專利名稱：與藥物抗性有關(guān)的遺傳變異的制作方法
1/35 與藥物抗性有關(guān)的遺傳變異
本申請要求2008年3月14日提交的美國臨時申請流水號61/036,874和2008年 5月16日提交的美國臨時申請流水號61/0M,064的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，通過述及將這兩篇完整 收入本文。發(fā)明領(lǐng)域
一般而言，本發(fā)明涉及預(yù)示藥物抗性的遺傳變異。
發(fā)明背景
現(xiàn)代分子生物學(xué)的一項關(guān)鍵目的是鑒定表征給定腫瘤的潛伏遺傳和基因組變 異，使得患者能接受用有可能提供最大好處的化療劑進行的靶向療法。乳腺癌是西方世 界女性中癌癥的最常見形式，估計全世界每年100萬例新診斷和40萬例死亡(1)。靶向 療法諸如用于雌激素受體陽性癌癥的他莫昔芬(2)和用于包含HER2癌基因擴增的腫瘤的 Herceptin(3)的出現(xiàn)對患者存活具有重大影響，盡管各種化學(xué)療法方案仍構(gòu)成乳腺癌治療 的一項重要組分(4)。乳腺癌是一種異質(zhì)疾病，具有以對靶向和化療劑的差異響應(yīng)為特征 的不同分子亞型。雖然化學(xué)療法在許多病例中是一種成功的治療方案，但是估計50%的 患者由于固有的或獲得的多藥抗性而未能受益(1)。多藥抗性(MDR)指癌細胞對(在結(jié) 構(gòu)和機制方面可以是無關(guān)的)多類化療藥物的抗性，而且涉及起ATP依賴性流出泵作用 的多種蛋白質(zhì)的過表達( 。了解促成乳腺癌中MDR的分子改變是至關(guān)重要的第一步， 從而能夠開發(fā)能夠預(yù)測對給定療法的抗性的診斷測試及理性選擇更有效的治療劑。
在先前的研究中已經(jīng)將ABCC3過表達與癌細胞系中的獲得性多藥抗性聯(lián)系 起來。例如，Liu等人報告了通過在存在多柔比星的情況中選擇生長而衍生的細胞系 MCF-7/AdVp3000中ABCC3相對于親本的459倍過表達(36)。另外，最近顯示用長 春新堿處理癌細胞系導(dǎo)致這些細胞中ABCC2和ABCC3轉(zhuǎn)錄物顯著上調(diào)(37)。相關(guān)泵 ABCC2 (MRP2)和ABCClO (MRP7)均顯示在過表達時賦予帕利他塞抗性(38) (39)，而且 已經(jīng)在小鼠模型中顯示ABCC2是帕利他塞體內(nèi)藥動學(xué)的一項重要決定因素00)。先前沒 有證明帕利他塞是ABCC3的底物，而且在MDCK或NIH-3T3細胞中進行的異位ABCC3 過表達研究確實未能證明對帕利他塞的抗性升高01，42)。值得注意的是，還在長期測 定法中發(fā)現(xiàn)Gl) ABCC3不能賦予對多柔比星的抗性，盡管其它已發(fā)表的功能研究的報告 提示ABCC3在轉(zhuǎn)運此藥劑中的作用(36)。
這些各式各樣的觀察結(jié)果例示了乳腺癌是一種能經(jīng)由多種機制規(guī)避化學(xué)療法的 異質(zhì)疾病的實情，而且強調(diào)了對可用于預(yù)測癌癥患者個體中治療響應(yīng)的生物標(biāo)志物組的需要。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個方面提供一種用于確定患者中的癌癥是否對抗有絲分裂劑處理 有抗性的方法，包括檢測ABCC3基因是否在來自該患者的測試癌癥樣品中擴增，其中 ABCC3基因的擴增指示該癌癥對抗有絲分裂劑處理有抗性。在一個實施方案中，所述測 試癌癥樣品是癌癥腫瘤樣品。
ABCC3基因的擴增是例如通過測定ABCC3基因的拷貝數(shù)來檢測的。在一些實 施方案中，拷貝數(shù)至少3指示ABCC3基因擴增，在其它實施方案中，拷貝數(shù)至少5指示 ABCC3基因擴增。
ABCC3基因的拷貝數(shù)是例如通過熒光原位雜交(FISH)、Southern印跡、免疫組 織化學(xué)(IHC)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、定量PCR(qPCR)、定量實時PCR(qRT-PCR)、比較基因組雜交、基于微陣列的比較基因組雜交、或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)來測定的。
