專(zhuān)利名稱(chēng)：γ-氨基丁酸的定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)比色分析簡(jiǎn)便且迅速地對(duì)氨基丁酸(以下有時(shí)也稱(chēng)為GABA。) 進(jìn)行定量的方法，該方法不受試樣中所含的各種氨基酸的影響。
背景技術(shù)：
GABA是自然界廣泛存在的氨基酸中的一種，已知有降壓作用、安神作用等生理功 能。為獲得該作用，而制造了很多添加或強(qiáng)化了 GABA的食品(參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。此外，已 知的是，谷類(lèi)種子只含有少量的GABA，但通過(guò)使種子發(fā)芽可增加GABA含量(參照專(zhuān)利文獻(xiàn) 2)。谷類(lèi)種子的GABA的增加根據(jù)收獲后處理、品質(zhì)的不同而不同，此外，需要對(duì)消費(fèi) 者保證的是，進(jìn)行了發(fā)芽處理等而強(qiáng)化GABA含量的食品中，通過(guò)該發(fā)芽處理確實(shí)地增加了 GABA。專(zhuān)利文獻(xiàn)3中公開(kāi)了堿性磷酸酶活性的測(cè)定法，該方法通過(guò)堿性磷酸酶使氧化型 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)，轉(zhuǎn)變 成氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，然后在電子載體的存在 下使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸與四唑鹽反應(yīng)而生成甲臜染料，并對(duì)該甲臜染料進(jìn)行測(cè)定?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)2007-159017號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)2003-250512號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)2005-304483號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題但是，對(duì)飲食品那樣含有各種氨基酸的試樣中的GABA進(jìn)行定量時(shí)，應(yīng)用專(zhuān)利文獻(xiàn) 3的方法的情況下，由于混雜的氨基酸的影響，甲臜染料發(fā)生沉淀，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。因 此，在飲食品中那樣混雜各種氨基酸的GABA的定量分析中，為了排除混雜的各種氨基酸的 影響，而采用使用了氨基酸分析計(jì)或HPLC等昂貴設(shè)備的分離分析法。但是，在這樣的分離 分析法中，不僅需要昂貴設(shè)備，而且無(wú)法同時(shí)對(duì)多個(gè)待測(cè)物進(jìn)行分析。因此，指出了制品中 標(biāo)示的GABA含量未必能保證是制品中實(shí)際所含的GABA含量等問(wèn)題。如上所述，對(duì)飲食品那樣的含有各種氨基酸的試樣中的GABA進(jìn)行定量的方法具 有若干問(wèn)題。即，在測(cè)定甲臜染料的方法中，受到混雜的氨基酸的影響，基本不可能準(zhǔn)確地 測(cè)定，另外，在分離分析法中，不僅需要昂貴設(shè)備，而且無(wú)法同時(shí)對(duì)多個(gè)待測(cè)物進(jìn)行分析，因 而效率差。本發(fā)明是為了解決這些問(wèn)題而完成的，其目的在于提供一種同時(shí)且簡(jiǎn)便、迅速地對(duì)少量多個(gè)待測(cè)物的試樣中所含的GABA進(jìn)行定量的方法，該方法無(wú)需使用氨基酸分析計(jì) 或HPLC等昂貴設(shè)備，而且，不會(huì)受到待測(cè)物中所含的各種氨基酸等的影響。GABAse是存在于微生物、西紅柿等多種生物中的酶復(fù)合體，兼具GABA轉(zhuǎn)氨酶活性 及琥珀酸脫氫酶活性。發(fā)明人等著眼于利用該酶由GABA生成琥珀酸半醛和將所生成的琥 珀酸半醛氧化時(shí)作為輔酶的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸定量地轉(zhuǎn)變成還原型，由所 生成的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸偶聯(lián)介由給電子體的水溶性腙的生成。