專利名稱：抗h5亞型a型流感病毒血凝素單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗H5亞型A型流感病毒血凝素單克隆抗體、以及使用該單克隆抗體的抗H5亞型A型流感病毒的免疫測定方法和免疫測定用試劑盒。
背景技術(shù)：
流感病毒存在H5或H7亞型，以亞洲為中心給養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)帶來重大損失，但近年來確認(rèn)禽流感病毒也會(huì)傳染給人。特別是屬于H5亞型的禽流感病毒，從2003年左右起，以亞洲 為中心，有許多關(guān)于該病毒傳染給人及其高死亡率的報(bào)道，由于人對上述病毒沒有免疫力， 所以全球范圍都擔(dān)心其爆發(fā)流行，人們正在研究其預(yù)防和流行時(shí)的對策。為了預(yù)防禽流感病毒傳染給人、或者至少是阻止其在人群中的大流行，特異性且 快速地檢測也會(huì)傳染給人的禽流感病毒至關(guān)重要。一直以來，在快速檢測檢體中的病毒方 面，廣泛采用免疫測定法，特別是利用使用在液體流通的多孔性基體的一部分中固定有抗 病毒抗體的固相的夾層法(Sandwich method)進(jìn)行的免疫色譜法，在病院等醫(yī)療場所可以 非常簡便地在短時(shí)間內(nèi)檢測病毒，因此被廣泛應(yīng)用。檢測人流感病毒的免疫色譜法用試劑 盒也有出售。為了利用免疫測定法檢測也會(huì)傳染給人的禽流感病毒，理所當(dāng)然需要抗禽流感病 毒的抗體。已知流感病毒的表面抗原由血凝素和稱作神經(jīng)氨酸苷酶的蛋白構(gòu)成。作為血凝 素(HA)，已知有抗原性不同的Hl H16這16種，而作為神經(jīng)氨酸苷酶，已知有抗原性不同 的附 N9這9種。關(guān)于流感病毒的亞型(subtype)，通過以“H5m”等方式記載上述血凝 素和神經(jīng)氨酸苷酶的種類來進(jìn)行標(biāo)記。迄今為止，確認(rèn)由鳥傳染給人的禽流感病毒基本上 是血凝素為H5型的禽流感病毒。因此，作為用于檢測由鳥傳染給人的高病原性流感病毒的 抗體，人們希望開發(fā)H5亞型流感病毒特異性抗體。人們對H5亞型A型流感病毒的血凝素進(jìn)行了充分研究，不僅其氨基酸序列、就連 立體結(jié)構(gòu)也已知(非專利文獻(xiàn)1)。此外，還已知各種抗H5亞型A型流感病毒血凝素的單克 隆抗體(非專利文獻(xiàn)2 4)。另外，還已知利用使用兩種抗血凝素單克隆抗體的夾層法來 測定H5亞型A型流感病毒(非專利文獻(xiàn)5、6)。非專利文獻(xiàn)1 :Ya Ha 等人，The EMBO Journal，21 (5)，865-875，2002非專利文獻(xiàn)2 =Nikolai V. K.等人，J. Gen. Virol. 83，2497，2002非專利文獻(xiàn)3 James Stevens 等人，SCIENCE 第 312 卷，21APRIL 2006非專利文獻(xiàn)4 =Zhi-Yong Yang 等人，SCIENCE 第 317 卷，10AUGUST2007非專利文獻(xiàn)5 :Tsuda Y.等人，Microbiol. Immunol. 51 (9)，903，2007非專利文獻(xiàn)6:Qigai He 等人，Clin. Vacc. Immnol. 617，200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題作為抗H5亞型A型流感病毒的血凝素的單克隆抗體，迄今為止主要研究作為抑制、阻止該病毒的傳染性的抗體具有中和活性的中和抗體。為了開發(fā)抗該病毒的疫苗，必需 要有中和抗體，上述非專利文獻(xiàn)2 4中記載的單克隆抗體也是中和抗體。此外，非專利文 獻(xiàn)5和6中記載的用于免疫測定的單克隆抗體，有關(guān)該抗體的表位分析結(jié)果及中和活性則 沒有記載。 當(dāng)然可以使用這樣的公知中和抗體來構(gòu)建H5亞型流感病毒的免疫測定系統(tǒng)。但 本申請發(fā)明人等在使用中和抗體構(gòu)建免疫測定系統(tǒng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在有可能無法追蹤該病毒的 突變的問題。即，已知流感病毒由于逃出了宿主的免疫監(jiān)視，所以在中和抗體識(shí)別表位常常 發(fā)生突變，使用公知的中和抗體構(gòu)建免疫測定系統(tǒng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)失去了與已發(fā)生突變的病毒的 反應(yīng)性，結(jié)合親和性降低，有可能無法檢測病毒或者測定值較正確值大幅降低?？紤]到病毒 頻繁地發(fā)生突變，人們希望即使發(fā)生少許突變也能夠正確地免疫測定病毒。因此，本發(fā)明的目的在于提供即使在H5亞型A型流感病毒發(fā)生某種程度的突變 的情況下，也可以正確進(jìn)行測定的H5亞型A型流感病毒的免疫測定方法和用于該方法的試 劑盒、以及可以用于該免疫測定的新型抗H5亞型A型流感病毒單克隆抗體。解決課題的方法已知在感染時(shí)，流感病毒首先與位于細(xì)胞表面的受體結(jié)合，之后被攝入細(xì)胞內(nèi)部。 因此，流感病毒為了在宿主內(nèi)增殖，病毒就必需與位于細(xì)胞表面的受體結(jié)合，若妨礙其結(jié) 合，則病毒無法增殖。公知的中和抗體在流感病毒的受體結(jié)合區(qū)中具有對應(yīng)表位，并與病毒 結(jié)合，以妨礙病毒與受體結(jié)合。另一方面，已知病毒在宿主的自然免疫力或通過給予疫苗等 產(chǎn)生的中和抗體存在的環(huán)境下容易發(fā)生突變，使其免受其中和抗體引起的增殖抑制。突變 本身也許會(huì)隨機(jī)發(fā)生，但只有發(fā)生變異以使其免受中和抗體引起的增殖抑制的病毒可以充 分增殖，所以在增殖的病毒中，結(jié)果具有這樣的突變的病毒變多。將這種現(xiàn)象稱作逃逸突變 或逃避突變，這樣的突變因中和抗體而變得容易發(fā)生，這被稱作抗體壓力或免疫壓力等。