本發(fā)明的另一個方面提供一種用于確定患者中的癌癥是否對抗有絲分裂劑處理 有抗性的方法，包括檢測ABCC3基因是否在來自該患者的測試癌癥樣品中過表達，其中 ABCC3基因的過表達指示該癌癥對抗有絲分裂劑處理有抗性。
在一個實施方案中，ABCC3基因的過表達是通過測定來自ABCC3基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平來檢測的。在一些實施方案中，測試癌癥樣品中來自ABCC3基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于對照樣品升高至少5倍指示ABCC3基因過表達。在其它實施方案 中，測試癌癥樣品中來自ABCC3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于對照樣品升高至少25倍 指示ABCC3基因過表達。
在另一個實施方案中，ABCC3基因的過表達是通過測定ABCC3多肽表達水平 來檢測的。在一些實施方案中，(測定)ABCC3多肽表達水平包括使測試癌癥樣品與抗 ABCC3抗體接觸并檢測抗ABCC3抗體對ABCC3多肽的結(jié)合。在一些實施方案中，測 試癌癥樣品中的ABCC3多肽表達水平相對于對照樣品升高至少2倍指示ABCC3基因過 表達。在其它實施方案中，測試癌癥樣品中的ABCC3多肽表達水平相對于對照樣品升高 至少10倍指示ABCC3基因過表達。
在一些實施方案中，所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、和結(jié)腸直腸癌。
在一些實施方案中，所述抗有絲分裂劑選自紫杉烷類(包括例如帕利他塞和多 西他塞)、美登木素生物堿類(包括例如DMl和DM4)、和auristatin類(包括例如單甲 基auristatin E (MMAE)和單甲基auristatin F (MMAF))，及它們的類似物和衍生物。
在一些實施方案中，所述抗有絲分裂劑偶聯(lián)至抗體。在一個實施方案中， 所述抗有絲分裂劑-抗體偶聯(lián)物是美登木素生物堿-抗Her2抗體偶聯(lián)物，諸如曲妥單 抗-DMl。
本發(fā)明的另一個方面提供一種用于確定乳腺癌腫瘤是否對抗有絲分裂劑處理有 抗性的方法，包括檢測ABCC3基因是否在乳腺癌腫瘤樣品中擴增，其中ABCC3基因的 擴增指示該乳腺癌腫瘤對抗有絲分裂劑處理有抗性。
ABCC3基因的擴增是例如通過測定ABCC3基因的拷貝數(shù)來檢測的。在一些實 施方案中，拷貝數(shù)至少3指示ABCC3基因擴增，在其它實施方案中，拷貝數(shù)至少5指示 ABCC3基因擴增。
ABCC3基因的拷貝數(shù)是例如通過熒光原位雜交(FISH)、Southern印跡、免疫組 織化學(xué)(IHC)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、定量PCR(qPCR)、定量實時PCR(qRT-PCR)、比較基因組雜交、基于微陣列的比較基因組雜交、或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)來測定的。
本發(fā)明的另一個方面提供一種用于確定乳腺癌腫瘤是否對抗有絲分裂劑處理有 抗性的方法，包括檢測ABCC3基因是否在乳腺癌腫瘤樣品中過表達，其中ABCC3基因 的過表達指示該乳腺癌腫瘤對抗有絲分裂劑處理有抗性。
在一個實施方案中，ABCC3基因的過表達是通過測定來自ABCC3基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平來檢測的。在一些實施方案中，測試癌癥樣品中來自ABCC3基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于對照樣品升高至少5倍指示ABCC3基因過表達。在其它實施方案 中，測試癌癥樣品中來自ABCC3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于對照樣品升高至少25倍 指示ABCC3基因過表達。
