專利名稱：鑒定調節(jié)癌細胞中Wnt信號傳導的化合物的方法
鑒定調節(jié)癌細胞中Wnt信號 傳導的化合物的方法交叉引用本申請要求2008年5月7日提交的美國臨時申請第61/051,322號的優(yōu)先權，該 申請通過引用納入本文。本發(fā)明涉及篩選作用于具有活性Wnt信號傳導途徑的細胞的化合物的試驗。
背景技術：
Wnt信號傳導通過調節(jié)細胞增殖和分化影響基本發(fā)育途徑，其在很多癌癥中具 有活性，這些癌癥包括結腸癌、白血病、乳腺癌、肝細胞癌、前列腺癌和黑色素瘤。在典型Wnt途徑中，分泌型糖蛋白Wnt與Frizzled受體結合引起β-聯(lián)蛋白在胞 質中累積，導致其易位至細胞核內，與LEF/TCF家族的HMG結合蛋白結合，激活Wnt 靶基因的轉錄。不存在Wnt信號傳導時，β-聯(lián)蛋白通過泛素途徑連續(xù)降解，β-聯(lián) 蛋白的轉換由β-聯(lián)蛋白降解復合物介導，其包括蛋白質APC、GSK3-i3和軸蛋白。 GSK3-i3磷酸化β-聯(lián)蛋白，對其進行標記以供降解。在Wnt信號傳導過程中，所述 β-聯(lián)蛋白降解復合物被破壞，由此阻止了 β-聯(lián)蛋白的磷酸化，使得β-聯(lián)蛋白累積， 然后進入細胞核，與LET/TCF家族成員HMGDNA結合蛋白結合。盡管LEF/TCF家族成員LEF-1、TCF-I和TCF-4本身無法激活轉錄，但它們確 實能通過其HMG結構域與DNA結合并使DNA彎曲。在至少一些情況中，不存在β-聯(lián) 蛋白時，LEF/TCF蛋白與DNA結合，募集轉錄阻抑蛋白。在Wnt信號傳導過程中，細 胞核內有β-聯(lián)蛋白可用時，聯(lián)蛋白取代所述阻抑蛋白，介導與轉錄激活蛋白的相 互作用。Wnt途徑的基因靶點包括c-Myc、細胞周期蛋白Dl、Cdx> MMP7、c_Myb、 c-Kit、PPAR σ、軸蛋白 2、Sp5、DKK4、BcI_X、LEF-I 本身和其它。LEF-K TCF-I和TCF-4是交替剪接基因。這些DNA結合蛋白的剪接變體導致 產(chǎn)生在其C末端尾部具有不同結構域的變體(J.Cell Sci 120 385-393 (2007))。此外， LEF-I和TCF-I均具有兩個啟動子各具有指導編碼全長蛋白質的轉錄物表達的第一啟 動子和指導N末端截短型表達的、位于基因的下游內含子內的第二啟動子。LEF-I和 TCF-I的N末端截短型(δ N-LEF-I和δ N-TCF-l)缺乏這些蛋白質的β-聯(lián)蛋白結合結 構域，但保留了其DNA結合結構域，允許這些LEF-I和TCF-I同種型作為顯性失活體起 作用并下調典型Wnt信號傳導途徑。

發(fā)明內容
本文提供篩選化合物在癌細胞中調節(jié)Wnt信號傳導能力的方法。在一個方面中，本文提供鑒定調節(jié)癌細胞中Wnt信號傳導的化合物的方法，其 中所述方法包括提供包含啟動子調控的報告基因的癌細胞，所述啟動子受TCF/LEF和 β-聯(lián)蛋白之間相互作用的調節(jié)；提供包含啟動子調控的所述報告基因的非癌細胞，所 述啟動子受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白之間相互作用的調節(jié)；使所述癌細胞和非癌細胞接觸 測試化合物；檢測接觸測試化合物的癌細胞中報告基因的信號和未接觸測試化合物的癌 細胞中報告基因的信號，并檢測接觸測試化合物的非癌細胞中報告基因的信號和未接觸測試化合物的非癌細胞中報告基因的信號。所述方法還包括鑒定測試化合物，其調節(jié)癌 細胞中報告基因表達的信號，但不調節(jié)非癌細胞中報告基因表達的信號。用于所述方法的癌細胞可以是任何癌細胞，非限制性例子可以是結腸癌細胞、 白血病細胞、淋巴瘤細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞、肺 癌細胞、卵巢癌細胞、子宮癌細胞、子宮頸癌細胞或頭頸癌細胞。

用于該方法的非癌細胞可以是任何非癌細胞，非限制性例子可以是HEK293細 胞、COS-7細胞、CHO細胞、NIH/3T3細胞或非癌的結腸細胞、上皮細胞、皮膚細胞、 B細胞、前B細胞、T細胞、前T細胞、乳腺細胞、前列腺細胞、肝細胞、肺細胞、卵巢 細胞、子宮細胞或子宮頸細胞。受TCF/LEF和β -聯(lián)蛋白之間相互作用調節(jié)的啟動子是結合β _聯(lián)蛋白或受其 作用的TCF/LEF蛋白上調、下調、抑制或激活的任何啟動子，包括合成啟動子、天然產(chǎn) 生的啟動子、天然產(chǎn)生的啟動子的一部分、天然產(chǎn)生的啟動子的變體、嵌合啟動子等。還提供鑒定調節(jié)Wnt信號傳導的化合物的方法，其中所述方法包括提供包含 核酸構建體的細胞，所述核酸構建體包含編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因和啟 動子調控的報告基因，所述啟動子受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白之間相互作用的調節(jié)；使所 述細胞接觸測試化合物；相對于未接觸測試化合物的對照細胞中報告基因表達的信號， 將具有調節(jié)接觸測試化合物的細胞中報告基因表達的信號作用的測試化合物鑒定為調節(jié) Wnt信號傳導的化合物，其中在不存在包含編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的 核酸構建體的細胞中未發(fā)現(xiàn)所述作用。在還有另一方面，提供鑒定調節(jié)Wnt信號傳導的化合物的方法，包括提供包 含以下的細胞1)包含編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的核酸構建體，所述基 因處于誘導型啟動子的調控下，2)啟動子調控的報告基因，所述啟動子受TCF/LEF和 β-聯(lián)蛋白之間相互作用的調節(jié)；誘導Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的表達；使所述細 胞接觸測試化合物；鑒定相對于未接觸測試化合物的對照細胞中報告基因表達的信號， 具有調節(jié)接觸測試化合物的細胞中報告基因表達的信號作用的測試化合物，其中在未誘 導編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的細胞中未獲得所述作用。在這些方面，所述試驗細胞包括含Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的重組 構建體。Wnt激活蛋白是在細胞中表達時調節(jié)Wnt信號傳導的任何蛋白質。Wnt激活 蛋白的非限制性例子包括β-聯(lián)蛋白、APC、軸蛋白1、軸蛋白2、GSK3、Disheveled、 LRP5、LRP6、Frizzled或Wnt蛋白。Wnt調節(jié)蛋白是在細胞中表達時通過調控一個或多 個Wnt激活蛋白或一個或多個Wnt調節(jié)蛋白的表達來調節(jié)Wnt信號傳導的任何蛋白質。 Wnt調節(jié)蛋白的非限制性例子包括β-聯(lián)蛋白、TCF-I、TCF-2、TCF_3、TCF-4，以及 與TCF/LEF蛋白或β-聯(lián)蛋白發(fā)生相互作用的轉錄阻抑蛋白，包括CtBP、Groucho > Pygo、p300和PITX2。在一些實施方式中，細胞中表達的Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白是所 述激活蛋白或調節(jié)蛋白的突變型。在一些實施方式中，所述Wnt激活蛋白(基因)是突 變型APC基因。在一些實施方式中，所述Wnt激活蛋白(基因)是突變型聯(lián)蛋白基 因。用于本文所述試驗的報告基因可以是任何報告基因，例如，堿性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶、內酰胺酶、熒光蛋白、螢光素酶或CAT。在一些優(yōu)選的實施方式中，用于所述方法的試驗細胞包含至少兩個報告基因，其中至少一個是啟動子調控的對照報告 基因，所述啟動子不受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白相互作用的調控，例如組成型啟動子。在 這些實施方式中，將操作性連接于受TCF/LEF和聯(lián)蛋白之間相互作用調節(jié)的啟動子 的報告基因表達的檢測信號根據(jù)表達受組成型啟動子調控的第二報告基因的檢測信號標 準化。在另一方面，本發(fā)明包括鑒定調節(jié) Wnt信號傳導的化合物的方法，其采用負選 擇鑒定破壞經(jīng)由TCF/LEF和β _聯(lián)蛋白相互作用的基因激活的化合物。所述方法包括 提供具有受啟動子調控的報告基因的細胞，所述啟動子受TCF/LEF和聯(lián)蛋白之間相 互作用的調節(jié)，其中所述報告基因具有負選擇性；使所述細胞接觸測試化合物；使所述 細胞接觸前藥，所述前藥由報告基因編碼的蛋白質轉化為活性藥物；鑒定允許細胞在前 藥存在下生長的測試化合物。本文還提供通過上述任何一種或多種方法鑒定得到的化合物。發(fā)明詳述定義本文所用的癌性細胞或癌細胞是白血病細胞或衍生自癌腫瘤的細胞。非白血病 細胞是否為癌細胞的一個測試是鑒定裸鼠中的細胞接種物是否引起腫瘤。本文所用的
