專利名稱：新鑒定的人類鼻病毒hrv-c和檢測(cè)hrv-c的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及鑒定和檢測(cè)人類鼻病毒.更具體地，本發(fā)明涉及表征人類鼻病 毒遺傳群C(HRV-C)的新毒株以及用于(例如通過PCR擴(kuò)增)檢測(cè)HRV-C的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
人類鼻病毒(HRV)是普通感冒的主要原因。盡管大部分HRV感染僅引起輕微疾病， 但鼻病毒也可引起下呼吸道感染，這可在兒童、老年人以及免疫抑制患者中導(dǎo)致嚴(yán)重疾病。 人類鼻病毒在全球的總體患病率及其造成的經(jīng)濟(jì)損失是相當(dāng)可觀的。鼻病毒是小RNA無包膜病毒，屬于細(xì)小RNA病毒科(picornaviridae)。迄今為 止，在世界衛(wèi)生組織(WHO)所資助的協(xié)作項(xiàng)目中，已經(jīng)通過特異性抗血清鑒定了超過100種 鼻病毒血清型。根據(jù)鼻病毒的細(xì)胞受體使用情況，將鼻病毒分為主要群(90%)和次要群 (10% )0另一種分離方法基于對(duì)抗病毒化合物的敏感性并結(jié)合序列相似性和致病性，將病 毒分為A群和8群[1]。近年來，一些研究者鑒定到了一些新的鼻病毒，它們無法被分類為傳統(tǒng)的A群或 B群。McErlean等[2]篩查了 1244份鼻咽吸出物，樣品收集自2003年內(nèi)由Queensland醫(yī) 院或全科醫(yī)師介紹的患者，年齡在1天到80歲，均具有急性呼吸道癥狀。在所篩查的這些 樣品中，17份鑒定出存在新的鼻病毒，作者將該新的鼻病毒命名為HRV-QPM，后者被分類 為HRV-A2。HRV-QPM的全基因組比所有其他已知的HRV要短，使用人類細(xì)胞系HeLa-Ohio、 A549、MRC-5和WI38均未能成功分離到該毒株。Kistler等[3]使用virochip測(cè)試了來自 2001年秋天至2004年12月內(nèi)患有感冒癥狀的成年人的樣品。他們發(fā)現(xiàn)了 5種趨異的HRV， 稱為HRV‘X’，與HRV-B參照血清型相比，它們與HRV-A具有更高的序列相似性。這些趨異的 HRV ‘X’分離株無法被培養(yǎng)。Lee等M使用Respiratory Multicode Assay分析了來自嬰 兒的鼻灌洗物。他們發(fā)現(xiàn)了 5種不同毒株，并認(rèn)為它們代表一種新的HRV遺傳群(HRV-C)。 在用于檢測(cè)和分離HRV的標(biāo)準(zhǔn)WI-38或MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)物中，含有這些新HRV毒株的樣品無 一產(chǎn)生了細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)。Lau等[5]使用RT-PCR方法篩查了一年間(2004年11月至 2005年10月)收集自住院兒童的200份鼻咽吸出物(NPA)。他們發(fā)現(xiàn)了 21份陽性HRV，其 屬于一種不同的遺傳群，即進(jìn)化枝C，與已知的HRV-A毒株的核苷酸相同性<63%，與已知 的HRV-B毒株的核苷酸相同性< 61%。Renwick等M使用MassTag PCR研究了 2003-2006 年間來自兒童醫(yī)院的97份鼻咽吸出物。他們發(fā)現(xiàn)了與已知的HRVA、HRVB或人類腸道病毒 (HEV)序列不相匹配的30種HRV序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了新的HRV-C鼻病毒毒株，稱為BCH019，其被認(rèn)為與嚴(yán)重呼吸道 疾病相關(guān)。圖1和SEQ ID NO 1給出了 BCH019的基因組序列。BCH019的基因組的結(jié)構(gòu)顯 示于圖2。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的HRV-C鼻病毒，其具有RNA基因組，所述基因 組包含選自如下一組中的多核苷酸序列
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(i)SEQ ID NO :1 所代表的序列，(ii)與SEQ ID NO :1具有至少75%相同性、優(yōu)選地至少80%、85%、90%或95% 相同性的序列，和(iii)⑴或(ii)所代表的序列的互補(bǔ)序列。此外，其基因組還包含至少一個(gè)編碼多蛋白的讀框，所述多蛋白的序列由SEQ ID NO 20代表。本發(fā)明還涉及所述病毒的核酸序列以及上述多核苷酸或其片段在設(shè)計(jì)用于檢測(cè) 樣品中的HRV-C鼻病毒的引物或探針中的用途。本發(fā)明還涉及核酸片段，所述核酸片段包含至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、優(yōu)選地至少 100、150或200個(gè)連續(xù)核苷酸或由所述至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、優(yōu)選地至少100、150或 200個(gè)連續(xù)核苷酸組成，所述連續(xù)核苷酸來自從SEQ ID NO :1的第627位核苷酸開始至 第7064位核苷酸結(jié)束的核苷酸序列或來自與從SEQ ID NO 1的第627位核苷酸開始至第 7064位核苷酸結(jié)束的核苷酸序列具有至少85%相同性、優(yōu)選地至少90或95%相同性的 核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列；本發(fā)明特別涉及以下序列中的片段SEQ ID N0:21(VP4nt 627-827 (含))、SEQ ID NO :22(VP2nt 828-1613 (含))和 SEQ ID NO :23 (PCR 產(chǎn)物 nt 556-886 (含))以及分別與其具有至少85%相同性、優(yōu)選地至少90或95%相同性的變體或 它們的互補(bǔ)序列。