在另一個實施方案中，ABCC3基因的過表達是通過測定ABCC3多肽表達水平 來檢測的。在一些實施方案中，(測定)ABCC3多肽表達水平包括使測試癌癥樣品與抗 ABCC3抗體接觸并檢測抗ABCC3抗體對ABCC3多肽的結(jié)合。在一些實施方案中，測 試癌癥樣品中的ABCC3多肽表達水平相對于對照樣品升高至少2倍指示ABCC3基因過 表達。在其它實施方案中，測試癌癥樣品中的ABCC3多肽表達水平相對于對照樣品升高 至少10倍指示ABCC3基因過表達。
在一些實施方案中，所述乳腺癌腫瘤是Her-2陽性乳腺癌腫瘤。
在一些實施方案中，所述抗有絲分裂劑選自紫杉烷類(包括例如帕利他塞和多 西他塞)、美登木素生物堿類(包括例如DMl和DM4)、和auristatin類(包括例如單甲 基auristatin E (MMAE)和單甲基auristatin F (MMAF))，及其類似物和衍生物。
在一些實施方案中，所述抗有絲分裂劑偶聯(lián)至抗體。在一個實施方案中， 所述抗有絲分裂劑-抗體偶聯(lián)物是美登木素生物堿-抗Her2抗體偶聯(lián)物，諸如曲妥單 抗-DMl。
本發(fā)明的另一個方面提供一種用于為基于抗有絲分裂劑的化學(xué)療法選擇乳腺癌 患者的方法，包括a)檢測ABCC3基因是否在來自該患者的測試癌癥樣品中擴增，并 b)若在該測試癌癥樣品中沒有檢測到ABCC3基因的擴增，則選擇該患者進行基于抗有絲 分裂藥物的化學(xué)療法。
ABCC3基因的擴增是例如通過測定ABCC3基因的拷貝數(shù)來檢測的。在一些實 施方案中，拷貝數(shù)至少3指示ABCC3基因擴增，在其它實施方案中，拷貝數(shù)至少5指示 ABCC3基因擴增。
ABCC3基因的拷貝數(shù)是例如通過熒光原位雜交(FISH)、Southern印跡、免疫組 織化學(xué)(IHC)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、定量PCR(qPCR)、定量實時PCR(qRT-PCR)、比較基因組雜交、基于微陣列的比較基因組雜交、或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)來測定的。
本發(fā)明的另一個方面提供一種用于為基于抗有絲分裂劑的化學(xué)療法選擇乳腺癌 患者的方法，包括a)檢測ABCC3基因是否在來自該患者的測試癌癥樣品中過表達，并 b)若在該測試癌癥樣品中沒有檢測到ABCC3基因的過表達，則選擇該患者進行基于抗有 絲分裂藥物的化學(xué)療法。
在一個實施方案中，ABCC3基因的過表達是通過測定來自ABCC3基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平來檢測的。在一些實施方案中，測試癌癥樣品中來自ABCC3基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于對照樣品升高至少5倍指示ABCC3基因過表達。在其它實施方案 中，測試癌癥樣品中來自ABCC3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于對照樣品升高至少25倍 指示ABCC3基因過表達。
在另一個實施方案中，ABCC3基因的過表達是通過測定ABCC3多肽表達水平 來檢測的。在一些實施方案中，(測定)ABCC3多肽表達水平包括使測試癌癥樣品與抗ABCC3抗體接觸并檢測抗ABCC3抗體對ABCC3多肽的結(jié)合。在一些實施方案中，測 試癌癥樣品中的ABCC3多肽表達水平相對于對照樣品升高至少2倍指示ABCC3基因過 表達。在其它實施方案中，測試癌癥樣品中的ABCC3多肽表達水平相對于對照樣品升高 至少10倍指示ABCC3基因過表達。
在一些實施方案中，所述乳腺癌患者具有Her-2陽性乳腺癌。