“正常”細胞是非癌細胞。正?；蚍前┘毎谎苌园┠[瘤或白血病?！癢nt信號傳導”或“Wnt途徑信號傳導”指一種細胞信號傳導途徑，該途徑 引起受β-聯(lián)蛋白禾口 TCF/LEF蛋白，如TCF-I、TCF-3、TCF-4或LEF-I相互作用調控 的基因表達?！皡⑴cWnt信號傳導的蛋白質”或“Wnt相關蛋白”可以是Wnt激活蛋白、Wnt 調節(jié)蛋白或Wnt靶基因。“Wnt相關基因”是編碼參與Wnt信號傳導的蛋白質的基因。 參與Wnt信號傳導的蛋白質包括但不限于Wnt激活蛋白(促進或抑制導致Wnt靶基因表 達的β-聯(lián)蛋白-TCF/LEF相互作用的蛋白質)，包括Wnt、Frizzled、Disheveled、LRP5/ LRP6 (BMC Genomics7 148 (2006))、軸蛋白 _1 (Genomics 7 148 (2006))、β -聯(lián)蛋白 (BMCGenomics 7 148(2006))、軸蛋白 _2、腺瘤性結腸息肉(APC)、GSK3-^ (BMC Genomics 7 148(2006))；以及Wnt調節(jié)蛋白(調節(jié)Wnt靶基因表達的蛋白質)，包 括 TCF-I (J.Biol.Chem.267 8530-8536(1992) ； MoI.Cell.Biol. 16 745-752(1996))、 TCF-3、TCF-4 (J.Biol.Chem.278 16169-16175(2003)); LEF-I (Nucl.Acids Res.28 1994-2003(2000) ； Devel.Dynamics 232 969-978(2005))、CtBPU Grouch、Pygo> PITX2和其它。Wnt靶基因包括但不限于LEF-I、c_myc、細胞周期蛋白Dl、cdx、MMP7、 c-myb、c-kit、PPARo、軸蛋白 2、BcI_X、sp5、siamois 和其它?！癟CF/LEF” 指 TCF-I、TCF-3、TCF-4 或 LEF-I 中的任何一個，或 TCF-I、TCF-3、TCF-4 或 LEF-I 中
兩個或多個的任何組合。本文所用的“Wnt-應答啟動子”是受TCF/LEF蛋白和β-聯(lián)蛋白相互作用 調控的啟動子。所述啟動子也可受除TCF/LEF蛋白和β-聯(lián)蛋白外其它因子的調控。 Wnt-應答啟動子的例子包括但不限于以下基因的啟動子LEF-I、TCFU c_myc、 c-kit、MMP7、軸蛋白 2、sp5、DKK4、細胞周期蛋白 Dl、cdx、BcI_X 和 siamois。
本文所用的RNA “同種型”、轉錄物同種型或同種型轉錄物是通過同一基因的 可變剪接產(chǎn)生的RNA分子。因此這些轉錄物的序列不同。從RNA同種型翻譯得到蛋白 質同種型，其具有不同的一級序列?！昂怂岱肿訕嫿w”、“核酸構建體”、“基因構建體”、“報告基因構建 體”、“剪接構建體”、“轉錄構建體”、“構建體”、“重組DNA分子”均指經(jīng)分 離和操作將某些核酸序列切離、連接、刪除、突變、擴展、延伸、復制或重組的核酸分 子，所述核酸序列可從生物體分離、從生物體分離的核酸模板復制、從生物體和合成核 酸片段合成或衍生得到。在本發(fā)明的方法中，包含、包括、攜帶或具有核酸分子或核酸 構建體的細胞是被轉化、轉染或感染(例如用病毒)的細胞，從而其包含之前分離的核酸 分子、重組核酸分子或基因構建體。本文提供的方法用來鑒定調節(jié)癌細 胞中Wnt信號傳導的化合物。所述方法采用 細胞試驗，其中將對測試化合物起反應的Wnt信號傳導應答啟動子調控的報告基因的活 性與測試化合物對非癌細胞的作用或測試化合物對Wnt信號傳導途徑不由細胞中引入的 Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的誘導作用活化的細胞的作用相比較。試驗方式本文提供的細胞試驗可以任何可行方式進行，但優(yōu)選高通量鑒定試驗以便篩選 大量化合物。優(yōu)選地，所述試驗在多孔板中進行，如例如，96孔、384孔或更多孔的 板，其中各孔盛有約5X IO3-IO5個細胞，通常為約104-5X 104個細胞。在優(yōu)選的實施方 式中，采用報告基因進行所述試驗，其中通過例如讀取多孔板的發(fā)光計或熒光計檢測報 告基因的信號。也優(yōu)選包括自動分配裝置(例如用于加入進行信號檢測的試劑緩沖液) 的孔板讀數(shù)計。對于用報告基因構建體或Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白基因構建體瞬時轉染細胞的 試驗，通常在轉染后24-48小時加入測試化合物。在例如通過加入誘導物，如四環(huán)素或 多西環(huán)素誘導基因表達的試驗中，可在加入誘導物之前、同時或之后加入測試化合物。 例如，可在加入誘導物后0-30分鐘、30分鐘-1小時、1-2小時、2-3小時、3_4小時、 4-6小時、6-8小時、8-10小時、10-12小時、12-16小時、16-20小時、20-24小時或 24-48小時加入測試化合物?？稍诩尤牖衔锖蟮娜魏螘r間點讀取報告基因信號，例如，加入化合物后30分 鐘、30分鐘-1小時、1-2小時、2-3小時、3-4小時、4_6小時、6_8小時、8_10小時、 10-12小時、12-16小時、16-20小時、20-24小時或24-48小時讀取。所用測試化合物的濃度可從約10皮摩到約10微摩，例如從約1納摩到約1微 摩?？稍诶?00納摩到10微摩的濃度下進行初篩，可在較高或較低的濃度下或濃度范 圍內進行之后的次級篩選。也可進行細胞試驗以測定測試化合物對細胞代謝狀態(tài)、增殖、生長或生存力的 作用。除本文所述的報告基因示值讀數(shù)試驗外，可對細胞進行一個或多個生存力試驗、 細胞分裂試驗、細胞周期試驗、遷移試驗、侵入試驗、細胞死亡試驗或凋亡試驗。例 如，可采用MTT試驗(例如，加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corp.)的 VYBRANT MTT細胞增殖檢測試劑盒)或其衍生XTT試驗(明尼蘇達州圣保羅的MD 生物科學公司(MDBiosciences))或BrdU摻入法(ABSOLUTE-STM SBIP檢測(英杰公司))監(jiān)測細胞生長?？赏ㄟ^測定胞內ATP水平(ATPLITETM-M試劑盒(伯金艾爾莫公 司(Perkin Elmer))、細胞效價GIo (威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司(PromegaCorp))) 或葡糖-6-磷酸活性(細胞活性毒性檢測(英杰公司))或通過采用膜穿透性染料(DiOc 18)的試驗鑒定細胞生存力(或細胞毒性)。在一些實施方式中，在單獨的次級篩選中進 行細胞試驗。在一些實施方式中，細胞試驗與報告基因試驗同時進行。例如，可在鑒 定報告基因表達的同一批孔內進行采用阿拉馬藍(Alamarblue) (Nasiry等，HumanReprod 22 1304-1309(2007))的生存力試驗或檢測胱冬酶活性的凋亡試驗(例如，可從加利福 尼亞州山景城克隆泰克公司(Clantech)購得的APOALERT 胱冬酶檢測試劑盒)，只要 細胞試驗的示值讀數(shù)不同于報告基因的示值讀數(shù)。細胞用于所述方法的癌細胞可以是任何癌細胞，非限制性例子可以是結腸癌細胞、 白血病細胞、淋巴瘤細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞、肺 癌細胞、卵巢癌細胞、子 宮癌細胞、子宮頸癌細胞或頭頸癌細胞。白血病細胞的非限 制性例子包括Jurkat、HL60和K562細胞。結腸癌細胞的非限制性例子包括SW48、 SW480、SW116、CaCo—2、DLDU Colo320、Colo205、HT29 禾Π HT116 細胞。用于該方法的非癌細胞可以是任何非癌細胞，非限制性例子可以是ΗΕΚ293 細胞、COS-7細胞、CHO細胞、ΝΙΗ/3Τ3細胞或非癌的結腸細胞、小腸上皮細胞、 上皮細胞、皮膚細胞、B細胞、前B細胞、T細胞、前T細胞、乳腺細胞、前列腺細 胞、肝細胞、肺細胞、卵巢細胞或子宮頸細胞。非癌結腸(小腸上皮)細胞包括但不 限于NCM356 細胞和 NCM460 細胞(Stauffer 等，Amer.J.Surg. 169 190-195(1995)； Battacharya 等，Amer.J.Gastr丄iv.Physiol.293 G429-437 (2007)；兩種細胞均可從英賽爾 公司(Incell)購得)，以及 NCIEM 細胞(Baten 等，F(xiàn)ASEB J. 6 2726(1992))?？捎?SV40 的T抗原轉化非癌細胞以改進其可轉染性。分離原代細胞，可通過用SV40的T抗原或 hTERT穩(wěn)定轉染所述細胞使其永生化。報告基因報告基因包括可檢測其表達的任何基因，例如通過檢測蛋白質本身(例如熒光 蛋白)、基于親和力檢測蛋白質結構域(例如肽標簽如flag標簽，或通過“自標記標簽” 肽序列的表達，例如結合熒光試劑的FLASH或“l(fā)umio”標簽)或檢測報告基因蛋白催 化的酶反應的產(chǎn)物。熒光蛋白包括但不限于藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、綠色熒光蛋白、 黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、橙色熒光蛋白、青色熒光蛋白或藍色熒光蛋白。具有 不同激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光蛋白的多樣性使其在需要兩個或多個報告基因的情況下特別 有用。為研究單個細胞中若干基因平行表達而設計的慢病毒載體已用來將位于不同病 毒構建體中的三個可檢測性不同的熒光蛋白引入同一個細胞中(Weber等MoI Ther. 16 698-706(2008))。熒光蛋白檢測是非侵入性的，可隨時間推移在同一個樣品上重復進 行。用于本發(fā)明方法中的熒光蛋白基因可以是熒光蛋白基因的突變型。例如，所述熒光 蛋白基因可以是人源化或相比野生型蛋白熒光增強的突變體，也可以是轉換率較高的突 變體，從而報告基因測定可更精確地反映動態(tài)過程，如對調節(jié)化合物起反應而在剪接或 基因表達模式中發(fā)生的變化。