在另一方面，本發(fā)明提供用于通過PCR擴(kuò)增來擴(kuò)增樣品中的HRV-C毒株的引物對(duì)， 其中至少一個(gè)引物包含由位于從SEQ ID NO 1的大約第556位核苷酸至大約第886位核 苷酸的區(qū)域內(nèi)的18至30個(gè)連續(xù)核苷酸、特別是18至25個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述引物對(duì)包含SEQ ID NO :6所示的正向引物556F和SEQ ID NO 7 所示的反向引物886R。在另一方面，本發(fā)明提供用于PCR擴(kuò)增樣品中的HRV-C毒株的試劑盒，其包含至少 一種本發(fā)明的上述引物對(duì)。在另一方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括(a)從所述樣品中提取核酸，(b)擴(kuò)增所提取的核酸，和(c)確定一或多種核酸序列的存在，其中所述擴(kuò)增步驟例如通過使用至少一種本 發(fā)明的上述引物對(duì)通過RT-PCR進(jìn)行。也可采用其他技術(shù)來擴(kuò)增樣品中的靶核酸，例如，NASBA和TMA技術(shù)。樣品選自人類的口腔和鼻腔樣品(獲自鼻灌洗物、鼻咽吸出物、支氣管灌洗液、痰 液、口腔和鼻腔拭子)和病毒培養(yǎng)上清液。SEQ ID No :1、21、22和23列出的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于通過對(duì)基因組RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄而獲得的cDNA。在其他方面，本發(fā)明涉及(a)分離的以下蛋白質(zhì)-由選自如下一組的多核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)(i)SEQID N0:1所代表的序 列，(ii)與SEQ ID NO 1具有至少75%相同性的序列，和(iii)⑴或(ii)所定義的序列 的互補(bǔ)序列；或
-由多核苷酸的核酸片段編碼的蛋白質(zhì)，所述多核苷酸的核苷酸序列如以上(i)、 (ii)或(iii)定義；或-包含SEQID NO 20所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)或由SEQ ID NO 20所示氨基酸序 列組成的蛋白質(zhì)；(b)多肽，其氨基酸序列包含(a)中所述蛋白質(zhì)的至少15個(gè)連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選 地至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸、有利地至少30個(gè)連續(xù)的氨基酸，或由(a)中所述蛋白質(zhì)的至少 15個(gè)連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸、有利地至少30個(gè)連續(xù)的氨基酸組成；(c)對(duì)(a)或(b)中所定義的蛋白質(zhì)的表位具有特異性的抗體；(d)檢測(cè)樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括將樣品與上述(a)中所定義的蛋 白質(zhì)或與上述(b)中所定義的多肽相接觸，并檢測(cè)所述蛋白質(zhì)或多肽與抗HRV-C抗體之間 形成的免疫復(fù)合物的存在，例如通過免疫酶學(xué)方法，包括比色法、熒光法、發(fā)光法或電化學(xué) 檢測(cè)，例如蛋白印跡、夾心免疫測(cè)定法和競(jìng)爭(zhēng)技術(shù)；樣品優(yōu)選地是選自血液、血漿和血清的 人類樣品；(e)檢測(cè)樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括將樣品與至少一種對(duì)該毒株的 HRV-C蛋白的表位具有特異性的抗HRV-C抗體相接觸，并檢測(cè)抗體/HRV-C蛋白免疫復(fù)合 物的存在，例如通過免疫酶學(xué)方法，包括比色法、熒光法、發(fā)光法或電化學(xué)檢測(cè)，例如蛋白印 跡、夾心免疫測(cè)定法和競(jìng)爭(zhēng)技術(shù)；樣品優(yōu)選地選自人類口腔和鼻腔樣品(獲自鼻灌洗物、鼻 咽吸出物、支氣管灌洗液、痰液、口腔和鼻腔拭子)和病毒培養(yǎng)上清液；(f)診斷HRV-C毒株的試劑盒，特征在于其包含上述(a)或(b)中定義的至少一種 蛋白質(zhì)或至少一種多肽；(g)診斷HRV-C毒株的試劑盒，特征在于其包含上述(c)中定義的至少一種抗體?？赏ㄟ^重組技術(shù)或化學(xué)合成法產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽。抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體或它們的片段，例如Fab、Fab\ Fab' 2、scFv、Fv0根據(jù)以下附圖和具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述，顯然可以明了本發(fā)明的這些以及其他 方面、優(yōu)勢(shì)和特征。


