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體外連接和組合裝配核酸分子的方法

文檔序號:580397閱讀:449來源:國知局
專利名稱:體外連接和組合裝配核酸分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及體外連接單鏈和/或雙鏈核酸分子的方法,其允許有效地一步裝配 多個具有重疊末端序列的核酸分子。本發(fā)明方法在實施系統(tǒng)組合裝配核酸序列變體片段 以修飾被連接核酸序列的性質(zhì)中是特別有用的,核酸序列例如提供密碼子使用、控制序 列、基因、途徑、染色體、染色體外核酸和基因組的變體的核酸序列。
背景技術(shù)
基于循環(huán)變溫儀的兩步法被用來裝配部分生殖道枝原體(M.genitalium)基因 組, 如 Gibson, D.G.等, “Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome.” Science(2008) 319 : 1215-1220 中所述。Li,M.Z.等., NatureMeth. (2007) 4 251-256描述了另一種方法。采用T7 5'核酸外切酶和單鏈DNA 結(jié)合蛋白的單步裝配方法公開在PCT公開W02006/021944中。本發(fā)明公開了一步方法, 其促進DNA分子在體外的裝配。這些方法采用缺少3'核酸外切酶活性的非熱穩(wěn)定5' 核酸外切酶或在dNTP存在的情況下起作用的3 ‘核酸外切酶。這些新方法在本發(fā)明的另外的方面中是特別有用的,其提供系統(tǒng)組合裝配以 修飾核酸分子。用于高通量篩選中的化學化合物裝配的組合技術(shù)這時已經(jīng)被充分建 立。另外,基因改組技術(shù)——其中編碼序列被隨機片段化和再退火——已經(jīng)實踐了許多 年。例如,用以創(chuàng)建嵌合基因片段文庫的方案描述在Meyer,Μ.等,“Combinatorial Recombination of Gene Fragments to Construct a Library of Chimeras” Current Protocols in Protein Science(2006) 26.2.1-26.2.17 ; McKee, A.E.等,JBEI 摘要中。然而,對于組合 方法的系統(tǒng)方法存在需求,其不依賴隨機重排或改組以提供優(yōu)化的核酸序列,例如,具 有優(yōu)化的編碼序列或代謝途徑的優(yōu)化的核酸序列,所述優(yōu)化的核酸序列可以根據(jù)期望的 性質(zhì)進行選擇。本發(fā)明通過提供用以裝配多種感興趣核酸的系統(tǒng)組合方法而滿足了該需 求。用于將各種組分裝配到全基因組或最小基因組中的技術(shù)已經(jīng)被創(chuàng)立。例如, 2007年11月15日公布的美國專利公開2000/0264688描述了構(gòu)建合成基因組的方法,其 通過產(chǎn)生和裝配包含部分基因組的序列盒進行。裝配核酸的逐步分級方法描述在2007年 1月4日公布的美國專利公開2007/004041中。然而,沒有表明系統(tǒng)地使用這些技術(shù)來裝 配期望的核酸分子。可以理解的是,基因組的構(gòu)建不需要包括所有天然存在的組分。PCT公開W02007/047148描述了基于生殖道枝原體的最小基因組,其中多達101個編碼蛋白的基 因可以被省略并且仍保持生存力。沒有表明最小基因組的組分被系統(tǒng)裝配為允許形成多 種可選最小基因組的組合文庫。因此,本發(fā)明涉及系統(tǒng)方法和其產(chǎn)物,其允許核酸分子的有效和廣泛修飾以便 以高通量的方式提供和篩選感興趣的核酸裝配物,并且容易適應(yīng)機器執(zhí)行。在可選的實 施方式中,與在反應(yīng)管中相對,裝配反應(yīng)可以在固體表面上進行,例如,在使用微觀流 體的芯片上(如Huang,Y.等,Lab Chip (2007) 7 24-26中所顯示)。