專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的氨基酸序列rgd的特異性人源化抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫特異性地識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的氨基酸序列 RGD (Arg-Gly-Asp)的人源化抗體(humanized antibody)，和該人源化抗體用于治療和
診斷包括癌癥、炎癥性疾病、自身免疫病、傳染病和骨病等在內(nèi)的多種疾病或病癥的應(yīng)用。在本臨時(shí)申請(qǐng)中引用了多個(gè)出版物(包括專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng))。這些出版物的公開(kāi) 內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本臨時(shí)申請(qǐng)，以更全面地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。
2.
背景技術(shù)：
細(xì)胞粘附在多細(xì)胞生物體的生命維持中發(fā)揮重要作用。多細(xì)胞生物體的細(xì)胞粘 附分類(lèi)為細(xì)胞_細(xì)胞外基質(zhì)(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“ECM” )粘附和細(xì)胞-細(xì)胞粘附。已經(jīng)闡明 細(xì)胞-ECM粘附由整合素(integrin)介導(dǎo)，細(xì)胞-細(xì)胞粘附由鈣粘蛋白(cadherin)、封閉 蛋白(claudin)和柄蛋白(nectin)介導(dǎo)?？缒ふ掣降鞍?例如整合素)形成細(xì)胞-ECM粘附。整合素形成α鏈和β鏈 的異源二聚體。目前已經(jīng)鑒別并確認(rèn)了至少18種類(lèi)型的α鏈，8種類(lèi)型的β鏈和24種 類(lèi)型的α β異源二聚體。各種類(lèi)型的整合素識(shí)別特異的配體。除了細(xì)胞粘附外，包括 整合素在內(nèi)的跨膜粘附蛋白還與從ECM至細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、增殖調(diào)控、移動(dòng)以及 分化有關(guān)(F.G Giancotti，et.al.，Science, 285，1028-1032，1999)。已知許多蛋白都是ECM蛋白，所述ECM蛋白分類(lèi)為膠原蛋白(例如I-XIX 型)、非膠原糖蛋白(例如骨橋蛋白(osteopontin，OPN))、玻連蛋白(vitronectin)、纖連 蛋白(fibronectin)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor)、層粘連蛋白(Iaminin)、腱 生蛋白(tenascin)、纖維蛋白原(fibrinogen)、血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin))、彈性 蛋白(elastin)和蛋白聚糖。這些ECM蛋白與相應(yīng)的整合素結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通 路，從而調(diào)控細(xì)胞骨架形成、移動(dòng)、增殖和分化等。與ECM蛋白結(jié)合的整合素根據(jù)ECM 蛋白的類(lèi)型傳遞特異信號(hào)，由此調(diào)控這些信號(hào)激活通路。在許多ECM蛋白的細(xì)胞粘附區(qū) 常觀察到RGD序列，該序列通過(guò)與整合素結(jié)合而具有多種功能。ECM蛋白的RGD序列 已經(jīng)被認(rèn)為是可能的藥物靶標(biāo)，并且已經(jīng)產(chǎn)生了多種小分子化合物和人工肽。已知一些類(lèi)型的整合素，例如α3β1整合素、α5β1整合素、α8β1整合素、 ανβ 整合素、α νβ 3整合素、α νβ 5整合素、α νβ 6整合素、α νβ 8整合素與RGD 序列結(jié)合。α 5β1整合素與其特異性配體纖連蛋白之間的相互作用激發(fā)了對(duì)整合素介 導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究。所述研究表明，α 5β1整合素不僅調(diào)控細(xì)胞粘附和細(xì)胞移 動(dòng)，還調(diào)控細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡。(S.M.Frischetal.，Curr.Opin.Cell Biol., 9，701-706， 1997)。還表明，α 5β1整合素在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并與癌癥的惡性改變有關(guān)。各整 合素介導(dǎo)的信號(hào)根據(jù)所結(jié)合的ECM蛋白而不同，例如，生長(zhǎng)因子的刺激激活與纖連蛋白 結(jié)合的內(nèi)層細(xì)胞的生長(zhǎng)，而抑制與層粘連蛋白-1結(jié)合的內(nèi)層細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，由層粘連蛋白-10/11向α 3β1整合素傳遞的信號(hào)不同于由纖連蛋白向α5β1整合素傳遞的信 號(hào)，前者顯著增強(qiáng)了癌細(xì)胞的移動(dòng)(J.Guetal.，J.Biol.Chem.，276，27090-27097，2001) 并通過(guò)血液饑餓有效避免凋亡(J.Guetal.，J.Biol.Chem., 277，19922-19928，2002)。觀 察到與α ν整合素結(jié)合的RGD序列在破骨細(xì)胞和新生血管中高表達(dá)，因此認(rèn)為抑制RGD 序列和α ν整合素是治療骨質(zhì)疏松癥和癌癥的藥物的靶標(biāo)。已經(jīng)表明，α5β1整合素在 腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，并與癌癥的惡性改變有關(guān)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了抗_α5β1 整合素抗體(Volocimab)、抗-α 4整合素抗體(Natalizumab)禾Π抗-α ν β 3整合素抗體 (Vitaxin)作為抑制整合素和ECM蛋白之間相互作用的抗-整合素抗體拮抗藥。同時(shí)，已知一些ECM蛋白，例如膠原蛋白、骨橋蛋白(OPN)、玻連蛋白、纖 連蛋白、血管性血友病因子、層粘連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋白原和血小板反應(yīng)蛋白包 含RGD序列。另外，還已知一些病毒和一些細(xì)菌具有RGD序列，從而粘附至細(xì)胞上。 OPN是具有與骨中富含的鈣相結(jié)合的性質(zhì)的酸性糖蛋白。據(jù)報(bào)道，OPN在細(xì)胞粘附、細(xì) 胞遷移、腫瘤形成、免疫應(yīng)答和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解中發(fā)揮重要作用。OPN敲除小鼠和 抗-OPN中和抗體的結(jié)果表明，OPN與肝炎、自身免疫病(例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)和癌 的轉(zhuǎn)移有關(guān)。已經(jīng)指出，抑制ECM蛋白與細(xì)胞結(jié)合的抑制劑可用于治療骨質(zhì)疏松癥或癌 癥。因此，除了上述靶向整合素的拮抗藥外，還開(kāi)發(fā)了靶向作為整合素結(jié)合伴侶的ECM 蛋白的拮抗藥。3.發(fā)明概述雖然已經(jīng)報(bào)道了諸如抑制RGD序列介導(dǎo)的與整合素的相互作用的小分子、抗 OPN抗體和抗整合素抗體的藥物，但還沒(méi)有關(guān)于特異識(shí)別RGD序列的抗體的報(bào)道。由 于RGD序列是ECM蛋白的保守序列之一，特異識(shí)別RGD序列的抗體可在人和治療性模 型動(dòng)物中均發(fā)揮作用，并因此可以被認(rèn)為是用于治療劑開(kāi)發(fā)的非常有用的活性成分。因 此，需要特異識(shí)別RGD序列的此類(lèi)抗體。