圖1給出了 BCH019的基因組序列。圖2顯示了 BCH019的基因組結(jié)構(gòu)(A部分)和通過隨機(jī)PCR最初獲得的3個(gè)不同 克隆的位置(B部分)。圖3顯示了 HRV系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果基于所有已知的HRV和一些HEV的全長(zhǎng)核 苷酸序列構(gòu)建的自舉鄰位相連樹(bootstrapped neighbor-joining tree)。圖4顯示了使用靶向BCH019的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的引物獲得的PCR產(chǎn)物。在瓊脂糖 凝膠上分離PCR產(chǎn)物。發(fā)明詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了一種新的鼻病毒毒株，稱為BCH019，認(rèn)為其與嚴(yán)重的呼吸道疾 病相關(guān)聯(lián)。BCHO19的全基因組序列顯示于圖1和SEQ ID NO :1?；蚪M表征顯示BCH019的
6全長(zhǎng)基因組具有7121nt，包括5，-UTR(626nt)、多蛋白編碼序列(6438nt)、3，-UTR(38nt) 和polyA尾(圖2)。BCH019中的多蛋白前體的編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與所有已知的HRV相同，其具有 高度保守的翻譯起始位點(diǎn)(編碼MGAQVS)和對(duì)應(yīng)于殼體基因VP4、VP2、VP3、VPl和非結(jié)構(gòu) 基因 2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D 的區(qū)域。使用軟件MEGA 4進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析后，構(gòu)建了基于所有已知HRV和一些HEV的 全長(zhǎng)核苷酸序列的自舉鄰位相連樹，其顯示BCH019是一種不同的鼻病毒，其屬于C群HRV 而非A群或B群(圖3)。VPl是形成殼體的峽部(canyon)和藥物結(jié)合袋(drug-binding pocket)的主要蛋白。峽部是受體結(jié)合位點(diǎn)。VP4基因是HRV的所有結(jié)構(gòu)蛋白中最為保守 的區(qū)域。BCH019是在一位臨床診斷為支氣管肺炎的患者(樣品編號(hào)BCH019)的鼻咽吸出物 樣品中檢測(cè)到的唯一微生物，這一點(diǎn)提示BCH019與該患者發(fā)生的急性下呼吸道感染癥狀 之間存在密切關(guān)聯(lián)。在另一方面，本發(fā)明提供用于通過PCR擴(kuò)增來特異性擴(kuò)增樣品中的HRV-C毒株的 引物、試劑盒和方法。本發(fā)明的引物被設(shè)計(jì)為靶向BCH019的VP4基因周圍的區(qū)域。在本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的至少一個(gè)引物包含相應(yīng)于從BCH019基因組序列VP4基因5’ 上游約70bp至3’下游約60bp的區(qū)域內(nèi)的18-25個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，即從SEQ ID NO 1的約第556位核苷酸至約第886位核苷酸。在另一實(shí)施方式中，要通過本發(fā)明的引物 對(duì)擴(kuò)增的區(qū)域包括VP4基因5’上游約70bp(5’ UTR的3’ -末端區(qū)域，其在所有鼻病毒中 是保守的)、整個(gè)VP4基因和VP4基因3’下游約60bp的區(qū)域(VP2基因的5’ -末端區(qū)域， 其僅在HRV-C中是保守的)。在這一實(shí)施方式中，根據(jù)該5’ UTR的3’ -末端區(qū)域(其在所 有鼻病毒中是保守的)的序列設(shè)計(jì)正向引物，同時(shí)根據(jù)VP2基因的5’ -末端區(qū)域(其僅在 HRV-C中是保守的)的序列設(shè)計(jì)反向引物。本領(lǐng)域人員熟知如何設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增特定核苷酸序列的引物。用于輔助設(shè)計(jì)引物的 軟件是本領(lǐng)域已知的，例如Vector NTI Advance 10 (Invitrogen)。設(shè)計(jì)引物需要考慮的因 素包括長(zhǎng)度、Tm、防止形成二級(jí)結(jié)構(gòu)等等，這也是本領(lǐng)域人員已知的。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，正向引物是556F(5’-ACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT C-3，，SEQ ID NO :6)，反向引物是886R(5，-TTTCCRATAGTGATTTGCTTKAGCC-3，，SEQ ID NO :7)。 