用于系統(tǒng)組合裝配核酸——其代表(表現(xiàn))變體編碼序列、表達系統(tǒng)、途徑合成 和最小或較大基因組——的技術(shù)至少部分采用體外裝配技術(shù)??梢圆捎萌魏芜m合的體外 裝配技術(shù);然而,本發(fā)明的方法包括對本領(lǐng)域中已經(jīng)描述的那些方法的改進。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面,本發(fā)明提供連接一組兩個或更多個雙鏈(ds)或單鏈(ss) DNA分子 的體外方法。待被連接的鄰近DNA分子在其末端處含有重疊序列。兩個或更多個DNA 分子在有效連接所述兩個或更多個DNA分子以在一步反應(yīng)(one-step reaction)中形成第一 裝配dsDNA分子的條件下在單個容器中在體外與(a)分離的非熱穩(wěn)定5'至3'核酸外切 酶——其缺少3'核酸外切酶活性,(b)群集劑,(C)分離的熱穩(wěn)定非鏈置換DNA聚合酶
(non-strand-displacing DNA polymerase)-其具有 3 ‘核酸外切酶活性,或所述 DNA 聚
合酶與缺少3'核酸外切酶活性的第二DNA聚合酶的混合物,(d)分離的熱穩(wěn)定連接酶, (e)dNTP的混合物,以及(f)適合的緩沖液接觸。在一些實施方式中,(a)的核酸外切酶是T5核酸外切酶并且接觸是在等溫條件 下進行,和/或(b)的群集劑是PEG,和/或(c)的非鏈置換DNA聚合酶是PhUSianTMDNA 聚合酶或VENT DNA聚合酶,和/或(d)的連接酶是Taq連接酶。在一些實施方式中,所述條件也適于在連接反應(yīng)后消化任意不成對的、非同源 的、單鏈DNA。待被連接DNA分子中至少一些在一個末端包含與任意感興趣的DNA分 子不同源的序列。任選地,非同源序列包含一個或更多個PCR引物的結(jié)合區(qū)域,和/或 與載體序列具有同源性的區(qū)域,和/或一種或更多種在感興趣的DNA分子中不存在的限 制酶例如罕見切割限制酶的識別位點。所述方法可以用來將第二組兩個或更多個DNA分子彼此連接以獲得除第一裝配 分子之外的第二裝配DNA分子,并且連接第一和第二裝配DNA分子以獲得第三裝配ds DNA分子。該過程可以按需要不斷被重復(fù),以獲得感興趣的全核酸序列。本發(fā)明還提供用于進行上述方法的試劑盒,其包含適當量的(a)分離的非熱穩(wěn) 定5'至3'核酸外切酶——其缺少3'核酸外切酶活性,(b)群集劑,(C)分離的熱穩(wěn)定 非鏈置換DNA聚合酶——其具有3'核酸外切酶活性,或所述DNA聚合酶與缺少3'核 酸外切酶活性的第二 DNA聚合酶的混合物,以及(d)分離的熱穩(wěn)定連接酶。例如,所述 試劑盒可以含有T5核酸外切酶、PEG、Phusion DNA聚合酶和Taq連接酶。在第二方面,本發(fā)明涉及連接一組兩個或更多個雙鏈(ds)或單鏈(ss) DNA分子 的可選的體外方法,其中待被連接的鄰近DNA分子在其末端處含有重疊序列。所述方法 包括將兩個或更多個DNA分子在有效連接所述兩個或更多個DNA分子以在一步循環(huán)變溫反應(yīng)(one-step thermocycled reaction)中形成第一裝配dsDNA分子的條件下在單個容器
中在體外與(a)分離的非熱穩(wěn)定3'至5'核酸外切酶——其在dNTPs存在的情況下有活 性,(b)群集劑,(c)分離的熱激活(heat-activated)DNA聚合酶,(d)分離的熱穩(wěn)定連接 酶,(e)dNTPs的混合物,以及(f)適合的緩沖液接觸。在該方面的一個實施方式中,(a)核酸外切酶是核酸外切酶III,和/或(C)的 聚合酶通過去除以熱敏方式與所述聚合酶結(jié)合的失活部分而被熱激活,和/或(b)的群集 劑是PEG,和/或(d)的連接酶是Taq連接酶。(C)的DNA聚合酶可以是AMPLITAQ GOLD 。該方法也可以用來獲得能與第一裝配組結(jié)合的第二裝配組的DNA分子。循環(huán)變 溫一步方法和上述等溫方法的任意組合可以用于多個組的DNA分子的裝配并且兩者中任 意一種均可以用于裝配組中較大DNA分子的后續(xù)裝配。