本 申請發(fā)明人等想到即使在病毒發(fā)生某種程度的突變的情況下，也可以正確地免疫測定病 毒的免疫測定法，該方法可以通過使用在不易突變的區(qū)、即中和抗體的對應(yīng)表位所存在的 區(qū)以外的區(qū)具有對應(yīng)表位的單克隆抗體來構(gòu)建，并進(jìn)一步確定了這樣的單克隆抗體的對應(yīng) 表位所存在的區(qū)，而且實(shí)際上提供了這樣的單克隆抗體，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供抗H5亞型A型流感病毒血凝素單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段， 所述單克隆抗體與H5亞型A型流感病毒的血凝素發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，其對應(yīng)表位不存在于 受體亞結(jié)構(gòu)域(其中，由其C末端11個(gè)氨基酸構(gòu)成的區(qū)除外)中，不具有A型流感病毒的 中和活性。此外，本發(fā)明提供H5亞型A型流感病毒的免疫測定方法，該方法包括通過免疫 測定來測定檢體中的H5亞型A型流感病毒，所述免疫測定利用上述本發(fā)明的單克隆抗體或 其抗原結(jié)合性片段與H5亞型A型流感病毒血凝素的抗原抗體反應(yīng)。本發(fā)明還提供H5亞型 A型流感病毒的免疫測定用試劑盒，該試劑盒中含有兩種可以同時(shí)與H5亞型A型流感病毒 血凝素結(jié)合的上述本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，首次提供即使在H5亞型A型流感病毒發(fā)生逃逸突變的情況下，結(jié)合 親和性也不發(fā)生變化的抗H5亞型A型流感病毒血凝素單克隆抗體。因此，通過使用本發(fā)明 的單克隆抗體的免疫測定，就連發(fā)生了逃逸突變的H5亞型A型流感病毒也可以測定，可以 快速測定對人也具有病原性的禽流感病毒。因此，認(rèn)為本發(fā)明對于防止對人也具有致病性的禽流感病毒的流行具有重大貢獻(xiàn)。


圖1是將兩種H5亞型A型流感病毒株的血凝素的氨基酸序列進(jìn)行排比，并與各亞結(jié)構(gòu)域的分布和實(shí)施例中制作的3種單克隆抗體的對應(yīng)表位一同顯示的圖。圖2是將兩種H5亞型A型流感病毒株的血凝素的氨基酸序列進(jìn)行排比后顯示的 圖。圖3是顯示H5亞型A型流感病毒株的血凝素的立體結(jié)構(gòu)和實(shí)施例中制作的3種 單克隆抗體的對應(yīng)表位區(qū)的圖。圖4是顯示實(shí)施例中進(jìn)行的、3種單克隆抗體的表位分析的中途結(jié)果的圖。圖5是顯示實(shí)施例中進(jìn)行的、3種單克隆抗體的表位分析的中途結(jié)果的圖。圖6是實(shí)施例中制作的、免疫測定器具(免疫色譜器具)的主要部分的模式截面 圖。圖7是實(shí)施例中制作的、免疫測定器具(免疫色譜器具)的模式平面圖。圖8是實(shí)施例中制作的、免疫測定器具(免疫色譜器具)的模式截面圖。圖9是實(shí)施例中制作的、其他免疫測定器具(免疫色譜器具)的主要部分的模式 截面圖。圖10是實(shí)施例中制作的、其他免疫測定器具(免疫色譜器具)的模式平面圖。
具體實(shí)施例方式
如上所述，本發(fā)明的單克隆抗體，其與H5亞型A型流感病毒血凝素發(fā)生抗原抗體 反應(yīng)，其對應(yīng)表位位于受體亞結(jié)構(gòu)域(其中，由其C末端11個(gè)氨基酸構(gòu)成的區(qū)除外)以外 的區(qū)。H5亞型A型流感病毒血凝素(以下，有時(shí)簡記作“H5HA”)的基因的核苷酸序列和 其所編碼的氨基酸序列的1個(gè)例子見SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。需要說明的是，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列是公知的，以檢索號(hào)(Accession No.)AB263192注冊 在 GenBank 中。關(guān)于H5HA的基因核苷酸序列和氨基酸序列，除上述以外，還已知幾個(gè)，例如，上述 非專利文獻(xiàn)1中記載的H5N3的HA的基因核苷酸序列和氨基酸序列，以檢索號(hào)AF303057注 冊在GenBank中(氨基酸序列也以檢索號(hào)Q9DLP3注冊)(SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4)。 與公知的任一種H5亞型HA發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的單克隆抗體也均包括在本發(fā)明的單克隆抗 體的范圍內(nèi)，由于H5亞型HA間的同源性高，所以上述單克隆抗體通常與所有的H5亞型HA 均發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。圖1顯示將SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列和SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列進(jìn) 行排比的圖。圖1中還記載了氨基酸序列中的各結(jié)構(gòu)域(非專利文獻(xiàn)1)。圖2顯示只對氨 基酸序列進(jìn)行排比的圖。如圖2充分顯示的那樣，兩者的氨基酸序列的同源性非常高(約 96.8%)、氨基酸數(shù)也相同，所以由對SEQ ID NO :4已知的各種結(jié)構(gòu)域的分布(非專利文獻(xiàn) 1)，SEQ ID NO 2的氨基酸序列中各種結(jié)構(gòu)域的分布也容易理解(圖1)。在本說明書和權(quán) 利要求書中，顯示H5HA的氨基酸序列中的位置時(shí)，以SEQ ID NO :2的氨基酸序列為基準(zhǔn)，但如上所述，由于H5A型流感病毒的HA間的氨基酸序列的同源性非常高，所以其他H5HA的氨 基酸序列也可以容易地與SEQ ID NO :2的氨基酸序列進(jìn)行排比，容易理解以SEQ ID NO 2 的氨基酸序列為基準(zhǔn)的位置在其氨基酸序列中相當(dāng)于某位置。此外，“以SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列為基準(zhǔn)”，是指使用SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列作為顯示其位置的基準(zhǔn)， 并不僅僅是指以具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的HA為免疫原制作的單克隆抗體。 由圖1可知以SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列為基準(zhǔn)，受體亞結(jié)構(gòu)域?yàn)樽訬末端 起第126號(hào)的氨基酸(以下，“記作126aa”) 278aa。