該引物對(duì)所覆蓋的區(qū)域?yàn)閺腂CH019基因組的VP4基因5’ -上游70bp至VP4基因3’ -下 游59bp，即從SEQ ID NO 1的556位核苷酸至886位核苷酸。如實(shí)施例所示，使用了引物對(duì)556F和886R來篩查臨床樣品，結(jié)果顯示，所篩查的 一些樣品也含有屬于HRV進(jìn)化枝C的鼻病毒。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于通過PCR擴(kuò)增來擴(kuò)增樣品中的HRV-C 毒株的引物對(duì)，其中所述引物對(duì)包含SEQ ID NO :6所示的正向引物556F和SEQ ID N0:7所 示的反向引物886R。 本發(fā)明還包括用于擴(kuò)增樣品中的HRV-C毒株的試劑盒，其包含至少一個(gè)本發(fā)明的 上述引物對(duì)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)來自哺乳動(dòng)物的樣品中的HRV-C毒株的 方法，其步驟包括(a)從所述樣品中提取核酸，
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(b)擴(kuò)增所提取的核酸，和(c)確定HRV-C特異性核酸序列的存在，其中所述擴(kuò)增步驟例如通過使用本發(fā)明的至少一個(gè)引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增而進(jìn) 行?？筛鶕?jù)本發(fā)明進(jìn)行測(cè)試的樣品可以是鼻灌洗物、鼻咽吸出物、支氣管灌洗液或痰 液。采用本發(fā)明的方法，可以進(jìn)一步澄清并表征普通感冒的致病因素是否是HRV-C，且 因此可根據(jù)具體的致病因素對(duì)患有普通感冒的患者進(jìn)行治療，這將使患者因此而獲益。
實(shí)施例實(shí)施例1 鑒定新的C群人類鼻病毒，稱為BCHO19病例介紹該新的鼻病毒毒株是從來自一名診斷為支氣管肺炎的2個(gè)月男性嬰兒的鼻咽吸 出物樣品(樣品編號(hào)BCH019)中鑒定到的。該患者針對(duì)抗CMV、EBV、HSV和CoX的IgM的檢 測(cè)均為陰性。對(duì)該鼻咽吸出物樣品進(jìn)行了排除性測(cè)試，結(jié)果顯示對(duì)已知的呼吸道病毒(包 括人副流感病毒1-4、流感病毒、呼吸道合胞病毒、人類腸道病毒、人類鼻病毒、人冠狀病毒 229E、NL63、HKU1和0C43、人變性肺病毒、人腺病毒和博卡病毒)均為陰性。痰液培養(yǎng)中僅 發(fā)現(xiàn)正常菌群。從該患者的鼻咽吸出物樣品中提取核酸并通過隨機(jī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增以便尋找 未知的致病微生物。隨機(jī)PCR隨機(jī)PCR可用于檢測(cè)DNA和RNA病毒基因組[7]。已經(jīng)使用隨機(jī)PCR鑒定了 3種不 同的病毒人博卡病毒[8]、人KI多瘤病毒[9]和人WU多瘤病毒[1°]。隨機(jī)PCR的第一個(gè)擴(kuò)增 步驟使用第一隨機(jī)引物，其具有5’端獨(dú)特核苷酸通用序列，含有用于后續(xù)克隆的限制性酶 切位點(diǎn)，隨后是位于3’端的簡(jiǎn)并6聚體或7聚體序列。第一擴(kuò)增步驟后，使用與第一隨機(jī) 因?yàn)榈?’通用區(qū)域互補(bǔ)的特異性第二引物進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增。從北京兒童醫(yī)院2007年4月的住院兒童獲得鼻咽吸出物。為了檢測(cè)那些普通致 病微生物呈陰性的呼吸道樣品，采用了以往描述的隨機(jī)PCR方法[8’11]并進(jìn)行了一些改進(jìn)。 簡(jiǎn)言之，將樣品在Sigma 3k30臺(tái)式離心機(jī)上3000rpm離心10分鐘以去除細(xì)胞碎片。通過 0. 2 μ m Super Membrane ( Acrodisc 25mm Syringe Filter, Pall)過濾 200 μ 1 無細(xì)胞 上清液。加入20 μ 1的無RNase的DNase I (Promega)，經(jīng)樣品在37°C溫浴60分鐘。使用 NucliSens基本試劑盒提取模塊(bi0M6rieux)提取核酸。將10 μ 1的核酸與0. 4 μ 1的通 用引物 FR26RV-N(5' -GCCGGAGCTCTGCAGATATCNNNNNN-3，，SEQ ID NO 2) (50 μ M)禾口 1. 7 μ 1 無菌去離子水混合。將樣品在65°C溫浴5分鐘，然后置于冰上冷卻。加入7. 9 μ 1反應(yīng)試劑 混合物，其含有4μ 1 的 5Χ 第一鏈緩沖液(Invitrogen)、2 μ 1 的 IOOmM DTT(Invitrogen)、 1 μ 1的含濃度為IOmM的各種dNTP的溶液(Invitrogen)、8單位(0. 4 μ 1)的重組RNase抑 制劑(Ambion)和 100 單位(0. 5 μ 1)的 SuperScript II 反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)。將反應(yīng) 混合物在25°C溫浴10分鐘，然后42°C溫浴50分鐘。在94°C變性3分鐘并在冰上冷卻，之 后加入 2. 5 單位(0. 5μ 1)的 3，-5，exo-Klenow DNA 聚合酶(New England Biolabs)，并將 反應(yīng)混合物在37°C溫浴1小時(shí)，隨后在75°C進(jìn)行酶滅活步驟10分鐘。