上述方法的組分可以作為試劑盒被提供,所述試劑盒在單個容器中包含一定量 的(a)分離的非熱穩(wěn)定3'至5'核酸外切酶,其在dNTPs存在的情況下有活性,(b)群 集劑,(C)分離的熱激活DNA聚合酶,(d)分離的熱穩(wěn)定連接酶,(e) dNTPs的混合物, 以及(f)適合的緩沖液,所述的量使得當所述兩個或更多個DNA分子在適合的緩沖溶液 和dNTPs存在的情況下被添加到試劑盒和在循環(huán)變溫條件下溫育時,所述兩個或更多個 DNA分子在協(xié)同反應(yīng)(concerted reaction)中被裝配。在該方面的一個實施方式中,所述 試劑盒包含(a)核酸外切酶III、(b)PEG、(c) AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶和(d) Taq 連接酶。用于第一和第二方面的公開方法中的物質(zhì)的任意組合可以一起被包裝成用于進 行任意一種公開方法的試劑盒。例如,試劑盒可以包含含有裝配ssDNA分子(例如,寡 核苷酸)或dsDNA分子所需的所有試劑的混合物。在第三方面,本發(fā)明提供修飾全核酸分子的性質(zhì)的方法。該方法包括(a)將 所述全核酸分子的核酸序列沿其長度代表性地分成多個部分,從而鑒定部分核酸分子的 序列;(b)對于至少3個所述部分核酸分子提供每個部分核酸分子的多個變體;(C)將所 述變體與沒有被改變的任意部分核酸分子在體外組合裝配在一起,其中所述部分核酸分 子或其變體在其末端處含有重疊序列,由此所述部分核酸分子和其變體在混合物中的裝 配將導(dǎo)致全核酸分子的多個變體的裝配;以及(d)表達全核酸分子的變體,以確定所述 全核酸分子的所述變體的任意被修飾性質(zhì)。步驟(c)的裝配可以通過上述方法中任一種進行——盡管也可以使用可選的連 接方法。例如,可以使用多步體外方法,或者可以使用體內(nèi)方法,諸如PCT申請PCT/ US2008/079109中所描述的那些方法。盡管體外裝配方法一般對于寡核苷酸更加方便, 但是體內(nèi)裝配方法也可以是可使用的替代物。一種可以應(yīng)用的裝配方法包括如下步驟(a)將所述變體以及沒有被改變的任意 部分核酸分子與非加工5'核酸外切酶;以及與(b)促進核酸退火的單鏈DNA結(jié)合蛋白 (SSB);以及與(c)非鏈置換DNA聚合酶;以及與(d)連接酶接觸,其在有效連接變體 和沒有被改變的部分核酸分子以導(dǎo)致全核酸分子的多個變體裝配的條件下進行。在一個實施方式中,該方面包括將全核酸分子的核酸序列分成至少5個部分, 所述至少5個部分可以使用本發(fā)明的體外方法被有利地裝配。在其它實施方式中,部分核酸分子變體提供由部分核酸分子編碼的一個或更多個氨基酸的密碼子的簡并形式???選地,部分核酸分子的變體提供多個核酸控制序列,其影響全核酸分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯。 作為另一選擇,部分核酸分子的變體提供編碼由全核酸分子編碼的肽或蛋白的結(jié)構(gòu)域或 基序的多個區(qū)域。作為又一選擇,由所述部分核酸分子編碼的肽或蛋白在代謝途徑中一 起起作用。上述各種重組方法可以用來構(gòu)建任何期望的裝配物,諸如質(zhì)粒、載體、基因、 代謝途徑、最小基因組、部分基因組、基因組、染色體、染色體外核酸,例如細胞質(zhì)的 細胞器,諸如線粒體(動物),和葉綠體和質(zhì)體(植物),等等。對于大DNA分子的裝 配,最終步驟可以在體內(nèi)進行,其中酵母是優(yōu)選的宿主。裝配步驟的體外和體內(nèi)操作之 間的平衡由與被裝配的DNA分子的性質(zhì)有關(guān)的方法的實用性確定。本發(fā)明進一步包括由上述方法獲得的DNA分子文庫,和使用被修飾的整個DNA 分子的方法。文庫——其含有2個或更多個變體,但通常是多個變體,如20、100、1000 或更多個——可以被篩選,以獲得具有期望特征,如期望產(chǎn)物的高水平產(chǎn)生、產(chǎn)物的功 能提高、或功能降低(如果是有利的)的成員。