. 1，其顯示pET_3c克隆表達(dá)區(qū))。利用包含NdeI分裂位點(diǎn)的5 ‘引物和包含BamHl分裂位點(diǎn)的3 ‘引物從pCV_TAT 質(zhì)粒擴(kuò)增tat基因的261bp片段(圖4，其顯示克隆在pET-3C中用Eco RI切下的pCV_Tat 載體所包含的原始序列；還顯示在SEQ ID N0S. 2和3中)。將擴(kuò)增的tat產(chǎn)物和pET_3c載體用NdeI和BamHl消化。然后，消化之后進(jìn)行連 接酶反應(yīng)，轉(zhuǎn)化到NovaBlue細(xì)菌菌株中，并且通過(guò)PCR篩選選擇tat陽(yáng)性克隆(圖5，其顯 示261 bp Tat基因的克隆，還如在SEQ ID NO. 4中所示)。使用ABI PRISM BigDye終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems))，使用T7啟動(dòng)子和T7終止子作為測(cè)序引物，通過(guò)Sanger法測(cè)序tat cDNA在 pET-3c載體中的正確插入(圖6，其顯示tat在pET-3c載體中的插入，突出顯示ntd位置 22-282 的 CDS,其還如 SEQ ID N0S. 5 和 6 所示)。將得到的重組質(zhì)粒(pET-3c/Tat)用于轉(zhuǎn)化多個(gè)大腸桿菌菌株，所述大腸桿菌菌 株包含在IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(thiogalactopyranoside))-可誘導(dǎo) 的lacUV5啟動(dòng)子控制下編碼的T7RNA聚合酶的基因。通過(guò)SDS-PAGE評(píng)估在誘導(dǎo)細(xì)菌培 養(yǎng)物后的重組Tat蛋白的生產(chǎn)，得到質(zhì)粒構(gòu)建體的功效和最佳細(xì)菌菌株的選擇。為了在 BL21(DE3)pLysS中的表達(dá)pET-3C/Tat，將過(guò)夜細(xì)胞培養(yǎng)物以1 10稀釋在合成培養(yǎng)基(pH 7. 5)中，所述合成培養(yǎng)基包含氨芐青霉素lml/L (儲(chǔ)液為25mg/mL)，氯霉素lml/L (儲(chǔ)液為 34mg/mL)，硫胺(thiamin) 0. 5ml/L(儲(chǔ)液為 4. 5mg/mL)，Mg 溶液 1. 25ml/L(儲(chǔ)液為 240mg/ mL)，和葡萄糖12ml/L(儲(chǔ)液為630mg/mL)。然后，將稀釋的細(xì)菌在37°C培養(yǎng)，直至600nm的光學(xué)密度為0.6-0. 7。為了最優(yōu)化 重組蛋白的表達(dá)條件，進(jìn)行數(shù)個(gè)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)向在37°C培養(yǎng)物中加入ImM IPTG 4小時(shí) 而獲得最有效的Tat生產(chǎn)。結(jié)束時(shí)，離心細(xì)菌，并且將沉淀物重懸在裂解緩沖液中。超聲處 理包含Tat蛋白的細(xì)菌裂解物，并且離心，以增溶該蛋白。然后，將沉淀物重懸在包含甘露 糖、甘油、磷酸鹽緩沖液、DTT和NaCl的緩沖液中。將樣品再次超聲處理，并且以10，500xg 離心 30 分鐘，過(guò)濾上清，并且上樣到 DEAE SEPHAROSEFAST FLOW(Amersham Pharmacia Biotech(安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù))，Uppsala，瑞典)柱。然后，該蛋白用IM NaCl洗 脫。收集包含Tat的級(jí)分，并且以1 1體積比稀釋，并上樣到肝素瓊脂糖CL-6B(Amersham Pharmacia Biotech (安瑪西亞法瑪西亞生物技術(shù))，Uppsala，瑞典)柱。然后，該蛋白用2M NaCl洗脫。收集包含Tat的級(jí)分，并透析以去除NaCl。通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證通過(guò)上述步驟 得到的蛋白的純度等級(jí)?；厥盏牡鞍椎漠a(chǎn)率顯示在表2中。表2.純化在大腸桿菌中表達(dá)的Tat蛋白
權(quán)利要求
1.用于制備生物活性Tat的方法，所述方法包括培養(yǎng)在誘導(dǎo)時(shí)能夠表達(dá)Tat的宿主生 物體，并且其中Tat的表達(dá)是在所述宿主生物體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)程中誘導(dǎo)的。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中生物活性的量度是Tat被單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞攝 取的能力。
3.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主生物體容易允許大體積培養(yǎng)。
4.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主生物體是真核細(xì)胞。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述宿主生物體是細(xì)菌或酵母。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述宿主生物體是釀酒酵母(S.cerevisiae)、枯草芽 ？包桿菌(B. subtilis)、或大腸桿菌(E. coli)。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述宿主生物體是大腸桿菌BL21菌株。
8.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中由培養(yǎng)的宿主獲得的表達(dá)產(chǎn)物與本領(lǐng)域中 已證明是生物活性的Tat相同，或基本上相同。
9.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中Tat為SEQID NOs. 2或3所示，或?yàn)槠渚?有生物活性且與所述序列具有至少70%序列同源性的突變體或變體。
10.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主生物體已經(jīng)使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化。
11.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中編碼Tat的序列處于可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控 制下。
12.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述啟動(dòng)子僅被特異性聚合酶識(shí)別，所述 特異性聚合酶受到可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制。
13.按照權(quán)利要求11或12的方法，其中所述啟動(dòng)子是Iac啟動(dòng)子。
14.按照權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼Tat的序列處于T7啟動(dòng)子的 控制下。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述宿主生物體能夠表達(dá)T7RNA聚合酶，并且其處 于Iac啟動(dòng)子的控制下。
16.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中Tat的表達(dá)在0.4-0. 9范圍內(nèi)、包括端點(diǎn) 值的OD處誘導(dǎo)。
17.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中Tat的表達(dá)在0.45-0. 8范圍內(nèi)、包括端點(diǎn) 值的OD處誘導(dǎo)。
18.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中Tat的表達(dá)在0.5-0. 7范圍內(nèi)、包括端點(diǎn) 值的OD處誘導(dǎo)。
19.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中Tat的表達(dá)在約為0.6的OD處誘導(dǎo)。
20.按照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)獲得的Tat。
21.用于生產(chǎn)單體Tat的方法，所述方法包括培養(yǎng)在誘導(dǎo)時(shí)能夠表達(dá)Tat的宿主生物 體，并且其中Tat的表達(dá)是在所述宿主生物體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)程中誘導(dǎo)的。
全文摘要
在大體積培養(yǎng)物中產(chǎn)生的Tat蛋白在常規(guī)光學(xué)密度下誘導(dǎo)時(shí)是沒(méi)有活性的，但是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)程中誘導(dǎo)時(shí)可以以生物活性形式獲得。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102007141SQ200980111208
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月6日
發(fā)明者毛羅·馬格納尼, 芭芭拉·恩索利 申請(qǐng)人:烏爾比諾大學(xué), 國(guó)家高等衛(wèi)生院