其結(jié)果 是，從GABA向琥珀酸的轉(zhuǎn)變和水溶性腙的生成偶聯(lián)進(jìn)行，從而能夠通過(guò)比色法進(jìn)行GABA的 定量。進(jìn)而，通過(guò)利用比色法，能夠使用比較廉價(jià)的酶標(biāo)儀(Microplate Reader)，并且成功 縮小了反應(yīng)體系，從而完成了本發(fā)明。用于解決問(wèn)題的方案即，本發(fā)明為一種對(duì)飲食品那樣含有各種氨基酸的試樣中的氨基丁酸進(jìn)行定 量的方法，其特征在于，其包括以下工序(1)使試樣、氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和要求氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸作為輔酶 的脫氫酶反應(yīng)，生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸后使酶失活的工序；(2)在生成水溶性甲臜染料的四唑鹽的存在下，使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸與電子載體反應(yīng)，從而生成水溶性甲臜染料的工序；(3)測(cè)定水溶性甲臜的工序。發(fā)明的效果本發(fā)明通過(guò)對(duì)GABA作用特異性的轉(zhuǎn)氨酶以及對(duì)其產(chǎn)物作用特異性的要求NADP作 為輔酶的脫氫酶，生成NADPH，接著，在水溶性四唑鹽的存在下使電子載體作用于NADPH，測(cè) 定所生成的水溶性甲臜染料，從而能夠簡(jiǎn)便地對(duì)GABA進(jìn)行定量，因此具有以下的效果。根據(jù)本發(fā)明方法，由于不需要氨基酸分析計(jì)、HPLC等昂貴設(shè)備，因而比較經(jīng)濟(jì)，而 且不會(huì)受到待測(cè)物中所含的各種氨基酸等的影響，能夠同時(shí)且簡(jiǎn)便、迅速地對(duì)少量多個(gè)待 測(cè)物的試樣中所含的GABA進(jìn)行定量。根據(jù)本發(fā)明方法，由于能夠同時(shí)且迅速地對(duì)大米等食品中所含的GABA進(jìn)行定量， 因此能夠測(cè)定生理功能備受矚目且在各種食品中添加的GABA在食品中的含量，能夠保證 這些制品中所含的GABA含量。進(jìn)而，即使在利用大米內(nèi)在的代謝酶組生成GABA并利用該特性強(qiáng)化了 GABA的發(fā) 芽糙米制品中，也能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行GABA含量的表示，能夠利用于由于糙米的發(fā)芽處理的 失敗而產(chǎn)生的GABA含量少的制品的檢查。此外，通過(guò)本發(fā)明，能夠容易地檢定利用發(fā)芽處 理產(chǎn)生的GABA含量的品種間差異，因而有利于適合發(fā)芽糙米的品種的篩選等。


圖1是GABA定量的原理說(shuō)明圖。圖2是使用了 GABA標(biāo)準(zhǔn)試樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。圖3是采用Dabsyl衍生化HPLC法的定量和利用本發(fā)明進(jìn)行定量的比較線(xiàn)圖。圖4是泰國(guó)的各個(gè)品種的GABA生成能力的研究圖。
具體實(shí)施例方式以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)用于實(shí)施本發(fā)明的最優(yōu)的方式進(jìn)行說(shuō)明。另外，當(dāng)然，本發(fā)明 并不限定于這些實(shí)施例。本發(fā)明的GABA的定量方法包括以下工序?yàn)榱伺懦鞣N氨基酸、特別是結(jié)構(gòu)與 GABA類(lèi)似的谷氨酸等氨基酸，而使用特異性轉(zhuǎn)氨酶、及要求氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸(以下稱(chēng)作NADP。)作為輔酶的脫氫酶(以下也稱(chēng)作NADP要求性脫氫酶。)，生成還 原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下稱(chēng)作NADPH。)后使酶失活的工序；在生成水溶性甲 臜染料的四唑鹽的存在下，使電子載體作用于所生成的NADPH，并測(cè)定所生成的水溶性甲臜 染料的工序。這里，各種氨基酸是指前述的谷氨酸以及具有與GABA類(lèi)似結(jié)構(gòu)的氨基酸，例如谷 氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸。轉(zhuǎn)氨酶可列舉出GABA轉(zhuǎn)氨酶(以下稱(chēng)作GABA-T。)，NADP要求性脫氫酶可列舉出 琥珀酸半醛脫氫酶(以下稱(chēng)作SSADH。)。電子載體可列舉出人工電子載體，例如吩嗪硫酸甲酯(以下稱(chēng)作PMS。)、1_甲氧 基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯鹽(以下稱(chēng)作1-MeO-PMS。)、吩嗪硫酸乙酯(以下稱(chēng)作PES。)。生成水溶性甲臜染料的四唑鹽可列舉出例如2_(2_甲氧基-4-硝基苯 基)-3-(4_硝基苯基)-2H-四唑鈉鹽(以下稱(chēng)作WST-8。)。圖1中示出了本發(fā)明的原理。本發(fā)明是對(duì)飲食品那樣含有各種氨基酸的試樣中 的氨基丁酸進(jìn)行定量的方法，其包括以下工序第一工序，通過(guò)氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和 NADP要求性脫氫酶的二酶體系，生成對(duì)、-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶特異性的NADPH后使酶失活； 第二工序，用第一工序中生成的NADPH將四唑鹽還原而生成水溶性甲臜染料，并測(cè)定水溶 性甲臜的顏色。即，包括以下工序通過(guò)GABA-T及SSADH將NADP轉(zhuǎn)變成NADPH后，使酶失 活的第一工序；在生成水溶性甲臜染料的四唑鹽的存在下，由NADPH介由電子載體而生成 水溶性甲臜，測(cè)定由該甲臜產(chǎn)生的顏色(黃色)的第二工序。第一工序中，如果不使酶失活就添加生成水溶性甲臜染料的四唑鹽和電子載體， 則同時(shí)進(jìn)行酶催化的非特異性四唑鹽的還原反應(yīng)，無(wú)法準(zhǔn)確地測(cè)定GABA。此外，使用生成水不溶性的甲臜染料的四唑鹽的情況下，還原而生成的甲臜染料 發(fā)生沉淀，因此難以準(zhǔn)確地測(cè)定。酶的失活例如通過(guò)將反應(yīng)溶液調(diào)成酸性來(lái)實(shí)現(xiàn)。更具體而言，添加鹽酸、硫酸等 酸，使PH為2以下。以下，示出若干實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明。實(shí)施例1以下示出了調(diào)查氨基酸對(duì)本發(fā)明的GABA的定量造成的影響的例子。調(diào)制含有GABAse、NADP的以下那樣的試劑1、作為反應(yīng)終止液的試劑2及含有 1-MeO-PMS、WST-8 的試劑 3。試劑1100mM Tris 緩沖液(pH8. 9)10mM a -酮戊二酸2mM 2_巰基乙醇
0. 5mM NADP0. 25U/mL GABAse (來(lái)源于 Pseudomonas fluorescens)試劑21M 硫酸試劑31-Me0-PMS、WST_8 混合試劑(和光純制藥 Cell Counting Kit_8)使用這些試劑，通過(guò)以下的步驟測(cè)定GABA濃度。S卩，使用GABA的濃度調(diào)節(jié) 至 0. lppm、0. 5ppm、lppm、5ppm、10ppm、20ppm、50ppm、100ppm 的水溶液作為試樣，向試樣 100 u L中加入90 y L的試劑1，然后將其在30°C下加熱15分鐘，接著，混合10 y L的試劑 2，進(jìn)而加入5ii L的試劑3，通過(guò)酶標(biāo)儀(Tekan公司制Sapphire)根據(jù)終點(diǎn)法(end point method)測(cè)定波長(zhǎng)470nm下的吸光度。此外，對(duì)試樣中添加了 lOOpprn谷氨酸、絲氨酸、甘 氨酸、組氨酸的試樣也進(jìn)行了測(cè)定。如圖2所示，GABA在至50ppm為止的區(qū)間相關(guān)系數(shù)為 0. 999，顯示出較高的線(xiàn)性，能夠進(jìn)行定量測(cè)定。此外可知，也沒(méi)有受到谷氨酸、絲氨酸、甘氨 酸、組氨酸等其他氨基酸的影響。實(shí)施例2對(duì)食品中的GABA進(jìn)行定量。通過(guò)Dabsyl衍生物化-HPLC法對(duì)各種精白米、糙米、發(fā)芽糙米的水提取物中的 GABA含量進(jìn)行測(cè)定并比較，結(jié)果如圖3所示，得到0. 999的非常高的相關(guān)系數(shù)。由此可知， 能夠通過(guò)精度與HPLC法同等的比色分析進(jìn)行定量。實(shí)施例3對(duì)發(fā)芽糙米中的GABA進(jìn)行定量。