將底物轉化為可檢測產(chǎn)物的酶包括堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、β “內酰胺酶 和螢光素酶。例如，堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和β-內酰胺酶的底物可以是切割時 產(chǎn)生熒光化合物的偶聯(lián)物。在一些實施方式中，可采用這些酶的分泌形式。可用于本發(fā)明方法的螢光素酶包括但不限于甲蟲螢光素酶(包括叩頭蟲 (click beetle)和螢火蟲螢光素酶)、海腎(Renilla)螢光素酶和長腹水蚤(Gaussia)螢 光素酶(Verhaegeb 等 Anal.Chem.74 4378-4385(2002) ； Tannous 等 MoI.Ther. 11 435-443(2005))。螢光素酶試驗是定量的，顯示很低的背景。除 分泌型長腹水蚤螢光素 酶外，螢光素酶試驗通常需要裂解試驗細胞。然而，在一些實施方式中，可采用膜穿透 性螢光素酶試劑避免細胞裂解?？稍陔p報告基因試驗中采用具有不同發(fā)射最佳(光譜) 的螢光素酶。例如，螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶具有可區(qū)分的信號，有試驗緩沖液 可用從而允許串聯(lián)讀取兩種螢光素酶的信號(普洛麥格公司，威斯康星州麥迪遜)。叩 頭蟲甲紅色和綠色螢光素酶突變體也設計為具有不同發(fā)射光譜，從而可在同一試驗中以 同一種底物緩沖液(普洛麥格公司，威斯康星州麥迪遜)采用兩種叩頭蟲螢光素酶報告基 因。Wnt調節(jié)蛋白和激活蛋白在一些實施方式中，用于本發(fā)明方法的非癌細胞或癌細胞還包括含Wnt激活蛋 白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的重組構建體。Wnt激活蛋白是在細胞中表達時調節(jié)Wnt信號 傳導的任何蛋白質。Wnt激活蛋白的非限制性例子包括β-聯(lián)蛋白、APC、軸蛋白1、軸 蛋白 2、GSK3、Disheveled、LRP5、LRP6、Frizzled 或 Wnt 蛋白。Wnt 調節(jié)蛋白是在細 胞中表達時通過調控一個或多個Wnt激活蛋白或一個或多個Wnt調節(jié)蛋白的表達來調節(jié) Wnt信號傳導的任何蛋白質。Wnt調節(jié)蛋白的非限制性例子包括β-聯(lián)蛋白、TCF-I、 TCF-2、TCF-3、TCF-4，以及與TCF/LEF蛋白或β -聯(lián)蛋白發(fā)生相互作用的轉錄阻抑 蛋白，包括CtBP、Groucho> Pygo> p300和PIX2。在一些實施方式中，在細胞中表達 的Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白是所述激活蛋白或調節(jié)蛋白的突變型。在一些實施方式中， 所述Wnt激活蛋白(基因)是突變型APC基因。在一些實施方式中，所述Wnt激活蛋 白(基因)是突變型聯(lián)蛋白基因。基因轉移和載體可將用于所述試驗方法中的重組報告基因構建體或Wnt調節(jié)蛋白或激活蛋白表 達構建體瞬時轉染入細胞，或可將其整合入宿主細胞。就瞬時轉染或選擇穩(wěn)定整合體而 言，將重組報告基因構建體作為質粒引入細胞?？刹捎脤NA引入細胞的任何方法將 核酸構建體轉染入細胞，所述方法包括例如，電穿孔、DNA生物射彈、脂質介導的轉 染、緊密DNA介導的轉染、脂質體、葡聚糖、免疫脂質體、脂質轉染試劑、陽離子試劑 介導的轉染、陽離子表面兩親性分子(CFA) (Nature Biotechnology 199614 ； 556)、多價 陽離子如精胺、陽離子脂質或聚賴氨酸、1，2，-二(油酰氧基)-3-(三甲銨基)丙烷 (DOTAP)-膽固醇復合物(Woff 和 Trabetskoy 1998Nature Biotechnology 16 421)及其組 合。通常通過在包含抗生素的介質上選擇穩(wěn)定整合體，包含報告基因構建體的質粒具有 對所述抗生素的耐性基因。在本發(fā)明一些優(yōu)選的實施方式中，采用病毒載體遞送系統(tǒng)將所述報告基因構建 體或Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白構建體引入細胞。例如，可采用腺病毒載體、腺病毒相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體或反轉錄病毒載體(包括慢病毒載體)將所述核酸 構建體引入細胞。病毒載體遞送系統(tǒng)提供以下優(yōu)勢隨機穩(wěn)定的整合、轉導可能反抗基 因遞送方法的細胞的能力，以及重組基因的單個位點整合，提供更為可靠和一致的試驗 系統(tǒng)。誘導型病毒表達載體包括例如美國專利第6,953,575號公開的載體?？捎糜趯蟾婊驑嫿w和Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白基因引入細胞的反轉 錄病毒包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、馬感染性貧 血病毒(EIAV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、弗吉納米肉瘤 病毒(FuSV)、莫羅尼(Moloney)小鼠白血病病毒(Mo_MLV)、FBR小鼠骨肉瘤病毒 (FBR MSV)、莫羅尼小鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、阿比爾森(Abelson)小鼠白血病病毒 (A-MLV)、禽類髓細胞瘤病病毒_29(MC29)、禽類成紅細胞增多癥病毒(AEV)和慢病 毒，這些病毒具有感染分裂和非分裂兩種細胞的能力。

靈長類慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。非 靈長類慢病毒群包括原型“緩慢病毒”綿羊脫髓鞘性腦白質炎/羊慢性進行性肺病病毒 (VMV)以及相關的山羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)和最近 描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)?？刹捎靡环N以上反轉錄病毒(或慢病毒)感染同一個細胞，從而可能采用反轉錄 病毒引入多于一個報告基因構建體、Wnt調節(jié)蛋白基因、Wnt激活蛋白基因及它們的組 合?？赏ㄟ^用不同改造病毒的混合物感染細胞并選擇攜帶各種病毒的細胞實現(xiàn)用三種反 轉錄病毒同時感染細胞(Weber等MoI Ther. 16 698-706(2008))。測試化合物測試化合物可以是小分子、肽、多肽、糖類、脂質或核酸分子。測試化合物可 以是天然或合成化合物文庫的成員。例如，測試化合物可來自組合文庫，即通過組合多 個化學構建塊而化學合成或生物合成的不同化學化合物的集合。測試化合物也可包括多肽和肽，包括基于多肽的肽模擬物。測試化合物也可以 是轉錄啟動子或增強子序列、或剪接界或增強子的核酸適體和核酸分子“誘殺劑”。在 一些實施方式中，測試化合物可以采用誘導三螺旋結構以抑制基因轉錄的核酸構建體的 形式(Helene (1991) Anticancer DragDes.6 569-584)。在一些實施方式中，測試化合物可包括針對一個或多個同種型Wnt激活蛋白、 調節(jié)蛋白或Wnt信號傳導途徑組分的RNAi構建體或反義寡核苷酸。在一些實施方式 中，測試化合物是包含針對參與Wnt信號傳導的一個或多個同種型基因的一種或多種 核酶的核酸分子。RNAi構建體、反義寡核苷酸和核酶的設計、合成和使用參見例如， Dykxhoorn 等(2003)Nat.Rev.MoI.Cell.Biol.4 457-467; Hannon 等(2004) Nature 431 371-378 ； Sarver 等(1990) Science 247 1222-1225; Been 等(1986) Cell 47 207-216。例如，一些實施方式中的測試化合物是siRNA( “短干擾RNA”)分子或產(chǎn)生 SiRNA分子的核酸構建體。在一些實施方式中，將測試化合物作為一種或多種短發(fā)夾 RNA( "shRNA")或轉錄產(chǎn)生一種或多種shRNA的一個或多個DNA構建體引入細胞， 其中在細胞內加工所述shRNA以產(chǎn)生一種或多種SiRNA分子?？扇芜x引入用于表達siRNA、shRNA、反義RNA、核酶的核酸構建體或產(chǎn)生三