本發(fā)明的單克隆抗體是其對應(yīng)表位 不存在于受體亞結(jié)構(gòu)域(其中，由其C末端11個(gè)氨基酸構(gòu)成的區(qū)除外)中的單克隆抗體。 若抗體與受體亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合，則流感病毒無法與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，無法侵入細(xì)胞內(nèi)，其 結(jié)果，無法在宿主內(nèi)增殖。即，該抗體具有流感病毒的中和活性。但是，下述實(shí)施例中具體 制作的單克隆抗體之一(IFH5-115)，雖然其對應(yīng)表位的一部分存在于受體亞結(jié)構(gòu)域的C末 端11個(gè)氨基酸(268-278aa)的區(qū)中，但不具有中和活性，所以受體亞結(jié)構(gòu)域的C末端區(qū)并 不是病毒與受體結(jié)合所必須的區(qū)。因此，從本發(fā)明中規(guī)定的、不存在對應(yīng)表位的區(qū)(基本是 受體亞結(jié)構(gòu)域)中除去受體亞結(jié)構(gòu)域的C末端側(cè)11個(gè)氨基酸。本發(fā)明的單克隆抗體的對應(yīng)表位，只要是上述受體亞結(jié)構(gòu)域(其中，由其C末端16 個(gè)氨基酸構(gòu)成的區(qū)除外)以外的區(qū)即可，沒有特別限定，但對應(yīng)表位優(yōu)選存在于下述區(qū)中 的對應(yīng)表位(1)41 60aa 和 312 322aa 的區(qū)、(2) 61 80aa 和 290 300aa 的區(qū)、或(3)101 113aa 禾Π 268 278aa 的區(qū)。其中，對應(yīng)表位“存在于區(qū)中”，是指與使該區(qū)缺失的缺失突變體的結(jié)合活性喪失 或者至少是顯著降低，不僅該區(qū)內(nèi)存在對應(yīng)表位的情形，而且在與該區(qū)重復(fù)的區(qū)中存在對 應(yīng)表位的情形、當(dāng)使該區(qū)缺失時(shí)結(jié)合活性喪失或至少顯著降低的情況也包含在內(nèi)。另外， 上述(1) (3)所規(guī)定的對應(yīng)表位區(qū)分別由氨基酸序列上的位置距離遠(yuǎn)的2個(gè)區(qū)構(gòu)成，但 是這些的2個(gè)區(qū)在HA的立體結(jié)構(gòu)中位置相鄰(參照圖3)。因此，例如在上述(1)的41 60aa和290 300aa的區(qū)中存在對應(yīng)表位，是指立體結(jié)構(gòu)中相鄰的這些區(qū)的整體中存在對 應(yīng)區(qū)，當(dāng)36 65aa和307 327aa的任一方缺失時(shí)，該單克隆抗體無法與該部分缺失HA
社a
？口口。對應(yīng)表位存在于哪一區(qū)，這可以如下述實(shí)施例所具體記載的那樣，原理上通過常 規(guī)方法、即研究與缺失突變體的結(jié)合性來研究。即，利用基因工程學(xué)方法制作缺失各種區(qū)的 各種突變體，測定這些的各缺失突變體與單克隆抗體的結(jié)合性是否因其缺失而喪失或顯著 降低，從而可以研究對應(yīng)表位存在于哪一區(qū)。本發(fā)明的單克隆抗體還不具有其通過抗原抗體反應(yīng)所結(jié)合的A型流感病毒的中 和活性。如上所述，本發(fā)明的單克隆抗體，其對應(yīng)表位位于受體亞結(jié)構(gòu)域(C末端側(cè)11個(gè)氨 基酸的區(qū)除外)以外的區(qū)，由于該構(gòu)成要件，大體上中和活性喪失，但對應(yīng)表位存在于受體 亞結(jié)構(gòu)域(C末端側(cè)11個(gè)氨基酸的區(qū)除外)以外的區(qū)時(shí)、例如通過立體障礙性地妨礙受體 亞結(jié)構(gòu)域與受體的結(jié)合而發(fā)揮中和活性的情形也包含在內(nèi)。單克隆抗體是否具有中和活 性，這可以如下述實(shí)施例所具體記載的那樣，使H5亞型A型流感病毒與其單克隆抗體的混 合物與細(xì)胞作用，之后培養(yǎng)細(xì)胞，研究是否產(chǎn)生對細(xì)胞的細(xì)胞毒，從而加以研究。
并且，優(yōu)選本發(fā)明的單克隆抗體與A型流感病毒的其他HA亞型(即Hl H4和 H6 H15)實(shí)質(zhì)上不發(fā)生交叉反應(yīng)。通過與其他HA亞型實(shí)質(zhì)上不發(fā)生交叉反應(yīng)，可以只將 確認(rèn)由鳥傳染給人的H5亞型A型流感病毒與其他流感病毒區(qū)別測定。此處，“實(shí)質(zhì)上不發(fā) 生交叉反應(yīng)”，是指不發(fā)生可以檢測的程度的交叉反應(yīng)，或者雖然可以檢測到交叉反應(yīng)，但 其程度微弱，可以和與H5HA的抗原抗體反應(yīng)明確區(qū)別開來。例如，在下述實(shí)施例中，雖然利 用使用兩種本發(fā)明的抗H5HA單克隆抗體作為固相化抗體和標(biāo)記抗體的免疫色譜法研究與 各種亞型的HA的交叉反應(yīng)，但按照這樣的方法，當(dāng)在檢測區(qū)檢測不到標(biāo)記時(shí)，可以判定實(shí) 質(zhì)上沒有發(fā)生交叉反應(yīng)。需要說明的是，下述實(shí)施例中使用的、Hl H4和H6 H15的基 因的核苷酸序列和氨基酸序列分別見SEQ IDNO 5 SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 15 SEQ ID N0:34。是否存在與其他HA亞型的交叉反應(yīng)，這可以使用它們來研究。本發(fā)明還提供上述本發(fā)明的單克隆抗體的抗原結(jié)合性片段。這里的“抗原結(jié)合 性片段”是指，例如免疫球蛋白的Fab片段或F(ab’)2片段這樣的、維持該抗體與對應(yīng)抗 原的結(jié)合性(抗原抗體反應(yīng)性)的抗體片段。眾所周知，這樣的抗原結(jié)合性片段也可用于 免疫測定。如公知的那樣，F(xiàn)ab片段或F(ab’)2片段可以通過用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶這 樣的蛋白分解酶處理單克隆抗體而得到。需要說明的是，抗原結(jié)合性片段并不限于Fab片 段或F(ab’)2片段，可以是維持與對應(yīng)抗原的結(jié)合性的任何片段，還可以是利用基因工程 學(xué)方法制備的片段。