在一些實施方案中，所述抗有絲分裂劑選自紫杉烷類(包括例如帕利他塞和多 西他塞)、美登木素生物堿類(包括例如DMl和DM4)、和auristatin類(包括例如單甲 基auristatin E (MMAE)和單甲基auristatin F (MMAF))，及其類似物和衍生物。
在一些實施方案中，所述抗有絲分裂劑偶聯(lián)至抗體。在一個實施方案中， 所述抗有絲分裂劑-抗體偶聯(lián)物是美登木素生物堿-抗Her2抗體偶聯(lián)物，諸如曲妥單 抗-DMl。
本發(fā)明的另一個方面提供一種降低癌細胞對抗有絲分裂劑的抗性的方法，包括 使該癌細胞與ABCC3的拮抗劑接觸。在一些實施方案中，所述拮抗劑是ABCC3抗體或 與ABCC3結(jié)合的siRNA。
本發(fā)明的又一個方面提供一種治療具有對抗有絲分裂劑有抗性的癌癥的患者的 方法，包括對該患者施用ABCC3的拮抗劑和治療有效量的抗有絲分裂劑。在一些實施 方案中，所述拮抗劑是ABCC3抗體或與ABCC3結(jié)合的siRNA。在一些實施方案中，所 述抗有絲分裂劑選自紫杉烷類、美登木素生物堿類、和auristatin類，及其類似物和衍生 物。在一些實施方案中，所述抗有絲分裂劑偶聯(lián)至抗體。在一個實施方案中，所述抗有 絲分裂劑-抗體偶聯(lián)物是美登木素生物堿-抗Her2抗體偶聯(lián)物，諸如曲妥單抗-DMl。
本發(fā)明還提供根據(jù)患者的癌癥的ABCC3擴增狀態(tài)來治療癌癥患者的方法。在一 個實施方案中，所述方法包括檢測ABCC3基因是否在來自該患者的測試癌癥樣品中擴增 或過表達并若在該測試癌癥樣品中沒有檢測到ABCC3基因的擴增或過表達，則對該患者 施用治療有效量的基于抗有絲分裂藥物的化學(xué)療法。在一個實施方案中，所述患者具有 Her2陽性乳腺癌且施用抗Her2抗體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物諸如曲妥單抗-DMl或曲妥單 抗-MMAE。
在本發(fā)明的另一個方面，根據(jù)患者的癌癥中沒有ABCC3擴增或過表達來為基于 抗有絲分裂藥物的化學(xué)療法選擇患者，并施用治療有效量的抗有絲分裂藥物。在一個實 施方案中，所選擇的患者具有Her2陽性乳腺癌且施用抗Her2抗體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物 諸如曲妥單抗-DMl或曲妥單抗-MMAE。
附圖簡述
圖Ia圖示乳腺癌細胞系對MMAE的體外響應(yīng)。圖Ib圖示乳腺癌細胞系對帕 利他塞的體外響應(yīng)。在χ軸上，將細胞系歸類入乳腺癌的主要分子亞型。y軸指示體外 IC50值，或?qū)е录毎婊盍σ种?0%的藥物濃度。水平線指示給定亞型的細胞系對每種 藥劑的敏感性均值。
圖&顯示在體外對帕利他塞的抗性與染色體17q21區(qū)擴增有關(guān)。圖沈顯示在 體外對MMAE的抗性與染色體17q21區(qū)擴增有關(guān)。以藥劑敏感性升高的次序從左至右顯 示細胞系。在圖的頂部指示用于SNP陣列數(shù)據(jù)有監(jiān)督的分析和抗性生物標(biāo)志物的鑒定的 歸類(敏感的、中間的、抗性的)。用菱形指示那些具有基因組DNA拷貝數(shù)擴增的細胞系。
圖3顯示ABCC3在具有17q21.3擴增的細胞系中過表達。根據(jù)該區(qū)拷貝數(shù)截留 4，將31種細胞系分成擴增的和不擴增的兩類?？蚓€圖(box-and-whiskerplots)顯示每個 組中的ABCC3表達。作為代表ABCC3的最易變的Affymetrix表達探針集，選擇208161_ s_at。其它探針集給出相似的結(jié)果。中央的框代表四分位間范圍(interquartile range)， 框內(nèi)部的線指示中值，而垂直虛線延伸至距中值最遠但在四分位范圍1.5倍內(nèi)的數(shù)據(jù)點。 垂直虛線以外的數(shù)據(jù)點用各個圈代表。
圖4a_4d顯示多幅圖，呈現(xiàn)ABCC3或?qū)φ誷iRNA處理后四種不同細胞系響應(yīng) 帕利他塞處理的有絲分裂指數(shù)。EFM-192A (a)和ZR-75-30 (b)細胞具有ABCC3擴 增和過表達且在敲低后展示增強的敏感性(有絲分裂指數(shù)升高)，而HCC_1428(c)和 MDA-MB-453 (d)具有低拷貝數(shù)和表達且不顯示升高的敏感性。