這類篩選可以通過高通量方法進行,其 可以是機器操作的/自動化的。本發(fā)明還進一步包括由本發(fā)明方法制備的產(chǎn)物,例如所得到的裝配合成基因或 基因組和被修飾的優(yōu)化基因和基因組,以及其應(yīng)用和產(chǎn)品。本發(fā)明的重組方法具有很廣泛的應(yīng)用,其可以例如設(shè)計有用產(chǎn)物的合成途徑, 所述有用產(chǎn)物包括藥物、生物燃料、診斷劑(diagnostics)、獸醫(yī)產(chǎn)品、農(nóng)業(yè)化學品、生長 因子等等-即,可以在細胞培養(yǎng)物中或在轉(zhuǎn)基因動物或植物中裝配的任意分子。作為簡 單的實例,大腸桿菌(E.coli)的乙酸途徑可以被改造成產(chǎn)生生物燃料,如乙醇、丁醇等 等。有關(guān)次級代謝物如聚酮化合物的合成途徑的酶也可以使用本發(fā)明的方法進行優(yōu)化。 因此,由本發(fā)明的系統(tǒng)組合方法得到的DNA分子可以用于廣泛的背景中,以產(chǎn)生有用的 產(chǎn)物。


圖IA是使用T4聚合酶的兩步循環(huán)變溫(熱循環(huán))體外裝配的示意圖。圖IB顯示了使用圖IA中所示的方法在5% PEG-8000存在⑴或不存在㈠的 情況下實施的8個核酸片段的裝配結(jié)果,每個核酸片段均在5.3kb至6.5kb之間并具有240 至360bp重疊序列。圖IC顯示了使用圖IA中所示的方法在PEG-8000存在的情況下4個核酸片段的 裝配結(jié)果,每個核酸片段為5kb并具有40bp重疊序列。圖ID顯示了由2個四分之一基因組片段裝配生殖道枝原體二分之一基因組 (3IOkb)的結(jié)果,所述基因組片段為144kb and 166kb并具有257bp重疊序列。圖IE顯示了由4個四分之一基因組片段裝配全合成生殖道枝原體基因組的結(jié) 果,所述基因組片段均為 150kb并具有80至257bp重疊序列。圖2A是用于分析修復(fù)裝配反應(yīng)成功策略的示意圖。在甲酰胺(+F)存在的情況 下dsDNA被變性成ssDNA,并且如果發(fā)生修復(fù),ssDNA保持較高分子量不變。圖2B顯示了用于分析使用圖IA中所示方法裝配的產(chǎn)物的圖2A方法的結(jié)果。
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圖3顯示了連接4個DNA片段的修復(fù)裝配產(chǎn)物滾環(huán)擴增(RCA)的結(jié)果,其顯示 僅修復(fù)裝配產(chǎn)物被擴增。圖4A是使用核酸外切酶III的一步循環(huán)變溫體外裝配示意圖。圖4B顯示了使用圖4A中所示方法的4個不同核酸片段的2個裝配物的結(jié)果, 所述4個不同核酸片段每個均為 5kb并具有300bp或40bp重疊序列。圖4C顯示了圖2A中所示的那對裝配產(chǎn)物修復(fù)的分析結(jié)果。圖5A是使用T5核酸外切酶的一步等溫體外裝配的示意圖。圖5B顯示了使用圖5A中所示方法裝配2個核酸片段的結(jié)果,所述2個核酸片 段為4,024bp和2,90 Ibp,具有 450bp重疊序列并摻入NotI限制酶序列。圖5C顯示了圖5B中所示產(chǎn)物的Not I消化結(jié)果。圖5D顯示了使用圖5A中所示方法將3個每個為 5kb的核酸片段與 8kb具 有40bp重疊序列的載體序列裝配在一起的結(jié)果。圖5E顯示了 DNA的代表性結(jié)果,所述DNA由轉(zhuǎn)化有圖5D中所示裝配產(chǎn)物的 大腸桿菌純化得到并且用NotI進行消化以從載體釋放裝配片段。圖6A-6D顯示了圖IA (T4聚合酶)、圖4A (核酸外切酶III)和圖5A (T5核酸外 切酶)所示方法的直接比較結(jié)果。圖6A顯示了使用上述各種裝配方法將5.9kb至6.2kb具有80bp重疊序列的4個 核酸片段與 8kb具有80bp重疊序列的載體裝配在一起的結(jié)果。圖6B顯示了 DNA的代表性結(jié)果,所述DNA由轉(zhuǎn)化有圖6A中所示裝配產(chǎn)物的 大腸桿菌純化得到并且用NotI進行消化以從載體釋放裝配片段。