專利名稱：用于dna序型分析試驗的物質(zhì)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及對基因組系統(tǒng)中遺傳標記物的檢測。在本發(fā)明的一個具體 實施方式中，本發(fā)明具體涉及用聚合酶鏈反應(yīng)或其它擴增系統(tǒng)同時擴增多個不同的多態(tài) 性遺傳基因座，優(yōu)選在一個反應(yīng)中測定這種多重系統(tǒng)中所含各個基因座的等位基因。因 此，本發(fā)明屬于化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，較具體說是分子生物學(xué)，更具體說是人類遺傳學(xué)， 最具體說是法醫(yī)學(xué)以及親子鑒定領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
通常采用DNA分型來鑒定人類兒童的親子關(guān)系和驗證馬、犬和其它動物以及農(nóng) 作物的世系。也常用DNA分型來鑒定在犯罪現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的血液、唾液、精液和其它組織的 來源或其它需要鑒定的人類遺跡。臨床上，例如某些白血病的治療，也用DNA分型來確 定存在特定癌組織時骨髓移植是否成功。DNA分型包括分析基因組DNA中的具有感興 趣特征通常稱為“標記物”的等位基因。目前所用的大多數(shù)分型方法是專門設(shè)計用于檢 測和分析在人群中至少以兩種形式出現(xiàn)的已知DNA標記物的一個或多個區(qū)域的長度和/ 或序列的差異。這種長度和/或序列的差異稱為“多態(tài)性”。出現(xiàn)這種差異的DNA區(qū) 域，g卩“基因座”稱為“多態(tài)性基因座”。具體說，提到多態(tài)性DNA序列時，必須將所謂的重復(fù)多態(tài)性DNA序列與非重 復(fù)多態(tài)性元件區(qū)分開。在DNA序列研究中，人們能夠區(qū)別兩種主要類型的重復(fù)序列， 即串聯(lián)重復(fù)和散布重復(fù)。串聯(lián)重復(fù)包括衛(wèi)星DNA。衛(wèi)星DNA由高度重復(fù)的DNA構(gòu) 成，如此稱呼是因為短DNA序列的重復(fù)傾向于產(chǎn)生不同頻率的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤 和胸腺嘧啶，因此與大DNA的密度不同，所以當通過密度梯度分離基因組DNA時它們 形成了第二條帶或“衛(wèi)星”條帶。小衛(wèi)星是由IO-IOObp的短堿基序列構(gòu)成的DNA區(qū) 段。它們出現(xiàn)在人類基因組中的1000個以上位置。一些小衛(wèi)星包含中心(或核心)序列
“GGGCAGGANG” (其中N可以是任何核苷酸)(N = A、C、G、T的UPAC編碼)， 或更常見包含鏈偏好(strand bias)。已證明，這種序列本身能促進染色體交換DNA。在 另一種模型中，存在相鄰的順式作用有絲分裂(myotic)雙鏈斷裂熱點是小衛(wèi)星重復(fù)拷貝 數(shù)差異的主要原因。在所有真核基因組中均發(fā)現(xiàn)了散在的(indispersed)重復(fù)性DNA。這些序列通 過RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座自我增殖，它們稱為反轉(zhuǎn)錄子。這種反轉(zhuǎn)錄子顯著大于上述重復(fù)性元 件。所謂的短散在核元件(short indispersed nuclear element，SINE)是另一類重復(fù)性 DNA元件。SINE的一種具體類型是所謂的ALU-序列。它們的長度約為300個堿基 對。因此，對簡單直接的序型分析試驗而言，這些元件也不特別有用。微衛(wèi)星是存在于核DNA或細胞器中的簡單序列重復(fù)(SSR)或短串聯(lián)重復(fù)(STR) 或多態(tài)性基因座，它們由長度為1-6個堿基對的重復(fù)單位構(gòu)成。它們用作分子標記物， 在遺傳學(xué)，包括親緣關(guān)系和人群研究領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。微衛(wèi)星也可用于研究(尋找特定 遺傳區(qū)域的重復(fù)或缺失)所需的基因劑量。微衛(wèi)星的一個常見例子是(CA)n重復(fù)，其中η在各等位基因之間不同。這些標記物常常存在高水平的種間和種內(nèi)多態(tài)性。特別是當 串聯(lián)重復(fù)數(shù)為10或更高時。這些重復(fù)序列常常較簡單，由兩個、三個或四個核苷酸構(gòu)成 (分別稱為二 _、三_、四-核苷酸重復(fù))，可以重復(fù)10-100次。在人類和其他基因組 中，CA核苷酸重復(fù)非常常見，每數(shù)千個堿基對出現(xiàn)一次。由于STR基因座常常存在極 多的等位基因，系譜內(nèi)的基因型常常能提供豐富的信息并且常常能夠鑒定到特定等位基 因的祖先。然而，在遺傳學(xué)試驗中利用這些所謂的STR有以下基本作用由于人群中的 差異大，在極大量的等位基因中發(fā)現(xiàn)所述等位基因時，例如，用電泳凝膠系統(tǒng)分析這些 基因時，所述等位基因的大小可能有顯著差異。采用(例如)RFLP時，巧合匹配的理論風(fēng)險為千億(100,000,000,000)分之一.然
而，實驗室的誤差率幾乎肯定高于此，實際的實驗室操作常不能反映計算巧合概率的理 論。例如，根據(jù)兩個樣品中標記物產(chǎn)生的條帶精確位于同一位置的概率計算這種巧合概 率時，實驗室工作人員可能斷定，由于瓊脂糖凝膠存在某些不完美，相同的遺傳樣品可 能產(chǎn)生相似但不精確相同的條帶圖樣。然而，在這種情況下，實驗室工作人員通過擴大 宣稱匹配的標準，可能導(dǎo)致提高巧合風(fēng)險。STR具有同樣的問題。這是由于每個基因座 都有許多等位基因，這種復(fù)雜性可導(dǎo)致產(chǎn)生模棱兩可的隨后被錯誤認定的擴增產(chǎn)物。含有多個基因座的系統(tǒng)稱為多重系統(tǒng)，已經(jīng)開發(fā)出含有多達11個以上不同STR 基因座的許多這類系統(tǒng)，它們可商品化購得。雖然可設(shè)計出STR基因座的擴增方案來產(chǎn) 生通常長度為60-500個堿基對(bp)的小產(chǎn)物，但每個基因座所含的等位基因常少于100 個堿基對范圍。采用STR基因座的顯著缺點是，由于人群中特定基因座存在高度差異， 某些等位基因可能有大量重復(fù)，導(dǎo)致產(chǎn)生大的擴增產(chǎn)物。這些系統(tǒng)的設(shè)計部分受限于一 次凝膠或毛細管電泳難以分離多個基因座。這是因為不同大小的片段，特別是較長片段 在本領(lǐng)域技術(shù)人員分離DNA片段常用方法的凝膠或毛細管電泳中受到空間壓縮。雖然多 個等位基因短串聯(lián)重復(fù)(STR)的分析仍然對法醫(yī)遺傳學(xué)和案例調(diào)查有著最大的影響，但 不得不說該系統(tǒng)由于檢測DNA時質(zhì)量低和數(shù)量少其應(yīng)用受到限制。例如，對分析重要 的STR而言，降解的DNA樣品是一種主要挑戰(zhàn)，因為多重試驗中擴增子的大小常常超過 200個堿基對。這種降解樣品極難擴增。同時，研究關(guān)注點是所謂的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，然而，難以分析這些 SNP,因為給定系統(tǒng)須要能夠鑒定單核苷酸多態(tài)性的位置。本發(fā)明提供了超過現(xiàn)有技術(shù)的顯著進步，提高了 DNA序型分析用于關(guān)聯(lián) (linkage)分析、刑事司法、親子鑒定和其它法醫(yī)學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)用以及遺傳鑒定應(yīng)用的分 辨、定位能力和處理總量。這具體是因為本發(fā)明采用了不同類型的多態(tài)性標記物的組 合，即所謂常見的雙等位基因缺失-插入多態(tài)性(DIP)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種DNA序型分析試驗，包括以下步驟提供待分析樣品，提供 用聚合酶鏈反應(yīng)同時擴增至少20個基因座所必需的試劑、酶和引物-寡核苷酸，擴增這 些基因座，檢測擴增產(chǎn)物；其中擴增產(chǎn)物和待擴增基因座的特征如下各待擴增基因座 的特征是已知人群中存在至少一個缺失-插入多態(tài)性，各基因座兩個等位基因的大小差 異在1個核苷酸以上100個核苷酸以下，源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷
21酸至300個核苷酸的第一組的至少兩種擴增產(chǎn)物攜帶第一標記，源自至少兩個不同基因 座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第二組的至少兩種擴增產(chǎn)物攜帶第二標記， 源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第三組的至少兩種擴 增產(chǎn)物攜帶第三標記，標記一、標記二和標記三是各不相同的可區(qū)分熒光標記，可用與 DNA測序設(shè)備聯(lián)用的多色檢測器同時檢測。本發(fā)明的一個目的是提供包含所述基因座(DIP)的多重擴增專用的方法、試劑 盒和引物。在本文中，相同性綜合概率(CPI)表示，發(fā)現(xiàn)人群中某組基因座的基因型相同 的兩個個體的概率(Kirst M，Cordeiro CM, Rezende GD, Grattapaglia D. “微衛(wèi)星標記物 對巨桉繁殖種群指紋和親子分析的效力，，(Power oftnicrosatellite markers for fingerprinting and parentage analysis in Eucalyptusgrandis breeding populations) .J Hered.2005 96 161—166. PMID 15601907)。在本文中，CPE/Trio(排除親子關(guān)系的綜合概率)表示人群中某組基因座父母 雙方的基因型已知時，排除親子關(guān)系的可能性。(Jamieson A，TaylorSCS (1997) “排 除親子關(guān)系三禾中_既率方程的比較” (Comparisons of threeprobability formulae for parentage exclusion) .Animal Genetics，28, 397-400。 )在本文中，“等位基因梯”是采用與用于擴增未知DNA樣品相同的PCR引物， 擴增至少一個基因座的等位基因產(chǎn)生的一組標準大小(已知)的標記物。每個DIP有兩 個等位基因。在本文中，等位基因是DNA區(qū)段中的相關(guān)遺傳變異，即占據(jù)同一基因座的DNA 序列的兩種或多種交替形式之一種。在本文中，DNA多態(tài)性是同一種群間DNA序列中共存有兩種或多種不同的核苷 酸序列的情況。在本文中，基因座或遺傳基因座是染色體上的特定位置。在本文中，基因座的等位基因位于同源性染色體的同一位點，但它們的DNA序 列至少有一個位置的核苷酸不同。在本文中，基因座-特異性引物是在擴增方法所用條件下，能與所述基因座或 其互補鏈(至少是該基因座的一個等位基因)的一部分特異性雜交、且不與其它DNA序 列有效雜交的引物。通常，引物指長度為10至40個(15-35個；18-30個)核苷酸，與 互補DNA鏈雜交后能形成可用DNA聚合酶延長的底物復(fù)合物的單鏈DNA寡核苷酸。在本文中，序型分析試驗適合于區(qū)分物種個體，特別是人類個體的擴增的多態(tài) 性DNA標記物模式。該方法也稱為“分子遺傳學(xué)鑒定模式”或“遺傳學(xué)指紋”。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種DNA序型分析試驗，包括以下步驟提供待分析樣品，提供同 時進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增至少20個基因座所必需的試劑、酶和引物-寡核苷酸，擴增這 些基因座，檢測擴增產(chǎn)物；其中擴增產(chǎn)物和待擴增基因座的特征如下各待擴增基因座 的特征是已知人群中存在至少一個缺失-插入多態(tài)性，其中各基因座的兩個等位基因大 小差異在1個核苷酸以上100個核苷酸以下，源自至少兩個不同基因座的大小約為20個 核苷酸至300個核苷酸的第一組的至少兩種擴增產(chǎn)物攜帶第一標記，源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第二組的至少兩種擴增產(chǎn)物攜帶第二標 記，源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第三組的至少兩 種擴增產(chǎn)物攜帶第三標記，標記一、標記二和標記三是各不相同的可區(qū)分熒光標記，可 用DNA測序設(shè)備的多色檢測器同時檢測，給定基因座的兩個等位基因的大小差異大于1 個核苷酸小于100個核苷酸。理想情況下所述大小差異大于2個小于80個、小于60個、 小于40個、小于30個或小于20個核苷酸。優(yōu)選大于3個小于20個核苷酸。從所做的 實驗可知，該大小范圍具有出乎意料的優(yōu)點，能夠進行大量多重檢測。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當所用樣品含降解的DNA、部分降解的DNA、極少量DNA， 或者例如PCR抑制劑時，該試驗的結(jié)果明顯好得多。待分析樣品可以是許多物質(zhì)，例如分離的DNA、細胞、唾液、尿液或血液中的 一種。同樣，也可包括其它組織。所述DNA可來自人、貓、犬或任何其它動物?！胺蛛x的DNA”是(1)所含序列與任何天然產(chǎn)生的序列不相同的DNA，或(2) 在具有天然產(chǎn)生序列的DNA(如cDNA或基因組DNA)中，不含在天然存在的含有感興 趣DNA的基因的生物體基因組中側(cè)接于含有感興趣DNA基因的至少一個基因的DNA。 因此，該術(shù)語包括摻入載體、摻入自主復(fù)制質(zhì)?；虿《?、或者摻入原核或真核細胞基因 組DNA中的重組DNA。該術(shù)語也包括單獨分子，例如相應(yīng)基因組DNA具有內(nèi)含子因 而序列不同的cDNA ；缺少至少一個側(cè)接基因的基因組片段；通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 產(chǎn)生且缺少至少一個側(cè)接基因的cDNA或基因組DNA的片段；缺少至少一個側(cè)接基因的 限制性酶切片段；編碼非天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，例如融合蛋白、突變蛋白或給定蛋白片段 的DNA;和cDNA或天然產(chǎn)生核酸的簡并變體核酸。此外，包括作為雜合基因，即非 天然產(chǎn)生的融合蛋白編碼基因的一部分的重組核苷酸序列。從以上描述可以明白，分離 的DNA不是指存在于(例如)限制性消化反應(yīng)混合物或電泳凝膠薄片中的DNA，例如， 存在于cDNA或基因組DNA文庫或基因組DNA限制性消化產(chǎn)物的幾百至幾百萬個其他 DNA分子中的DNA。PCR反應(yīng)可由10-45個變性和合成DNA分子的“循環(huán)”構(gòu)成。這類方法包 括但不限于PCR(如美國專利號4,683,195和4,683,202所述，通過引用納入本文)、 鏈置換擴增(“SDA”)(如美國專利號5,455,166所述，通過引用納入本文)和核酸 序列擴增("NASBA “)(如美國專利號5,409,818所述，通過引用納入本文)。例 如，可通過滾環(huán)復(fù)制系統(tǒng)進行擴增，其中甚至可采用解旋酶提高DNA解鏈效率并減 少加熱(參見 Yuzhakou 等，Cell 86 877-886(1996)和 Mok 等，J.Biol.Chem.262 16558-16565(1987)，通過引用納入本文)。在一個優(yōu)選實施方式中，進行熱循環(huán)擴增反應(yīng)的變性溫度約為90°C至95°C以 上，更優(yōu)選92-94°C。優(yōu)選的熱循環(huán)擴增方法包括聚合酶鏈反應(yīng)，包括約10至100個循 環(huán)，更優(yōu)選約25至50個循環(huán)，峰值溫度約為90°C至95°C以上，更優(yōu)選92_94°C。在一個優(yōu)選實施方式中，采用DNA聚合酶I進行PCR反應(yīng)，相對于所涉及的反 應(yīng)步驟數(shù)目，可產(chǎn)生以指數(shù)擴增的至少一種靶核酸序列，前提是(a)對靶序列二末端的了 解足夠詳細，以便合成與其雜交的寡核苷酸引物，和(b)得到少量靶序列以啟動聚合酶 鏈反應(yīng)。該聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物是不連續(xù)的核酸雙鏈體，其末端對應(yīng)于所用特異性引物的末端。可采用任何來源的純化或非純化形式的核酸作為原料核酸，如果其含有或被認 為含有所需的靶核酸序列。因此，該方法可采用(例如)單鏈或雙鏈DNA。此外，可 利用DNA-RNA各含一條鏈的DNA-RNA雜合體。也可采用這些核酸的任何混合物，或 者用相同或不同引物進行前述擴增反應(yīng)所產(chǎn)生的核酸。擴增的核酸優(yōu)選DNA。待擴增 的靶核酸序列可以只是較大分子的一部分，或者最初可以是不連續(xù)的分子，然后與靶核 酸構(gòu)成完整的核酸。待擴增的靶序列最初不一定以純形式出現(xiàn)；可以是復(fù)雜混合物的微 小部分或某特定動物核酸序列的一部分，可能只構(gòu)成特定生物樣品的很小部分。原料核 酸可含有一種以上的所需靶核酸序列，這些序列可以相同或不同。因此，該方法不僅可 用于產(chǎn)生大量的一種靶核酸序列，而且可用于同時擴增位于相同或不同核酸分子上的多 個靶核酸序列。在動物DNA背景中擴增人類DNA時這特別有用。這種情況可能發(fā)生在 某些犯罪現(xiàn)場。所述核酸可獲自任何來源，包括質(zhì)粒和克隆的DNA，DNA的來源包括細菌、 酵母菌、病毒和高等生物如植物或動物?？捎酶鞣N技術(shù)例如Sambrook J，F(xiàn)ritsche EF， Maniatis T.《分子克隆實驗室手冊》(Molecular cloningAlaboratory manual)第 2 版，冷 泉港實驗室出版社(Cold Spring HarborLaboratoryPress) (1989)所述技術(shù)提取(例如)血液
或其他液體，或組織材料如絨毛膜絨毛或羊膜細胞的DNA。該試驗采用基因座-特異性引物。這些引物位于DIP的上游和下游。將引物理想 地置于大約相等距離以減少錯配，而獲得理想的解鏈溫度。引物長度優(yōu)選約為15-100， 更優(yōu)選約20-50，最優(yōu)選約20-40個堿基。該方法的引物必須橫跨包含DIP(缺失-插 入-多態(tài)性)的區(qū)域。具體地說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對20個以上基因座進行高度多重PCR 時，引物的退火溫度應(yīng)為56-65°C，更優(yōu)選57-63°C，最優(yōu)選59-61°C。此外，一個基因 座特異性引物對的正向和反向引物，以及多重PCR混合物的所有引物之間的退火溫度差 異應(yīng)小于4°C。所有引物應(yīng)是給定試驗的特異性PCR引物，例如，在人類法醫(yī)學(xué)或診斷 學(xué)多重應(yīng)用中應(yīng)是人類特異性引物。基因座特異性引物對以及多重反應(yīng)混合物中的所有 引物在PCR或多重-PCR中應(yīng)不會產(chǎn)生非特異性副產(chǎn)物。而且，非常重要的是應(yīng)避免多 重反應(yīng)混合物的所有引物之間發(fā)生DNA序列自身互補，以防止在PCR或多重PCR中形 成自身二聚體或異質(zhì)二聚體。可用任何合適的方法，例如磷酸三酯和磷酸二酯法，或其自動化實施方式制備 寡核苷酸引物。在這類自動化的一種實施方式中，將二乙基亞磷酰胺用作原料，根據(jù)通 過引用納入本文的 Beaucage 等，Tetrahedron Letters，22: 1859-1862 (1981)所述進行合 成。一種在修飾的固體支持物上合成寡核苷酸的方法參見美國專利號4,458,006，通過引 用納入本文。也可采用分離自生物來源(例如限制性核酸內(nèi)切酶消化物)的引物。用含有模板序列的核酸擴增靶核酸序列。如果這種核酸含有兩條鏈，將其用 作模板之前需要分離核酸的二條鏈，可以單獨步驟分離或與引物延伸產(chǎn)物的合成同時分 離?？捎萌魏魏线m的變性方法，包括物理、化學(xué)或酶學(xué)方法實施這種鏈分離。分離 核酸鏈的一種物理方法包括加熱核酸，直到其完全(> 99% )變性。熱變性涉及的溫 度范圍通常為約80°C _105°C，優(yōu)選約90°C-98°C，更優(yōu)選93°C _95°C，時間范圍為約 1-10分鐘。也可用稱為解旋酶的這類酶或RecA酶誘導(dǎo)鏈分離，RecA具有解旋酶活性且已知能變性DNA。適合用解旋酶分離核酸鏈的反應(yīng)條件參見冷泉港定量生物學(xué)研討 會(Cold Spring Harbor Symposia onQuantitative Biology)，第 XLIII 卷，“DNA 復(fù)制和 重組”(DNA: Replicationand Recombination)(紐約州(NewYork)冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratory)，1978)，采用 RecA 的技術(shù)參見 C.Radding，Ann.Rev.Genetics,