螺旋結構的核酸作為RNA分子或重組DNA構建體。任選設計降低特定同種型的基因表達或剪接的DNA構建體，從而在細胞中自哺乳動物中具有轉錄活性的啟動子開始表達所 需RNA分子。出于一些目的，優(yōu)選采用基于病毒或質粒的核酸構建體引入所述測試化合 物。藥物組合物及給藥方法采用一種或多種生理上可接受的運載體配制藥物組合物，所述運載體包括促進 將活性化合物加工為藥學上使用的制劑的賦形劑和助劑。適當?shù)闹苿┮蕾囉谒x的給 藥途徑。對藥物組合物的總結參見例如，《雷明登藥物科學與實踐》(Remington: The Science and Practice of Pharmacy)，第9版(賓夕法尼亞外丨伊斯頓馬克出版公司 (Eahston，Pa. Mack PublishingCompany), 1995) ； Hoover, John E.,《雷明登藥 物科學》(Remington ‘ sPharmaceutical Sciences)，馬克出版公司，賓夕法尼亞外丨伊斯 頓(MackPublishing Co., Easton, Pennsylvania) 1975 ； Liberman, H.A.禾口 Lachman, L.編，《藥物劑型》(Pharmaceutical Dosage Forms)，Marcel Decker 出版公司，紐約， 1980 ；以及《藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng)》(Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems)，第 7 版(Lippincott Williams 和 Wilkins 出版公司，I"9)。本文提供的藥物組合物包括一種或多種調節(jié)Wnt信號傳導的化合物(“Wnt信號 傳導調節(jié)物”)和藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或運載體。此外，任選將Wnt信號傳 導調節(jié)物作為與其它活性成分混合的藥物組合物進行給藥，如在聯(lián)合治療中那樣。在一 些實施方式中，所述藥物組合物包括其它藥用或藥學試劑、運載體、佐劑，如防腐劑、 穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、溶解促進劑、調節(jié)滲透壓的鹽類和/或緩沖液。此外，所述 藥物組合物也包含其它有治療價值的物質。本文所用的藥物組合物指Wnt信號傳導調節(jié)物與其它化學組分如運載體、穩(wěn)定 齊 、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑的混合物。所述藥物組合物促進 Wnt同種型表達調節(jié)物給予生物體。實施本文提供的治療或使用方法中，將治療有效量 的Wnt信號傳導調節(jié)物以藥物組合物的形式給予具有待治療的狀況、疾病或病癥的哺乳 動物。在一些實施方式中，所述疾病是癌癥。哺乳動物優(yōu)選人。治療有效量根據(jù)狀況 的嚴重程度和所處階段、對象的年齡和相對健康狀況、所用Wnt信號傳導調節(jié)物的效力 和其它因素而不同。任選單獨使用或與作為混合物組分的一種或多種治療劑聯(lián)用Wnt信 號傳導調節(jié)物。任選通過多種給藥途徑將本文所述的藥物制劑給予對象，給藥途徑包括但不限 于口服、腸胃外(例如，靜脈內、皮下、肌內)、鼻內、口腔含化、外用、直腸或透皮給 藥途徑。本文所述的藥物組合物包括但不限于水性液體分散體、自身乳化分散體、固體 溶液、脂質體分散體、氣溶膠、固體劑型、粉劑、速釋制劑、控釋制劑、速融制劑、片 齊U、膠囊、丸劑、遲釋制劑、緩釋制劑、脈沖釋放制劑、多顆粒制劑以及速釋和控釋混 合制劑。一些實施方式中的藥物組合物包括至少一種Wnt同種型表達調節(jié)物，作為游離 酸或游離堿形式或藥學上可接受的鹽形式的活性成分。此外，本文所述的方法和藥物組 合物包括使用N-氧化物、晶形(也稱為多晶型)以及這些Wnt同種型表達調節(jié)物具有同 種活性的活性代謝物。在一些情況中，Wnt同種型表達調節(jié)物以互變異構體形式存在?！斑\載體材料”包括制藥學中任何常用的賦形劑， 應基于與本文公開化合物如Wnt同種型表達調節(jié)物的相容性和所需劑型的釋放曲線性質對其進行選擇。示范性運載 體材料包括例如，粘合劑、懸浮劑、崩解劑、填充劑、表面活性劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、 潤滑劑、潤濕劑、稀釋劑等。本文所述包含Wnt信號傳導調節(jié)物的藥物組合物可配制為任何合適的劑型，包 括但不限于水性口服分散體、液體、凝膠、糖漿、酏劑、漿液、懸浮液等，就待治療患 者口服攝取而言，包括固 體口服劑型、氣溶膠、控釋制劑、速融制劑、泡騰制劑、凍干 制劑、片劑、粉劑、丸劑、錠劑、膠囊、遲釋制劑、緩釋制劑、脈沖釋放制劑、多顆粒 制劑以及速釋和控釋混合制劑。就吸入給藥而言，所述Wnt信號傳導調節(jié)物任選地采用氣溶膠、霧劑或粉劑形 式。采用合適的推進劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其 它合適的氣體，在加壓包裝或噴霧器中以氣溶膠噴霧形式方便地遞送本文所述藥物組合 物。在加壓氣溶膠的情況下，通過提供閥門遞送計量用量來確定劑量單位。將例如(僅 是舉例)用于吸入劑或吹入劑的明膠膠囊和藥筒配制為包含Wnt同種型表達調節(jié)物和合適 的粉基，如乳糖或淀粉的粉末混合物。Wnt信號傳導調節(jié)物透皮制劑的給藥方式在例如美國專利第3,598,122、 3,598,123, 3,710,795, 3,731,683, 3,742,951, 3,814,097, 3,921,636, 3,972,995, 3,993,072, 3,993,073, 3,996,934, 4,031,894, 4,060,084, 4,069,307, 4,077,407, 4,201,211, 4,230,105, 4,292,299, 4,292,303, 5,336,168, 5,665,378, 5,837,280, 5,869,090、6,923,983、6,929,801 和 6,946,144 號中有描述。適用于肌內、皮下或靜脈內注射的包含Wnt信號傳導調節(jié)物的制劑包括生理上 可接受的無菌水性或非水性溶液、分散體、懸浮液或乳液，以及用于重建為無菌可注射 溶液或分散體的無菌粉末。合適的水性和非水性運載體、稀釋劑、溶劑或載體的例子包 括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛(cremophor)等)、其合適的 混合物、植物油(如橄欖油)和可注射有機酯如油酸乙酯。例如，通過使用涂層如卵磷 月旨、在分散體的情況中通過保持所需粒度和通過使用表面活性劑來維持適當?shù)牧鲃有浴?適合皮下注射的制劑還包含任選的添加劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。就靜脈內注射而言，任選地在水性溶液中配制Wnt信號傳導調節(jié)物，優(yōu)選生理 相容性緩沖液，如漢克液(Hank’ s solution)、林格液(Ringer’ ssolution)或生理鹽水緩 沖液。就經(jīng)粘膜給藥而言，在制劑中采用適合要滲透的屏障的滲透劑。就其它腸胃外注 射而言，合適的制劑包括水性或非水性溶液，優(yōu)選帶有生理相容性緩沖液或賦形劑。胃腸外注射任選包括推注或連續(xù)輸注。用于注射的制劑任選地以單位劑型提 供，例如，裝在安瓿或多劑量容器中，添加有防腐劑。在一些實施方式中，本文所述 藥物組合物采用適用于胃腸外注射的油性或水性載體中的無菌懸浮液、溶液或乳液的形 式，其包含配方試劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于胃腸外給藥的藥物組合物 包括水溶性形式的Wnt信號傳導調節(jié)物的水性溶液。此外，Wnt信號傳導調節(jié)物的懸浮 液任選制備為合適的油性注射懸浮液。在一些實施方式中，將Wnt信號傳導調節(jié)物局部給藥，將其配制為各種可局部 給藥的組合物，如溶液、懸浮液、洗液、凝膠、糊劑、藥棒、香膏、乳膏或油膏。這樣 的藥物組合物任選包含增溶劑、穩(wěn)定劑、張度增強劑、緩沖液和防腐劑。
也可任選將Wnt信號傳導調節(jié)物配制為直腸組合物，如灌腸劑、直腸凝膠、直 腸泡沫、直腸氣溶膠、栓劑、膠凍栓劑或滯留灌腸劑，其包含常規(guī)栓劑基料如可可油或 其它甘油酯，以及合成聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮、PEG等。鑒定調節(jié)癌細胞中Wnt信號傳導的化合物的試驗提供了鑒定調節(jié)癌細胞中Wnt信號傳導的化合物的方法，其中所述方法包括 提供包含啟動子調控的報告基因的癌細胞，所述啟動子受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白之間相 互作用的調節(jié)；提供包含啟動子調控的所述報告基因的非癌細胞，所述啟動子受TCF/ LEF和β-聯(lián)蛋白之間相互作用的調節(jié)；使所述癌細胞和非癌細胞接觸測試化合物；鑒 定調節(jié)癌細胞中報告基因表達的信號但不調節(jié)非癌細胞中報告基因表達的信號的測試化 合物。通過將細胞接觸測試化合物時檢測到的細胞信號與細胞未接觸測試化合物時檢測 到的信號作比較，確定對細胞中報告基因的信號的調節(jié)作用。用于所述方法的癌細胞可以是任何癌細胞，非限制性例子可以是結腸癌細胞、 白血病細胞、淋巴瘤細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞、肺 癌細胞、卵巢癌細胞、子宮頸癌細胞或頭頸癌細胞。在一些實施方式中，所述癌細胞是 白血病細胞，例如，Jurkat細胞、HL60細胞或Κ562細胞。在一些實施方式中，所述癌細 胞是結腸癌細胞，例如，SW116細胞、SW48細胞、SW480細胞、Colo 320細胞、Colo 205細胞、ΗΤ-29細胞、ΗΤ-116細胞或CaC02細胞。用于該方法的非癌細胞可以是任何非癌細胞，非限制性例子可以是HEK293細 胞、COS-7細胞、CHO細胞、NIH/3T3細胞或非癌的結腸細胞、上皮細胞、皮膚細胞、 B細胞、T細胞、乳腺細胞、前列腺細胞、肝細胞、肺細胞、卵巢細胞、子宮細胞或子宮 頸細胞。非癌結腸細胞包括但不限于NCM 356細胞和NCM 460細胞(兩種細胞均可 從英賽爾公司購得)，以及NCIEM細胞(Baten等，F(xiàn)ASEB J.6 2726 (1992))。在一些實施方式中，采用癌性結腸細胞和非癌性結腸細胞實施所述方法。受TCF/LEF和β -聯(lián)蛋白之間相互作用調節(jié)的啟動子是結合β -聯(lián)蛋白或受其 作用的TCF/LEF蛋白上調、下調、抑制或激活的任何啟動子，包括合成啟動子、天然產(chǎn) 生的啟動子、天然產(chǎn)生的啟動子的一部分、嵌合啟動子等。也包括WIN啟動子。WIN啟 動子是包含一個或多個Wnt應答元件(WRE)的合成啟動子，所述應答元件發(fā)現(xiàn)于Wnt/ β-聯(lián)蛋白途徑激活的基因或在Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑被組成性激活的癌細胞中過表達基因 的啟動子中。本文提供的用于表達構建體的啟動子包括WIN啟動子、Wnt/β-聯(lián)蛋白途 徑激活的包含至少兩個Wnt應答元件的基因天然啟動子、帶有至少兩個或多個Wnt應答 元件并結合了側接Wnt應答元件的合成序列的基因天然啟動子的組合，以及帶有兩個或 多個Wnt應答元件并結合了另外的其它轉錄激活蛋白結合位點的天然啟動子。用于所述 方法的合成啟動子是包含還存在于“TOPFlash”啟動子的Wnt應答元件的WIN啟動子， 但所述WIN啟動子包含散布于WRE之間的富含GC的區(qū)域(