本發(fā)明人之前分離了免疫特異性地識(shí)別RGD序列的小鼠單克隆抗體，并通過(guò)雜 交瘤克隆33Ε10和35Β6 (保藏編號(hào)分別為FERM ΒΡ-10440和FERMBP-10441)產(chǎn)生該抗 體。在本發(fā)明中，雜交瘤克隆名稱(chēng)可與由所述克隆產(chǎn)生的單克隆抗體名稱(chēng)互換使用。所 有這些小鼠抗-RGD抗體都為IgGl同型。觀察到這些單克隆抗體通過(guò)與諸如骨橋蛋白的 ECM蛋白的RGD序列結(jié)合而干擾RGD序列介導(dǎo)的ECM和細(xì)胞之間的結(jié)合。因此，這 些抗-RGD抗體對(duì)與RGD序列相關(guān)的疾病可具有治療或診斷作用，所述與RGD序列相 關(guān)的疾病為，例如癌癥，如癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，和炎癥性疾病，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 骨關(guān)節(jié)炎、傳染病、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化、肉 芽腫、炎癥性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病)、自身免疫病、骨質(zhì)疏松癥等。然而，由于這些單克隆抗體都為小鼠源的，由于其免疫原性而可能在人中產(chǎn)生 的不利作用阻礙了其直接應(yīng)用于人的診斷或治療應(yīng)用。為了降低免疫原性，本發(fā)明人制 備了人源化抗體，該人源化抗體具有與人源化抗體所來(lái)源的原始小鼠抗-RGD抗體所表 現(xiàn)的生物活性相應(yīng)的生物活性。 因此，本發(fā)明提供了免疫特異性地識(shí)別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片 段，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含部分來(lái)源于非人來(lái)源和部分來(lái)源于人來(lái)源的 抗原結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含來(lái)源于非人來(lái)源(供體，例如33E10和35B6單克隆抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“CDR” ) 和來(lái)源于人來(lái)源(接受體(acceptor))的框架區(qū)(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“FR”)。所述人源化抗體 或其抗原結(jié)合片段可抑制RGD序列和其配體之間的結(jié)合。在具體實(shí)施方式
中，免疫特異性地識(shí)別RGD序列的所述人源化抗體或其抗原結(jié) 合片段包含ω重鏈(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“H-鏈”)，其包含源自人Η-鏈的可變區(qū)(下文簡(jiǎn) 稱(chēng)為“V-區(qū)”)的至少一個(gè)H-鏈FR(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“FRH”)，和源自免疫特異性地識(shí) 別RGD序列的非人抗體的H-鏈CDR(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“CDRH” )中的至少一個(gè)的至少一個(gè) CDRH ；或者(ii)輕鏈(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“L-鏈”)，其包含源自人L-鏈的V-區(qū)的至少一個(gè) L-鏈FR(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“FRL”)，和源自免疫特異性地識(shí)別RGD序列的非人抗體的L-鏈 CDR(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“CDRL” )中的至少一個(gè)的至少一個(gè)CDRL ；或者上述(i)和(ii)兩 者。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的人源化抗體的CDRH中的至少一個(gè)和/或CDRL 中的至少一個(gè)可以源自由選自保藏編號(hào)為FERM BP-10440和FERMBP-10441的雜交瘤 產(chǎn)生的單克隆抗體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含
(i)源自人FRH的至少一個(gè)FRH，和包含選自氨基酸序列SEQIDN0: 1、2和3的氨基 酸序列的至少一個(gè)CDRH ；或者(ii)源自人FRL的至少一個(gè)FRL，和包含選自氨基酸序 列SEQ ID NO 4、5和6的氨基酸序列的至少一個(gè)CDRL ；或者(iii)上述(i)和(ii)兩 者。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含在CDRHl 的 SEQ ID NO 1、在 CDRH2 的 SEQ ID NO 2 和在 CDRH3 的 SEQ ID NO 3。在一 些實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含在CDRLl的SEQ ID NO 4、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 5 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 6。優(yōu)選地，本發(fā)明 的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含在CDRHl的SEQ ID NO 1、在CDRH2的SEQ ID NO 2、在 CDRH3 的 SEQ ID NO 3、在 CDRLl 的 SEQ ID NO 4、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 5 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 6。在一些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含源自 由GenBank登錄號(hào)X65891 (SEQ ID NO 13)編碼的人H-鏈的V-區(qū)的FRH或者源自由 GenBank登錄號(hào)X72441 (SEQ ID NO 18)編碼的人κ -L-鏈的V-區(qū)的FRL。在一些 實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的FRH包含選自氨基酸序列SEQIDN0 : 14、15、16 和17(分別為Χ65891的氨基酸序列FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一個(gè)氨基酸序 列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的FRL包含選自氨基酸序列SEQIDN0 : 19、20、21和22(分別為Χ72441的氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一 個(gè)氨基酸序列。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包 含G)包含氨基酸序列SEQ ID NO 24的H-鏈的V_區(qū)(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“ VH” )；或者