16: 405-37(1982)，通過引用納入本文?？捎萌魏魏线m方法進行合成。通常，在緩沖水溶液中進行合成。在一些優(yōu)選 的實施方式中，所述緩沖液的pH約為7.5-9.2 (在室溫下調(diào)節(jié))。優(yōu)選將摩爾過量(對克 隆的核酸而言，引物模板的比例通常為約1000 1，對基因組核酸而言，引物模板 的比例通常為約IO6: 1)的兩種寡核苷酸引物加入到含有分離的模板鏈的緩沖液中。然 而應(yīng)理解，如果將本文所述方法用于某些應(yīng)用，互補鏈的量可能未知，因此不能明確確 定相對于互補鏈含量所需要的引物用量。然而，作為一個實際問題，當復(fù)雜的長鏈核酸 鏈的混合物中包含待擴增序列時，加入的引物摩爾量通常需超過互補鏈(模板)含量。 優(yōu)選超過的摩爾量較大可提高該方法的效率。PCR的優(yōu)選反應(yīng)條件如下20mMTris/ HCl-緩沖液(室溫調(diào)節(jié)至 pH 8.8)，200 μ M (40-500 μ Μ) dNTP, 1-10 (1-4) mM MgCl2, 50mM KCl,寡核苷酸引物各0.05-2 μ Μ, 0.05-0.5% (體積/體積)吐溫20和1-2.5單 位Taq DNA聚合酶。在一些實施方式中(分析法醫(yī)學(xué)殘跡、單細胞或低拷貝數(shù)(LCN) DNA)，優(yōu)選采用Taq DNA聚合酶和所謂“熱啟動技術(shù)”(美國專利號05587287 ；美國 專利號05677152;美國專利號06214557 ；美國專利號06183967)以避免非特異性擴增。 而且，缺乏5’ 一3’核酸外切酶活性的遺傳工程改造的Taq DNA聚合酶(例如，歐洲專 利號0553264，歐洲專利號1507002，歐洲專利號0395736，歐洲專利號0983364)對某些 應(yīng)用有利?？捎肗onidet Ρ-40
或曲通Χ-100
代替去污劑吐溫20，或者采用這些去污劑的混合物(例如，吐溫20和Nonidet Ρ-40)。可用ΝΗ4+(終濃度l_20mM)代替單價陽離子K+，或采用這兩種陽離子的混合 物。有時，優(yōu)選除氯以外的陰離子，例如硫酸根或醋酸根離子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道還 有其他添加劑，例如DNA聚合酶的穩(wěn)定劑和/或PCR增強劑。這些物質(zhì)的例子是甜菜堿 (0.1-2.0M)、海藻糖(0.02-2.0M)、山梨糖醇(0.02-2.0M)、二甲基亞砜(高達5%體積/ 體積)或四甲基氯化銨(高達5%體積/體積)。此外，有時可加入200-2000mg/mL牛 血清白蛋白(BSA)或明膠以中和不純DNA樣品制劑中PCR抑制物的作用。也優(yōu)選在合成混合物中加入足量的三磷酸核苷，優(yōu)選dATP、dCTP、dGTP、 dTTP和/或dUTP。核苷酸的摩爾濃度優(yōu)選為40-500 μ M，具體是100-250 μ Μ。雖然 這種dNTP濃度適合于本發(fā)明方法，但高于500 μ M的濃度可能有利于某些實施方式。優(yōu)選本發(fā)明聚合酶選自以下菌屬的細菌棲熱菌屬(Thermus)、產(chǎn)液 菌屬(Aquifex)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、熱發(fā)狀菌屬(Thermocridis)、氫桿 菌屬(Hydrogenobacter)、嗜熱藍細菌屬(Thermosynchecoccus)禾口熱厭氧桿菌屬 (Thermoanaerobacter)。優(yōu)選本發(fā)明聚合酶選自以下生物體伊歐產(chǎn)液菌屬(Aquifex aeolicus)、釀膿產(chǎn) 液菌屬(Aquifex pyogenes)、B耆熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、7_Κ生棲熱菌(Thermus aquaticus)、那不勒其j 棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)、太平洋棲熱菌(Thermus pacificus)禾口海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)。
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DNA聚合酶I是在原核細胞中介導(dǎo)DNA復(fù)制過程的酶。Pol I是首個發(fā)現(xiàn)的具 有聚合酶活性的酶，并且是對其特征最了解的酶。雖然此酶是發(fā)現(xiàn)的具有獲得性聚合酶 活性的第一種酶，但它不是參與細菌DNA復(fù)制的原始酶。1956年Arthur Komberg發(fā)現(xiàn) 它是第一種已知的DNA聚合酶，最初是在大腸桿菌(E.coli)中得到特征鑒定，但它在原 核生物中廣泛存在。常將它簡稱為Poll。在大腸桿菌和許多其他細菌中，編碼Poll的 基因稱為pol-A。在本發(fā)明中，優(yōu)選的酶是pol-A型聚合酶。最優(yōu)選的聚合酶是Taq DNA聚合酶。在一個實施方式中，在PCR反應(yīng)中摻入尿嘧啶殘基。尿嘧啶DNA糖基化酶(尿 嘧啶-N-糖基化酶)是大腸桿菌ung基因的產(chǎn)物，已克隆、測序和在大腸桿菌中表達。 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)能去除DNA (單鏈和雙鏈)中的這些尿嘧啶殘基，但不破 壞DNA糖-磷酸二酯鍵主鏈，從而防止其成為雜交靶點或DNA聚合酶的模板。在升高 的溫度下，(酶解)產(chǎn)生的脫堿基位點易于被水解切割。因此，去除尿嘧啶堿基通常伴 隨著DNA片段化。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何使用尿嘧啶DNA糖基化酶來避免污染。同 樣，此酶以及尿嘧啶核苷酸均可用于本發(fā)明試劑盒中。在一個優(yōu)選實施方式中，至少同時擴增25個基因座。在另一實施方式中，可用等位基因特異性多重PCR擴增本發(fā)明的DIP基因座 (本文披露的SEQ ID)和基因分型(美國專利號5,595,890 ； Newton CR，Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, MarkhamAF. “DNA 中 的點突變分析擴增受阻突變系統(tǒng)(Analysis ofanypoint mutation in DNA.The amplification refractory mutation system (ARMS)) .Nucleic Acids Res 17 2503-2516，1989)。在這個例 子中，每個基因座用了三種引物，一種是基因座特異性引物，兩種是等位基因特異性引 物。等位基因特異性引物的3’ -末端位于DIP序列內(nèi)，這種方式可使DNA聚合酶合成 等位基因特異性延伸產(chǎn)物。因此，在雜合DNA的情況下，可在一次PCR中用基因座特 異性引物同時產(chǎn)生兩種不同擴增子。如果這兩種等位基因特異性擴增子可通過電泳區(qū)分 其大小，只需采用一種標記的引物(基因座特異性引物)。如果不能區(qū)分，可用人造加尾 序列延伸一個等位基因特異性引物的5’端(用核苷酸或遷移修飾劑在5’端加尾)，或 者用兩種不同的熒光團標記兩種等位基因特異性引物的5’端。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，至少同時擴增30個基因座。在另一優(yōu)選的實施方式中，至少同時擴增40個基因座。在進一步優(yōu)選的實施方式中，至少同時擴增50個基因座。在本發(fā)明序型分析試驗的一個特別優(yōu)選的實施方式中，所述三組擴增產(chǎn)物包括 至少六種擴增產(chǎn)物。本發(fā)明人第一次證明，一次反應(yīng)產(chǎn)生30種擴增產(chǎn)物是可能的，反應(yīng) 中至少用三種顏色標記PCR引物。本發(fā)明人已鑒定到這種理想的分布，能夠在多個裝置 上進行檢測，同時能夠提高相同性綜合概率(CPI)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這使得能夠額外利用測序裝置中通常存在的第四種顏色作為不 同類型的對照和/或梯。因此，采用至少三組擴增產(chǎn)物可能包含至少十種擴增產(chǎn)物這一令人驚訝的事 實，第一次使得能夠采用數(shù)量足夠高的DIP獲得高的相同性綜合概率(CPI)評分，同時允 許有一個額外的對照泳道/染料/標記。這導(dǎo)致不需要使用STR。
本發(fā)明人已用德國人群的樣品測試過該系統(tǒng)。該系統(tǒng)的相同性綜合概率(CPI) 為2,1X10_13。這是一個極佳值，優(yōu)于采用8種STR的AmpFISTRMinifilier試劑盒(CPI為 8,21xlO-11)。另外，本發(fā)明人能夠證明，本發(fā)明30種DIP的CPE/Trio(排除親子關(guān)系的綜合 概率)為 0,9979205。因此，在本發(fā)明序型分析試驗的一個實施方式中，a)-c)三組擴增產(chǎn)物包括至 少十種擴增產(chǎn)物，它們顯示的相同性綜合概率(CPI)為2,1X10_13或更優(yōu)，和/或它們的 CPE/Trio(排除親子關(guān)系的綜合概率)為0,9979205或更優(yōu)。各基因座的兩個等位基因的大小差異優(yōu)選大于1個核苷酸小于40個核苷酸。源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的兩種或多種 擴增產(chǎn)物優(yōu)選攜帶第四標記。同樣，在另一實施方式中，可采用5、6、7種或更多種標 記。由于DNA的核苷酸內(nèi)含物優(yōu)選4種標記，，因此用于擴增產(chǎn)物DNA測序的大多數(shù) 裝置都能夠檢測4種標記。所述標記優(yōu)選熒光染料。這類染料可選自熒光素異硫氰酸酯(FITC)、6-羧基 熒光素(6-FAM)、2，7-螢光素二醋酸酯(xanthen)、羅丹明、6-羧基-2，，4，，7，， 4，7-六氯熒光素(HEX)、6-羧基-4，，5，-二氯_2，，7，-二甲氧基熒光素(JOE)、 N，N，N，，N，-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、 5_羧基羅丹明-6GCR6G5)、2，-氯_7，苯基-1，4-二氯-6-羧基熒光素(VIC)、 2'-氯-5'-氟-7'，8'-苯并-1，4-二氯-6-羧基熒光素(NED)或PET(美國加 州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems、Foster City、CA、USA)的專有產(chǎn) 品)、6-羧基羅丹明-6G(RG6)、羅丹明110;香豆素、得克薩斯紅、Cy3、Cy5、Cy7和 BODIPY 染料。用三種顏色標記PCR寡核苷酸內(nèi)部長度標準品時，優(yōu)選的組合是6-FAM(藍 色)、VIC(綠色)、NED(黃色)，ROX(紅色)。任選將6-FAM(藍色)、VIC(綠 色)、NED (黃色)和PET (紅色)用作PCR引物標記，聯(lián)合用LIZ (橙色)標記內(nèi)部長度 標準品。表1列出了與應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(美國加州福斯特城)自動化測序設(shè)備聯(lián)用的 多重PCR所用的其他優(yōu)選的標記染料組合。應(yīng)提及，也有其他多色自動化測序設(shè)備，如 CEQ 8000系列遺傳分析儀(美國加州富勒敦的貝克曼庫爾特公司(Beckmarai Coulter, Fullerton, CA, USA))、MEGABace 系列基因分型系統(tǒng)(英國白金漢郡的GE健康護 理公司(GE Healthcare，Buckinghamshire, UK))或 LI-CORE 4300 DNA 分析系統(tǒng)(英國 劍橋的英國 LI-CORE 生物科學(xué)公司(LI-CORE Biosciences UK，Cambridge, UK))，或 可能出現(xiàn)其他光學(xué)系統(tǒng)、因而需要其他熒光染料和染料組合的自動化設(shè)備。因此，聯(lián)用 其他熒光團用于其他自動化測序設(shè)備的本發(fā)明實施方式任何時候都有可能建立。美國專利6,734,296、美國專利5,624,800和WO 2006071568 (通過引用納入本文) 公開了用所謂遷移修飾劑提高后續(xù)用毛細管凝膠電泳進行基因分型的多重檢測的應(yīng)用程 度。遷移修飾劑定義為引物5’端的共價非核苷酸修飾，這種修飾能降低DNA擴增產(chǎn) 物、引物延伸產(chǎn)物或寡核苷酸-連接酶產(chǎn)物的電泳遷移率。這種技術(shù)能夠分離含有相同 數(shù)量核苷酸的多種擴增產(chǎn)物的DNA片段。在一個優(yōu)選的實施方式中，通過標準的亞磷 酰胺化學(xué)法，在寡核苷酸5’端與多種引物亞組的熒光標記之間合成不同數(shù)量(n= 1、2、3、....)的六乙二醇部分(Grossman PD，BlochW，Brinson E, Chang CC, Eggerding FA, Fung S, Iovannisci, DM, Woo S, Winn-Deen ES. “核酸序列的高密度多重檢 測寡核苷酸連接試驗和序列編碼的分離(High-densitymultiplex detection of nucleic acid sequences oligonucleotide ligation assayand sequence-coded separation), Nucleic Acids Res
22 4527-34， 1994)。表1:與應(yīng)用生物系統(tǒng)公司測序設(shè)備相容的組合熒光染料。染料縮寫名的解釋 參見正文。
顏色數(shù)藍色綠色黃色紅色橙色46-FAMHEXNEDROX46-FAMVICNEDROX46-FAMTETHEXTAMRA46-FAMJOENEDROX56-FAMVICNEDPETLIZ56-FAMHEXNEDPETLIZ45/6-FAMJOETMRROX在一個實施方式中，用毛細管凝膠電泳裝置進行檢測步驟。也可以在凝膠裝置 上進行檢測步驟。為各個基因座構(gòu)建等位基因梯后，在加入擴增樣品的同時，混合和加入這些基 因梯進行凝膠電泳。各等位基因梯與樣品中相應(yīng)基因座的等位基因共同遷移?？衫糜?道內(nèi)部標準品評價本發(fā)明多重反應(yīng)的產(chǎn)物，泳道內(nèi)部標準品是專門用于在聚丙烯酰胺凝 膠同一泳道或同一根毛細管中運行的大小標記物類型。泳道內(nèi)部標準品優(yōu)選由一系列已 知長度的片段組成。泳道內(nèi)部標準品更優(yōu)選用一種熒光染料標記，該染料可與擴增反應(yīng) 中的其他染料相區(qū)別。本發(fā)明還涉及本文所述DIP在制備等位基因梯中的應(yīng)用。構(gòu)建泳道內(nèi)部標準品后，也可將此種標準品與擴增的樣品或等位基因梯混合加 入進行電泳，比較凝膠電泳不同泳道中或毛細管電泳不同毛細管中的遷移。泳道內(nèi)部標 準品遷移的差異標示出分離介質(zhì)行為的差異。定量測定此種差異并與等位基因梯相關(guān)聯(lián) 后，能夠校正對未知樣品中等位基因大小的測定。在另一實施方式中，還擴增一個或多個短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，和/或擴增 一個或多個數(shù)目不同的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，和/或擴增一個或多個單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。因此，按照這些實施方式，DIP可與其他多態(tài)性序列混合。優(yōu)選STR序列。
28
至關(guān)重要的是經(jīng)常需要能夠測定個體的性別。因此，在前述權(quán)利要求任一項所 述的序型分析試驗的一個實施方式中，還擴增一個或多個非重組無變異的X-和/或Y-染 色體DNA序列、性別特異性短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，和/或一個或多個性別特異性數(shù)目 不同的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)和/或擴增一個或多個性別特異性單核苷酸多態(tài)性(SNP)。 優(yōu)選的基因座是牙釉蛋白基因座，它有兩個平行進化的同源拷貝AmelX和AmelY，位 于人性染色體的非重組區(qū)域內(nèi)(AkaneA. “用PCR分析X_Y牙釉蛋白基因進行性別鑒 定” (Sexdetermination by PCR analysis of the X_Y amelogenin gene)，Methods MolBiol，第 98卷，第245-249頁，1998)。牙釉蛋白基因的內(nèi)含子1某些部分編碼DIP，可通過聚 合酶鏈反應(yīng)(PCR)利用該DIP測定未知來源樣品的人性別。例如，DNASEQIDN0.61 和SEQ ID N0.62分別是AmelX和AmelY序列，其編碼6bp DIP (-/AAAGTG)?？捎霉瓅 物SEQ ID NO.185和SEQ IDN0.186擴增X-染色體的113bp片段和Y-染色體的119bp， 進行電泳分離。同樣，DNA SEQ ID N0.63和SEQ ID N0.64分別是AmelX和AmelY序 列，其編碼3bp DIP (-/GAT)。可用引物SEQ ID NO. 187和SEQ ID NO. 188擴增X-染色 體的83bp片段和Y-染色體的86bp，進行電泳分離。本發(fā)明方法所用的引物對必須滿足某些標準。它們必須能與所需位置特異性雜 交。假退火對該反應(yīng)非常不利。Ta優(yōu)選50-68°C，更優(yōu)選56-65°C或57-63°C，最優(yōu)選 59-61°C。GC含量優(yōu)選20-60% GC。長度優(yōu)選18_30bp。在多重PCR中，優(yōu)選引物最 大自身互補和所有引物之間的最大互補為3-7bp。而且，高度多重PCR合適引物的選擇 總是需要根據(jù)經(jīng)驗使之優(yōu)化以避免產(chǎn)生非特異性副產(chǎn)物。在本發(fā)明序型分析試驗的一個非常優(yōu)選的實施方式中，引物-寡核苷酸對選自 具有以下序列的核酸分子a) DIP NO. 1 SEQ ID NO.125 和 SEQ ID NO.126
或者 SEQ ID N0.267 和 SEQ ID N0.268b)DIPN0.2 SEQ ID NO. 127 和 SEQ ID NO. 128c)DIPN0.3 SEQ ID NO.129 和 SEQ ID NO.130d) DIP NO.4 SEQ ID NO. 131 和 SEQ ID NO. 132e)DIPN0.5 SEQ ID NO.133 和 SEQ ID NO.134f)DIP NO.6 SEQ ID N0.135 和 SEQ ID NO. 136g)DIPN0.7 SEQ ID NO. 137 和 SEQ ID NO. 138h) DIP NO.8 SEQ ID NO. 139 和 SEQ ID NO. 140或者SEQ ID N0.287 和 SEQ ID N0.288i) DIP NO.9 SEQ ID NO. 141 和 SEQ ID NO. 142j) DIP NO. 10 SEQ ID NO. 143 禾口 SEQ ID NO. 144k)DIP NO.ll SEQ ID NO. 145 和 SEQ ID NO. 1461) DIP NO. 12 SEQ ID NO. 147 和 SEQ ID NO. 148m) DIP NO. 13 SEQ ID NO. 149 和 SEQ ID N0.150n)DIP NO. 14 SEQ ID NO. 151 和 SEQ ID NO. 152o) DIP NO. 15 SEQ ID NO. 153 和 SEQ ID NO. 154或者SEQ ID N0.281 和 SEQ ID N0.282
p) DIP NO. 16 SEQIDN0.155 和 SEQIDN0.156q) DIP NO. 17 SEQ ID N0.157 和 SEQ ID N0.158或者SEQ ID N0.273 和 SEQ ID N0.274r)DIP NO. 18 SEQ ID NO. 159 和 SEQ ID NO. 160或者SEQ ID N0.277 和 SEQ ID N0.278s) DIP NO. 19 SEQ ID NO. 161 和 SEQ ID NO. 162或者SEQ ID N0.279 和 SEQ ID N0.280t) DIP N0.20 SEQ ID NO. 163 和 SEQ ID NO. 164或者SEQ ID N0.275 和 SEQ ID N0.276u)DIPN0.21 SEQ ID NO. 165 和 SEQ ID NO. 166v) DIP N0.22 SEQ ID NO. 167 和 SEQ ID NO. 168w)DIPN0.23 SEQ ID NO. 169 和 SEQ ID NO. 170x)DIP N0.24 SEQ ID NO. 171 和 SEQ ID NO. 172y)DIPN0.25 SEQ ID NO. 173 禾口 SEQ ID NO. 174z)DIPN0.26 SEQ ID NO.175 和 SEQ ID NO.176aa)DIPN0.27 SEQ ID NO. 177 和 SEQ ID NO. 178ab)DIPN0.28 SEQ ID NO.179 和 SEQ ID NO.180ac) DIP N0.29 SEQ ID NO. 181 和 SEQ ID NO. 182或者SEQ ID N0.271 與 SEQ ID N0.272ad)DIPN0.30 SEQ ID NO. 183 和 SEQ ID NO. 184或者SEQ ID N0.283 和 SEQ ID N0.284ae)DIPN0.31 SEQ ID NO. 185 和 SEQ ID NO. 186af) DIP N0.32 SEQ ID NO. 187 和 SEQ ID NO. 188或者SEQ ID N0.269 和 SEQ ID N0.270ag)DIPN0.33 SEQ ID NO. 189 和 SEQ ID NO. 190或者SEQ ID N0.285 和 SEQ ID N0.286ah) DIP N0.34 SEQ ID NO. 191 和 SEQ ID NO. 191ai)DIPN0.35 SEQ ID NO. 193 和 SEQ ID NO. 194aj)DIPN0.36 SEQ ID NO. 195 和 SEQ ID NO. 196ak)DIPN0.37 SEQ ID NO. 197 和 SEQ ID NO. 198al) DIP N0.38 SEQ ID NO. 199 和 SEQ ID N0.200am)DIPN0.39 SEQ ID N0.201 和 SEQ ID N0.202an) DIP N0.40 SEQ ID N0.203 和 SEQ ID N0.204