圖1)。圖1顯示癌癥相關 的Wnt報告基因。除發(fā)現(xiàn)于Wnt/ β -聯(lián)蛋白途徑激活的基因或在Wnt/ β -聯(lián)蛋白途徑被 組成性激活的癌細胞中過表達基因的啟動子中的一個或多個Wnt應答元件以外，合成啟 動子可包含一個或多個富含GC的區(qū)域。以下啟動子也可用于所述構建體Wnt/β-聯(lián) 蛋白途徑激活的包含至少兩個(或多個)Wnt應答元件的基因天然啟動子、帶有至少兩個 或多個Wnt應答元件并結合了側接所述Wnt應答元件的合成序列的基因天然啟動子的組合，以及帶有兩個或多個Wnt應答元件并結合了另外的其它轉錄激活蛋白結合位點的天 然啟動子。受TCF/LEF和β -聯(lián)蛋白之間相互作用調節(jié)的天然產(chǎn)生啟動子的非限制性例子 包括但不限于LEF-I、c-myc、c_myb、c_kit、細胞周期蛋白Dl、cdx、MMP7、存活蛋 白、Siamois、軸蛋白2、DKK4和sp5的啟動子。不想將本發(fā)明方法或采用本發(fā)明方法鑒定的Wnt調節(jié)化合物限制于任何特定機 理，但應理解，一些通過結合與β-聯(lián)蛋白形成復合物的TCF/LEF蛋白激活的啟動子也 可由聯(lián)蛋白與TCF/LEF家族的 特定成員而非另一成員的相互作用激活?？赏ㄟ^可能 與TCF/LEF或β聯(lián)蛋白發(fā)生或不發(fā)生相互作用的其它蛋白質調控受TCF/LEF-β聯(lián)蛋白 調控的啟動子。例如，LEF-I受TCF-4而非LEF-I本身調控，除非存在ΡΙΤΧ2，在該情況 中LEF-I與ΡΙΤΧ2相互作用誘導其本身的轉錄(Amen等MoI Cell.Biol.27 7560-7573)。 TCF-4E 調控 LEF-I 和 cdx，不受 LEF-I 調控。LEF-I 激活 Siamois，而 TCF-4E 不具該 功能(Hecht等J.Biol.Chem.278 3776-3785(2003))。在所述方法包括的實施方式中，鑒 定調節(jié)Wnt信號傳導的化合物的試驗鑒定兩個或多個TCF/LEF-β聯(lián)蛋白應答啟動子的 表達，以確保所述化合物作用具有Wnt途徑特異性。例如，待鑒定細胞可具有操作性連 接于WIN啟動子的第一報告基因和操作性連接于軸蛋白2啟動子的第二報告基因。第三 報告基因可操作性連接于組成型啟動子以便標準化報告基因表達水平。在這些實施方式 中，鑒定為Wnt途徑調節(jié)物的測試化合物是導致癌細胞而非正常細胞中一個或兩個基因 表達水平差異的化合物。還提供一種方法，其中所述方法包括提供包含核酸構建體的細胞，所述構建 體含有編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因和啟動子調控的報告基因，所述啟動子 受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白之間相互作用的調節(jié)；使所述細胞接觸測試化合物；相對于未 接觸測試化合物的對照細胞中報告基因表達的信號，將具有調節(jié)接觸測試化合物的細胞 中報告基因表達的信號作用的測試化合物鑒定為調節(jié)Wnt信號傳導的化合物，其中在不 存在包含編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的核酸構建體的細胞中未發(fā)現(xiàn)所述作 用。在這些方面中，所述試驗細胞包括含Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的重 組構建體。Wnt激活蛋白是在細胞中表達時刺激或抑制Wnt信號傳導的任何蛋白質。 Wnt激活蛋白的非限制性例子包括β-聯(lián)蛋白、APC、軸蛋白1、軸蛋白2、GSK3、 Disheveled、LRP5、LRP6、Frizzled或Wnt蛋白。Wnt調節(jié)蛋白是在細胞中表達時通過 調控一個或多個Wnt激活蛋白或一個或多個Wnt調節(jié)蛋白的表達來調節(jié)Wnt信號傳導的 任何蛋白質。Wnt調節(jié)蛋白的非限制性例子包括β-聯(lián)蛋白、TCF-I、TCF-2、TCF-3、 TCF-4，以及與TCF/LEF蛋白或β _聯(lián)蛋白發(fā)生相互作用的轉錄阻抑蛋白和轉錄增強 物，包括CtBP、Groucho> Pygo> p300和PIX2。在一些實施方式中，在細胞中表達 的Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白是所述激活蛋白或調節(jié)蛋白的突變型。在一些實施方式中， 所述Wnt激活蛋白(基因)是突變型APC基因。在一些實施方式中，所述Wnt激活蛋 白(基因)是突變型聯(lián)蛋白基因。在另一方面，提供鑒定調節(jié)Wnt信號傳導的化合物的方法，包括提供包含以 下的細胞1)包含編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的核酸構建體，所述基因處于誘導型啟動子的調控下，2)啟動子調控的報告基因，所述啟動子受TCF/LEF和β-聯(lián) 蛋白之間相互作用的調節(jié)；誘導Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的表達；使所述細胞接觸 測試化合物；相對于未接觸測試化合物的對照細胞中報告基因表達的信號，鑒定具有調 節(jié)接觸測試化合物的細胞中報告基因表達的信號的作用的測試化合物，其中在未誘導編 碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的細胞中未獲得所述作用。用于本文所述試驗的報告基因可以是任何報告基因，例如，堿性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶、內酰胺酶、熒光蛋白、螢光素酶或CAT。在一些優(yōu)選的實施方式中，用 于所述方法的試驗細胞包含至少兩個報告基因，其中至少一個是啟動子調控的對照報告 基因，所述啟動子不受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白相互作用的調控，例如組成型啟動子。在 這些實施方式中，將操作性連接于受TCF/LEF和聯(lián)蛋白之間相互作用調節(jié)的啟動子 的報告基因表達的信號檢測根據(jù)表達受組成型啟動子調控的第二報告基因的檢測信號標 準化。具有重組Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白的細胞可以是癌細胞或非癌細胞。在所述 方法的優(yōu)選實施方式中，其中在待測細胞中提供編碼Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白的基因， 所述待測細胞是非癌細胞，其中Wnt信號傳導途徑被Wnt調節(jié)蛋白或激活蛋白的表達激 活?？赏ㄟ^具有Wnt應答啟動子的報告基因表達評估存在或誘導Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋 白的表達對Wnt信號傳導途徑的激活作用。報告基因表達是缺乏Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋 白或未誘導Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白表達的同一類型細胞中表達的至少兩倍表明所述細 胞具有激活的Wnt信號傳導途徑。所述非癌細胞可以是任何細胞，例如，HEK細胞、COS-7細胞、ΝΙΗ/3Τ3細 胞、CHO細胞等，但優(yōu)選非癌T細胞、前T細胞、乳腺細胞、前列腺細胞、上皮細胞、 結腸細胞、小腸上皮細胞、皮膚細胞、肝細胞、肺細胞、卵巢細胞、子宮細胞或子宮頸 細胞，這些細胞中Wnt調節(jié)蛋白或激活蛋白的表達激活Wnt信號傳導途徑。例如，非癌 結腸或小腸上皮細胞，例如但不限于NCM 356細胞、NCM 460細胞和NCIEM細胞可用 于本文所述方法。試驗細胞表達的Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白可以是激活Wnt途徑的任何Wnt 激活蛋白或調節(jié)蛋白。在一些實施方式中，Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白是Wnt調節(jié)蛋白， 例如，包含 LEF1、TCFU TCF3、TCF4、CtBP> Pygo> Groucho> CtBP、ρ300 或這些 蛋白的截短型或突變型。在一些實施方式中，試驗細胞表達的Wnt調節(jié)蛋白是LEF1、 TCFU TCF3或TCF4，或其截短型或突變型。在一些實施方式中，試驗細胞表達的重 組Wnt調節(jié)蛋白是TCF-4E或LEF-I。