圖5顯示在體外穩(wěn)定的ABCC3過表達導(dǎo)致對帕利他塞和MMAE的抗性。對自 CMV啟動子過表達ABCC3的單細胞克隆衍生的穩(wěn)定細胞系或具有空載體的對照系測定 帕利他塞(圖5a)或MMAE(圖5b)的生長抑制效果。
圖6顯示對用MMAE(a)或帕利他塞(b)處理的乳腺癌細胞系的生長抑制。點 代表384孔板中四個復(fù)制孔的平均值及擬合的非線性劑量-響應(yīng)曲線。y軸指示相對于對 照媒介處理孔的百分比細胞存活力。誤差棒指示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖7顯示在標(biāo)準(zhǔn)細胞存活力測定法中分析對游離DMl的敏感性的三種ABCC3過 表達克隆和一種對照細胞系。
圖8顯示一幅圖，呈現(xiàn)用對照(NTC)或ABCC3siRNA轉(zhuǎn)染的EFM-192A細胞在 用曲妥單抗-mc-vc-PAB-MMAF處理時的有絲分裂指數(shù)。
圖9a顯示用對照(NTC)或ABCC3siRNA轉(zhuǎn)染的EFM-192A細胞在用游離DMl 處理時的有絲分裂應(yīng)答。圖9b顯示用對照(NTC)或ABCC3siRNA轉(zhuǎn)染的EFM-192A細胞在用T-DMl處理時的有絲分裂應(yīng)答。


圖10顯示在自T-DMlII期試驗獲得的樣品上實施的FISH分析的結(jié)果。
圖11是一張表，顯示關(guān)于細胞系的分子亞型及其對抗有絲分裂藥物的敏感性的 fn息ο
發(fā)明詳述
I.定義
短語“基因擴增”和“基因復(fù)制”(及變化形式諸如“基因的擴增”或“基 因的復(fù)制”)可互換使用，指在特定細胞或細胞系中形成多拷貝的基因或基因片段的過 程。復(fù)制區(qū)(擴增的DNA的區(qū)段)通常稱為“擴增子”。一般而言，所產(chǎn)生的信使 RNA(mRNA)的量，即基因表達的水平，也按由特定基因形成的拷貝數(shù)的比例增加。
如本文中所使用的，除非另有說明，術(shù)語“ABCC3”指來自任何脊椎動物來源 的任何天然ABCC3(也稱作MRP-3)，包括哺乳動物，諸如靈長類(例如人和猴)和嚙齒 類(例如小鼠和大鼠)。該術(shù)語涵蓋“全長的”未加工的ABCC3以及源自細胞中加工 的任何形式的ABCC3。該術(shù)語還涵蓋ABCC3的天然存在變體，例如剪接變體、等位變 體、和其它同等型(isoforms)。該術(shù)語還涵蓋天然ABCC3的維持ABCC3的至少一項生 物學(xué)活性的片段或變體。ABCC3的例子包括那些用Genbank登錄號NM_003786 (人)和XM_358306(小鼠)鑒定的。還可參見 Kiuchi，etal.，F(xiàn)EBS Lett. 433 149-152(1998); 及 Borst，etal., JNCI 92 (16) 1295-1302(2000)。
術(shù)語“遺傳變異”包括基因或多肽擴增中的變異以及氨基酸序列或多核苷酸序 列中的變異。
術(shù)語“細胞增殖性病癥”和“增殖性病癥”指與一定程度的異常細胞增殖有關(guān) 的病癥。在一個實施方案中，細胞增殖性病癥指癌癥。
“腫瘤”在用于本文時指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性 的還是良性的，及所有癌前(pre-cancemus)和癌性細胞和組織。術(shù)語“癌癥”、“癌 性”、“細胞增殖性病癥”、“增殖性病癥”和“腫瘤”在本文中提到時并不互相排 斥。