ao) DIP N0.41 SEQ ID N0.205 和 SEQ ID N0.206或者SEQ ID N0.251 與 SEQ ID N0.252ap) DIP N0.42 SEQ ID N0.207 和 SEQ ID N0.208或者SEQ ID N0.253 和 SEQ ID N0.254aq) DIP N0.43 SEQ ID N0.209 和 SEQ ID N0.210或者SEQ ID N0.255 與 SEQ ID N0.2560127]ar) DIP N0.44 SEQ ID N0.211 和 SEQ ID N0.2120128]或者 SEQ ID N0.257 和 SEQ ID N0.2580129]as) DIP N0.45 SEQ ID N0.213 和 SEQ ID N0.2140130]或者 SEQ ID N0.259 和 SEQ ID N0.2600131]at) DIP N0.46 SEQ ID N0.215 和 SEQ ID N0.2160132]或者 SEQ ID N0.261 和 SEQ ID N0.2620133]au) DIP N0.47SEQ ID N0.217 和 SEQ ID N0.2180134]或者 SEQ ID N0.263 和 SEQ ID N0.2640135]av) DIP N0.48 SEQ ID N0.219 和 SEQ ID N0.2200136]aw) DIP N0.49SEQIDN0.221 和 SEQIDN0.2220137]ax) DIP N0.50SEQ ID N0.223 和 SEQ ID N0.2240138]ay) DIP NO.51SEQ ID N0.225 和 SEQ ID N0.2260139]或者 SEQ ID N0.265 和 SEQ ID N0.2660140]az) DIP N0.52 SEQ ID N0.227 和 SEQ ID N0.2280141]ba) DIP N0.53SEQ ID N0.229 和 SEQ ID N0.2300142]bb) DIP N0.54SEQ ID N0.231 和 SEQ ID N0.2320143]be) DIP N0.55SEQ ID N0.233 和 SEQ ID N0.2340144]bd) DIP N0.56SEQ ID N0.235 和 SEQ ID N0.2360145]be) DIP N0.57SEQ ID N0.237 和 SEQ ID N0.2380146]bf) DIP N0.58 SEQ ID N0.239 和 SEQ ID N0.2400147]bg) DIP N0.59SEQ ID N0.241 和 SEQ ID N0.2420148]bh) DIP N0.60SEQ ID N0.243 和 SEQ ID N0.2440149]bi) DIP NO.61 SEQ ID N0.245 和 SEQ ID N0.2460150]bj) DIP N0.62 SEQ ID N0.247 與 SEQ ID N0.2480151]bk) DIP N0.63SEQ ID N0.249 和 SEQ ID N0.2500152]優(yōu)選選擇至少 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、9、20、21、22、23、24、25、26、27 對或 30 對以上。0153]本發(fā)明涉及一種用于DNA序型分析方法的試劑盒，其包括用于聚合酶鏈反應(yīng)擴
增的至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30對或更多對引物，其中所述引物對由一個上游引 物和一個下游引物組成，能夠結(jié)合選自以下序列中任何之一的特異性DIP序列，DIP NO. 1 -SEQ ID N0.1,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.2,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.2 -SEQ ID N0.3,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID N0.4,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間，DIP N0.3 -SEQ ID N0.5,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，0162]-SEQ ID N0.6,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
0163]DIP N0.4
0164]-SEQIDNO
0165]-SEQIDNO
0166]DIP N0.5
0167]-SEQIDNO
0168]-SEQIDNO
0169]DIP N0.6
0170]-SEQ ID NO
0171]-SEQ ID NO
0172]DIP NO.7
0173]-SEQ ID NO
0174]-SEQ ID NO
0175]DIP NO.8
0176]-SEQ ID NO
0177]-SEQ ID NO
0178]DIP N0.9
0179]-SEQ ID NO
0180]-SEQ ID NO
0181]DIP NO. 10
0182]-SEQ ID NO
0183]-SEQ ID NO
0184]DIP NO. 11
0185]-SEQ ID NO
0186]-SEQ ID NO
0187]DIP NO. 12
0188]-SEQ ID NO
0189]-SEQ ID NO
0190]DIP NO. 13
0191]-SEQ ID NO
0192]-SEQ ID NO
0193]DIP NO. 14
0194]-SEQ ID NO
0195]-SEQ ID NO
0196]DIP NO. 15
0197]-SEQ ID NO
0198]-SEQ ID NO
0199]DIP NO. 16
0200]-SEQ ID N0.31，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，
,7，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， ,8，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與262之間，
,9，其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸編251與252之間， ,10，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,11，其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,12，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,13，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,14，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,15，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,16，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,17,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,18，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間，
,19，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間， ,20，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間，
,21，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,22，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,23，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， ,24，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與260之間，
,25，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,26，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,27，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,28，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間，
,29，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,30，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與263之間，
32-SEQ ID N0.32，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO 17 -SEQ ID N0.33, -SEQ ID N0.34, DIP NO. 18 -SEQ ID N0.35, -SEQ ID N0.36, DIP NO. 19 -SEQ ID N0.37, -SEQ ID N0.38, DIP N0.20 -SEQ ID N0.39, -SEQ ID N0.40, DIP N0.21 -SEQ ID N0.41, -SEQ ID N0.42, DIP N0.22 -SEQ ID N0.43, -SEQ ID N0.44, DIP N0.23 -SEQ ID N0.45, -SEQ ID N0.46, DIP N0.24 -SEQ ID N0.47, -SEQ ID N0.48, DIP N0.25 -SEQ ID N0.49, -SEQ ID N0.50, DIP N0.26 -SEQ ID N0.51, -SEQ ID N0.52, DIP NO 27 -SEQ ID N0.53, -SEQ ID N0.54, DIP N0.28 -SEQ ID N0.55, -SEQ ID N0.56, DIP N0.29
-SEQ ID N0.57,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間，
其中插入_缺失多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中插入_缺失多態(tài)性位于核苷酸251與263之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與257之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與263之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與296之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與266之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與273之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間，-SEQ ID N0.58，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與267之間， DIP N0.30 -SEQ ID N0.59, -SEQ ID N0.60, DIP N0.31 -SEQ ID N0.61, -SEQ ID N0.62, DIP N0.32 -SEQ ID N0.63, -SEQ ID N0.64, DIP N0.33 -SEQ ID N0.65, -SEQ ID N0.66, DIP N0.34 -SEQ ID N0.67, -SEQ ID N0.68, DIP N0.35 -SEQ ID N0.69, -SEQ ID N0.70, DIP N0.36 -SEQ ID N0.71, -SEQ ID N0.72, DIP N0.37 -SEQ ID N0.73, -SEQ ID N0.74, DIP N0.38 -SEQ ID N0.75, -SEQ ID N0.76, DIP N0.39 -SEQ ID N0.77, -SEQ ID N0.78, DIP N0.40 -SEQ ID N0.79, -SEQ ID N0.80, DIP N0.41 -SEQ ID N0.81, -SEQ ID N0.82, DIP N0.42
-SEQ ID N0.83，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸271與272之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸271與278之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸280與281之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸280與284之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸255與256之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸255與261之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與259之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間，
-SEQ ID N0.84，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間，DIP N0.43 -SEQ ID N0.85,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.86，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與255之間，DIP NO.44 -SEQ ID N0.87，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID N0.88，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間，DIP N0.45 -SEQ ID N0.89，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID N0.90,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間，DIP N0.46 -SEQ ID N0.91，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID N0.92,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間，DIP N0.47 -SEQ ID N0.93，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.94，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.48 -SEQ ID N0.95，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.96，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.49 -SEQ ID N0.97，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與248之間，-SEQ ID N0.98，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與252之間，DIP N0.50 -SEQ ID N0.99，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID NO. 100,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，DIPN0.51 -SEQ ID NO. 101,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.102,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間，DIP N0.52 -SEQ ID N0.103,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID NO. 104,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID NO. 106,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID NO. 108,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間，DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，
一SEQ ID NO．110，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與258之間，
DIP NO．56
一SEQ ID NO．11l，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與25l之間，
一SEQ ID NO．112，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間，
DIP NO．57
一SEQ ID NO．113，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間，
一SEQ ID NO．114，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間，
DIP NO．58
一SEQ ID NO．115，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與25l之間，
一SEQ ID NO．116，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與263之間，
DIP NO．59
一SEQ ID NO．117，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與25l之間，
一SEQ ID NO．118，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與266之間，
DIP NO．60
一SEQ ID NO．119，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．120，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與268之間，
DIP NO．6l
一SEQ ID NO．12l，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與25l之間，
一SEQ ID NO．122，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與277之間，
DIP NO．62
一SEQ ID NO．123，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．124，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與260之間，
DIP NO．63
一SEQ ID NO．289，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與25l之間，
一SEQ ID NO．290，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，
其中所述引物對各為不同DIP序列的特異性引物對。
所述試劑盒優(yōu)選包括至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2l、22、23、24、25、26、27或30個以上引物對。
所述試劑盒優(yōu)選至少包括20、30或40個DIP的引物，所述試劑盒包括DIP編號3l的引物(SEQ ID NO．6l和62)和DIP編號32的引物(SEQ IDNO．63和64)。
這兩種DIP分別是Y染色體和X染色體上的DIP。
所述試劑盒優(yōu)選包括各自能夠結(jié)合選自以上不同序列的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2l、22、23、24、25、26、27、28、29或30．／卜引物對。