使用5 μ 1的各反應(yīng)混合物作為后續(xù)PCR的模板。50 μ 1的反應(yīng)混合物含有5 μ 1 10 XExTaq緩沖液(Mg2+plus) (TaKaRa)、0. 2mM 的各種 dNTP (TaKaRa)、40pmol 特異性引物 FR20RV(5，_GCCGGAGCTCTGCAGAT ATC-3，，SEQ ID NO 3)(特異于通用引物 FR26RV-N)、和 2· 5 單位的 ExTaq (TaKaRa)。94°C 10 分鐘后，使用GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem)進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增 (940C 1 分鐘，65 °C 1 分鐘，72 °C 2 分鐘)。PCR產(chǎn)物的克降和測(cè)序使用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)純化如上獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。在 瓊脂糖凝膠上分離產(chǎn)物，切取長(zhǎng)度在 500和2000bp之間的片段并用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)提取。純化的 PCR 產(chǎn)物被連接至 pMD18_T 載體(TaKaRa) 并導(dǎo)入化學(xué)感受態(tài)的大腸桿菌(E. colDDHlOBdnvitrogen)。細(xì)菌培養(yǎng)在氨芐青霉 素-X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)瓊脂板中，進(jìn)行藍(lán)白篩選。挑取白色集 落并在Iml的Luria-Bertani肉湯加氨芐青霉素中培養(yǎng)2小時(shí)。為了隨后PCR擴(kuò)增克隆的插入物，將1μ 1細(xì)菌懸液加入至PCR混合物中，該混 合物含有 0. 2 μ M 的 PMD18-T 載體引物 M13fwd(5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，，SEQ ID NO :4)和 M13rev(5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，，SEQ ID NO :5)、2mM 各種 dNTP、 2 μ IlOXExTaq緩沖液和1. 25U的Taq DNA聚合酶，總反應(yīng)體積為20 μ 1。如下進(jìn)行循環(huán) 1個(gè)循環(huán)的94°C 3分鐘，隨后30個(gè)循環(huán)的94°C變性30s，55°C退火30s，并在72°C延伸1分 鐘。為了避免對(duì)相同克隆的PCR產(chǎn)物或引物二聚體進(jìn)行重復(fù)測(cè)序，僅將大于250bp且 大小不同的PCR產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。從樣品編號(hào)為BCH019的患者(其對(duì)所檢測(cè)的所有熟知的呼吸道病毒和細(xì)菌均為 陰性)的樣品中獲得了 185個(gè)隨機(jī)PCR克隆，發(fā)現(xiàn)其中有6個(gè)呈鼻病毒陽性，它們代表鼻病 毒基因組的3個(gè)不同片段。然后使用3個(gè)原始的不同克隆的序列設(shè)計(jì)新的PCR引物，以便逐 步連接缺口。使用1 μ 1提取自BCH019的核酸作為模板進(jìn)行一步式RT PCR0 20 μ 1反應(yīng)混 合物含有10μ1 2 X Reaction Mix (Invitrogen)，1 μ 1 Superscript IIIRT/'platinum Taq Mix(Invitrogen)，20pmol各種引物。在48°C溫育45分鐘，94°C 3分鐘之后，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。在瓊脂糖凝膠上觀察產(chǎn)物，提取產(chǎn)物，然后連接到PMD18-T載體。轉(zhuǎn)化至感 受態(tài)DH10B并培養(yǎng)，之后將含有產(chǎn)物的克隆送至測(cè)序公司測(cè)序。使用RACE系統(tǒng)擴(kuò)增末端序 列，以便快速擴(kuò)增cDNA末端(Invitrogen)。采用BLASTn和MEGA 4軟件分析所獲得的序列與可從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的核 苷酸序列的序列相似性。表征BCH019的基因組這3個(gè)原始的不同克隆代表鼻病毒基因組的3個(gè)不同片段(圖2B)。第一個(gè)307bp， 覆蓋5，UTR/VP4區(qū)域，第二個(gè)494bp，覆蓋VP2/VP3區(qū)域，第三個(gè)635bp，覆蓋2C/3A區(qū)域。設(shè) 計(jì)了一系列PCR引物，利用它們逐步獲得了絕大多數(shù)基因組片段。然后使用Invitrogen的 RACE系統(tǒng)獲得基因組的5’端和3’端末端序列。這一新病毒被鑒定為鼻病毒，稱為BCH019， 其完整性基因組序列見圖1和SEQ ID NO :1。BCHO19的基因組長(zhǎng)度為7121nt，包括5，UTR(626nt)、多蛋白編碼序列(6438nt)、 3’ UTR(38nt)和polyA尾(圖2A)。BCHO19中的多蛋白前體的結(jié)構(gòu)與所有的HRV相同，其