將精白米、糙米浸漬到水中，對(duì)發(fā)芽的情況下的GABA進(jìn)行定量。對(duì)泰國(guó)產(chǎn)的各種 糙米試樣進(jìn)行水浸漬處理，通過(guò)實(shí)施例1所示的方法測(cè)定處理前后的GABA含量，結(jié)果在低溫 干燥米和日曬干燥米中確認(rèn)到GABA含量的增加。另一方面，在泰國(guó)經(jīng)雨期廣泛應(yīng)用的高溫干 燥處理的大米中，GABA生成酶失活，如圖4所示未出現(xiàn)GABA的增加，確認(rèn)了本法的可靠性。實(shí)施例4對(duì)巧克力中的GABA進(jìn)行定量。通過(guò)本法及HPLC法對(duì)市售巧克力中所含的GABA進(jìn)行定量。用熱水對(duì)添加有GABA 的巧克力及通常的巧克力進(jìn)行提取，通過(guò)實(shí)施例1所示的方法測(cè)定GABA含量。在添加有 GABA的巧克力中定量出2895士84ppm的GABA，在同一條件下，從通常的巧克力中未檢測(cè)到 GABA。在HPLC法中，在添加有GABA的巧克力中定量出2965士54ppm的GABA，在通常的巧克 力中未檢測(cè)到GABA。由這些結(jié)果可確認(rèn)，本發(fā)明的方法對(duì)于添加有GABA的食品中的GABA 含量的保證也是有效的。實(shí)施例5對(duì)清涼飲料中的GABA進(jìn)行定量。與實(shí)施例1同樣地對(duì)市售清涼飲料水中所含的GABA進(jìn)行定量。測(cè)定添加有GABA 的清涼飲料及添加有氨基酸的清涼飲料中的GABA含量，結(jié)果在添加有GABA的清涼飲料中 定量出9842士95ppm的GABA，在同一條件下，在不含GABA的添加有氨基酸的清涼飲料中未 檢測(cè)到GABA。由這些結(jié)果可確認(rèn)，本發(fā)明的方法對(duì)于添加有GABA的清涼飲料中的GABA含量的保證是有效的。由這些結(jié)果可確認(rèn)，通過(guò)本發(fā)明的方法，能夠保證廣泛的食品中的GABA含量。比較例對(duì)代替水溶性甲臜WST-8而使用非水溶性甲臜即MTT的方法進(jìn)行比較。在各種精白米、糙米、發(fā)芽糙米的水提取物中，使用MTT(3-(4，5_ 二甲基-2-噻唑 基)-2，5- 二苯基-2H-四唑溴化物)時(shí)，即使低濃度下反應(yīng)產(chǎn)物也發(fā)生沉淀，沉積在微孔板 表面，因而無(wú)法進(jìn)行分析。認(rèn)為這是由于食品的水提取物中所含的蛋白質(zhì)等和MTT甲臜共 沉淀而導(dǎo)致的。進(jìn)而，對(duì)含有GABA的巧克力水提取物中的GABA進(jìn)行分析時(shí)，提取物中所含 的有色物質(zhì)所產(chǎn)生的可見(jiàn)光部的吸收妨礙了分析。另一方面，適用水溶性甲臜的情況下，沒(méi)有溶解性的問(wèn)題，通過(guò)增加甲臜濃度，能 夠解決問(wèn)題。首先，基本上提供一種簡(jiǎn)便地對(duì)GABA進(jìn)行定量的方法，其特征在于，其包括以下 工序第一工序，為了排除結(jié)構(gòu)與GABA類(lèi)似的谷氨酸等氨基酸，使用特異性轉(zhuǎn)氨酶、及要求 氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下稱(chēng)作NADP。)作為輔酶的脫氫酶，生成還原型煙 酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下稱(chēng)作NADPH。)；和第二工序，在四唑鹽的存在下，使電子載 體作用于所生成的NADPH，測(cè)定所生成的水溶性甲臜染料。詳細(xì)而言，一種簡(jiǎn)便地對(duì)GABA進(jìn)行定量的方法，其特征在于，其包括以下工序第 一工序，為了排除結(jié)構(gòu)與GABA類(lèi)似的谷氨酸等氨基酸，使用特異性轉(zhuǎn)氨酶、及要求氧化型 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下稱(chēng)作NADP。)作為輔酶的脫氫酶，生成還原型煙酰胺腺 嘌呤二核苷酸磷酸(以下稱(chēng)作NADPH。)后，添加硫酸；和第二工序，在四唑鹽的存在下使電 子載體作用于所生成的NADPH，測(cè)定所生成的水溶性甲臜染料。