優(yōu)選試劑盒包括的引物對選自以下的引物對
a)DIP NO．1SEQ II)NO．125和SEQ II)NO．126
或者SEQ ID NO．267和SEQ ID NO．268
b)DIP NO．2SEQ II)NO．127和SEQ II)NO．128
C)DIP NO．3SEQ II)NO．129和SEQ II)NO．130d)DIP N0.4 SEQ ID NO. 131 禾口 SEQIDN0.132
e)DIP N0.5 SEQ ID NO.133 禾口 SEQ ID NO.134
f)DIPN0.6 SEQ ID N0.135 和 SEQ ID NO. 136
g)DIPN0.7 SEQ ID NO. 137 禾P SEQ ID NO. 138
h)DIP N0.8 SEQ ID NO. 139 禾P SEQ ID NO. 140 或者 SEQ ID N0.287 和 SEQ ID N0.288
i)DIP N0.9 SEQ ID NO. 141 和 SEQ ID NO. 142 j) DIP NO. 10 SEQ ID NO. 143 禾口 SEQ ID NO. 144 k)DIP NO.ll SEQ ID NO. 145 和 SEQ ID NO. 146 1) DIP NO. 12 SEQ ID NO. 147 和 SEQ ID NO. 148 m) DIP NO. 13 SEQ ID NO. 149 禾P SEQ ID N0.150 n) DIP NO. 14 SEQ ID NO. 151 和 SEQIDN0.152 o) DIP NO. 15 SEQ ID NO. 153 禾P SEQ ID NO. 154 或者 SEQ ID N0.281 和 SEQ ID N0.282
p) DIP NO. 16 SEQ ID NO. 155 和 SEQ ID NO. 156
q) DIP NO. 17 SEQ ID NO. 157 禾P SEQ ID NO. 158
或者 SEQ ID N0.273 和 SEQ ID N0.274
r)DIP N0.18 SEQ ID NO. 159 和 SEQ ID N0.160
或者 SEQ ID N0.277 和 SEQ ID N0.278
s) DIP NO. 19 SEQ ID NO. 161 和 SEQ ID NO. 162
或者 SEQ ID N0.279 和 SEQ ID N0.280
t) DIP N0.20 SEQ ID NO. 163 和 SEQ ID NO. 164
或者 SEQ ID N0.275 和 SEQ ID N0.276
u) DIP N0.21 SEQ ID NO. 165 和 SEQ ID NO. 166
v) DIP N0.22 SEQ ID NO. 167 和 SEQ ID NO. 168
w) DIP N0.23 SEQ ID NO. 169 禾P SEQ ID NO. 170
x) DIP N0.24 SEQ ID NO. 171 和 SEQIDN0.172
y) DIP N0.25 SEQ ID NO. 173 禾P SEQ ID NO. 174
z) DIP N0.26 SEQ ID NO.175 和 SEQ ID NO. 176
aa)DIP N0.27 SEQ ID NO. 177 和 SEQ ID NO. 178
ab)DIP N0.28 SEQ ID NO. 179 和 SEQ ID NO.180
ac)DIP N0.29 SEQ ID NO. 181 和 SEQ ID NO. 182 或者 SEQ ID N0.271 與 SEQ ID N0.272
ad)DIP N0.30 SEQ ID NO. 183 和 SEQ ID NO. 184 或者 SEQ ID N0.283 和 SEQ ID N0.284
ae)DIP N0.31 SEQ ID NO. 185 和 SEQ ID NO. 186
af)DIP N0.32 SEQ ID NO. 187 和 SEQ ID NO. 188 或者 SEQ ID N0.269 和 SEQ ID N0.270
ag)DIP N0.33 SEQ ID NO. 189 和 SEQ ID NO. 190
37或者 SEQ ID N0.285 和 SEQ ID N0.286
ah)DIP N0.34 SEQ ID NO. 191 和 SEQ ID NO. 191
ai)DIP N0.35 SEQ ID NO. 193 和 SEQ ID NO. 194 aj) DIP N0.36 SEQ ID NO. 195 和 SEQ ID NO. 196 ak) DIP N0.37 SEQ ID NO. 197 和 SEQ ID NO. 198 al) DIP N0.38 SEQ ID NO. 199 和 SEQ ID N0.200 am) DIP N0.39 SEQ ID N0.201 和 SEQ ID N0.202 an) DIP N0.40 SEQ ID N0.203 禾口 SEQ ID N0.204 ao) DIP N0.41 SEQ ID N0.205 和 SEQ ID N0.206 或者 SEQ ID N0.251 與 SEQ ID N0.252
ap) DIP N0.42 SEQ ID N0.207 禾口 SEQ ID N0.208
或者 SEQ ID N0.253 和 SEQ ID N0.254
aq) DIP N0.43 SEQ ID N0.209 和 SEQ ID N0.210
或者 SEQ ID N0.255 與 SEQ ID N0.256
ar) DIP N0.44 SEQ ID N0.211 和 SEQ ID N0.212
或者 SEQ ID N0.257 和 SEQ ID N0.258
as) DIP N0.45 SEQ ID N0.213 和 SEQ ID N0.214
或者 SEQ ID N0.259 和 SEQ ID N0.260
at) DIP N0.46 SEQ ID N0.215 禾P SEQIDN0.216
或者 SEQ ID N0.261 和 SEQ ID N0.262
au) DIP N0.47 SEQ ID N0.217 禾P SEQ ID N0.218
或者 SEQ ID N0.263 和 SEQ ID N0.264
av) DIP N0.48 SEQ ID N0.219 禾口 SEQ ID N0.220
aw) DIP N0.49 SEQ ID N0.221 和 SEQ ID N0.222
ax) DIP N0.50 SEQ ID N0.223 和 SEQ ID N0.224
ay) DIP N0.51 SEQ ID N0.225 和 SEQ ID N0.226
或者 SEQ ID N0.265 和 SEQ ID N0.266
az) DIP N0.52 SEQ ID N0.227 和 SEQ ID N0.228
ba)DIP N0.53 SEQ ID N0.229 禾口 SEQ ID N0.230
bb)DIP N0.54 SEQ ID N0.231 和 SEQ ID N0.232 be) DIP N0.55 SEQ ID N0.233 禾口 SEQ ID N0.234
bd)DIP N0.56 SEQ ID N0.235 和 SEQ ID N0.236
be)DIP N0.57 SEQ ID N0.237 禾口 SEQ ID N0.238
bf)DIP N0.58 SEQ ID N0.239 和 SEQ ID N0.240
bg)DIP N0.59 SEQ ID N0.241 和 SEQ ID N0.242
bh)DIP N0.60 SEQ ID N0.243 和 SEQ ID N0.244
bi)DIP N0.61 SEQ ID N0.245 和 SEQ ID N0.246 bj) DIP N0.62 SEQ ID N0.247 與 SEQ ID N0.248 bk) DIP N0.63 SEQ ID N0.249 禾P SEQ ID N0.250
在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明涉及采用選自以下的至少2、3、4、5、6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、28、29、30個或更多個序列DIP NO. 1 -SEQ ID N0.1，其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.2，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.2 -SEQ ID N0.3，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID N0.4，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間，DIP N0.3 -SEQ ID N0.5，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.6，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.4 -SEQ ID N0.7，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID N0.8，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與262之間，DIP N0.5 -SEQ ID N0.9，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID NO.IO,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.6 _SEQIDNO.il，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.12，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.7 -SEQ ID N0.13，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID NO. 14,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.8 -SEQ ID N0.15，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.16，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.9 -SEQ ID N0.17，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.18，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間，DIP NO. 10 -SEQ ID N0.19，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間，-SEQ ID N0.20,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間，DIP NO. 11 -SEQ ID NO.21，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.22，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP NO. 12 -SEQ ID N0.23，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID N0.24，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與260之間，
DIP N0．13
一SEQ ID NO．25，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．26，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與256之間，
DIP N0．14
一SEQ ID NO．27，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．28，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與260之間，
DIP N0．15
一SEQ ID NO．29，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．30，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與263之間，
DIP N0．16
一SEQ ID NO．3l，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．32，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與256之間，
DIP N017
一SEQ ID NO．33，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．34，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與270之間，
DIP N0．18
一SEQ ID NO．35，其中插入一缺失多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．36，其中插入一缺失多態(tài)性位于核苷酸25l與263之間，
DIP N0．19
一SEQ ID NO．37，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．38，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與257之間，
DIP N0．20
一SEQ ID NO．39，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．40，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與257之間，
DIP NO．2l
一SEQ ID NO．41，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．42，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與258之間，
DIP N0．22
一SEQ ID NO．43，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與25l之間，
一SEQ ID NO．44，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與257之間，
DIP N0．23
一SEQ ID NO．45，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．46，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與257之間，
DIP N0．24
一SEQ ID NO．47，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與252之間，
一SEQ ID NO．48，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸25l與263之間，
DIP N0．25
一SEQ ID NO．49，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與25l之間，
一SEQ ID NO．50，其中缺失一插入多態(tài)性位于核苷酸250與296之間，DIP N0.26 -SEQ ID N0.51, -SEQ ID N0.52, DIP NO 27 -SEQ ID N0.53, -SEQ ID N0.54, DIP N0.28 -SEQ ID N0.55, -SEQ ID N0.56, DIP N0.29 -SEQ ID N0.57, -SEQ ID N0.58, DIP N0.30 -SEQ ID N0.59, -SEQ ID N0.60, DIP N0.31 -SEQ ID N0.61, -SEQ ID N0.62, DIP N0.32 -SEQ ID N0.63, -SEQ ID N0.64, DIP N0.33 -SEQ ID N0.65, -SEQ ID N0.66, DIP N0.34 -SEQ ID N0.67, -SEQ ID N0.68, DIP N0.35 -SEQ ID N0.69, -SEQ ID N0.70, DIP N0.36 -SEQ ID N0.71, -SEQ ID N0.72, DIP N0.37 -SEQ ID N0.73, -SEQ ID N0.74, DIP N0.38 -SEQ ID N0.75, -SEQ ID N0.76,
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與266之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與273之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與267之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸271與272之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸271與278之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸280與281之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸280與284之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸255與256之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸255與261之間，DIP N0.39 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.40 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.41 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.42 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.43 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.44 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.45 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.46 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.47 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.48 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.49 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.50 -SEQ ID NO -SEQ ID NO DIP N0.51 -SEQ ID NO -SEQ ID NO
,77,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,78,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,79,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， ,80，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與259之間，
,81，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,82，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間，
,83，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,84，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間，
,85，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,86，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與255之間，
,87，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， ,88，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間，
,89，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， ,90，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間，
,91，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， ,92，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間，