(ii)包含氨基酸序列SEQID NO 26的L-鏈的V_區(qū)(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“ VL” ) ； (iii)上述 (i)和(ii)兩者。 在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含ω源自人 FRH的至少一個(gè)FRH，和包含選自氨基酸序列SEQ ID NO 7、8和9的氨基酸序列的至 少一個(gè)CDRH ；或者(ii)源自人FRL的至少一個(gè)FRL，和包含選自氨基酸序列SEQ ID NO 10、11和12的氨基酸序列的至少一個(gè)CDRL ；或者(iii)上述(i)和(ii)兩者。在 一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含在CDRHl的SEQID NO 7、在 CDRH2 的 SEQ ID NO 8 和在 SEQ ID NO 9 的 CDRH3。在一些實(shí)施方 式中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含在CDRLl的SEQ ID NO: 10、在 CDRL2的SEQ IDNO 11和在CDRL3的SEQ IDNO 12。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述人源 化抗體或其抗原結(jié)合片段包含在CDRHl的SEQ ID NO 7、在CDRH2的SEQ ID NO 8、在 CDRH3 的 SEQ ID NO 9、在 CDRLl 的 SEQ ID NO 10、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 11 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 12。在一些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含源自 由GenBank登錄號(hào)X65891 (SEQ ID NO 13)編碼的人H-鏈的V-區(qū)的FRH或者源自由 GenBank登錄號(hào)X72441 (SEQ ID NO 18)編碼的人κ -L-鏈的V-區(qū)的FRL。在一些 實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的FRH包含選自氨基酸序列SEQIDN0 : 14、15、16 禾口 17 (分別為Χ65891的氨基酸序列FRHl、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一個(gè)氨基酸序 列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的FRL包含選自氨基酸序列SEQIDN0 : 19、20、21和22(分別為Χ72441的氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一 個(gè)氨基酸序列。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包 含G)包含氨基酸序列SEQ ID NO 28的VH ；或者(ii)包含氨基酸序列SEQID NO 30的VL ；或者(iii)上述(i)和(ii)兩者。本發(fā)明還提供了包含編碼免疫特異性地識(shí)別RGD序列的本發(fā)明人源化抗體或其 抗原結(jié)合片段的核苷酸序列的分離的核酸分子。具體而言，本發(fā)明提供了分離的核酸分 子，其包含編碼包含選自SEQ ID NO : 1、2、3、7、8和9的至少一個(gè)氨基酸序列的人源 化H-鏈的核苷酸序列，或者包含編碼包含選自SEQ ID NO 4、5、6、10、11和12的至 少一個(gè)氨基酸序列的人源化L-鏈的核苷酸序列，或者包含所述人源化H-鏈的核苷酸序 列和所述人源化L-鏈的核苷酸序列兩者。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，此分離的核酸分子 包含編碼VH的核苷酸序列SEQ ID NO 23，或者包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO 24 的核苷酸序列。在一些優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，此分離的核酸分子包含編碼VL的核苷 酸序列SEQ ID NO 25，或者包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO 26的核苷酸序列。優(yōu) 選地，本發(fā)明的分離的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 25兩 者。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的分離的核酸分子進(jìn)一步包含編碼供體來(lái)源的信 號(hào)肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO 32和34)或者異源來(lái)源的信號(hào)肽的核苷酸序列。在其它優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，此分離的核酸分子包含編碼VH的核苷酸序列SEQ ID NO 27，或者包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO 28的核苷酸序列。在一些優(yōu)選 的具體實(shí)施方式
中，此分離的核酸分子包含編碼VL的核苷酸序列SEQ ID NO: 29，或者 包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO: 30的核苷酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離的核酸分子 包含核苷酸序列SEQ ID NO : 27和SEQ ID NO: 29兩者。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，本 發(fā)明的分離的核酸分子進(jìn)一步包含編碼供體來(lái)源的信號(hào)肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO 36和38)或者異源來(lái)源的信號(hào)肽的核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了載體，例如表達(dá)載體，其包含編碼免疫特異性地識(shí)別RGD 序列的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的H-鏈或L-鏈或兩者的核苷酸序列。在此 載體中，本發(fā)明的核苷酸序列可操作地連接一個(gè)或多個(gè)調(diào)控元件。本發(fā)明的核苷酸序列 可以包括編碼作為CDR來(lái)自的非人供體抗體的天然信號(hào)肽的核苷酸序列，或者編碼異源來(lái)源的信號(hào)肽的核苷酸序列。此外，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核酸分子的宿主細(xì)胞，其含有包含本發(fā)明 核酸分子的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的宿主細(xì)胞，其包含編碼本發(fā) 明的人源化H-鏈的第一核酸分子和編碼本發(fā)明的人源化L-鏈的第二核酸分子，所述第 一核酸分子和第二核酸分子均以表達(dá)具有生物學(xué)功能的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結(jié)合 片段的方式可操作地連接調(diào)控元件。因此，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的制備方法，所 述方法包括在使所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì) 胞，和收集所產(chǎn)生的人源化抗體。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的至少一種人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的組合 物。此外，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療與RGD-蛋白相關(guān)的病癥或疾病的藥物組合 物，其包含本發(fā)明的至少一種人源化抗體或其抗原結(jié)合片段和藥學(xué)上可接受的載體。所 述兩種組合物中的任一種均可以進(jìn)一步包含可以加和或協(xié)同地改善所述病癥或疾病的另 一種活性化合物。所述活性化合物包括，但不限于抗炎化合物和化療化合物等。