更詳細(xì)而言，一種飲食品中的氨基丁酸的定量方法，其特征在于，該方法對(duì)飲食品中的氨基丁酸進(jìn)行定量，其包括以下工序(1)使食品的水提取液或飲料、氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶、和要求氧化型煙酰胺腺嘌呤 二核苷酸作為輔酶的脫氫酶反應(yīng)，生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸后，添加硫酸的 工序；(2)在生成水溶性甲臜染料的四唑鹽的存在下，使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸與電子載體反應(yīng)，從而生成水溶性甲臜染料的工序；(3)測(cè)定水溶性甲臜的工序。這里，四唑鹽為2_(2_甲氧基-4-硝基苯 基)-3- (4-硝基苯基)-2H-四唑鈉鹽。另外，由前述的本發(fā)明的原理可知，本發(fā)明的對(duì)氨基丁酸進(jìn)行定量的方法并 不限定于實(shí)施例所示的飲食品中的氨基丁酸的定量，也適用于含有結(jié)構(gòu)與GABA類(lèi)似的 谷氨酸等氨基酸的測(cè)定試樣、例如生物待測(cè)物試樣。
權(quán)利要求
1.一種Y-氨基丁酸的定量方法，其特征在于，該方法對(duì)含有氨基酸的試樣中的Y-氨 基丁酸進(jìn)行定量，其包括以下工序(1)使試樣、Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和要求氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸作為輔酶的脫 氫酶反應(yīng)而生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸后使酶失活的工序；(2)在生成水溶性甲臜染料的四唑鹽的存在下，使還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 與電子載體反應(yīng)而生成水溶性甲臜染料的工序；(3)測(cè)定所生成的水溶性甲臜染料的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Y-氨基丁酸的定量方法，所述四唑鹽為2-(2_甲氧基-4-硝 基苯基)-3- (4-硝基苯基)-2H-四唑鈉鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Y-氨基丁酸的定量方法，所述要求氧化型煙酰胺腺嘌呤二 核苷酸作為輔酶的脫氫酶為琥珀酸半醛脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Y-氨基丁酸的定量方法，所述電子載體選自吩嗪硫酸甲酯、 1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯鹽及吩嗪硫酸乙酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Y-氨基丁酸的定量方法，所述水溶性甲臜的測(cè)定為波長(zhǎng) 470nm下的吸光度的測(cè)定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Y-氨基丁酸的定量方法，所述酶的失活是添加硫酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的Y-氨基丁酸的定量方法，所述試樣含有谷氨 酸、絲氨酸、甘氨酸或組氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的Y-氨基丁酸的定量方法，所述試樣為飲食品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種γ-氨基丁酸的定量方法，其包括以下工序?yàn)榱伺懦Y(jié)構(gòu)與GABA類(lèi)似的谷氨酸等氨基酸，使用特異性轉(zhuǎn)氨酶、及要求氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作為輔酶的脫氫酶，生成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸后使酶失活的工序；在生成水溶性甲臜染料的四唑鹽的存在下使電子載體作用于所生成的NADPH，測(cè)定所生成的水溶性甲臜染料的工序。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK102007219SQ200980113228
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日
發(fā)明者吉橋忠, 帕查利·湯托蘭庫(kù), 瓦盧尼·巴拉尼亞儂, 維帕·斯洛加納莫塔庫(kù) 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心