,93，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,94，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,95，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,96，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，
,97，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與248之間， ,98，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與252之間，
,99，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， ,100，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，
,101，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， ,102，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間，DIP N0.52 -SEQ ID NO. 103， -SEQ ID NO. 104， DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105， -SEQ ID NO. 106， DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107， -SEQ ID NO. 108， DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109， -SEQ ID NO. 110， DIP N0.56 -SEQ ID NO.lll, -SEQ ID NO. 112， DIP N0.57 -SEQ ID NO. 113， -SEQ ID NO. 114， DIP N0.58 -SEQ ID NO. 115， -SEQ ID NO. 116， DIP N0.59 -SEQ ID NO. 117， -SEQ ID NO. 118， DIP N0.60 -SEQ ID NO. 119， -SEQ ID NO. 120， DIP N0.61 -SEQ ID NO. 121， -SEQ ID NO. 122， DIP N0.62 -SEQ ID NO. 123， -SEQ ID NO. 124， DIP N0.63 -SEQ ID N0.289, -SEQ ID N0.290,
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與263之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與266之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與268之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與277之間，
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間，和
其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， 其中缺失_插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間。
只可以部分使用這些序列。可采用90%、80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%或20%的序列，只要其包括使用DIP。這意味著，如果本文揭示含有100個核苷酸 的序列，其中DIP距離該序列5’端30個核苷酸，那么意味可采用50%，例如，擴增從
435’端開始的前50個核苷酸，當然也意味可擴增任何50個核苷酸，只要其包含該DIP多 態(tài)性。DIPN0.31和32是牙釉蛋白DIP。優(yōu)選這些DIP是所選DIP的一部分。在一個實施方式中，所述試劑盒還可包括進行“實時PCR”應(yīng)用所需的組分。 術(shù)語“實時PCR”指依據(jù)熒光信號進行檢測和定量測定的系統(tǒng)。這種信號的增加與PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的含量成正比。通過記錄每個循環(huán)的熒光發(fā)射量，就能監(jiān)測指數(shù)期PCR反應(yīng)， 其中最初顯著增加的PCR產(chǎn)物量與目標模板的初始量相關(guān)。靶核酸的起始拷貝數(shù)越高， 觀察到熒光顯著增加越快。在3-15個循環(huán)期間檢測到熒光顯著增加超過基線值以上， 表明檢測到累積的PCR產(chǎn)物。所述組分包括但不限于嵌入性染料、熒光標記的引物和探 針，及其衍生物。本發(fā)明試劑盒可包括使用信息小冊子。本發(fā)明序型分析試驗的應(yīng)用，優(yōu)選連接酶鏈反應(yīng)試驗、雜交試驗、聚合酶鏈反 應(yīng)試驗、基于芯片的試驗。也優(yōu)選雜交試驗、陣列化引物延伸(APEX，也稱為基于芯片 的小測序反應(yīng)或單個堿基延伸)、陣列化連接試驗、等位基因特異性陣列化連接試驗。最 優(yōu)選聚合酶鏈反應(yīng)試驗。具有高度多重容量的其它基因分型技術(shù)是基于芯片的技術(shù)，單個堿基引物延伸 (SnaPShot)或基于OLA的(SNPlex)技術(shù)與毛細管電泳聯(lián)用，和珠技術(shù)與可尋址序列聯(lián) 用。這些方法和下述方法可與本文所述探針一起使用，它們都屬于本發(fā)明范圍。已知其它檢測技術(shù)也能對多重DNA混合物的雙等位基因多態(tài)性進行基因分型。 綜述參見Syvanen (2001) ( Syvanen AC, 2001. “可及的遺傳變異單核苷酸多態(tài)性的基 因分型” (Accessing genetic variation Genotypingsingle nucleotide polymorphisms), Nature Reviews Genetics 2 930-941)和 Kwock(2003) (Kwock PY, 2003.《單核苷酸多態(tài)性， 方法和方案》(SingleNucleotide Polymorphisms.Methods and Protocols).美國新澤西州托托 瓦的休曼娜出版社(Humana Press，Totowa, New Jersey, USA))。對本發(fā)明方法具有特 別價值的的技術(shù)是能夠在一次反應(yīng)中對多個DIP同時進行基因分型的技術(shù)。用于自動化
多色DNA測序和毛細管電泳聯(lián)用的兩種市售系統(tǒng)是^SWa/^Ac^ 多重系統(tǒng)(SNaPshot Multiplex System)禾P SNPlex 基因分型系統(tǒng)(SNPlex Genotyping System)(均購自美國 加州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City, CA，USA))。第 一個系統(tǒng)是基于引物延伸的方法，根據(jù)生產(chǎn)商說明，它能夠檢測10個以上的雙等位基因 多態(tài)性；第二個系統(tǒng)聯(lián)合了多重等位基因-特異性寡核苷酸連接試驗(OLA)和PCR， 能夠同時對多達48個雙等位基因的多態(tài)性進行基因分型。另一種基于電泳的多重基因 分型方法稱為多重連接依賴性探針擴增(MultiplexLigation-dependent Probe Amplification) (MLPA ； Schouten JP, McElgunn CJ，Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F 禾口 Pals G (2002)，“用多重連接依賴性探針擴增相對定量40種核酸序列”(Relative quantification of 40nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent prob amplification), Nucleic Acids Res30:e57)。而且，對本發(fā)明方法而言，基于DNA-芯片的技術(shù)特別有用。EU Patent No.820,524 and US Patent No.歐洲專利號820,524和美國專利號5,679,524 (通過引用納入 本文)揭示了基于芯片的等位基因特異性雜交試驗、陣列化引物延伸(APEX，也稱為基 于芯片的小測序反應(yīng)或芯片單堿基引物延伸)、陣列化連接反應(yīng)和等位基因特異性陣列化 連接試驗。歐洲專利號799,897(通過引用納入本文)描述了通用標簽-陣列的應(yīng)用，歐洲專利號1,186,669 897(通過引用納入本文)描述了嵌套可尋址等位基因的特異性芯片 (NOCTM)-PCR。最后，美國專利號6,287,778897 (通過引用納入本文)描述了與珠聯(lián)用 的通用標簽-序列。本發(fā)明試劑盒可用于DNA序型分析，具體是法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。該試劑盒還可包括等位基因梯。


圖1:通過多重PCR擴增進行人DNA序型分析和性別測定，并對一個性染色 體和30個常染色體的DIP進行基因分型描繪的電泳圖顯示片段大小(堿基對，bp)上的 6-FAM、VIC、NED、PET和LIZ染料的相對熒光單位(RFU)。如實施例1所述，從 250pg男性基因組DNA開始進行多重PCR和基因分型。如正文所述，PCR后進行純化 步驟再作電泳。利用LIZ-標記的大小內(nèi)部標準品計算片段大小。每幅電泳圖底部標出 了峰與等位基因之間的排布。圖2 DIP標記物編號以及等位基因和PCR引物的SEQ ID編號。 實施例實施例1:通過多重PCR擴增對人DNA作序型分析和性別測定，并對一個性染 色體和30個常染色體的DIP進行基因分型 基本方法和DNA制備.所有試劑和其它消耗品均為PCR級，特別是不含DNA、 DNA-和RNA-依賴性核酸酶?；镜姆肿舆z傳學(xué)實驗按照Sambrook等(1989) (Sambrook J, Fritsche EF, Maniatis T.《分子克隆實驗室手冊》(Molecular cloning.A laboratory manual).第 2 版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述 進行。人類檢測樣品是全血或痰液，后者按照生產(chǎn)商說明書用無菌口頰拭子(德國文森 / 陸赫的 NP 公司(Nerbe Plus GmbH, Winsen/Luhe, Germany))收集。按照生產(chǎn)商說
明書用NucleoSpin 組織試劑盒(Macherey 和 Nagel，德國多讓(Dueren，Germany))提 取DNA。用UV VIS分光計記錄核苷酸堿基的260nm吸光度(Sambrook等，1989)，或 者用Quantifyler 人DNA定量試劑盒(美國加州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和ABI Prism 7000 SDS實時熱循環(huán)儀(美國加州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進行定量實時 PCR(qPCR),測定 DNA 含量。 遺傳標記物的選擇和PCR引物設(shè)計。選擇能夠區(qū)分位于X-和Y-染色體非重 組區(qū)的人牙釉蛋白基因的兩個平行進化同源DIP拷貝3bp DIP(Seq.ID N0.61和62)和 6bp DIP (Seq.ID N0.63和64)測定性別。在該實施例的多重PCR中，還采用了 DIP基因 座的Seq.ID N0.63/64序列。按照以下標準總共采用61個常染色體DIP基因座人基 因組內(nèi)已確定和繪了圖的單拷貝靶序列，DIP的核苷酸長度為2-30bp，用于多重PCR的 標記物位于不同染色體上或標記物的物理距離至少為10.000.000bp，小等位基因的等位基 因頻率為0.3-0.5，至少一個人群研究報告的雜合性至少為40%。進一步采用這些基因 座的30個DIP (參見表2)進行本實施例的多重PCR。設(shè)計PCR引物。用Blastn軟件 根據(jù)人基因組序列核查引物的特異性(“局部排列對比搜索工具的基本核苷酸”(Basic Local Alignment Search Tool nucleotides) ； Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW,Lipman DJ. “局部排列對比搜索基本工具”(Basic local alignment search tool) .J Mol Biol,
第215卷，第403-410頁，1990)。用自身二聚體軟件(Autodimer)控制多重PCR引物 對的相容性(VallonePM，Butler JM. “自身二聚體引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的篩選工 具” (AutoDimer a screening tool for primer-dimer and hairpinstructures) .Biotechniques,第 37卷，第226-231頁，2004)。對于多重檢測，還要根據(jù)擴增子大小和熒光染料標記仔細 選擇寡核苷酸引物對，以保證毛細管凝膠電泳的最佳信號分離。在服務(wù)性實驗室(比利 時瑟蘭的友基公司(Eurogentec SA，Seraing, Belgium)；或美國加州福斯特城的應(yīng)用生 物系統(tǒng)公司)，用標準的亞磷酰胺化學(xué)法合成寡核苷酸引物。用熒光染料6-羧基熒光素 (6-FAM)、2，-氯-7，苯基-1，4-二氯-6-羧基熒光素(VIC)、2'-氯-5'-氟-7'， 8'-苯并-1，4-二氯-6-羧基熒光素(NED)或PET (美國加州福斯特城的應(yīng)用生物系 統(tǒng)公司的專有產(chǎn)品)和標準化學(xué)法在5’ _端共價標記各引物對的一個引物。在服務(wù)性 實驗室，通過離子對反相高效液相層析按照標準方法純化所有引物后，溶于TE-緩沖液 (10mM Tris/HCl(室溫調(diào)節(jié)至 pH 8.0)，ImM EDTA)至 100 y M 濃度，4°C避光保存。先在單一 PCR反應(yīng)中加入不同濃度的人DNA(0.03_5.0ng)和非人DNA(最高 20ng)至200nM終濃度，檢測引物的靈敏度和特異性是否合格(參見下一節(jié))。而且， 逐漸升高溫度(55-65°C )進行退火步驟。重復(fù)這些實驗以建立多重PCR，進行多輪手工 引物重設(shè)計和優(yōu)化引物濃度。最終的引物及其在多重PCR中的濃度見表2。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR).該酶反應(yīng)的總體積為25 u L，其中含50mMTris/HCl (室 溫調(diào)至 pH8.8)、20mMNH4S04、0.2mMdNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等摩爾 混合物)、1.5mM MgCl2、1.5單位JumpStartTM TaqDNA聚合酶(德國陶克城的西格瑪 奧德里奇化學(xué)品公司(Sigma-AldrichChemie GmbH、Taufkirchen、Germany))、200 u g/ mL牛血清白蛋白(德國曼海姆的羅氏診斷公司(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、 Germany))、0.01 %吐溫20和0.1_1.0ng人基因組DNA。所用引物對及其在PCR中的 終濃度見表2，它們的核苷酸序列參見序列表(Seq.ID.125-184和187-188)。采用ABI 9600 (美國加州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)熱循環(huán)儀。循環(huán)條件如下初始95°C熱 激活240秒；然后94°C變性30秒、60°C引物退火120秒、72°C引物延伸75秒共30輪。 所有溫度變化的速度設(shè)定為1°C/秒。然后，進行68°C 3600秒的最后延伸步驟，通過 TaqDNA聚合酶的固有末端轉(zhuǎn)移酶活性，而可不依賴模板地在3’ -端最大程度地加上一 個核苷酸(優(yōu)選A)。表2 用于多重PCR的寡核苷酸引物。圖1中采用DIP等位基因的標記物編碼 (Dx確定DIP基因座，而x是連續(xù)的編號；附帶的負號(_)指缺失，加號⑴指插入)來 注明各峰。列出了相應(yīng)的SeqID編號。
權(quán)利要求
1.一種DNA序型分析試驗，包括以下步驟(i)提供待分析的樣品，(ii)提供用聚合酶鏈反應(yīng)同時擴增至少20個基因座所必需的試劑、酶和引物-寡核 苷酸，(iii)擴增所述基因座，(iv)檢測擴增產(chǎn)物，其中所述擴增產(chǎn)物和待擴增基因座的特征如下a)各待擴增基因座的特征是已知人群中存在至少一個缺失_插入多態(tài)性，其中各基 因座的兩個等位基因的大小差異在1個核苷酸以上100個核苷酸以下，b)源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第一組的至少 兩種擴增產(chǎn)物攜帶第一標記，C)源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第二組的至少 兩種擴增產(chǎn)物攜帶第二標記，d)源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第三組的至少 兩種擴增產(chǎn)物攜帶第三標記，e)標記一、標記二和標記三是各不相同的熒光標記，f)對給定基因座而言，兩個等位基因之間的大小差異大于1個核苷酸小于100個核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的序型分析試驗，其特征在于，同時擴增至少25個基因座。
3.如權(quán)利要求1所述的序型分析試驗，其特征在于，同時擴增至少30個基因座。
4.如權(quán)利要求3所述的序型分析試驗，其特征在于，b)至d)三組擴增產(chǎn)物各自包含 至少十種擴增產(chǎn)物。
5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的序型分析試驗，其特征在于，各基因座的兩個等 位基因的大小差異大于1個核苷酸小于40個核苷酸。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的序型分析試驗，其特征在于，源自至少兩個不同基 因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的兩種或多種擴增產(chǎn)物攜帶第四標記。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的序型分析試驗，其特征在于，用毛細管凝膠電泳裝 置進行所述檢測步驟。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的序型分析試驗，其特征在于，所述待擴增基因座選 自以下序列DIP NO. 1 -SEQ ID N0.1,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.2,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.2 -SEQ ID N0.3，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.4,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間， DIP N0.3 -SEQ ID N0.5,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.6,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.4 -SEQ ID N0.7，其中缺失 -插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.8,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與262之間， DIP N0.5 -SEQ ID N0.9,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 10,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.6 -SEQIDNO.il，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 12,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.7 -SEQ ID NO. 13,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.14,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.8 -SEQ ID NO. 15,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 16,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.9 -SEQ ID NO. 17,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 18,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP NO. 10 -SEQ ID NO.19，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間， -SEQ ID N0.20,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間， DIP NO. 11 -SEQ ID NO.21,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.22,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO. 12 -SEQ ID N0.23，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.24,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與260之間， DIP NO. 13 -SEQ ID N0.25,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.26,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO. 14 -SEQ ID N0.27,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.28,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP NO. 15 -SEQ ID N0.29,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.30,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP NO. 16 -SEQ ID NO.31,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.32,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO 17 -SEQ ID N0.33,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.34,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間， DIP NO. 18 -SEQ ID N0.35,其中插入-缺失多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.36,其中插入-缺失多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP NO. 19 -SEQ ID N0.37,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0. 