9具有高度保守的翻譯起始位點(diǎn)(MGAQVS)和對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)蛋白VP4、VP2、VP3、VP1和非結(jié)構(gòu)蛋 白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D編碼序列的區(qū)域(圖2A)。系統(tǒng)講化分析基于將BCHO19與所有HRV血清型(人類鼻病毒分離株NAT045 [F077280]、人 類鼻病毒分離株NAT001 [EF077279]、人類鼻病毒QPM [EF186077]、人類鼻病毒C毒株 026[EF582387]、人類鼻病毒 C 毒株 025 [EF582386]、人類鼻病毒 C 毒株 024 [EF582385]、 HRV89[NC 001617]、B [NC 001490]、93[EF173425]、52[EF173424]、37 [EF173423]、 3[EF173422]、27[EF173421]、17[EF173420]、94[EF173419]、78[EF173418]、64[EF173417]、 24[EF173416],12[EFl73415],11[EF173414]、30[DQ473512]、55[DQ473511 ]、 75 [DQ473510]、A[DQ473509]、28 [DQ473508]、53 [DQ473507]、46 [DQ473506]、36 [DQ473505]、 88[DQ473504]、7[DQ473503]、76[DQ473502]、34[DQ473501]、59[DQ473500]、44[DQ473499]、 10[DQ473498]、23[DQ473497]、49[DQ473496]、38[DQ473495]、74[DQ473494]、 15[DQ473493]、73[DQ473492]、41[DQ473491]、4[DQ473490]、70[DQ473489]、48[DQ473488]、 35[DQ473487]、6[DQ473486]、2[X02316]、39[AY751783]、14[K02121]、IB[D00239]、 16 [L24917])以及10種HEV (人類腸道病毒68 [EF107098]、人類腸道病毒70 [DQ201177]、 人脊髓灰質(zhì)炎病毒1型[V01148]、脊髓灰質(zhì)炎病毒2型[X00595]、人柯薩奇病毒 A2 [AY421760]、人柯薩奇病毒A6 [AY421764]、腸道孤病毒1 [AF029859]、人腸道孤病毒 6 [AY302558]、柯薩奇病毒B2 [AF081485]、和人柯薩奇病毒Al [AF499635])的完整序列進(jìn)行 比對(duì)而構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。發(fā)現(xiàn)BCH019的序列代表一種不同的新的人類鼻病毒。即便與系統(tǒng)進(jìn)化樹中最接 近的HRV毒株HRV NAT045相比，BCH019與HRV NAT045之間的序列相似性也僅有66. 7%。 BCHO19與其他一些最近發(fā)現(xiàn)的鼻病毒，包括HRV-QPM ；HRV-NAT045.001 ；HRV-C 024,025和 026顯然屬于一個(gè)不同的進(jìn)化枝，即HRV-C。實(shí)施例2 驗(yàn)證BCH019的基因組序列為了驗(yàn)證BCH019的序列，再次提取樣品BCHO19的核酸。使用新設(shè)計(jì)的針對(duì)所有推 定蛋白編碼序列的特異性引物來擴(kuò)增基因。設(shè)計(jì)引物VP4(5’-ATGGGTGCACAAGTGAGTAA-3’， SEQ ID NO 8)和弓丨物 VP2R(5，-GCTATTGCTTTTGGGTTTG-3，，SEQ ID NO 9)來擴(kuò) 增 VP4 和 VP2 基因(圖 4B)。設(shè)計(jì)弓丨物 VP3(5，-GGGCTACCAACCAGACTACCAA-3，， SEQ ID NO: 10)禾口 弓丨物 VP3R(5，-CGATATGTTGTTACTAGGCTGTTC-3，，SEQ ID NO: 11)來擴(kuò)增 VP3 基因(圖 4D)。設(shè)計(jì)弓丨物 2A(5，-GGACCCAGTGATTTATTTGTACA-3，， SEQ ID NO: 12)和弓丨物 2BR (5，-CTGCTTGGAGGGCGGTTTA-3，，SEQ ID NO: 13)來擴(kuò) 增 2A 和 2B 基因(圖 4D)。設(shè)計(jì)引物 2C(5，-CAGTGGTGATGGTTGGCTC-3，，SEQ ID NO 14)和弓丨物 2CR(5，-GCGTTGGAATATTGCATCTAG-3，，SEQ ID NO: 15)來擴(kuò)增 2C 基 因(圖 4A)。設(shè)計(jì)引物 3A(5，-GATTAGGAGATTCTGAGACACCA-3，，SEQ ID NO: 16)和 引物 3CR(5，-CGCTGGGTGTCATTAAAGTATT-3，，SEQID NO: 17)來擴(kuò)增 3A、3B 和 3C 基 因(圖 4D)。設(shè)計(jì)引物 3D(5，-TGCTATCACACATGTCCAAGA-3，，SEQ ID NO 18)和弓丨物 3DR(5，-GAAATTGTCAAGCCACTGC-3，，SEQ ID NO 19)來擴(kuò)增 3D 基因(圖 4C)。圖4顯示了使用針對(duì)BCH019的蛋白編碼區(qū)的引物獲得的PCR產(chǎn)物。