所述活 性化合物還包括小分子化合物和抗體或其抗原結(jié)合片段，例如人α4結(jié)合素特異性抗體 或人α 9結(jié)合素特異性抗體。 另一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療與RGD-蛋白相關(guān)或涉及RGD-蛋白的 病癥或疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施予預(yù)防有效量或治療有效量的 本發(fā)明的至少一種人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。對(duì)于此類(lèi)應(yīng)用，本發(fā)明的人源化抗體 或其抗原結(jié)合片段可以與增強(qiáng)所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的生物學(xué)作用的治療分 子(moiety)結(jié)合。此類(lèi)治療分子的實(shí)例包括另一種抗體、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死細(xì)胞的細(xì) 胞毒素、放射性元素和/或包括抗炎劑和抗生素等在內(nèi)的其它治療劑。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于診斷受試者的與RGD-蛋白 相關(guān)或涉及RGD-蛋白的病癥或疾病的方法，所述方法包括向待檢查受試者施予診斷有 效量的本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。對(duì)于此類(lèi)應(yīng)用，本發(fā)明的人源化抗體可 以用可檢測(cè)的標(biāo)記物(例如放射性元素)進(jìn)行標(biāo)記。3.1.定義本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指能夠免疫特異性地結(jié)合目標(biāo)抗原或目標(biāo)序列 (例如RGD序列)的抗體分子，并涵蓋完整的抗體分子或其片段，包括其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”是指保留了免疫特異性地結(jié)合目標(biāo)多肽、 蛋白或序列(尤其為RGD序列)的能力的任何抗體片段，其包括單鏈抗體、Fab片段、 F(ab' )2片段、二硫鍵連接的Fvs和包含VL和/或VH中任一種的片段或包含特異結(jié)合 目標(biāo)多肽、蛋白或序列的CDR的片段。因此，人源化抗體的此抗原結(jié)合片段可以包括或 可以不包括部分或全長(zhǎng)的人恒定區(qū)。本領(lǐng)域熟知獲得上述抗體片段的各種方法。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“免疫特異性地識(shí)別”是指抗體或其抗原結(jié)合片段特異性地 結(jié)合目標(biāo)多肽、蛋白或序列(尤其為人RGD序列)的能力。該抗體不非特異性地與其它 多肽或蛋白結(jié)合。然而，免疫特異性地結(jié)合目標(biāo)多肽或蛋白(例如RGD-蛋白)的抗體 或其抗原結(jié)合片段可以與其它抗原交叉反應(yīng)。例如，免疫特異性地識(shí)別人RGD-蛋白的 本發(fā)明人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以與鼠(murine)RGD-蛋白交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，免疫特異性地識(shí)別人RGD-蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段不與其它抗原交叉反應(yīng)。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“源自人來(lái)源”或“源自非人來(lái)源”分別是指其氨基酸序列源自人抗體或非人抗體的相應(yīng)部分的抗體部分。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“接受體序列”是指來(lái)自人抗體VH或VL的FR的核苷酸序 列或氨基酸序列，其作為來(lái)自通常為非人抗體的供體抗體的CDR的接受體。
4.


圖1顯示利用鼠OPN的部分肽對(duì)單克隆抗體4P11、11M6、25H15和35B6表位
分析的結(jié)果。圖2顯示利用鼠OPN和人OPN的部分肽對(duì)單克隆抗體29R5、30C7、33E10禾口 3818表位分析的結(jié)果。圖3顯示利用包含RGD序列的鼠OPN的部分肽對(duì)單克隆抗體33E10和35B6表 位分析的結(jié)果。圖4顯示利用鼠OPN的部分肽對(duì)單克隆抗體33E10和35B6表位分析的結(jié)果。圖5顯示利用鼠OPN的部分肽(CGDSLAYGLR ； SEQ ID NO 79)對(duì)單克隆抗 體33E10和35B6表位分析的結(jié)果。圖6顯示抗RGD單克隆抗體的CDRH分析結(jié)果。在該圖中，33E10的第99位 的氨基酸(F)與35B6的第98位的氨基酸(F)可以為K或R。圖7顯示抗RGD單克隆抗體的CDRL分析結(jié)果。圖8顯示抗RGD抗體與包含RGD序列的多種ECM蛋白的結(jié)合親和性結(jié)果。圖9顯示抗RGD抗體對(duì)mOPN N-末端片段(mOPN N-half)與癌細(xì)胞(NIH3T3
細(xì)胞)結(jié)合的抑制結(jié)果。圖10A-10C顯示抗RGD抗體對(duì)多種ECM蛋白與癌細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)結(jié)合的
抑制結(jié)果。圖11顯示抗RGD抗體對(duì)肝炎的抑制作用的結(jié)果。圖12A-12B顯示抗RGD抗體對(duì)試驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型中的肺轉(zhuǎn)移的抑制作用的結(jié)果。 圖12A顯示轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)量，圖12B顯示重量變化。圖13A-13C顯示抗RGD抗體對(duì)自發(fā)轉(zhuǎn)移模型中的肺轉(zhuǎn)移的抑制作用的結(jié)果。圖 13A顯示癌體積，圖13B顯示轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)量，圖13C顯示重量變化。圖14顯示抗RGD抗體在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的治療作用的研究結(jié)果。圖15顯示小鼠33E10VH cDNA的核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨 基酸殘基以單字母密碼顯示。信號(hào)肽序列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基 (E)以雙下戈Ij線表不。根據(jù) Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services， 1991)定義的CDR序列以下劃線表示。圖16顯示小鼠33E10VLcDNA的核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨 基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽序列以斜體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘 基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。圖17顯示所設(shè)計(jì)的側(cè)翼具有SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線表示)的33E10VH基因的核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽 序列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基(E)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat etal.