38,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.20 -SEQ ID N0.39,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.40,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.21 -SEQ ID N0.41,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.42,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.22 -SEQ ID N0.43，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.44,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與257之間， DIP N0.23 -SEQ ID N0.45,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.46,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.24 -SEQ ID N0.47,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.48,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP N0.25 -SEQ ID N0.49，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.50,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與296之間， DIP N0.26 -SEQ ID N0.51,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.52,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與266之間， DIP NO 27 -SEQ ID N0.53，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.54，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與273之間， DIP N0.28 -SEQ ID N0.55,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.56,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP N0.29 -SEQ ID N0.57,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.58,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與267之間， DIP N0.30 -SEQ ID N0.59,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.60,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間， DIP N0.31 -SEQ ID N0.61,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸271與272之間， -SEQ ID N0.62,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸271與278之間， DIP N0.32 -SEQ ID N0.63，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸280與281之間， -SEQ ID N0.64，其中缺 失-插入多態(tài)性位于核苷酸280與284之間， DIP N0.33 -SEQ ID N0.65，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.66,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.34 -SEQ ID N0.67,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.68,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.35 -SEQ ID N0.69，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.70,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間， DIP N0.36 -SEQ ID N0.71,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.72，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間， DIP N0.37 -SEQ ID N0.73,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.74,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.38 -SEQ ID N0.75，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸255與256之間， -SEQ ID N0.76，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸255與261之間， DIP N0.39 -SEQ ID N0.77,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.78,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.40 -SEQ ID N0.79，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.80,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與259之間， DIP N0.41 -SEQ ID N0.81,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.82,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間， DIP N0.42 -SEQ ID N0.83,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.84,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間， DIP N0.43 -SEQ ID N0.85,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.86,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與255之間， DIP N0.44 -SEQ ID N0.87，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.88，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.45 -SEQ ID N0.89，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.90,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.46 -SEQ ID N0.91,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.92，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.47 -SEQ ID N0.93,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.94,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.48 -SEQ ID N0.95,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.96,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.49 -SEQ ID N0.97,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與248之間， -SEQ ID N0.98,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與252之間， DIP N0.50 -SEQ ID N0.99，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.100,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.51 -SEQ ID NO. 101,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 102,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.52 -SEQ ID NO. 103,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.104,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.106,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 108,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 110,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.56 -SEQ IDN0.111,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID NO. 112,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間， DIP N0.57 -SEQ ID NO. 113,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間， -SEQ ID N0.114，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間， DIP N0.58 -SEQ ID NO. 115,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.116，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與263之間， DIP N0.59 -SEQ ID NO. 117,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.118，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與266之間， DIP N0.60 -SEQ ID NO. 119,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 120,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與268之間， DIP NO.61 -SEQ ID NO. 121,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.122，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與277之間， DIP N0.62 -SEQ ID N0.123,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 124,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP N0.63 -SEQ ID N0.289，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.290,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， 其中所述引物對為不同DIP序列各自的特異性引物對。
9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的序型分析試驗，其特征在于，還擴增一個或多個 短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，和/或擴增一個或多個數(shù)目不同的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，和/ 或擴增一個或多個單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
10.如前述權(quán)利要求中任一項所述的序型分析試驗，其特征在于，還擴增一個或多個 性別特異性短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，和/或擴增一個或多個性別特異性無變異DNA區(qū) 段，和/或擴增一個或多個性別特異性數(shù)目不同的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，和/或擴增一 個或多個性別特異性單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
11.如前述權(quán)利要求中任一項所述的序型分析試驗，其特征在于，所述引物-寡核苷 酸對選自含有以下序列的核酸分子a)DIP NO.l SEQ ID NO. 125 和 SEQ ID NO. 126 或者 SEQ ID N0.267 和 SEQ ID N0.268b)DIP N0.2 SEQ ID NO. 127 和 SEQ ID NO. 128c)DIP N0.3 SEQ ID NO. 129 和 SEQ ID NO. 130d)DIP N0.4 SEQ ID NO. 131 和 SEQ ID NO. 132e)DIP N0.5 SEQ ID NO. 133 和 SEQ ID NO. 134f)DIP N0.6 SEQ ID NO. 135 和 SEQ ID NO. 136g)DIPNO.7 SEQ ID N0.137 和 SEQIDN0.138h)DIP NO.8 SEQ ID NO. 139 和 SEQIDN0.140 或者 SEQ ID N0.287 和 SEQ ID N0.288i)DIP NO.9 SEQ ID NO.141 和 SEQIDN0.142 j) DIP NO. 10 SEQ ID NO. 143 和 SEQ ID NO. 144 k) DIP NO. 11 SEQ ID NO. 145 和 SEQ ID NO. 146 1) DIP NO. 12 SEQ ID NO. 147 和 SEQIDN0.148 m) DIP NO. 13 SEQ ID NO. 149 和 SEQIDN0.150 η) DIP NO. 14 SEQ ID NO. 151 和 SEQ ID NO. 152 o) DIP NO. 15 SEQ ID NO. 153 和 SEQ ID NO. 154 或者 SEQ ID N0.281 和 SEQ ID N0.282p) DIP NO. 16 SEQ ID N0.155 和 SEQIDN0.156 q) DIP NO. 17 SEQ ID NO. 157 和 SEQ ID NO. 158或者 SEQ ID N0.273 和 SEQ ID N0.274r) DIP NO. 18 SEQ ID NO. 159 禾口 SEQ ID NO. 160或者 SEQ ID N0.277 和 SEQ ID N0.278s) DIP NO. 19 SEQ ID NO. 161 和 SEQ ID NO. 162或者 SEQ ID N0.279 和 SEQ ID N0.280t) DIP N0.20 SEQ ID NO. 163 和 SEQ ID NO. 164或者 SEQ ID N0.275 和 SEQ ID N0.276u) DIP NO.21 SEQ ID NO. 165 和 SEQ ID NO. 166v) DIP N0.22 SEQ ID NO. 167 和 SEQ ID NO. 168w) DIP N0.23 SEQIDN0.169 和 SEQIDN0.170χ) DIP N0.24 SEQ ID NO. 171 和 SEQ ID N0.172y) DIP N0.25 SEQ ID N0.173 和 SEQIDN0.174ζ) DIP N0.26 SEQ ID NO. 175 和 SEQ ID NO. 176aa)DIP N0.27 SEQ ID NO. 177 和 SEQ ID NO. 178ab)DIP N0.28 SEQ ID N0.179 和 SEQ ID N0.180ac)DIP N0.29 SEQ ID NO. 181 和 SEQ ID NO. 182 或者 SEQ ID N0.271 和 SEQ ID N0.272ad)DIP N0.30 SEQ ID NO. 183 和 SEQ ID NO. 184 或者 SEQ ID N0.283 和 SEQ ID N0.284ae)DIP NO.31 SEQ ID NO. 185 和 SEQ ID NO. 186af)DIPN0.32 SEQ ID NO. 187 和 SEQ ID NO. 188 或者 SEQ ID N0.269 和 SEQ ID N0.270ag)DIP N0.33 SEQ ID NO. 189 和 SEQ ID NO. 190 或者 SEQ ID N0.285 和 SEQ ID N0.286ah)DIP N0.34 SEQ ID NO. 191 和 SEQ ID NO. 191ai) DIP N0.35 SEQ ID NO. 193 和 SEQ ID NO. 194aj) DIP N0.36 SEQ ID NO. 195 和 SEQ ID NO. 196ak) DIP N0.37 SEQ ID NO. 197 和 SEQ ID NO. 198al) DIP N0.38 SEQ ID NO. 199 和 SEQ ID N0.200am) DIP N0.39 SEQ ID N0.201 和 SEQ ID N0.202an) DIP N0.40 SEQ ID N0.203 和 SEQ ID N0.204ao) DIP NO.41 SEQ ID N0.205 和 SEQ ID N0.206或者 SEQ ID N0.251 和 SEQ ID N0.252ap) DIP N0.42 SEQ ID N0.207 和 SEQ ID N0.208或者 SEQ ID N0.253 和 SEQ ID N0.254aq) DIP N0.43 SEQ ID N0.209 和 SEQ ID N0.210或者 SEQ ID N0.255 和 SEQ ID N0.256ar) DIP N0.44 SEQ ID NO.211 和 SEQIDN0.212或者 SEQ ID N0.257 和 SEQ ID N0.258as) DIP N0.45 SEQ ID N0.213 和 SEQIDN0.214或者 SEQ ID N0.259 和 SEQ ID N0.260at) DIP NO.46 SEQ ID N0.215 和 SEQ ID N0.216或者 SEQ ID N0.261 和 SEQ ID N0.262au) DIP N0.47 SEQ ID N0.217 和 SEQ ID N0.218或者 SEQ ID N0.263 和 SEQ ID N0.264av) DIP N0.48 SEQ ID N0.219 和 SEQ ID N0.220aw) DIP N0.49 SEQ ID N0.221 禾P SEQ ID N0.222ax) DIP N0.50 SEQ ID N0.223 和 SEQ ID N0.224ay) DIP NO.51 SEQ ID N0.225 和 SEQ ID N0.226或者 SEQ ID N0.265 和 SEQ ID N0.266az) DIP N0.52 SEQ ID N0.227 和 SEQ ID N0.228ba)DIP N0.53 SEQ ID N0.229 和 SEQ ID N0.230bb)DIP N0.54 SEQ ID N0.231 和 SEQ ID N0.232 be) DIP N0.55 SEQ ID N0.233 和 SEQ ID N0.234bd)DIP N0.56 SEQ ID N0.235 和 SEQ ID N0.236be)DIP N0.57 SEQ ID N0.237 和 SEQ ID N0.238bf)DIP N0.58 SEQ ID N0.239 和 SEQ ID N0.240bg)DIP N0.59 SEQ ID N0.241 和 SEQ ID N0.242bh)DIP N0.60 SEQ ID N0.243 和 SEQ ID N0.244bi)DIP N0.61 SEQ ID N0.245 和 SEQ ID N0.246 bj) DIP N0.62 SEQ ID N0.247 和 SEQ ID N0.248 bk) DIP N0.63 SEQ ID N0.249 和 SEQ ID N0.250