例如，還可以使用通過基因工程學(xué)方法使單鏈可變區(qū)(scFv single chainfragment of variable region)在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的抗體。scFv的制作方法也眾所 周知，提取如上制作的雜交瘤的mRNA，制備單鏈cDNA，使用免疫球蛋白H鏈和L鏈的特異性 弓丨物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增免疫球蛋白H鏈基因和L鏈基因，將它們通過接頭連接，賦予適當(dāng)?shù)南拗?酶切位點(diǎn)，之后導(dǎo)入質(zhì)粒載體中，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從大腸桿菌中回收scFv，從而可以制 作scFv。本發(fā)明中所說的“抗原結(jié)合性片段”也包含這樣的scFv。本發(fā)明的單克隆抗體可如下得到利用以H5亞型A型流感病毒作為免疫原的常 規(guī)方法，制備抗H5亞型A型流感病毒單克隆抗體，篩選與HA具有結(jié)合性的單克隆抗體，再 篩選對H5亞型A型流感病毒不具有中和活性的單克隆抗體，分析所篩選的單克隆抗體的對 應(yīng)表位，選擇本發(fā)明中規(guī)定的、滿足表位的上述要件的單克隆抗體，從而可以得到本發(fā)明的 單克隆抗體。單克隆抗體本身可以通過周知的雜交瘤法來制作，在下述實(shí)施例中也有具體 記載。此外，關(guān)于A型流感病毒的中和活性，可以利用下述方法進(jìn)行研究使該病毒與單克 隆抗體的混合物與細(xì)胞作用，研究細(xì)胞是否被抑制。該方法在下述實(shí)施例中也有具體記載。 并且，對應(yīng)表位分析可以利用下述方法來進(jìn)行制作H5HA的各種缺失突變體，研究它們與 單克隆抗體的結(jié)合性。該方法在下述實(shí)施例中也有具體記載。
本發(fā)明還提供H5亞型A型流感病毒的免疫測定方法，該方法包括通過免疫測定 來測定檢體中的H5亞型A型流感病毒，所述免疫測定利用上述本發(fā)明的單克隆抗體或其抗 原結(jié)合性片段與H5亞型A型流感病毒血凝素的抗原抗體反應(yīng)。需要說明的是，在本發(fā)明中， “測定” 一詞包含檢測、定量、半定量。在該領(lǐng)域中免疫測定方法本身眾所周知，本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片 段也可用于周知的任一種免疫測定方法。即，根據(jù)反應(yīng)形式進(jìn)行分類，有夾層法、競爭法、凝 集法等；根據(jù)標(biāo)記進(jìn)行分類，有酶免疫分析、放射免疫分析、熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分 析等；這些方法均包含在本發(fā)明所說的“免疫測定”中，在本發(fā)明的免疫測定方法中可以采用。另外，各免疫測定所必需的試劑類也是周知的，除了所用的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性 片段具有特征以外，可以使用通常的免疫測定用試劑盒進(jìn)行免疫測定。即，本發(fā)明還提供用 于實(shí)施本發(fā)明的測定方法的測定試劑盒，該試劑盒中含有上述本發(fā)明的單克隆抗體或其抗 原結(jié)合性片段。 在免疫測定方法中，利用使用兩種能夠同時(shí)與H5亞型A型流感病毒血凝素結(jié)合的 本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段的夾層法進(jìn)行的免疫測定方法，對高靈敏度且迅 速的病毒測定有利。在夾層法中，通常所用的兩種單克隆抗體中，一種固定在珠?；蛭⒘颗?養(yǎng)板的孔、或免疫色譜法的多孔性基質(zhì)這樣的固相上，另一種用酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā) 光標(biāo)記等進(jìn)行標(biāo)記，在固相化抗體與標(biāo)記抗體之間夾層有作為測定對象的病毒抗原，測定 與固相結(jié)合的標(biāo)記。想要檢測H5亞型A型流感病毒時(shí)，通過檢測與固相結(jié)合的標(biāo)記，可以 檢測該病毒。想要定量該病毒時(shí)，使用不同的各種已知量的標(biāo)準(zhǔn)檢體，通過該免疫測定系統(tǒng) 測定標(biāo)記，以標(biāo)記量與病毒量的相關(guān)關(guān)系作圖，先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對未知檢體進(jìn)行相同的操 作，測定標(biāo)記量，將測定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從而可以定量測定病毒。需要說明的是，上述夾 層法本身眾所周知。在本發(fā)明的夾層法中，使用兩種可以同時(shí)與單一的H5HA分子結(jié)合的本發(fā)明的抗 H5HA單克隆抗體。此時(shí)，若使用上述對應(yīng)表位以SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列為基準(zhǔn)存 在于以下(1)、(2)或(3)區(qū)的3種單克隆抗體中的兩種來進(jìn)行，則可以進(jìn)行靈敏度和特異 性特別優(yōu)異的免疫測定，因此優(yōu)選。(1)41 60aa 和 312 322aa 區(qū)、(2)61 80aa 和 290 300aa 區(qū)、或(3) 101 113aa 和 268 278aa 區(qū)。定量檢體中的H5亞型A型流感病毒時(shí)，可以優(yōu)選采用ELISA等以微量培養(yǎng)板的孔 或珠粒為固相的夾層法。另一方面，想要在醫(yī)療現(xiàn)場迅速、簡便地檢測檢體中的H5亞型A 型流感病毒時(shí)，優(yōu)選采用免疫色譜法(經(jīng)常簡記作“免疫色譜”)。免疫色譜法本身及其中 使用的器具(以下，有時(shí)稱作“免疫色譜器具”)眾所周知，在下述實(shí)施例中也有具體記載。對側(cè)流式的免疫色譜法簡單說明如下。在由硝基纖維素膜這樣的多孔性材料構(gòu)成 的、通常為帶狀的基質(zhì)上包括將第1抗H5HA單克隆抗體固相化的檢測區(qū)帶；以及位于其 上游(后述的展開液流動(dòng)方向的上流側(cè))、滴注標(biāo)記的第2抗H5HA單克隆抗體的標(biāo)記試劑 區(qū)帶。