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖18顯示所設(shè)計(jì)的側(cè)翼具有NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線表示)的33E10VL基 因的核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽 序列以斜體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat etal.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖 19 顯示 pCh33E10 和 pHu33E10 (統(tǒng)稱(chēng)表達(dá)載體(collectively Expression Vector)) 的結(jié)構(gòu)示意圖。從上部的SalI位點(diǎn)順時(shí)針開(kāi)始，所述質(zhì)粒包含從人巨細(xì)胞病毒(CMV) 主要立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(CMV啟動(dòng)子)開(kāi)始以起始抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄的重鏈轉(zhuǎn) 錄單元。CMV啟動(dòng)子之后為VH外顯子、包含含有人Y -1重鏈恒定區(qū)(所述人Y -1重 鏈恒定區(qū)包含具有插有內(nèi)含子的CH1、鉸鏈、CH2和CH3外顯子)的基因組序列以及 CH3外顯子之后的聚腺苷酸位點(diǎn)。輕鏈轉(zhuǎn)錄單元在重鏈基因序列之后，該輕鏈轉(zhuǎn)錄單元 以CMV啟動(dòng)子起始，之后為VL外顯子和包含人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)和在CL之前 的部分內(nèi)含子的基因組序列，以及CL外顯子之后的聚腺苷酸位點(diǎn)。所述輕鏈基因之后為 SV40早期啟動(dòng)子(SV40啟動(dòng)子)、大腸桿菌黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和含 有SV40聚腺苷酸位點(diǎn)(SV40聚腺苷酸位點(diǎn))的片段。最后，所述質(zhì)粒包含質(zhì)粒pUC19 的含有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(pUCori)和β-內(nèi)酰胺酶基因(β-內(nèi)酰胺酶)的一部分。圖 20 顯示 33E10VH、人源化 33Ε10 (Hu33E10) VH 和人接受體 U03400 (GenBank 登錄號(hào))的氨基酸序列的比對(duì)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。序列上方的數(shù)字表示根 據(jù) Kabat et al. (1991)的位置。Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91—3242, U.S.Department of Health and Human Services， 1991)定義的CDR序列以下劃線表示。預(yù)測(cè)雙下劃線表示的殘基與CDR接觸，并且在 人源化形式中在這些位置上小鼠殘基被保留。在該圖中省略了 U03400中的CDR殘基。

圖 21 顯示 33E10VL、人源化 33E10 (Hu33E10)VL 和人接受體 X72452 (GenBank 登錄號(hào))的氨基酸序列的比對(duì)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。序列上方的數(shù)字表示根 據(jù)Kabatetal. (1991)的位置。Kabat et al. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。在該 圖中省略了 X72452中的CDR殘基。圖22顯示用于構(gòu)成Hu33E10VH基因的寡核苷酸。圖23顯示用于構(gòu)成Hu33E10VL基因的寡核苷酸。圖24顯示用于構(gòu)成Hu33E10VH基因的寡核苷酸。箭頭指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。圖25顯示用于構(gòu)成Hu33E10VL基因的寡核苷酸。箭頭指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。圖26顯示側(cè)翼具有SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線表示)的Hu33E10VH基因的
核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽序 列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基(E)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat et al.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖27顯示側(cè)翼具有NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線表示)的Hu33E10VL基因的核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽序列以斜 體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991) 定 義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖28顯示小鼠35B6VH cDNA的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨 基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽序列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基 (Q)以雙下戈1J線表不。根據(jù) Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services，
1991)定義的CDR序列以下劃線表示。圖29顯示小鼠35B6VL cDNA的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨 基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽序列以斜體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘 基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。圖30顯示所設(shè)計(jì)的側(cè)翼具有SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線表示)的35B6VH基 因的核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽 序列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基(Q)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat etal.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖31顯示所設(shè)計(jì)的側(cè)翼具有NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線表示)的35B6VL基因 的核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽序 列以斜體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat et al.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖32顯示pCh35B6和pHu35B6 (統(tǒng)稱(chēng)表達(dá)載體)的結(jié)構(gòu)示意圖。