12. —種用于DNA擴增方法的試劑盒，其包括至少3個用于聚合酶鏈反應(yīng)擴增的引物 對，其中所述引物對由一個上游引物和一個下游引物組成，能夠結(jié)合選自以下序列中的任何一個序列， DIP NO. 1 -SEQ ID N0.1,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.2,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.2 -SEQ ID N0.3，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.4,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間， DIP N0.3 -SEQ ID N0.5,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.6,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.4 -SEQ ID N0.7，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.8,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與262之間， DIP N0.5 -SEQ ID N0.9,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 10,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.6 -SEQIDNO.il，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 12,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.7 -SEQ ID NO. 13,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.14,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.8 -SEQ ID NO. 15,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 16,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO.9 -SEQ ID NO. 17,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 18,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP NO. 10 -SEQ ID NO.19，其中缺 失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間， -SEQ ID N0.20,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間， DIP NO. 11 -SEQ ID NO.21,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.22,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO. 12 -SEQ ID N0.23，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.24,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與260之間， DIP NO. 13 -SEQ ID N0.25,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.26,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO. 14 -SEQ ID N0.27,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.28,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP NO. 15 -SEQ ID N0.29,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.30,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP NO. 16 -SEQ ID N0.31,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.32,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO 17 -SEQ ID N0.33,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.34,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間， DIP NO. 18 -SEQ ID N0.35,其中插入-缺失多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.36,其中插入-缺失多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP NO. 19-SEQ ID N0.37,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.38,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.20 -SEQ ID N0.39,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.40,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.21 -SEQ ID N0.41,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.42,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.22 -SEQ ID N0.43，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.44,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與257之間， DIP N0.23 -SEQ ID N0.45,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.46,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.24 -SEQ ID N0.47,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.48,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP N0.25 -SEQ ID N0.49，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.50,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與296之間， DIP N0.26 -SEQ ID N0.51,其中缺失-插入多態(tài)性位于 核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.52,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與266之間， DIP NO 27 -SEQ ID N0.53，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.54，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與273之間， DIP N0.28 -SEQ ID N0.55,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.56,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP N0.29 -SEQ ID N0.57,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.58,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與267之間， DIP N0.30 -SEQ ID N0.59,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.60,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間， DIP N0.31 -SEQ ID N0.61,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸271與272之間， -SEQ ID N0.62,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸271與278之間， DIP N0.32 -SEQ ID N0.63，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸280與281之間， -SEQ ID N0.64，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸280與284之間， DIP N0.33 -SEQ ID N0.65，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.66,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.34 -SEQ ID N0.67,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.68,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.35 -SEQ ID N0.69，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.70,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間， DIP N0.36 -SEQ ID N0.71,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.72，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間， DIP N0.37 -SEQ ID N0.73,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.74,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.38 -SEQ ID N0.75，其中缺失-插入多態(tài)性 位于核苷酸255與256之間， -SEQ ID N0.76，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸255與261之間， DIP N0.39 -SEQ ID N0.77,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間，-SEQ ID N0.78,其 中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.40 -SEQ ID N0.79，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.80,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與259之間， DIP N0.41 -SEQ ID N0.81,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.82,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間， DIP N0.42 -SEQ ID N0.83,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.84,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間， DIP N0.43 -SEQ ID N0.85,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.86,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與255之間， DIP N0.44 -SEQ ID N0.87，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.88，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.45 -SEQ ID N0.89，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.90,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.46 -SEQ ID N0.91,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.92，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.47 -SEQ ID N0.93,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.94,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.48 -SEQ ID N0.95,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.96,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.49 -SEQ ID N0.97,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與248之間， -SEQ ID N0.98,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與252之間， DIP N0.50 -SEQ ID N0.99，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.100,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.51 -SEQ ID NO. 101,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 102,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.52 -SEQ ID NO. 103,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間，-SEQ ID N0.104,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.106,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 108,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 110,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.56 -SEQ IDN0.111,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID NO. 112,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間， DIP N0.57 -SEQ ID NO. 113,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間， -SEQ ID N0.114，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間， DIP N0.58 -SEQ ID NO. 115,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.116，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與263之間， DIP N0.59 -SEQ ID NO. 117,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.118，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與266之間， DIP N0.60 -SEQ ID NO. 119,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 120,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與268之間， DIP NO.61 -SEQ ID NO. 121,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.122，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與277之間， DIP N0.62 -SEQ ID N0.123,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.64,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP N0.63 -SEQ ID N0.289，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.290,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， 其中所述引物對為不同DIP序列各自的特異性引物對。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括各自能夠結(jié)合選自 權(quán)利要求11所示不同序列的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個引物對。