對(duì)每一 PCR 產(chǎn)物測(cè)序至少3個(gè)克隆以確保各個(gè)區(qū)域的序列的準(zhǔn)確性。結(jié)果證實(shí)該樣品中存在鼻病毒BCHO19且序列是準(zhǔn)確的。實(shí)施例3 檢測(cè)來自患有呼吸道感染的患者的樣品中的HRV-C設(shè)i十用干確定C群人類鼻病毒的PCR ^mVP4基因是全部結(jié)構(gòu)蛋白中最為保守的區(qū)域，因此比較了所有已知HRV的該區(qū)域 的全長(zhǎng)序列，以便設(shè)計(jì)針對(duì)HRV-C的特異性引物。設(shè)計(jì)了正向引物556F(5，-ACTACTTTGGGTG TCCGTGTTTC-3，，SEQ ID NO 6)和反向引物 886R(5，-TTTCCRATAGTGATTTGCTTKAGCC-3，，SEQ ID NO 7)，它們針對(duì)的是SEQ ID NO 1中從VP4基因5，-上游70bp至VP4基因3，-下游 59bp的區(qū)域。根據(jù)5’ UTR 3’ -末端區(qū)域的序列設(shè)計(jì)正向引物556F，該區(qū)域在所有鼻病毒 中是保守的，同時(shí)根據(jù)VP2基因5’-末端區(qū)域的序列設(shè)計(jì)反向引物886R，該區(qū)域僅在HRV-C 中是保守的。為了評(píng)估HRV-C感染的發(fā)病率，使用弓丨物556F和886R來篩查臨床樣品中HRV-C 毒株的感染證據(jù)。各樣品單獨(dú)進(jìn)行提取并擴(kuò)增。每一實(shí)驗(yàn)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。使用 NucliSens基本試劑盒提取模塊(bioM6rieuX)提取核酸。使用核酸(1 μ 1)作為PCR 的模板。20 μ 1 反應(yīng)試劑混合物包括10 μ 12 X Reaction Mix(Invitrogen)，1 μ 1 Superscript IIIRT/ platinum Taq Mix (Invitrogen), 20pmol 各個(gè)引物 556F (5，-ACTAC TTTGGGTGTCCGTGTTTC-3',SEQ ID NO 6)和 886R(5，-TTTCCRATAGTGATTTGCTTKAGCC-3，，SEQ ID NO :7)。48°C溫育45分鐘，94°C 3分鐘之后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(94°C 30秒，55 °C 30 秒，和72°C 1分鐘)。在瓊脂糖凝膠上觀察產(chǎn)物。預(yù)期產(chǎn)物的大小為330bp。對(duì)所有PCR產(chǎn) 物進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)它們是HRV-C特異性的。檢測(cè)HRV-C感染使用引物556F和886R篩查了來自BCH的298份樣品，又有另外13份樣品發(fā)現(xiàn) HRV-C陽性(表1)。其中有12名男童，1名女童。年齡范圍在1個(gè)月6天至3歲。病例分 別來自急診室、兒科病房、兒科重癥監(jiān)護(hù)室(PICU)。在8例中，鼻病毒是檢測(cè)到的唯一的呼 吸道病毒。2007年夏季(7、8、9月)無病例出現(xiàn)。由于C群人類鼻病毒是一個(gè)新的進(jìn)化枝，迄今尚不知C群鼻病毒是否也與A群或B 群一樣具有許多類型，以及該類病毒在急性呼吸道感染患者中的分布。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 13 個(gè)額外的HRV-C陽性樣品。這一結(jié)果提示C群鼻病毒感染可能是常見的，且與A群或B群 鼻病毒感染相比，其臨床表現(xiàn)有所不同。這些結(jié)果提示，同HRV-A和HRV-B—樣，HRV-C毒 株也具有高度的遺傳多樣性。
權(quán)利要求
1.分離的HRV-C鼻病毒，其具有RNA基因組，所述基因組包含選自如下一組中的多核苷 酸序列(i)SEQID NO :1所代表的序列，(ii)與SEQID NO :1具有至少75%相同性的序列，和(iii)(i)或(ii)所代表的序列的互補(bǔ)序列。
2.權(quán)利要求1的病毒，特征在于其基因組包含至少一個(gè)編碼多蛋白的讀框，所述多蛋 白的序列由SEQ ID NO 20代表。
3.可從權(quán)利要求1的病毒的基因組獲得的核酸序列。
4.核酸片段，特征在于其包含至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、優(yōu)選地至少100個(gè)連續(xù)核苷酸或 由所述至少50個(gè)連續(xù)核苷酸、優(yōu)選地至少100個(gè)連續(xù)核苷酸組成，所述至少50個(gè)連續(xù)核苷 酸、優(yōu)選地至少100個(gè)連續(xù)核苷酸來自從SEQ ID NO 1的第627位核苷酸開始至第7064位 核苷酸結(jié)束的核苷酸序列或來自與從SEQ ID NO :1的第627位核苷酸開始至第7064位核 苷酸結(jié)束的核苷酸序列具有至少85%相同性的核苷酸序列或來自它們的互補(bǔ)序列。
5.權(quán)利要求4的核酸片段，特征在于其選自如下一組-SEQ ID N0:21、與SEQ ID NO :21具有至少85%相同性的序列或它們的互補(bǔ)序列，-SEQ ID N0:22、與SEQ ID NO :22具有至少85%相同性的序列或它們的互補(bǔ)序列，和-SEQ ID N0:23、與SEQ ID NO :23具有至少85%相同性的序列或它們的互補(bǔ)序列。