從上部的SalI 位點(diǎn)順時(shí)針開(kāi)始，所述質(zhì)粒包含從人巨細(xì)胞病毒(CMV)主要立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子 (CMV啟動(dòng)子)開(kāi)始以起始抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄的重鏈轉(zhuǎn)錄單元。CMV啟動(dòng)子之后為VH 外顯子、包含含有人Y-I重鏈恒定區(qū)(所述人Y-I重鏈恒定區(qū)包含具有插入內(nèi)含子的 CHU鉸鏈、CH2和CH3外顯子)的基因組序列以及CH3外顯子之后的聚腺苷酸位點(diǎn)。 輕鏈轉(zhuǎn)錄單元在重鏈基因序列之后，該輕鏈轉(zhuǎn)錄單元以CMV啟動(dòng)子起始，之后為VL外 顯子和包含人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)和在CL之前的部分內(nèi)含子的基因組序列，以及CL 外顯子之后的聚腺苷酸位點(diǎn)。然后，所述輕鏈基因之后為SV40早期啟動(dòng)子(SV40啟動(dòng) 子)、大腸桿菌黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和含有SV40聚腺苷酸位點(diǎn)(SV40 聚腺苷酸位點(diǎn))的片段。最后，所述質(zhì)粒包含質(zhì)粒pUC19的含有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(pUCori) 和β -內(nèi)酰胺酶基因(β -內(nèi)酰胺酶)的一部分。圖 33 顯示 35B6VH、人源化 335Β6 (Hu35B6) VH 和人接受體 Z47230 (GenBank 登
錄號(hào))的氨基酸序列的比對(duì)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。序列上方的數(shù)字表示根據(jù) Kabatetal. (1991)的位置。Kabatetal. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。預(yù)測(cè)雙下 劃線表示的殘基與CDR接觸，并且在人源化形式中在這些位置上小鼠殘基被保留。在該 圖中省略了 Z47230中的CDR殘基。圖 34 顯示 35B6VL、人源化 335B6 (Hu35B6) VL 和人接受體 X72479 (GenBank 登
錄號(hào))的氨基酸序列的比對(duì)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。序列上方的數(shù)字表示根據(jù) Kabatetal. (1991)的位置。Kabatetal. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。預(yù)測(cè)雙下 劃線表示的殘基與CDR接觸，并且在人源化形式中在這些位置上小鼠殘基被保留。在該圖中省略了 X72479中的CDR殘基。圖35顯示用于構(gòu)成Hu35B6VH基因的寡核苷酸。圖36顯示用于構(gòu)成Hu35B6VL基因的寡核苷酸。圖37顯示用于構(gòu)成Hu35B6VH基因的寡核苷酸。箭頭指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。圖38顯示用于構(gòu)成Hu35B6VL基因的寡核苷酸。箭頭指示各寡核苷酸的位置和 方向(由5’至3’)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。圖39顯示側(cè)翼具有SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線表示)的Hu35B6VH基因的核苷
酸序列和推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽序列以斜 體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基(Q)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991) 定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖40顯示側(cè)翼具有NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線表示)的Hu35B6VL基因的核苷 酸序列與推測(cè)的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號(hào)肽序列以斜 體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991) 定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖41A-41B顯示通過(guò)ELISA對(duì)嵌合35B6抗體和人源化35B6抗體與hOPN-BSA 的結(jié)合進(jìn)行分析的結(jié)果。以起始濃度2.5μ g/ml(圖41A)或Ι.Ομ g/ml(圖41B)和一系 列兩倍稀釋對(duì)各個(gè)抗體進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)一式三份。各抗體濃度的平均吸收值和標(biāo)準(zhǔn)偏差 顯示在圖41A-41B中。5.發(fā)明詳述5.1.針對(duì)RGD序列的抗體的制備可以通過(guò)本領(lǐng)域任何適合的方法產(chǎn)生免疫特異性地識(shí)別RGD序列的抗體。在本發(fā)明中，包含細(xì)胞粘附“RGD”序列的RGD-蛋白或肽(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為 “RGD-肽”)可以為(1)源自表達(dá)RGD蛋白的人ECM或者源自具有ECM的所有組
織，(2)通過(guò)向細(xì)菌、酵母、諸如動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞系等中轉(zhuǎn)染編碼RGD-蛋白或RGD-肽 的DNA(優(yōu)選為cDNA)而表達(dá)獲得的重組蛋白或肽，或者(3)合成的蛋白或肽。在本發(fā)明中，用作抗原的RGD-肽能夠通過(guò)免疫產(chǎn)生針對(duì)RGD序列的抗體。所 述RGD-肽包括氨基酸序列CVDVPNGRGDSLAYGLR (SEQ IDNO 71)(其為鼠ECM蛋 白的細(xì)胞粘附序列)的RGD-肽。所述RGD-蛋白或RGD-肽包括，例如OPN、玻連蛋 白、纖連蛋白、血管性血友病因子、膠原蛋白、層粘連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋白原、 血小板反應(yīng)蛋白和包括其片段的RGD?？梢詫⑷斯せ蛱烊蛔兓绨被岬娜〈?、缺 失、修飾和添加應(yīng)用于所述蛋白或所述肽，只要所述蛋白或所述肽包含RGD-序列。所 述變體蛋白或肽可以包含其中的多個(gè)氨基酸，優(yōu)選1-10個(gè)氨基酸，更優(yōu)選1-幾個(gè)(例如 1-5個(gè))氨基酸被取代、缺失、修飾、添加或插入的氨基酸序列。在本發(fā)明中，所述RGD-肽包含至少約5個(gè)氨基酸，優(yōu)選約5-50個(gè)氨基酸，更 優(yōu)選約10-20個(gè)氨基酸。可以利用本領(lǐng)域熟知的方法，例如化學(xué)合成法、細(xì)胞培養(yǎng)法、 基因重組法及其正確修飾產(chǎn)生在本發(fā)明中作為抗原的RGD-蛋白或RGD-肽。例如，可 以利用蛋白酶對(duì)ECM蛋白進(jìn)行適當(dāng)切割，從而獲得RGD-肽。所述RGD-蛋白或所述 RDG-肽可源自哺乳動(dòng)物，例如鼠(murine)、大鼠、兔、豬、牛、猴和人?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的任何方法制備可用于制備抗-RGD抗體的RGD-蛋白或RGD-肽。