在標(biāo)記試劑區(qū)帶添加檢體，并且標(biāo)記抗體必需從標(biāo)記試劑區(qū)帶流出、并流入基質(zhì)內(nèi)， 所以通常標(biāo)記試劑區(qū)帶由滴注標(biāo)記抗體的多孔性襯墊構(gòu)成。在基質(zhì)的上游端設(shè)有貯藏展開 液的展開液槽。并且，通常在上述檢測區(qū)帶的下游，由展開確認(rèn)部和展開液吸收區(qū)帶構(gòu)成， 所述展開確認(rèn)部用于確認(rèn)標(biāo)記抗體是否展開、并固相化有抗標(biāo)記抗體；所述展開液吸收區(qū) 帶位于上述展開確認(rèn)部的下游，設(shè)有用于吸收流來的展開液的多孔性吸收襯墊。并且，當(dāng)標(biāo) 記為酶標(biāo)記時(shí)，在標(biāo)記試劑區(qū)帶的上游設(shè)有滴注標(biāo)記酶的底物的底物區(qū)帶。使用時(shí)，在標(biāo)記試劑區(qū)帶添加檢體，展開液槽破裂，展開液向基質(zhì)的上端部展開。 展開液利用基質(zhì)的毛細(xì)現(xiàn)象流向下游。展開液通過底物區(qū)帶時(shí)，底物被洗脫到展開液中，含 有底物的展開液向前流動(dòng)。展開液通過標(biāo)記試劑區(qū)帶時(shí)，標(biāo)記抗體和檢體被洗脫到展開液 中，含有底物、標(biāo)記抗體和檢體的展開液向前流動(dòng)。檢體中含有H5亞型A型流感病毒時(shí)，該 病毒的HA與標(biāo)記抗體通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合。它們的混合物流動(dòng)至檢測區(qū)帶時(shí)，在檢測區(qū)帶中固相化抗體與該病毒的HA通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合。其結(jié)果，經(jīng)由該病毒的HA，標(biāo)記抗體被固定在檢測區(qū)帶。因此，通過測定固定在檢測區(qū)帶的標(biāo)記，可以檢測該病毒。檢體中不 含有H5亞型A型流感病毒時(shí)，固相化抗體上沒有結(jié)合任何物質(zhì)，所以標(biāo)記抗體不會(huì)被固定 在檢測區(qū)帶，進(jìn)一步流向下游。因此，在檢測區(qū)帶檢測不到標(biāo)記。在檢測區(qū)帶下游的展開液 確認(rèn)部，抗標(biāo)記抗體被固相化，所以標(biāo)記抗體被固定在展開液確認(rèn)部。在展開液確認(rèn)部檢測 到標(biāo)記時(shí)，確認(rèn)展開液順利地流動(dòng)至此。展開液進(jìn)一步被其下游的吸收襯墊吸收。作為適用于本發(fā)明的免疫測定方法的檢體，只要是想要檢測是否含有H5亞型A型 流感病毒的檢體即可，可以是任何物質(zhì)，可以是血液(包括全血、血漿、血清)、唾液、痰等體 液或粘膜的擦拭液(趙C 0液)、器具或設(shè)備的擦拭液等，但并不限于這些。以下，根據(jù)實(shí)施例來更具體地說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例參考例1免疫用和ELISA/蛋白質(zhì)印跡法(WB)用H5亞型A型流感病毒(H5N1)抗 原的制備將弱毒流感病毒株A/duck (鴨)/Hokkaido (北海道)/Vac-l/04(H5m) (Genbank 檢索號(hào)AB259712、SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50)感染發(fā)育雞胚漿尿液(鶏卵槳尿液)以 27000rpm的轉(zhuǎn)速于4°C下超速離心1. 5小時(shí)，以小丸(pellet)的形式回收病毒。小丸用 PBS溶解后，通過蔗糖梯度離心法回收含有病毒的餾分(fraction)。再次進(jìn)行超速離心，除 去蔗糖，得到純化病毒溶液。純化病毒用福爾馬林或TritonX-IOO (商品名)滅活，作為免 疫、ELISA和WB用抗原。福爾馬林處理如下進(jìn)行向純化病毒溶液中加入福爾馬林，使終濃 度達(dá)到0.2%，在4°C下靜置1周。TritonX-IOO (商品名)處理通過向純化病毒溶液中加入 3 倍量的細(xì)胞提取用緩沖液(0. 05M Tris-HCl, ρΗ8· 0、0· 6Μ KC1、0. 5% TritonX-100 (商品 名))來進(jìn)行。確認(rèn)病毒滅活時(shí)，將滅活處理的病毒接種在10日齡發(fā)育雞胚中，培養(yǎng)2天， 之后通過病毒感染發(fā)育雞胚漿尿液的紅細(xì)胞凝集(HA)試驗(yàn)確認(rèn)不到HA效價(jià)，從而確認(rèn)病 毒滅活。參考例2特異性確認(rèn)(IF、WB)用H5亞型A型流感病毒(H5N1)抗原的制備用于已建立的抗體的特異性確認(rèn)的病毒感染Madin-Darby犬腎(Madin-Darby canine kidney, MDCK)細(xì)胞(獲取自北海道大學(xué))及其細(xì)胞提取液的制作如下進(jìn)行。就 熒光抗體法(IF)用抗原而言，在腔室玻片上培養(yǎng)MDCK細(xì)胞直至鋪滿成整片狀(7 >〉一 卜)，之后用添加有胰蛋白酶的MEM(未添加血清)稀釋各流感病毒至最佳濃度，接種在細(xì)胞 中，在CO2培養(yǎng)箱中35°C下培養(yǎng)16小時(shí)，之后用冷丙酮固定細(xì)胞，作為特異性確認(rèn)用IF用 玻片。就WB用抗原而言，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)MCDK細(xì)胞直至鋪滿成整片狀，在與IF用抗原 制作同樣最優(yōu)化的病毒溶液中加入含有胰蛋白酶的無血清MEM，將所得病毒溶液加入到細(xì) 胞中，在35°C下培養(yǎng)16小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞溶解緩沖液溶解細(xì)胞，以 HOOOrpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將該上清作為特異性確認(rèn)用WB用抗原。實(shí)施例IA型流感病毒(H5)血凝素特異性單克隆抗體的確立使用參考例1中制作的純化滅活流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04 (H5N1)對 小鼠進(jìn)行免疫，將同一只小鼠的后肢淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合來制作。