6.弓丨物對(duì)，用于通過PCR擴(kuò)增來擴(kuò)增樣品中的HRV-C毒株，其中至少一個(gè)引物的序列由 18-30個(gè)連續(xù)核苷酸組成，所述18-30個(gè)連續(xù)核苷酸位于從SEQ ID NO=I的大約第556位 核苷酸至大約第886位核苷酸的區(qū)域內(nèi)。
7.權(quán)利要求6的引物對(duì)，其中正向引物由SEQID NO :6所示核苷酸序列組成，反向引 物由SEQ ID NO 7所示核苷酸序列組成。
8.檢測(cè)樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括(a)從所述樣品中提取核酸，(b)擴(kuò)增所提取的核酸，和(c)確定一或多種HRV-C特異性核酸序列的存在，其中所述擴(kuò)增步驟例如通過使用權(quán)利要求6或7所定義的至少一個(gè)引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增而進(jìn)行。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述樣品選自人類鼻部和口腔樣品和培養(yǎng)上清液。
10.用于擴(kuò)增樣品中的HRV-C毒株的試劑盒，其包括至少一個(gè)權(quán)利要求6或7所定義的 引物對(duì)。
11.權(quán)利要求1所定義的多核苷酸序列或其片段在設(shè)計(jì)用于檢測(cè)樣品中的HRV-C鼻病 毒的引物或探針中的用途。
12.分離的蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1所定義的多核苷酸序列編碼。
13.分離的蛋白質(zhì)，其由具有權(quán)利要求4所定義的核苷酸序列的核酸片段編碼。
14.分離的蛋白質(zhì)，其包含SEQID NO :20的氨基酸序列或由SEQ IDNO 20的氨基酸序 列組成。
15.多肽，特征在于其氨基酸序列包含權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所定義的蛋白質(zhì)的至 少15個(gè)連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選地至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸、有利地至少30個(gè)連續(xù)的氨基酸，或由權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所定義的蛋白質(zhì)的至少15個(gè)連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選地至少20個(gè) 連續(xù)的氨基酸、有利地至少30個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。
16.抗體，其對(duì)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所定義的蛋白質(zhì)的表位具有特異性。
17.用于檢測(cè)樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括將所述樣品與權(quán)利要求12-14中 任一項(xiàng)所定義的蛋白質(zhì)相接觸或與權(quán)利要求15所定義的多肽相接觸，并檢測(cè)所述蛋白質(zhì) 或多肽與抗HRV-C抗體所形成的免疫復(fù)合物的存在。
18.用于檢測(cè)樣品中的HRV-C毒株的方法，其步驟包括將所述樣品與至少一種權(quán)利要 求16所定義的抗體相接觸，并檢測(cè)抗體/HRV-C蛋白質(zhì)的免疫復(fù)合物的存在。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述樣品是選自血液、血漿和血清的人類樣品。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述樣品選自人類鼻部和口腔樣品和培養(yǎng)上清液。
21.診斷HRV-C毒株的試劑盒，特征在于其包含至少一種權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所定 義的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求15所定義的多肽。
22.診斷HRV-C毒株的試劑盒，特征在于其包含至少一種權(quán)利要求16所定義的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類鼻病毒遺傳群C(HRV-C)的新毒株的表征以及用于通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)HRV-C的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102007208SQ200980113369
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日
發(fā)明者R·岡薩雷斯, 王健偉, 申昆玲, 相子春 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所, 生物梅里埃公司, 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院