在一些實施方式中，Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白是 β-聯(lián)蛋白，或Wnt激活蛋白的突變型或截短型，例如，β-聯(lián)蛋白、APC、軸蛋白1、 軸蛋白 2、GSK3 β , Disheveled、LRP5、LRP6、Frizzled 或 Wnt 的突變型。在某些實施 方式中，Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白是Wnt，如Wntl、Wnt3或Wnt 3a。在某些實施方式 中，Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白是Frizzled(Fz)，如Fzl、Fz3、Fz5或Fz7。在某些實施方式中，試驗細胞表達的Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白是激活Wnt信號 傳導的突變型β-聯(lián)蛋白，如缺乏外顯子3磷酸化位點的突變型β-聯(lián)蛋白，或激活Wnt 信號傳導的突變型APC，如缺乏功能性β-聯(lián)蛋白結合結構域的截短APC。在本發(fā)明的一些實施方式中， 試驗細胞包含編碼兩種或多種Wnt激活蛋白或調節(jié)蛋白的核酸構建體。試驗細胞可表達重組Wnt調節(jié)蛋白和激活蛋白的任何組合。在本 發(fā)明的一些實施方式中，將Wnt調節(jié)蛋白和Wnt激活蛋白引入試驗細胞。例如，試驗細 胞可包含編碼β -聯(lián)蛋白和LEF-I、TCF-4和截短APC基因或LEF-I和TCF-4的重組構 建體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，引入試驗細胞的兩個或多個Wnt調節(jié)蛋白或激活蛋 白激活Wnt途徑。

在另一方面，本發(fā)明包括鑒定調節(jié)Wnt信號傳導的化合物的方法，其采用負選 擇鑒定破壞經(jīng)由TCF/LEF和β _聯(lián)蛋白相互作用的基因激活的化合物。所述方法包括 提供具有受啟動子調控的報告基因的細胞，所述啟動子受TCF/LEF和聯(lián)蛋白之間相 互作用的調節(jié)，其中所述報告基因具有負選擇性；使所述細胞接觸測試化合物；使所述 細胞接觸前藥，所述前藥由報告基因編碼的蛋白質轉化為活性藥物；鑒定允許細胞在前 藥存在下生長的測試化合物。在這些實施方式中，耐受負選擇的細胞是Wnt途徑被破壞的細胞。可用于負選擇的報告基因包括但不限于將阿昔洛韋和更昔洛韋轉化為毒性 化合物的胸苷激酶、將藥物的頭孢菌素偶聯(lián)物(例如，C-Dox[頭孢菌素多柔比星]和 CCM[7-(4-羧基丁酰氨基)-頭孢菌素氮芥(mustard)])轉化為其毒性形式的β _內酰胺 酶、將5-氟胞嘧啶轉化為5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶、可將含磷酸鹽的前藥轉化為其毒 性形式的堿性磷酸酶、將含硫酸鹽的前藥轉化為游離藥物的芳基硫酸酯酶、將糖基化的 前藥轉化為游離藥物的β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶和將含肽前藥轉化為游離藥物的肽 酶。實施例1 調節(jié)癌細胞中Wnt信號傳導途徑的細胞試驗SW480是具有產(chǎn)生截短APC蛋白的突變APC基因的結腸癌細胞系，導致聯(lián) 蛋白累積失調。通過用包含處于WIN啟動子，WinBeam調控下的螢火蟲螢光素酶基因 的慢病毒載體穩(wěn)定轉化細胞系，產(chǎn)生報告基因細胞系CWinBeam-SW480，所述啟動子基 于天然產(chǎn)生的Wnt應答啟動子SP5的啟動子序列(Naoko Fuiimura等JBC 2007的圖3顯示 SP5啟動子)。此外，通過用處于WIN報告基因，WinVerve和WinThunder調控下的螢 火蟲螢光素酶基因穩(wěn)定轉導SW480，產(chǎn)生其它兩個報告基因細胞系cWinVerve-SW480和 cWinThunder-SW480,所述WinVerve報告基因基于天然產(chǎn)生的Wnt應答啟動子DKK4的 啟動子序列(圖4)，所述WinThunder報告基因是由12個或更多WRE組成的合成Wnt應 答DNA(圖5)。在產(chǎn)生的細胞系中，在通過脂質轉染將β-聯(lián)蛋白的SiRNA而非siRNA 陰性對照引入細胞時，WIN啟動子的螢光素酶活性消失(圖6-8)。圖6顯示β-聯(lián)蛋白的 SiRNA如何有效下調β _聯(lián)蛋白表達并消除WinBeam螢光素酶活性。圖7顯示W(wǎng)inVerve 螢光素酶活性如何被β _聯(lián)蛋白的SiRNA下調。圖8顯示cWinThunder活性如何被β -聯(lián) 蛋白的SiRNA下調。采用同一細胞系，通過處于組成型啟動子SV40調控下的螢火蟲螢 光素酶基因的穩(wěn)定轉染產(chǎn)生對照報告基因，該啟動子不受聯(lián)蛋白的SiRNA影響(圖 9)。圖9顯示SV40啟動子活性不受β -聯(lián)蛋白的SiRNA影響。在一些實施方式中，帶有不同突變如β-聯(lián)蛋白中突變的其它結腸癌細胞， HCT-116也可用來產(chǎn)生帶有WIN啟動子的穩(wěn)定報告基因細胞系cWinB eam-HCT-116、 cWinVerve-HCT-116和cWinThunder-HCT-l 16，以及帶有SV40的對照報告基因細胞(圖 10-12)。 圖10顯示W(wǎng)inBeam如何在SW480、HCT-116和DLDl中具有組成型活性。圖11顯示W(wǎng)inVerve如何在SW480和HCT-116中具有組成型活性。圖12顯示SW480和HCT-116細胞中的WinThunder螢光素酶活性。在其它實施方式中，正常細胞如人胚胎腎 細胞系HEK293也可用來產(chǎn)生帶有WIN啟動子的穩(wěn)定報告基因細胞系cWinBeam_293、 cWinVerve-293和cWinThunder-293，以及帶有SV40的對照報告基因細胞(圖13-15)。 圖13顯示W(wǎng)inBeam如何在293細胞中被β -聯(lián)蛋白和Wnt激活蛋白激活。圖14顯示 WinVerve如何在293細胞中被β -聯(lián)蛋白和Wnt激活蛋白激活。圖15顯示帶有誘導型 β -聯(lián)蛋白的293Trex細胞中的WinThunder活性。在正常細胞的情況中，通過加入外源Wnt激活蛋白或穩(wěn)定表達與誘導型 “Tet-On”啟動子連接的聯(lián)蛋白獲得功能性“Ε3”突變體來誘導報告基因活性。該
突變型β-聯(lián)蛋白缺乏包含磷酸化位點S33、S37、Τ41和S45的外顯子3結構域，因此 不是β-聯(lián)蛋白降解復合物降解的目標，從而在細胞中形成組成型Wnt信號傳導。所述 “Tet-On”啟動子允許通過向培養(yǎng)物中加入四環(huán)素或四環(huán)素衍生物多西環(huán)素來進行可滴 定誘導，從而在抗生素調控下穩(wěn)定表達活性聯(lián)蛋白(圖13-15)。將培養(yǎng)的cWinBeam細胞以每孔約10,000個細胞分配到384孔多孔板上。向 孔中加入化合物文庫的化合物至終濃度達到50皮摩到10微摩。各細胞類型的一系列對 照孔只接受緩沖液或化合物溶劑。在加入化合物后24小時，通過加入BrightGlo螢光素 酶⑧報告基因檢測試劑反應/裂解緩沖液，采用發(fā)光計讀取光發(fā)射來鑒定WIN報告基因 (WinBeam、WinVerve和WinThunder)的活性和SV40螢光素酶。在兩復板上，通過加入 細胞效價GIo試劑/裂解緩沖液，采用發(fā)光計讀取光發(fā)射，鑒定細胞生存力(圖16-18)。 圖16顯示采用WIN報告基因選擇得到的化合物。圖17顯示如何采用WIN報告基因將 非特異性和毒性化合物排除在分析范圍之外。圖18顯示如何將對WIN報告基因沒有作 用的毒性和非特異性化合物排除在分析范圍之外。如果測試化合物調節(jié)WinBeam報告基因活性但不影響SV40啟動子活性，則鑒 定其為候選調節(jié)物。在其它實施方式中，如果測試化合物調節(jié)WinVerve和WinThunder 報告基因活性，則將其視作候選調節(jié)物。經(jīng)細胞生存力試驗讀數(shù)所示影響細胞生存力的 測試化合物鑒定為毒性化合物(圖16-18)。藉此鑒定為候選調節(jié)物的測試化合物用于重復篩選。在重復篩選中，將 cWinBeam細胞分配到兩復96孔板的孔中，加入給定的測試化合物。如前所述在加入測 試化合物后4-48小時檢驗各孔。進行螢光素酶試驗和細胞生存力試驗。將在cWinBeam 報告基因細胞中引起WIN螢光素酶信號差異但不影響細胞生存力的測試化合物鑒定為 Wnt信號傳導調節(jié)物。在其它實施方式中，如果測試化合物調節(jié)WinVerve和WinThunder 報告基因活性但不影響生存力，則將其視作候選調節(jié)物(圖16-18)。實施例2:采用正常細胞或癌細胞和細胞表達的外源Wnt途徑激活蛋白的細胞試 驗用以下瞬時轉染人胚胎腎細胞系HEK293 1)巨細胞病毒(CMV)啟動子組成性 調控下的編碼β-聯(lián)蛋白的基因，其通過IRES與編碼紅色熒光蛋白的基因連接；和2) 包含軸蛋白2啟動子調控下的綠色熒光蛋白(GFP)基因的報告基因構建體(圖2)。通過 IRES與β-聯(lián)蛋白基因連接的RFP基因提供用Wnt激活蛋白β-聯(lián)蛋白基因轉染細胞的 標記，以及標準化GFP報告基因信號的表達對照。所述RFP和GFP基因編碼半衰期縮短的失穩(wěn)RFP和GFP以供改進的試驗(可從加利福尼亞州山景城的克隆泰克公司購得)。