即，使用經(jīng)弗氏完 全佐劑乳化的純化滅活流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04 (H5m)，以50 100 μ g/小鼠對BALB/C小鼠的足墊給藥，進(jìn)行初次免疫，2 3周后，使用不含佐劑的純化滅活流感病毒 A/duck/Hokkaido/Vac-1/04 (H5N1)，以50 100 μ g/小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫?？贵w效價(jià)的確認(rèn) 通過使用包被有TritonXlOO處理純化流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-l/04(H5m)抗原的 96孔ELISA板的固相ELISA、以及利用同一抗原進(jìn)行的WB來進(jìn)行。對于確認(rèn)到抗體效價(jià)上 升的小鼠，使用純化滅活流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04 (H5m)，以25 50 μ g對足 墊給藥，進(jìn)行免疫，3 4天后，由小鼠下肢淋巴結(jié)制備淋巴細(xì)胞。將之前用RPMI-1640培 養(yǎng)基培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(P3U1)與脾細(xì)胞以1 2 1 5的比例混合，使用聚乙二醇 (PEG;《一 U 一社制)進(jìn)行細(xì)胞融合。融合的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，之后分別注入 96孔培養(yǎng)板中，在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。產(chǎn)生抗體的篩選通過上述所示的固相ELISA來進(jìn)行。即，將TritonX-IOO (商品名) 處理純化流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04 (H5m)抗原以1 μ g/ml的濃度、按50 μ 1/ 孔分別注入96孔ELISA板(3 >夕社制)中，在4°C下放置一夜，使其吸附。將孔用
脫脂乳封閉后，用清洗緩沖液(含0. 05%Tween20的PBS)清洗3次，加入50μ1進(jìn)行了細(xì) 胞融合的板中的培養(yǎng)上清，在37°C下反應(yīng)1小時(shí)。同樣，用清洗緩沖液清洗3次，之后加入 POD標(biāo)記抗小鼠免疫球蛋白抗體(DAC0社制)，再于37°C下反應(yīng)1小時(shí)。用清洗緩沖液清 洗4次后加入底物ABTS，選擇可見顯色的孔。接下來，將所選擇的孔的細(xì)胞移入48孔或24 孔培養(yǎng)板中，在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后通過WB確認(rèn)與血凝素反應(yīng)。WB如下進(jìn)行 對TritonX-IOO (商品名)處理純化流感病毒A/duck/Hokkaido/Vac-1/04 (H5m)抗原進(jìn)行 SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，使用所制作的膜，按照常規(guī)方法來進(jìn)行。通過WB確 認(rèn)與血凝素反應(yīng)的孔的細(xì)胞通過極限稀釋法形成單一克隆，確立產(chǎn)生以下所示的與抗流感 (H5N1)血凝素反應(yīng)的單克隆抗體的各種雜交瘤。為了除去表位發(fā)生交叉的克隆，通過抑制試驗(yàn)首先除去競爭的單克隆抗體，只選 擇互相不競爭的單克隆抗體。該抑制試驗(yàn)具體如下進(jìn)行。與Mab的篩選一樣，制作吸附有 純化流感病毒的96孔ELISA板，向各孔中同時(shí)加入數(shù)倍高濃度的抑制用Mab和等量的堿性 磷酸酶標(biāo)記Mab，在37°C下反應(yīng)1小時(shí)。清洗后加入底物pNPP，確認(rèn)各Mab是否抑制標(biāo)記 Mab與固相的反應(yīng)。將所選擇的14種單克隆抗體進(jìn)行各種組合，利用后述方法實(shí)際制作 用 作后述免疫色譜器具(4 A 7々口 7卜器具)的固相抗體和標(biāo)記抗體的免疫色譜器具，使 用所制作的免疫色譜器具，實(shí)際檢測檢體中的A型流感病毒，確立給予優(yōu)異的靈敏度和特 異性(如下所述，不與其他HA亞型進(jìn)行交叉反應(yīng))的3種單克隆抗體ΙΠ15-115、ΙΠ15-136、 IFH5-26和分別產(chǎn)生上述單克隆抗體的3種雜交瘤ΙΠ15-115、ΙΠ15-136、ΙΠ15-26(以下，有 時(shí)將單克隆抗體IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26分別稱作單克隆抗體115 (或Mabll5)、單克 隆抗體136(或Mabl36)和單克隆抗體26 (或Mab26))。需要說明的是，如下所述，這些單克 隆抗體不具有對A型流感病毒的中和活性。實(shí)施例2通過IF和WB確認(rèn)單克隆抗體的反應(yīng)特異性IF法如下進(jìn)行。即，向參考例2中制作的特異性確認(rèn)用IF用玻片上添加單克隆抗 體的培養(yǎng)上清或腹水(用含有BSA的PBST稀釋)，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，之后用PBS清 洗，使之與熒光色素標(biāo)記抗小鼠IgG (用含有BSA的PBST稀釋1000倍)在室溫下反應(yīng) 30分鐘。用PBS清洗后，用甘油密封，在熒光顯微鏡下觀察。使用參考例2制作的抗原，按 照常規(guī)方法進(jìn)行WB。