14.選自下組的至少2個DIP序列的組合在序型分析試驗中的應(yīng)用-SEQ ID NO.l,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.2,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.2 -SEQ ID N0.3，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.4,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間， DIP N0.3 -SEQ ID N0.5,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.6,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.4 -SEQ ID N0.7，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.8,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與262之間， DIP N0.5 -SEQ ID N0.9,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 10,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.6 -SEQIDNO.il，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 12,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.7 -SEQ ID NO. 13,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.14,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO.8 -SEQ ID NO. 15,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 16,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO.9 -SEQ ID NO. 17,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 18,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP NO. 10 -SEQ ID NO.19，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間， -SEQ ID N0.20,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間， DIP NO. 11 -SEQ ID NO.21,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.22,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO. 12 -SEQ ID N0.23，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.24,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與260之間， DIP NO. 13 -SEQ ID N0.25,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.26,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP NO. 14 -SEQ ID N0.27,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.28,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP NO. 15 -SEQ ID N0.29,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.30,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP NO. 16 -SEQ ID N0.31,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.32,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP NO 17 -SEQ ID N0.33,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.34,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間， DIP NO. 18 -SEQ ID N0.35,其中插入-缺失多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.36,其中插入-缺失多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP NO. 19-SEQ ID N0.37,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.38,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.20 -SEQ ID N0.39,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.40,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.21 -SEQ ID N0.41,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.42,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.22 -SEQ ID N0.43，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.44,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與257之間， DIP N0.23 -SEQ ID N0.45,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.46,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.24 -SEQ ID N0.47,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.48,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與263之間， DIP N0.25 -SEQ ID N0.49，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.50,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與296之間，DIP N0.26 -SEQ ID N0.51,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.52,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與266之間，DIP NO 27 -SEQ ID N0.53，其中 缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.54，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與273之間， DIP N0.28 -SEQ ID N0.55,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.56,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP N0.29 -SEQ ID N0.57,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.58,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與267之間， DIP N0.30 -SEQ ID N0.59,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.60,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與270之間， DIP N0.31 -SEQ ID N0.61,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸271與272之間， -SEQ ID N0.62,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸271與278之間， DIP N0.32 -SEQ ID N0.63，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸280與281之間， -SEQ ID N0.64，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸280與284之間， DIP N0.33 -SEQ ID N0.65，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.66,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.34 -SEQ ID N0.67,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.68,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.35 -SEQ ID N0.69，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.70,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與255之間， DIP N0.36 -SEQ ID N0.71,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.72，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間， DIP N0.37 -SEQ ID N0.73,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.74,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.38 -SEQ ID N0.75，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸255與256之間， -SEQ ID N0.76，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸255與261之間， DIP N0.39 -SEQ ID N0.77,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.78,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間，DIP N0.40 -SEQ ID N0.79，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.80,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與259之間， DIP N0.41 -SEQ ID N0.81,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.82,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間， DIP N0.42 -SEQ ID N0.83,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.84,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與254之間， DIP N0.43 -SEQ ID N0.85,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.86,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與255之間， DIP N0.44 -SEQ ID N0.87，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.88，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.45 -SEQ ID N0.89，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.90,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.46 -SEQ ID N0.91,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.92，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與254之間， DIP N0.47 -SEQ ID N0.93,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.94,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.48 -SEQ ID N0.95,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID N0.96,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與256之間， DIP N0.49 -SEQ ID N0.97,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與248之間， -SEQ ID N0.98,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸247與252之間， DIP N0.50 -SEQ ID N0.99，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.100,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.51 -SEQ ID NO. 101,其中缺失-插入多態(tài)性位于核 苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 102,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與257之間， DIP N0.52 -SEQ ID NO. 103,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.104,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間，DIP N0.53 -SEQ ID NO. 105,其中缺 失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.106,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間， DIP N0.54 -SEQ ID NO. 107,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 108,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.55 -SEQ ID NO. 109,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 110,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與258之間， DIP N0.56 -SEQ IDN0.111,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID NO. 112,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與258之間， DIP N0.57 -SEQ ID NO. 113,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與252之間， -SEQ ID N0.114，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸246與247之間， DIP N0.58 -SEQ ID NO. 115,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.116，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與263之間， DIP N0.59 -SEQ ID NO. 117,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.118，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與266之間， DIP N0.60 -SEQ ID NO. 119,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 120,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與268之間， DIP NO.61 -SEQ ID NO. 121,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.122，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與277之間， DIP N0.62 -SEQ ID N0.123,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與252之間， -SEQ ID NO. 124,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸251與260之間， DIP N0.63 -SEQ ID N0.289，其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與251之間， -SEQ ID N0.290,其中缺失-插入多態(tài)性位于核苷酸250與256之間； 其中安排所述引物使之能夠擴增缺失-插入多態(tài)性。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于，所述擴增方法選自等位基因特異性多重 PCR、連接酶鏈反應(yīng)試驗、多重連接依賴性探針擴增試驗、雜交試驗、聚合酶鏈反應(yīng)試 驗、基于芯片的試驗、雜交試驗、單堿基引物延伸試驗、陣列化引物延伸(APEX)、陣列 化連接試驗、等位基因特異性陣列化連接試驗和芯片PCR。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA序型分析試驗，包括以下步驟提供待分析樣品，提供同時進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增至少20個基因座所必需的試劑、酶和引物-寡核苷酸，擴增這些基因座，檢測擴增產(chǎn)物，其中擴增產(chǎn)物和待擴增基因座的特征如下各待擴增基因座的特征是已知人群中存在至少一個缺失-插入多態(tài)性，其中各基因座兩個等位基因的大小差異在2個核苷酸以上100個核苷酸以下，源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第一組的至少兩種擴增產(chǎn)物攜帶第一標記，源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第二組的至少兩種擴增產(chǎn)物攜帶第二標記，源自至少兩個不同基因座的大小約為20個核苷酸至300個核苷酸的第三組的至少兩種擴增產(chǎn)物攜帶第三標記，標記一、標記二和標記三是各不相同可區(qū)分的熒光標記，可用(例如)與DNA測序設(shè)備聯(lián)用的多色檢測器同時檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102016074SQ200980115783
公開日2011年4月13日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者J·加貝特, M·伯默, W·布拉貝茲 申請人:生物物種有限公司