術(shù)語“癌癥”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長/增殖 不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin) 淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥的更具體例子包括 鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、 胃腸癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肉 瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺 癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴 增生性病癥、及各種類型的頭和頸癌。
“對抗有絲分裂劑治療有響應(yīng)的”或“對抗有絲分裂劑治療響應(yīng)性的”癌癥患 者指顯示源自或源于抗有絲分裂劑治療的臨床或治療受益的癌癥患者。此類受益包括細 胞或生物學(xué)應(yīng)答、完全響應(yīng)、部分響應(yīng)、病情穩(wěn)定(沒有進展或復(fù)發(fā))、或患者具有較晚 復(fù)發(fā)的源自或源于藥劑治療的響應(yīng)。
“對抗有絲分裂劑治療有抗性的”癌癥、癌細胞、或癌癥腫瘤指不顯示對藥 劑的統(tǒng)計學(xué)顯著的細胞或生物學(xué)應(yīng)答的癌癥、癌細胞、或癌癥腫瘤。相反，對該藥劑 治療沒有抗性的癌癥、癌細胞、或癌癥腫瘤顯示對藥劑的統(tǒng)計學(xué)顯著的細胞或生物學(xué)應(yīng) 答，諸如例如與未用藥劑處理的癌細胞或腫瘤相比細胞死亡或凋亡率升高或增殖或生長 降低。在具體的實施方案中，若IC50大于30nM、或者大于50nM、或者大約IOOnM MMAE,則癌癥、癌細胞、或癌癥腫瘤對MMAE治療有抗性。在其它實施方案中，若 IC50大于50nM、或者大于ΙΟΟηΜ、或者大于500nM、或者大于IOOOnM帕利他塞，則癌 癥、癌細胞、或癌癥腫瘤對帕利他塞治療有抗性。
“抗有絲分裂劑”指抑制、阻止、或以其它方式破壞有絲分裂的化合物?？褂?絲分裂劑的具體例子包括但不限于紫杉烷類，諸如帕利他塞和多西他塞；美登木素生物 堿類，諸如DMl和DM4 ；多拉司他汀10 ；多拉司他汀15 ； auristatin類，諸如單甲基 auristatinE(MMAE)和單甲基auristatinF(MMAF)；長春花生物堿類，諸如長春堿和長春新堿；及其類似物和衍生物?？褂薪z分裂劑任選偶聯(lián)至抗體。
術(shù)語“治療”或“處理”指治療性處理及預(yù)防性或防范性措施二者，其中目標(biāo) 是預(yù)防或減緩(減輕)不想要的生理學(xué)變化或紊亂，諸如癌癥的形成或傳播。為了本發(fā) 明，有利或期望的臨床結(jié)果包括但不限于緩解癥狀、削弱疾病的程度、疾病狀態(tài)穩(wěn)定 (即不惡化)、延遲或減緩疾病進展、改善或減輕疾病狀態(tài)、及康復(fù)(無論是部分的還是完全的)，無論是可檢測的還是不可檢測的。“治療”或“處理”還可以指與不接受治 療的預(yù)期存活相比延長存活。需要治療的受試者包括早就患有疾病或紊亂的受試者以及 傾向于患上疾病或紊亂的受試者或者要預(yù)防疾病或紊亂的受試者。
“個體”或“患者”指脊椎動物。在某些實施方案中，脊椎動物指哺乳動物。 哺乳動物包括，但不限于，牲畜(諸如牛)、運動用動物、寵物(諸如貓、犬、和馬)、 靈長類動物、小鼠和大鼠。在某些實施方案中，患者指人。
“有效量”指在必需的劑量和時間上有效實現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。
本發(fā)明的物質(zhì)/分子的“治療有效量”可根據(jù)諸如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性 別和體重及該物質(zhì)/分子在個體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量涵蓋 該物質(zhì)/分子的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量。“預(yù)防有效量”指在必需 的劑量和時間上有效實現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病 發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量將低于治療有效量。