雖然在任一種方法中均確認(rèn)到單克隆抗體IFH5-115、IFH5-136、IFH5-26與弱毒 型H5m流感HA反應(yīng)，但這些單克隆抗體與其他亞株的HA或強(qiáng)毒型H5m的反應(yīng)根據(jù)方法 而不同。因此，對于這些單克隆抗體要通過實(shí)際的測定系統(tǒng)(EL)來確認(rèn)。實(shí)施例3抗流感H5W型病毒單克隆抗體的對應(yīng)表位分析3-1N末端缺失質(zhì)粒的制作為了確定Mab 26,115和136的N末端側(cè)的識(shí)別位點(diǎn)，通過PCR法擴(kuò)增包含564 個(gè)氨基酸的流感 HW^l 株 A/duck/Hokkaido/Vac-l/04(H5m)的 HA (SEQ ID NO 2)中 1 564aa(Α 片段)、1 514aa(B 片段)、21 514aa(C 片段)UOl 500aa(D 片段),151 500aa(E片段)和201 500aa(F片段)這6個(gè)片段。在各引物中預(yù)先附加BamHI、XbaI 位點(diǎn)。擴(kuò)增片段用QIAGEN社的PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，插入到在表達(dá)用質(zhì)粒pW6A的 NdeI-EcoRI位點(diǎn)插入有GST的表達(dá)用質(zhì)粒pWG6A的BamHI、XbaI位點(diǎn)，制作質(zhì)粒pWGInf. H5N1-N-A, pWGInf. H5N1-N-B、pWGInf. H5N 卜N_C、pWGInf. H5N1-N-D, pWGInf. H5N1-N-E 和 pWGInf. H5N1-N-F。使用它們來轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)(從 Brookhaven National Laboratory獲取)，得到氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌BL21 (DE3) pWGInf. H5N1-N-A, BL21 (DE3) pWGInf. H5N1-N-B, BL21 (DE3) pWGInf. H5N1-N-C、BL21 (DE3) pWGInf. H5N1-N-D、 BL21 (DE3) pWGInf. H5N1-N-E 和 BL21 (DE3) pWGInf. H5N1-N-F。3-2 重組蛋白(GST+Inf. H5N1-N-A、GST+Inf. H5N1-N-B、GST+Inf. H5N1-N-C、GST+Inf. H5N1-N-D、GST+Inf. H5N1-N-E 禾口 GST+Inf. H5N1-N-F)的表達(dá)和蛋白質(zhì)印跡法將3-1中制作的轉(zhuǎn)化體在2ml含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中、于37°C 下培養(yǎng)。通過預(yù)培養(yǎng)使在600nm處OD達(dá)到0. 6 0. 8，之后添加ImM的IPTG，進(jìn)行表達(dá)誘 導(dǎo)，再培養(yǎng)3小時(shí)。將1. 5ml量的菌體培養(yǎng)液以5，OOOrpm的轉(zhuǎn)速離心2分鐘，收集菌體，懸 浮于100 μ 1緩沖液(IOmM Tris-鹽酸、ρΗ8· 0、0· IM氯化鈉、ImM EDTA)中，通過15分鐘的 超聲破碎，將菌體完全粉碎。以此作為菌體試樣。向8 μ 1菌體試樣中加入4 μ 1 3倍濃度的SDS聚丙烯酰胺緩沖液(0. 15Μ Tris-鹽 酸、ρΗ6. 8,6% SDS、24%甘油、6mM EDTA,2% 2-巰基乙醇、0. 03%溴酚藍(lán))，充分?jǐn)嚢瑁?在100°C下加熱處理，供給電泳。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)使用 e-PAGEL 12. 5%凝膠濃度(商品名、ATTO社制)，按照常規(guī)方法進(jìn)行。電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜(ΑΤΤ0社制)上，用1 % BSA在4°C下封閉一夜。除去封閉液，用PBS-Tween (商品名)清 洗，之后加入調(diào)整至2 μ g/ml的濃度的單克隆抗體26、115和136，在室溫下反應(yīng)60分鐘。 用PBS-Tween(商品名)充分清洗后，與利用反應(yīng)用液稀釋至5000倍的過氧化物酶標(biāo)記的 抗小鼠免疫球蛋白兔多克隆抗體(夕‘二社制)反應(yīng)，清洗后，使用ECL蛋白質(zhì)印跡法檢測 系統(tǒng)(GE Healthcare Biosciences社制)，對即顯膠片(富士 film社制)曝光1 15分 鐘，檢測信號(hào)。其結(jié)果見圖4。單克隆抗體26和115與A、B和C片段反應(yīng)，不與D片段反 應(yīng)。單克隆抗體136與A、B、C和D片段反應(yīng)，不與E片段反應(yīng)。因此，判明單克隆抗體26 禾口 115識(shí)別21 IOOaa區(qū)、而單克隆抗體136識(shí)別101 150aa區(qū)。3-3N末端缺失質(zhì)粒的制作接下來，通過PCR法擴(kuò)增進(jìn)一步細(xì)分流感H5W的21 400氨基酸片段而得到 的片段 Nl (21 400aa)、N2 (41 400aa)、N3 (61 400aa)、N4 (81 400aa)、N5(101 400aa)、N6 (114 400aa)、N7 (127 400aa)和 N8 (139 400aa)。將擴(kuò)增片段用 QIAGEN社的PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，插入昆蟲細(xì)胞表達(dá)用質(zhì)粒pBac-EGTs-6A(改變Invitrogen 社制PFastBacl 載體)的 BamHI-XbaI 位點(diǎn)，制作質(zhì)粒 pBacInf. H5Nl-NUpBacInf. H5N1-N2、 pBacInf. H5N1-N3、pBacInf. H5N1-N4, pBacInf. H5N1-N5, pBacInf. H5N1-N6, pBacInf. H5N1-N7和pBacInf. H5m-N8。將它們轉(zhuǎn)化成Bacmid制作用大腸桿菌DHlOBac，制作 Bacmid-Inf. H5N1-N1、Bacmid-Inf. H5N1-N2、Bacmid-Inf. H5N1-N3、Bacmid-Inf. H5N1-N4、 Bacmid-Inf. H5N1-N5、Bacmid-Inf. H5N1—N6、Bacmid-Inf. H5N1-N7 禾口 Bacmid-Inf. H5N1-N8。3-4 重組蛋白(Inf. H5N1-N1、Inf. H5N1-N2、Inf. H5N1-N3、Inf. H5N1-N4、Inf. H5N1-N5, Inf. H5N1-N6, Inf. H5N1-N7 和 Inf. H5N1-N8)的表達(dá)將3-3中制作的8種BacmidDNA轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞Sf_21 (Invitrogen社制)中，制 作重組病毒 P1-N1、P1-N2、P1-N3、P1-N4、P1-N5、P1-N6、P1-N7 和 P1-N8。