圖6C顯示了使用上述各種裝配方法將生殖道枝原體的2個四分之一基因組與 Skb具有80bp重疊序列的載體裝配在一起的結(jié)果。圖6D顯示了 DNA的代表性結(jié)果,所述DNA由轉(zhuǎn)化有圖6C中所示裝配產(chǎn)物的 大腸桿菌純化得到并且用NotI進行消化以從載體釋放裝配片段。圖7A示意性說明了密碼子優(yōu)化在創(chuàng)建裝配片段組合文庫中的應(yīng)用。圖7B示意性說明了多種基序和結(jié)構(gòu)域變體在創(chuàng)建基因組合文庫中的應(yīng)用。圖7C示意性說明了變體基因在創(chuàng)建代謝途徑組合文庫中的應(yīng)用。圖8A是乙酸利用途徑的示意圖。圖8B示意性說明了來自5個生物體的變體基因與4個控制序列一起在創(chuàng)建圖8A 所示乙酸利用途徑組合文庫中的應(yīng)用。圖8C示意性說明了圖8B中所示核酸片段的裝配策略。圖8D顯示了圖8C中所示的示例性乙酸利用途徑的裝配結(jié)果,其顯示通過限制 酶消化由載體釋放的裝配產(chǎn)物。圖9A-9F顯示了使用圖5A中所示方法(T5核酸外切酶)連續(xù)裝配全小鼠線粒體
基因組。圖9A顯示了在15個涵蓋整個小鼠線粒體基因組的反應(yīng)中裝配5個300bp片段的結(jié)果。圖9B顯示了圖9A所示反應(yīng)產(chǎn)物的擴增結(jié)果。圖9C顯示了在3個涵蓋整個小鼠線粒體基因組的反應(yīng)中裝配5個圖9A中所示
10l,180bp反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)果。圖9D顯示了圖9C中所示反應(yīng)產(chǎn)物的擴增結(jié)果。圖9E顯示了在載體構(gòu)建物中由3個圖9C中所示5,560bp反應(yīng)產(chǎn)物最終裝配整個 小鼠線粒體基因組的結(jié)果。圖9F顯示了在去除載體序列和再環(huán)化之后最終裝配圖9F中所示整個小鼠線粒體 基因組產(chǎn)物的結(jié)果。
具體實施例方式定義如本文所用,單數(shù)形式“一個(a)”、“一個(an)”和“所述(the) ”包括復(fù)
數(shù)指示物,除非上下文另外清楚地指明。如本文所用,術(shù)語“約”指加或減20%。因此,“約” 30分鐘包括24-30分 鐘。當指核酸的長度、溫度等時,“約”也指的是加或減20%。如本文所用,范圍的 端點包括在該范圍內(nèi)。當加或減20%導(dǎo)致不可分割單元如核苷酸的非整數(shù)值時,技術(shù)人 員將了解,其應(yīng)當將該值四舍五入成最近的整數(shù)。例如,約8個核苷酸并不是6.4至9.6 個核苷酸,而應(yīng)當被解釋為6至10個核苷酸。術(shù)語“活性溫度”指的是這樣的溫度在該溫度以上,DNA聚合酶比核酸外切 酶(即,核酸外切酶III)明顯更加有活性,以便核酸外切酶(即,核酸外切酶III)最初產(chǎn) 生的單鏈突出端的長度凈減少。在本發(fā)明的“體外”實施的那些方法中,所有蛋白組分均被分離和/或基本上 純化。體外裝配反應(yīng)無法在活細胞中或用粗細胞提取物實施;所述反應(yīng)在無細胞的環(huán)境 中實施。通過本發(fā)明的方法進行DNA分子的“連接(joining) ”在本文中有時被稱為DNA 分子的“重組”或“裝配”。根據(jù)本發(fā)明,基因水平上的優(yōu)化通過不連續(xù)組分(discrete components)的設(shè)計以