將所述細胞分配到384孔板上，在轉染后24小時向孔中加入化合物文庫的測試 化合物至終濃度達到50皮摩到10微摩。一系列對照孔接受化合物緩沖液或溶劑，代替 測試化合物。在加入化合物后4、8、12和24小時的時間點采用熒光計鑒定細胞的RFP 和GFP表達。各孔的GFP信號根據(jù)該孔的RFP信號標準化。將增強或減弱標準化GFP 信號的測試化合物鑒定為調節(jié)Wnt信號傳導的化合物。實施例3:采用正常細胞或癌細胞、細胞表達的外源Wnt途徑激活蛋白和兩個報 告基因的細胞試驗用具有以下的三種不同慢病毒構建體轉化正常人大腸上皮細胞系NCM460(英賽 爾公司，德克薩斯州圣安東尼奧)1)WIN啟動子調控下的穩(wěn)定整合綠色熒光蛋白基因 (圖1) ； 2)sp5啟動子調控下的穩(wěn)定整合紅色熒光蛋白基因(圖3)；和3)用于基因表達 標準化的組成型HSVtk啟動子調控下的穩(wěn)定整合的編碼黃色熒光蛋白(YFP)的基因。所 述GFP、RFP和YFP基因編碼失穩(wěn)蛋白質以供更可靠的試驗。所得NCM460/G，R， YFP-tet^聯(lián)蛋白細胞系還具有4)與誘導型“Tet-On”啟動子連接的編碼β-聯(lián)蛋白獲 得功能性“Ε3”突變體的反轉錄病毒整合基因。該突變型聯(lián)蛋白缺乏包含磷酸化位 點S33、S37、Τ41和S45的外顯子3結構域，因此不是β -聯(lián)蛋白降解復合物降解的目 標，從而在細胞中形成組成型Wnt信號傳導。所述“Tet-On”啟動子允許通過向培養(yǎng)物 中加入四環(huán)素或四環(huán)素衍生物多西環(huán)素進行可滴定誘導。懸浮培養(yǎng)NCM460/G，R，YFP-tet^聯(lián)蛋白細胞，將其以每孔約10,000個細胞
分配到兩復384孔多孔板上，通過加入0.5微克/毫升的多西環(huán)素誘導兩復板之一各孔培 養(yǎng)物中的β聯(lián)蛋白表達。在多西環(huán)素誘導后24小時，向兩復板的孔中加入化合物文庫 的測試化合物至終濃度達到1微摩。各細胞類型的一系列對照孔只接受緩沖液或溶劑。 在加入所述化合物后0、4、8、12和24小時讀取GFP、RFP和YFP的熒光信號。根據(jù)接受測試化合物的兩復板的各孔中YFP的信號標準化GFP和RFP各報告基 因表達的信號。將這些標準化值與未加入測試化合物的對照孔的標準化值進行比較，以 提供各測試化合物孔的測試化合物調節(jié)值(各測試化合物改變報告基因活性的程度的標 準化值)。就給定化合物而言，比較多西環(huán)素誘導和未誘導的NCM460/RLu，GLu-ind^ 聯(lián)蛋白孔的調節(jié)值。將與加入未誘導細胞時相比，在加入誘導細胞時能引起顯著不同調 節(jié)值(正或負)的化合物鑒定為調節(jié)Wnt信號傳導的化合物。實施例4 :采用β -內酰胺酶的負選擇篩選用包含WIN啟動子調控下的β -內酰胺酶基因的AAV構建體穩(wěn)定轉染DLDl結 腸癌細胞系的細胞。采用產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，例如香豆素頭孢菌素熒光素(CCF2)的底物， 通過試驗驗證所述啟動子的β-內酰胺酶表達。為檢驗抑制所述WIN啟動子的化合物，將細胞以每孔10,000個細胞分配到384 孔板的孔中。向孔中加入測試化合物至濃度為1微摩。一系列對照孔接受緩沖液或化合 物溶劑，代替測試化合物。在加入測試化合物后24小時向各孔中加入C-Dox(多西環(huán)素 的頭孢菌素衍生物)，使?jié)舛冗_到0.1-1微摩。將細胞再溫育24小時，之后將培養(yǎng)基換 為不含測試化合物或前藥的培養(yǎng)基。在24小時、2天和3天后檢查孔中的細胞生存力和生長情況。鑒定細胞存活的孔為接受了調節(jié)Wnt信號傳導的測試化合物的孔。
可采用胸苷激酶作為負選擇性標記進行相同篩選，其中細胞在測試化合物存在 下溫育后，向孔中加入的前藥是例如阿昔洛韋或更昔洛韋。
權利要求
1.一種鑒定調節(jié)細胞中Wnt信號傳導的化合物的方法，包括(a)提供包含啟動子調控的報告基因的癌細胞，所述啟動子受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋 白之間相互作用的調節(jié)；(b)提供包含啟動子調控的所述報告基因的非癌細胞，所述啟動子受TCF/LEF和 β-聯(lián)蛋白之間相互作用的調節(jié)；(c)使(a)的癌細胞和(b)的非癌細胞接觸測試化合物；和(d)檢測接觸測試化合物的癌細胞中報告基因表達的信號和未接觸測試化合物的癌細 胞中報告基因表達的信號，并檢測接觸測試化合物的非癌細胞中報告基因表達的信號和 未接觸測試化合物的非癌細胞中報告基因表達的信號；和(e)如果測試化合物調節(jié)癌細胞中報告基因表達的信號但不調節(jié)非癌細胞中報告基因 表達的信號，則將其鑒定為調節(jié)癌細胞中Wnt信號傳導的化合物。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌細胞是結腸癌細胞、白血病細胞、 淋巴瘤細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞或頭頸癌細胞。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細胞是結腸癌細胞、白血病細胞或淋 巴瘤細胞。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述細胞是白血病細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述細胞是Jurkat細胞或K562細胞。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述細胞是結腸癌細胞。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述細胞是SW48、SW480、SW116、 CaC02、DLDU Colo320、Colo205、LS174T、HT-29 或 HT-116 細胞。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述非癌細胞是HEK293細胞、HeLa細 胞、C0S-7細胞、CHO細胞或NIH/3T3細胞。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述非癌細胞是小腸上皮細胞、非癌結腸 細胞、非癌淋巴細胞、非癌上皮細胞、非癌乳腺細胞、非癌前列腺細胞或非癌肝細胞。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述細胞是小腸上皮細胞。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述細胞是正常人大腸上皮細胞 (NHLIEC)。
12.—種鑒定調節(jié)Wnt信號傳導的化合物的方法，包括(a)提供包含核酸構建體的細胞，所述構建體含有編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白 的基因和啟動子調控的報告基因，所述啟動子受TCF/LEF和聯(lián)蛋白之間相互作用的 調節(jié)；(b)使所述細胞接觸測試化合物；和(c)相對于未接觸測試化合物的對照細胞中報告基因表達的信號，將具有調節(jié)接觸測 試化合物的細胞中報告基因表達的信號的作用的測試化合物鑒定為調節(jié)Wnt信號傳導的 化合物，其中在不存在包含編碼Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的核酸構建體的細 胞中未發(fā)現(xiàn)所述作用。
13.—種鑒定調節(jié)Wnt信號傳導的化合物的方法，包括(a)提供包含核酸構建體的細胞，所述核酸構建體包含誘導型啟動子調控下的編碼 Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因，還包含啟動子調控的報告基因，所述啟動子受TCF/LEF和β -聯(lián)蛋白之間相互作用的調節(jié)；(b)誘導Wnt激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的表達；(C)使所述細胞接觸測試化合物；和(d)鑒定相對于未接觸測試化合物的對照細胞中報告基因表達的信號，具有調節(jié)接觸 測試化合物的細胞中報告基因表達的信號的作用的測試化合物，其中在未誘導編碼Wnt 激活蛋白或Wnt調節(jié)蛋白的基因的細胞中未獲得所述作用。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述誘導型啟動子是tet調控啟動子。
15.如權利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述細胞包含含有編碼Wnt激活 蛋白的基因的核酸構建體。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括Wnt蛋白、 Frizzled、Disheveled、LPR5、LPR6、β-聯(lián)蛋白、APC、軸蛋白 1 或 GSK33，或這些 蛋白的同種型、截短型或突變型。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括Wnt蛋白。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括Wntl、 Wnt3 或 Wnt3a。
19.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括 Frizzled (Fz)。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括Fzl、Fz3、 Fz5 或 Fz7。