用它們的 Pl 的一 部分感染Sf21細(xì)胞，在27°C下培養(yǎng)4天，之后以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，回收培養(yǎng)上 清。將其作為ELISA的試樣。采用將與139 400氨基酸區(qū)反應(yīng)的單克隆抗體254固相化的ELISA法。即，將 單克隆抗體254稀釋至2 μ g/mL的濃度，向微量培養(yǎng)板組件(Nunc社制)的各孔中分別 注入50 μ L，在4°C下培養(yǎng)一夜，將其固相化。接下來，用含有0. Tween20(商品名)的 PBS (PBS-Tween (商品名))清洗各孔，之后加入100 μ L用PBS稀釋的1 %牛血清白蛋白 (BSA)，在37°C下封閉1小時(shí)。除去封閉液后，加入50 μ 1生物素化單克隆抗體26、115和 126，在37°C下反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-Tween (商品名)充分清洗后，向各孔中分別加入50 μ 1 利用反應(yīng)用液稀釋2，000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素(DAK0社制)，在37°C下反應(yīng)1 小時(shí)。反應(yīng)后，用PBS-Tween (商品名)充分清洗，向各孔中分別加入50 μ 1對硝基苯基磷 酸，在室溫下反應(yīng)30分鐘，之后向各孔中分別加入50 μ 1反應(yīng)停止液，波長405nm處測定顯 色水平(吸光度)。如表1所示，可以推定單克隆抗體26在61 80氨基酸區(qū)存在表位， 單克隆抗體115在41 60氨基酸區(qū)存在表位，單克隆抗體136在101 113氨基酸區(qū)存 在表位。[表 1]
權(quán)利要求
抗H5亞型A型流感病毒血凝素單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，所述單克隆抗體與H5亞型A型流感病毒的血凝素發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，其對應(yīng)表位不存在于受體亞結(jié)構(gòu)域中，對上述A型流感病毒不具有中和活性，所述亞結(jié)構(gòu)域不包括由其C末端11個(gè)氨基酸構(gòu)成的區(qū)。
2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，該單克隆抗體與Hl亞型 H4 亞型和H6亞型 H15亞型的血凝素實(shí)質(zhì)上不發(fā)生交叉反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，其對應(yīng)表位以SEQID NO 2所示的氨基酸序列為基準(zhǔn)，存在于下述區(qū)中(1)41 60aa 和 312 322aa 的區(qū)、(2)61~ 80aa 和 290 300aa 的區(qū)、或(3)101 113aa 和 268 278aa 的區(qū)。
4.H5亞型A型流感病毒的免疫測定方法，該方法包括通過免疫測定來測定檢體中的 H5亞型A型流感病毒，所述免疫測定利用權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其 抗原結(jié)合性片段與H5亞型A型流感病毒血凝素的抗原抗體反應(yīng)。
5.權(quán)利要求3所述的方法，該方法采用夾層法，所述夾層法使用兩種可以同時(shí)與單一 的H5亞型A型流感病毒血凝素分子結(jié)合的權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或 其抗原結(jié)合性片段。
6.權(quán)利要求5所述的方法，該方法使用3種單克隆抗體中的兩種來進(jìn)行，上述3種單克 隆抗體的對應(yīng)表位以SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列為基準(zhǔn)，存在于下述區(qū)中(1)41 60aa 和 312 322aa 區(qū)、(2)61~ 80aa 和 290 300aa 區(qū)、或(3)101 113aa 和 268 278aa 區(qū)。
7.權(quán)利要求6所述的方法，該方法采用免疫色譜法。
8.H5亞型A型流感病毒的免疫測定用試劑盒，該試劑盒含有兩種可以同時(shí)與H5亞型 A型流感病毒血凝素結(jié)合的權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片 段。
9.權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中上述兩種單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段中的一方 被固定在固相上，另一方被標(biāo)記。
10.權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中上述固相為免疫色譜法用的固相。
全文摘要
本發(fā)明公開了即使在H5亞型的A型流感病毒發(fā)生某種程度的突變的情況下，也可以正確進(jìn)行測定的H5亞型的A型流感病毒的免疫測定方法和用于該方法的試劑盒、以及可以用于該免疫測定的新型抗H5亞型A型流感病毒單克隆抗體。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合性片段與H5亞型A型流感病毒的血凝素發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，其對應(yīng)表位不存在于受體亞結(jié)構(gòu)域(其中，由其C末端11個(gè)氨基酸構(gòu)成的區(qū)除外)中，因此對上述A型流感病毒不具有中和活性。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101990575SQ200980112548
公開日2011年3月23日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者內(nèi)田好昭, 喜田宏, 宮川英二, 小垣弘之, 白川貴志, 藤井信之, 迫田義博 申請人:國立大學(xué)法人北海道大學(xué);富士瑞必歐株式會(huì)社