系統(tǒng)化方式來實現(xiàn)。在所有上述組合的水平上這是真實的。本發(fā)明方法從而避免了現(xiàn)有 技術(shù)方法的隨機性(randomnature)。核苷酸裝配的方法簡要地,當待被連接DNA分子為雙鏈時,優(yōu)選的方法包括將所述DNA分子 與如下溫育(a)核酸外切酶(例如,非加工核酸外切酶),其“嚼回(回嚼,咀嚼 chews-back)”雙鏈DNA分子的末端,以暴露包含重疊區(qū)域的單鏈突出端;(b)群集劑, 如PEG,其促進核酸退火以及發(fā)揮其它功能,以便單鏈突出端被特異性地退火(雜交); (C)非鏈置換DNA聚合酶,其通過延伸被退火區(qū)域的3'末端而填補被退火分子中剩余的 單鏈缺口 ;以及(d)熱穩(wěn)定連接酶,其封閉(連接)所形成的切口。對于單鏈分子,(a) 的核酸外切酶可以但不必被省略。當待被連接DNA分子是單鏈時,單鏈DNA分子(例如,約40_60個堿基的寡核 苷酸,在本文中也被稱為核苷酸或nt)經(jīng)由其末端處具有同一性的序列(例如,約20個 堿基)進行退火,以形成帶缺口的分子。核酸外切酶活性可以對這些帶缺口的分子起作 用,以增加缺口的大小。帶缺口的分子然后用上述聚合酶和連接酶進行修復(fù),以形成雙
11鏈分子。本發(fā)明新型的一步方法可以用來同時連接大量DNA分子。為了實現(xiàn)它,待被連 接DNA分子被設(shè)計以便對于每對待被連接DNA分子在其末端處含有重疊序列-即,一個 DNA分子的遠端區(qū)域包含與另一 DNA分子的近端區(qū)域具有獨特序列同源性(例如,同一 性)區(qū)域。遠端和近端是針對分子鏈一端處隨意的參照點而言,例如,對于參照物X,
權(quán)利要求
1.連接一組兩個或更多個雙鏈(ds)或單鏈(SS)DNA分子的體外方法,其中待連接的 鄰近DNA分子在其末端處含有重疊序列,所述方法包括將所述兩個或更多個DNA分子 在有效連接所述兩個或更多個DNA分子以在一步反應(yīng)中形成第一裝配dsDNA分子的條件 下在單個容器中在體外與下列接觸(a)缺少3'核酸外切酶活性的分離的非熱穩(wěn)定5'至3'核酸外切酶,(b)群集劑,(C)具有3'核酸外切酶活性的分離的熱穩(wěn)定非鏈置換DNA聚合酶,或者所述DNA 聚合酶與缺少3'核酸外切酶活性的第二 DNA聚合酶的混合物,(d)分離的熱穩(wěn)定連接酶,(e)dNTP的混合物,以及(f)適合的緩沖液。
2.權(quán)利要求1所述的方法,其中(a)的所述核酸外切酶是Τ5核酸外切酶并且所述接 觸是在等溫條件下。
3.權(quán)利要求1的所述方法,其中(b)的所述群集劑是PEG,和/或(C)的所述非鏈置換DNA聚合酶是Phusion DNA聚合酶或VENT DNA聚合酶, 和/或(d)的所述連接酶是Taq連接酶。
4.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述條件還適于在所述連接反應(yīng)后消化任何不成對的 非同源的單鏈DNA。
5.權(quán)利要求4所述的方法,其中所述待連接DNA分子中至少一些在一個末端包含與 任意感興趣的所述DNA分子不同源的序列。
6.權(quán)利要求5所述的方法,其中所述非同源序列包含一個或更多個PCR引物的結(jié)合 區(qū)域,和/或與載體序列同源的區(qū)域,和/或一個或更多個限制酶的識別位點。
7.權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法,進一步包括重復(fù)所述方法來彼此連接第二組兩 個或更多個DNA分子,以獲得第二裝配DNA分子,然后連接所述第一和所述第二裝配 DNA分子,以獲得第三裝配dsDNA分子。
8.用于連接一組兩個或更多個雙鏈(ds)或單鏈(SS)DNA分子的一步體外反應(yīng)試劑 盒,其中待連接的鄰近DNA分子在其末端含有重疊序列,所述試劑盒在單個容器中包含(a)缺少3'核酸外切酶活性的分離的非熱穩(wěn)定5'至3'核酸外切酶,(b)群集劑,(C)具有3'核酸外切酶活性的分離的熱穩(wěn)定非鏈置換DNA聚合酶,或者所述DNA 聚合酶與缺少3'核酸外切酶活性的第二 DNA聚合酶的混合物,(d)分離的熱穩(wěn)定連接酶,其量使得當在適合的緩沖溶液和dNTP存在的情況下將所述兩個或更多個DNA分子 添加到所述試劑盒并且在等溫條件下溫育時,所述兩個或更多個DNA分子在協(xié)同反應(yīng)中 被裝配。
9.權(quán)利要求8所述的試劑盒,其包含(a)T5核酸外切酶,(b)PEG,(c)Phusion DNA聚合酶,以及(d)Taq連接酶。