21.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括β-聯(lián)蛋 白，或截短或突變的β-聯(lián)蛋白。
22.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括截短或突變 的 APC。
23.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括截短或突變 的軸蛋白。
24.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑激活蛋白包括截短或突變 的 GSK3 β。
25.如權利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述細胞包含含有編碼Wnt途徑 調節(jié)蛋白的序列的核酸分子。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑調節(jié)蛋白包括LEF1、 TCF 1、TCF3、TCF4、CtBP> Pygo> Groucho> CtBP> ρ300 或這些蛋白的截短型或突變型。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑調節(jié)蛋白包括LEF1，或 其同種型、截短型或突變型。
28.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑調節(jié)蛋白包括TCF1、 TCF3或TCF4，或它們的同種型、截短型或突變型。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑調節(jié)蛋白包括TCF1，或 其同種型、截短型或突變型。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑調節(jié)蛋白包括TCF1-E，或其截短型或突變型。
31.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑調節(jié)蛋白包括TCF4，或 其同種型、截短型或突變型。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述Wnt途徑調節(jié)蛋白包括TCF4-E， 或其截短型或突變型。
33.如權利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述細胞包含含有編碼Wnt激活 蛋白和Wnt途徑調節(jié)蛋白的基因的核酸構建體。
34.如權利要求12或13所述的方法，還包括對細胞進行細胞試驗。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述細胞試驗是細胞生長試驗、細胞死 亡試驗、凋亡試驗、遷移試驗或侵入試驗。
36.如之前任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述報告基因是螢光素酶基 因、半乳糖苷酶基因、內酰胺酶基因、編碼CAT的基因、編碼熒光蛋白的基因、 編碼堿性磷酸酶的基因或編碼胸苷激酶的基因。
37.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述報告基因是叩頭蟲螢光素酶基因、 螢火蟲螢光素酶基因、海腎螢光素酶基因或長腹水蚤螢光素酶基因。
38.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述報告基因是編碼綠色熒光蛋白的基 因、編碼黃色熒光蛋白的基因、編碼紅色熒光蛋白的基因、編碼橙色熒光蛋白的基因、 編碼青色熒光蛋白的基因或編碼藍色熒光蛋白的基因。
39.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述報告基因是編碼分泌型堿性磷酸 酶、分泌型半乳糖苷酶、分泌型內酰胺酶或分泌型螢光素酶的基因。
40.一種鑒定調節(jié)Wnt信號傳導的化合物的方法，包括(a)提供包含啟動子調控的報告基因的細胞，所述啟動子受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白 之間相互作用的調節(jié)，其中所述報告基因具有負選擇性；(b)使所述細胞接觸測試化合物；(c)使所述細胞接觸前藥，所述前藥由報告基因編碼的蛋白質轉化為活性藥物；和(d)鑒定允許細胞在前藥存在下生長的測試化合物。
41.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述報告基因是胸苷激酶基因。
42.如權利要求41所述的方法，其特征在于，所述前藥是更昔洛韋或阿昔洛韋。
43.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述報告基因是內酰胺酶基因。
44.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述前藥是含頭孢菌素的前藥。
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，所述前藥是偶聯(lián)頭孢菌素的苯二胺氮 芥、多柔比星、鉬絡合物、紫杉醇或長春花生物堿。
46.如權利要求45所述的方法，其特征在于，所述前藥是頭孢菌素多柔比星或 7- (4-羧基丁酰氨基)-頭孢菌素氮芥。
47.如之前任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋 白之間相互作用調節(jié)的啟動子是包含一個或多個Wnt應答元件(WRE)和一個或多個富含 GC的區(qū)域的啟動子。
48.如權利要求47所述的方法，其特征在于，所述受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白之間相互作用調節(jié)的啟動子是WIN啟動子。
49.如之前任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白 之間相互作用調節(jié)的啟動子是天然產(chǎn)生的啟動子或其一部分。
50.如權利要求49所述的方法，其特征在于，所述受TCF/LEF和β-聯(lián)蛋白之間相 互作用調節(jié)的啟動子是軸蛋白2、cdx> sp5、DKK4、c-myc、細胞周期蛋白D1、存活蛋 白、MMP7、LEFl或TCFl啟動子，或它們的一部分。
51.如權利要求1-38中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞還包含操作性連接 于受TCF/LEF和聯(lián)蛋白之間相互作用調節(jié)的第二啟動子的第二報告基因，其中第一 啟動子和第二啟動子不同。
52.如權利要求51所述的方法，其特征在于，所述第一啟動子和所述第二啟動子中至 少有一個是天然產(chǎn)生的啟動子或其一部分。
53.如權利要求51所述的方法，其特征在于，所述第一啟動子和所述第二啟動子 中至少有一個是軸蛋白2、cdx> sp5、DKK4、c_myc、細胞周期蛋白D1、存活蛋白、 MMP7、LEFl或TCFl啟動子，或它們啟動子的一部分。
54.如權利要求8-52中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞是癌細胞。
55.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述細胞是結腸癌細胞、白血病細胞、 淋巴瘤細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞或頭頸癌細胞。
56.如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述細胞是結腸癌細胞、白血病細胞或 淋巴瘤細胞。
57.如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述細胞是白血病細胞。
58.如權利要求57所述的方法，其特征在于，所述細胞是Jurkat細胞或K562細胞。
59.如權利要求57所述的方法，其特征在于，所述細胞是結腸癌細胞。
60.如權利要求59所述的方法，其特征在于，所述細胞是SW48、SW480、SW116、 CaC02、DLDU Colo320、Colo205、LS174T、HT-29 或 HT-116 細胞。
61.如權利要求8-52中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞是非癌細胞。
62.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述細胞是HEK293細胞、COS細 胞、CHO細胞或3T3細胞。
63.如權利要求61所述的方法，其特征在于，所述細胞是非癌小腸上皮細胞、非癌 結腸細胞、非癌淋巴細胞、非癌上皮細胞、非癌乳腺細胞、非癌前列腺細胞或非癌肝細 胞。
64.如權利要求63所述的方法，其特征在于，所述細胞是非癌小腸上皮細胞。
65.如權利要求64所述的方法，其特征在于，所述細胞是正常人大腸上皮細胞 (NHLIEC)。
66.一種通過如權利要求1-65中任一項所述方法鑒定的化合物。
全文摘要
本文提供了篩選具有調節(jié)癌細胞中Wnt信號傳導能力的化合物的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102027133SQ200980116859
公開日2011年4月20日 申請日期2009年5月6日 優(yōu)先權日2008年5月7日
發(fā)明者C·F·巴羅嘉, D·卡森, D·盧, J·胡德 申請人:埃皮瑟瑞克斯有限公司, 溫瑟瑞克斯有限公司