用于產(chǎn)生所述變體多肽的方法的實(shí)例包括合成寡核苷酸定點(diǎn)突變法(缺口 雙鏈體法)、涉及利用亞硝酸鹽或亞硫酸鹽處理隨機(jī)引入點(diǎn)突變的點(diǎn)突變法、涉及利 用Bal31酶或其它酶制備缺失突變的方法、盒式突變 、連接子掃描法、錯(cuò)摻入法(miss incorporation method)、錯(cuò)配弓丨物法和DNA片段合成法等。所述RGD-肽可以與其它生物大分子，例如甲狀腺球蛋白(thyrogloblin)、鑰孔 血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或牛球蛋白，優(yōu)選甲狀腺球 蛋白結(jié)合。通過(guò)使用偶聯(lián)劑，例如具有活性酯基團(tuán)和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的結(jié)合試劑(所 述活性酯基團(tuán)與蛋白或肽的氨基基團(tuán)結(jié)合，并且所述馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)與蛋白或肽的巰基 基團(tuán)結(jié)合；S.Yoshirake et al.，Eur.J.Biochem.，101，395-399，1979)，通過(guò)使用混合酐 法(B.F.Erlanger et al.，J.Biol.Chem.，234，1090-1094，1954)，或者通過(guò)使用活性酯法 (A.E.Karuetal.，J.Agric.FoodChem.，42，301-309，1994)，可以獲得 RGD-肽和生物大 分子結(jié)合的方法。優(yōu)選通過(guò)使用偶聯(lián)劑獲得RGD-肽和生物大分子結(jié)合的方法。還可以使用自身過(guò)表達(dá)RGD-蛋白或RGD-肽的細(xì)胞作為抗原。自身過(guò)表達(dá) RGD-蛋白或RGD-肽的細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)制備?？梢岳冒凑丈鲜鲋苽涞倪m當(dāng)抗原，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的多種方法制備特異于 RGD序列的抗體?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的多種方法產(chǎn)生針對(duì)RGD序列的抗體。例如， 可以將目標(biāo)抗原施予包括但不限于兔、小鼠、大鼠等在內(nèi)的多種宿主動(dòng)物，從而誘導(dǎo)產(chǎn) 生包含特異于所述抗原的多克隆抗體的抗血清?？梢愿鶕?jù)宿主種類(lèi)使用多種佐劑提高免 疫應(yīng)答，所述佐劑包括，但不限于弗氏(完全或不完全)佐劑，礦物膠，例如氫氧化鋁， 表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇(pluranicpolyol)、聚陰離子、肽、油乳 齊U、鑰孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚，和用于人的潛在有用的佐劑，例如BCG(卡介菌，Bacille Calmette-Guerin)和短小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)。此類(lèi)佐劑也是本領(lǐng)域熟知 的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的包括使用雜交瘤、重組技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)或其組 合在內(nèi)的多種技術(shù)制備單克隆抗體。例如，可以通過(guò)使用包括本領(lǐng)域已知的以及例如 Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ； Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T—Cell Hybridomas， pp.563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(兩者均通過(guò)引用整體并入本文)中教導(dǎo)的雜交瘤技 術(shù)，產(chǎn)生單克隆抗體。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”不限于通過(guò)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的 抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指源自單個(gè)克隆的抗體，并包括真核、原核或噬菌體克隆， 但不限于產(chǎn)生該單克隆抗體的方法。利用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生并篩選特異抗體的方法是常規(guī)方法，且為本領(lǐng)域所熟知。 在非限制性實(shí)例中，可以利用目標(biāo)抗原或表達(dá)此抗原的細(xì)胞免疫小鼠。檢測(cè)到免疫應(yīng) 答(例如在小鼠血清中檢測(cè)到特異于所述抗原的抗體)后，收集小鼠脾臟并分離脾細(xì) 胞。然后，通過(guò)熟知的技術(shù)將所述脾細(xì)胞與任何合適的骨髓瘤細(xì)胞(例如，P3U1、 P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-Ul、P3NSl_Ag4、SP2/0_Agl4、P3X63_Ag8_653 等)融合。 通過(guò)有限稀釋選擇并克隆雜交瘤。然后，通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)所述雜交瘤克隆， 獲得分泌能夠與所述抗原結(jié)合的抗體的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)小鼠腹膜內(nèi)接種陽(yáng)性雜交瘤克隆來(lái)產(chǎn)生腹水液，該腹水液通常包含高水平的抗體?？梢酝ㄟ^(guò)已知技術(shù) 產(chǎn)生識(shí)別特異表位的抗體片段。例如，可以通過(guò)免疫球蛋 白分子的蛋白水解切割，利用諸如木瓜蛋白酶(以產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(以產(chǎn)生 F(ab，)2片段)的酶產(chǎn)生Fab和F(ab，)2片段。F(ab，)2片段包含完整的L-鏈和H-鏈 的V區(qū)、CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何用于合成抗體的方法，尤其是通過(guò)化學(xué)合成或者優(yōu) 選通過(guò)重組表達(dá)技術(shù)，產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何信息(例如來(lái)自Genbank的信息、文獻(xiàn)或 者通過(guò)常規(guī)克隆和序列分析)，獲得編碼抗體的核苷酸序列。如果不能獲得包含編碼特定 抗體或其表位結(jié)合片段的核酸的克隆，而抗體分子或其表位結(jié)合片段的序列已知，則可 以化學(xué)合成編碼所述免疫球蛋白的核酸，或者從合適的來(lái)源(例如抗體cDNA文庫(kù)，或者 由表達(dá)所述抗體的任何組織或細(xì)胞，例如所篩選的表達(dá)抗體的雜交瘤細(xì)胞分離的核酸， 優(yōu)選polyA+RNA，或由其產(chǎn)生的cDNA文庫(kù))利用與序列的3’和5’末端雜交的合成 引物通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得編碼所述免疫球蛋白的核酸或通過(guò)克隆利用特異于所述特定基因 序列的寡核苷酸探針以鑒定例如來(lái)自cDNA文庫(kù)的編碼所述抗體的cDNA克隆從而獲得編 碼所述免疫球蛋白的核酸。然后，可以利用本領(lǐng)域熟知的任何方法，將通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn) 生的核酸克隆至可復(fù)制的克隆載體內(nèi)。5.2.重組抗體的制備可以利用本領(lǐng)域熟知的用于操作核苷酸序列的方法，例如重組DNA技術(shù)、定 點(diǎn)突變和 PCR 等(參見(jiàn)，例如 Sambrook etal.，見(jiàn)上文；和 Ausubel et al.，eds.，1998， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,描述的技術(shù)，其均通過(guò)