10.修飾全核酸分子性質(zhì)的方法,所述方法包括(a)將所述全核酸分子的核酸序列沿其長度代表性地分成多個部分,從而鑒定部分核 酸分子的所述序列;(b)對于至少3個所述部分核酸分子,提供每個部分核酸分子的多個變體;(c)將所述變體與沒有被改變的任意部分核酸分子在體外組合裝配在一起,其中所述 部分核酸分子或其變體在其末端處含有重疊序列,由此所述部分核酸分子和其變體在所 述混合物中的裝配將導(dǎo)致所述全核酸分子的多個變體的裝配;以及(d)表達所述全核酸分子的所述變體,以確定所述全核酸分子的所述變體的任何被修 飾性質(zhì)。其中步驟(c)的所述裝配通過權(quán)利要求1所述的方法進行。
11.連接一組兩個或更多個雙鏈(ds)或單鏈(SS)DNA分子的體外方法,其中待被連 接的鄰近DNA分子在其末端處含有重疊序列,所述方法包括將兩個或更多個DNA分子 在有效連接所述兩個或更多個DNA分子以在一步循環(huán)變溫反應(yīng)中形成第一裝配dsDNA分 子的條件下在單個容器中在體外與下列接觸(a)分離的非熱穩(wěn)定3'至5'核酸外切酶,其在dNTP存在的情況下有活性,(b)群集劑,(C)分離的熱激活DNA聚合酶,(d)分離的熱穩(wěn)定連接酶,(e)dNTP的混合物,以及(f)適合的緩沖液。
12.權(quán)利要求11所述的方法,其中(a)的所述核酸外切酶是核酸外切酶III。
13.權(quán)利要求11所述的方法,其中(c)的聚合酶通過去除以熱敏方式與所述聚合酶結(jié) 合的失活部分而被熱激活。
14.權(quán)利要求11所述的方法,其中(b)的所述群集劑是PEG,和/或(C)的所述DNA聚合酶是AMPLITAQGOLD ,和/或(d)的所述連接酶是Taq連接酶。
15.權(quán)利要求11-14中任一項所述的方法,進一步包括重復(fù)所述方法來將第二組兩個 或更多個DNA分子彼此連接,以獲得第二裝配DNA分子,然后連接所述第一和所述第 二裝配DNA分子,以獲得第三裝配dsDNA分子。
16.用于連接一組兩個或更多個雙鏈(ds)或單鏈(ss)DNA分子的一步體外反應(yīng)的試 劑盒,其中待被連接的鄰近DNA分子在其末端含有重疊序列,所述試劑盒在單個容器中 包含(a)分離的非熱穩(wěn)定3'至5'核酸外切酶,其在dNTP存在的情況下有活性,(b)群集劑,(C)分離的熱激活DNA聚合酶,(d)分離的熱穩(wěn)定連接酶,(e)dNTP的混合物,以及(f)適合的緩沖液,其量使得當所述兩個或更多個DNA分子在適合的緩沖溶液和dNTP存在的情況下被 添加到所述試劑盒和在循環(huán)變溫條件下溫育時,所述兩個或更多個DNA分子在協(xié)同反應(yīng) 中被裝配。
17.權(quán)利要求16所述的試劑盒,其包含(a)核酸外切酶III,(b)PEG,(c)AMPLITAQ GOLD DNA 聚合酶,以及(d)Taq連接酶。
18.修飾全核酸分子的性質(zhì)的方法,所述方法包括(a)將所述全核酸分子的核酸序列沿其長度代表性地分成多個部分,從而鑒定部分核 酸分子的所述序列;(b)對于至少3個所述部分核酸分子,提供每個部分核酸分子的多個變體;(c)將所述變體與沒有被改變的任意部分核酸分子在體外組合裝配在一起,其中所述 部分核酸分子或其變體在其末端處含有重疊序列,由此所述部分核酸分子和其變體在所 述混合物中的裝配將導(dǎo)致所述全核酸分子的多個變體的裝配;以及(d)表達所述全核酸分子的所述變體,以確定所述全核酸分子的所述變體的任何被修 飾性質(zhì)。其中步驟(c)的所述裝配通過權(quán)利要求11所述的方法進行。
19.修飾全核酸分子的性質(zhì)的方法,所述方法包括(a)將所述全核酸分子的核酸序列沿其長度代表性地分成至少5個部分,從而鑒定部 分核酸分子的所述序列;(b)對于至少3個所述部分核酸分子,提供所述部分核酸分子的多個變體;(C)將所述變體與沒有被改變的任意部分核酸分子在體外組合裝配在一起,其中所述 部分核酸分子或其變體在其末端處含有重疊序列,由此所述部分核酸分子和其變體在所 述混合物中的裝配將導(dǎo)致所述全核酸分子的多個變體的裝配;以及(d)表達所述全核酸分子的所述變體,以確定所述全核酸分子的所述變體的任何被修 飾性質(zhì)。