引用整體并入本文)，對(duì)所述抗體的核苷酸序列進(jìn)行處理?？梢韵蚩贵w中引入突變，例如 在表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域區(qū)或者在任意部分引入氨基酸取代、缺失和/或插入，從而增強(qiáng)或降 低生物活性。可以使用包含編碼抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體用于抗體或其抗原結(jié)合片段的 重組表達(dá)。可以利用之前節(jié)段中討論的本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生包含 編碼抗體分子、抗體的H-鏈和/或L-鏈或其用于產(chǎn)生抗體或其抗原結(jié)合片段的部分的 核苷酸序列的載體?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含抗體或其抗原結(jié)合片 段的編碼序列以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括，例如體外重 組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組?？梢詫⒕幋aVH、VL、VH和VL兩者、VH 和/或VL的抗原結(jié)合片段或者抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR的核苷酸序列克隆至此載體中用 于表達(dá)。此序列可以與編碼可以是天然的或與原始抗體異源的信號(hào)肽的多核苷酸融合。 然后，可以將由此制備的表達(dá)載體引入到適合表達(dá)所述抗體的宿主細(xì)胞中。因此，本發(fā) 明包括包含編碼免疫特異性地識(shí)別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸 的宿主細(xì)胞?？梢岳帽景l(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞，其中，第一載體編碼源 自H-鏈的多肽，第二載體編碼源自L-鏈的多肽。所述兩種載體可以包含能夠均等表達(dá) H-鏈和L-鏈多肽的同一選擇標(biāo)記物，或者不同的選擇標(biāo)記物，從而確保兩種質(zhì)粒的維 持?；蛘?，可以使用編碼并能夠同時(shí)表達(dá)H-鏈和L-鏈多肽的單個(gè)載體。H-鏈和L-鏈的編碼序列可以包含cDNA或基因組DNA。在另一個(gè)實(shí)施方式中，還可以利用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示法產(chǎn)生抗體。 在噬菌體展示法中，功能抗體結(jié)構(gòu)域被展示在具有編碼其的多核苷酸序列的噬菌體顆粒 表面。在具體的實(shí)施方式中，可以利用此噬菌體來(lái)展示由庫(kù)(repertoire)或組合抗體文庫(kù) (例如人或鼠)表達(dá)的抗原結(jié)合域，例如Fab和Fv或者通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定的Fv?？梢岳每?原，例如利用標(biāo)記抗原或被固體表面或珠結(jié)合或捕獲的抗原，選擇或鑒定表達(dá)與目標(biāo)抗 原結(jié)合的抗原結(jié)合域的噬菌體。在這些方法中使用的噬菌體通常為包括fd和M13在內(nèi)的 絲狀噬菌體。所述抗原結(jié)合域作為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白融合的重組融合蛋白 表達(dá)?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示法的實(shí)例包括在Brinkman etal., J.Immunol.Methods, 182 41-50, 1995 ； Amesetal., J.Immunol.Methods, 184 177-186，1995 ； Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.，24 952-958，1994 ； Persic et al.，Gene，187 9-18, 1997 ； Burton et al., Advances in Immunology，57 191-280,
1994； PCT 申請(qǐng)?zhí)?PCT/GB91/01134 ； PCT 公開(kāi) W090/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/11236 ； W095/15982 ； WO 95/20401 ；和美國(guó)專(zhuān)利 號(hào) 5,698,426 ； 5,223,409 ； 5,403,484 ； 5,580,717 ； 5,427,908 ； 5,750,753 ； 5,821,047 ； 5,571,698 ； 5,427,908 ； 5,516,637 ； 5,780,225 ； 5,658,727 ； 5,733,743 和 5,969,108 中描述 的方法，其均通過(guò)引用整體并入本文。如上述參考文獻(xiàn)中的描述，在噬菌體選擇后，可以分離來(lái)自噬菌體的抗體編碼 區(qū)并用于產(chǎn)生包括人抗體或其它任何目標(biāo)片段在內(nèi)的所有抗體，并按照例如以下詳述在 包括例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌在內(nèi)的任何期望宿主中表 達(dá)。例如，也可以利用本領(lǐng)域已知的方法，例如在PCT公開(kāi)WO 92/22324 ； Mullinax et al., BioTechniques，12(6) 864-869，1992 ；和 Sawai et al.，AJRI, 34: 26-34，
1995；和 Better et al.，Science, 240 1041-1043，1988 (均通過(guò)引用整體并入本文)中 公開(kāi)的方法，采用重組產(chǎn)生Fab、Fab，和F(ab，)2片段的技術(shù)?？捎糜诋a(chǎn)生單鏈Fvs 和抗體的技術(shù)的實(shí)例包括在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,946,778和5,258,498 ； Huston et al., Methods in Enzymology, 203 46-88，1991 ； Shu et al.，PNAS, 90: 7995-7999，1993 ；和 Skerra et al., Science, 240 1038-1040，1988 中描述的技術(shù)。在通過(guò)上述任一方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體分子后，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的純化免 疫球蛋白分子的任一方法對(duì)其進(jìn)行純化，例如通過(guò)層析(例如離子交換層析、親和層析 (尤其是在蛋白A或蛋白G純化后針對(duì)特異抗原的親和層析)和根據(jù)體積的柱層析)、 離心、差異溶解度或通過(guò)用于蛋白純化的其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行純化。此外，本發(fā)明的 抗體或其片段可以與本文描述的異源多肽序列或本領(lǐng)域已知的其它物質(zhì)融合，以便于純 化。對(duì)于包括抗體在人體內(nèi)的應(yīng)用和體外檢測(cè)試驗(yàn)在內(nèi)的一些應(yīng)用，可以?xún)?yōu)選使用 嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在下文5.3節(jié)中將詳細(xì)討論嵌合抗體和人源化抗體。 與其它化合物或異源多肽融合或結(jié)合的抗體可用于體外免疫試驗(yàn)、純化方 法(例如親和層析)以及體內(nèi)治療應(yīng)用或診斷應(yīng)用中。參見(jiàn)，例如PCT
發(fā)明者上出利光, 今重之, 尚卡爾·庫(kù)馬爾, 曹仲欣, 鶴下直也 申請(qǐng)人:株式會(huì)社遺傳科技