20.權(quán)利要求19所述的方法,其中所述部分核酸分子的所述變體提供由所述部分核酸 分子編碼的一個或更多個氨基酸的密碼子的簡并形式;或其中所述部分核酸分子的所述變體提供影響所述全核酸分子轉(zhuǎn)錄或翻譯的多個核酸 控制序列;或其中所述部分核酸分子的所述變體提供編碼肽或蛋白的結(jié)構(gòu)域或基序的多個區(qū)域, 所述肽或蛋白由所述全核酸分子編碼;或其中由所述部分核酸分子編碼的所述肽或蛋白在代謝途徑中一起起作用。
21.修飾全核酸分子的性質(zhì)的方法,所述方法包括(a)將所述全核酸分子的核酸序列沿其長度代表性地分成多個部分,從而鑒定部分核 酸分子的所述序列;(b)對于至少3個所述部分核酸分子,提供所述部分核酸分子的多個變體;(c)將所述變體與沒有被改變的任意部分核酸分子在體外組合裝配在一起,其中所述 部分核酸分子或其變體在其末端處含有重疊序列,由此所述部分核酸分子和其變體在所 述混合物中的裝配將導(dǎo)致所述全核酸分子的多個變體的裝配;以及(d)表達所述全核酸分子的所述變體,以確定所述全核酸分子的所述變體的任何被修 飾性質(zhì);其中所述部分核酸分子的所述變體提供由所述部分核酸分子編碼的一個或更多個氨 基酸的密碼子的簡并形式;或其中所述部分核酸分子的所述變體提供影響所述全核酸分子轉(zhuǎn)錄或翻譯的多個核酸 控制序列;或其中所述部分核酸分子的所述變體提供編碼肽或蛋白的結(jié)構(gòu)域或基序的多個區(qū)域, 所述肽或蛋白由所述全核酸分子編碼;或其中由所述部分核酸分子編碼的所述肽或蛋白在代謝途徑中一起起作用。
22.權(quán)利要求19、20或21所述的方法,其中在步驟(c)中的所述裝配如下進行(1)通過這樣的方法,所述方法包括(a)將所述變體以及沒有被改變的任意部分核酸分子與非加工5'核酸外切酶;以及與(b)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB),其促進核酸退火;以及與 (C)非鏈置換DNA聚合酶;以及與(d)連接酶接觸,其在有效連接所述變體和沒有被改變的部分核酸分子以導(dǎo)致所述全核酸分子 的多個變體裝配的條件下進行;或(2)通過體內(nèi)裝配。
23.權(quán)利要求19-21中任一項所述的方法,進一步包括裝配根據(jù)所述體外或體內(nèi)方法 制備的兩個或更多個全核酸分子。
24.變體DNA分子的文庫,其由權(quán)利要求10或18-21中任一項所述方法制備。
25.被修飾DNA分子,其由權(quán)利要求10或18-21中任一項所述方法制備。
26.權(quán)利要求25所述的被修飾DNA,其包含至少一個優(yōu)化的密碼子;和/或 至少一個優(yōu)化的控制序列;和/或至少一個編碼優(yōu)化的蛋白的核苷酸序列;和/或 至少一個編碼優(yōu)化的途徑的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及體外連接兩個或更多個感興趣的雙鏈(ds)或單鏈(ss)DNA分子的方法,其中每對的第一DNA分子的遠端區(qū)域和第二DNA分子的近端區(qū)域共享序列同一性區(qū)域。所述方法允許以預(yù)先確定的順序和方向連接大量DNA片段,而不使用限制酶。其可以用來例如連接感興趣的基因或基因組合成產(chǎn)生的亞片段。還公開了用于進行所述方法的試劑盒。連接DNA分子的方法可以用來產(chǎn)生組合文庫,所述組合文庫用于通過密碼子優(yōu)化、基因優(yōu)化和途徑優(yōu)化產(chǎn)生例如最佳蛋白表達。
文檔編號C12P19/34GK102016070SQ200980113021
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月15日
發(fā)明者C·A·哈奇森三世, D·G·吉布森, H·O·史密斯, J·C·文特爾, L·揚 申請人:合成基因組公司
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