術(shù)語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死 亡或破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y9°、 Re186> Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素；化療劑，例如甲氨蝶 呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vincaalkaloids)(長春新堿 (vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、 美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin) C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素 (daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分 子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文 披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細胞毒劑。“殺腫瘤”藥引起腫瘤細胞 的破壞。
“毒素”指能夠?qū)毎纳L或增殖產(chǎn)生有害效果的任何物質(zhì)。
“化療劑”指在癌癥的治療中有用的化學(xué)化合物。
術(shù)語“拮抗劑”以最廣義使用，包括任何部分或完全阻斷、抑制、或中和多肽 諸如ABCC3的生物學(xué)活性或其轉(zhuǎn)錄或翻譯的分子。合適的拮抗劑分子包括但不限于拮抗 性抗體、多肽片段、寡肽、有機分子(包括小分子)、和反義核酸(包括siRNA)。
“抗體”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)指具有相似結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗 體展現(xiàn)出對特定抗原的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體和一般缺乏抗原特異性的 其它抗體樣分子二者。后一類多肽例如由淋巴系統(tǒng)以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水 平生成。
術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全 長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異 性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中 更為詳細描述的)?？贵w可以是嵌合的、人的、人源化的和/或親和力成熟的。
術(shù)語“抗ABCC3抗體”或“能結(jié)合ABCC3的抗體”指能夠以足夠親和力結(jié)合 ABCC3,使得該抗體可用作靶向ABCC3的治療劑和/或診斷劑的抗體。優(yōu)選的是，抗 ABCC3抗體結(jié)合無關(guān)、非ABCC3蛋白的長度小于抗體對ABCC3結(jié)合的約10%，根據(jù)放 射免疫測定法(RIA)的測量。在某些實施方案中，能結(jié)合ABCC3的抗體具有Sl μ Μ、<100ηΜ> <10ηΜ> <1ηΜ>或《0.InM的解離常數(shù)(Kd)。在某些實施方案中，抗ABCC3 抗體能結(jié)合在來自不同物種的ABCC3間保守的ABCC3表位。
術(shù)語“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的 抗體而非如下文所定義的抗體片段。該術(shù)語具體指重鏈包含份區(qū)的抗體。
“抗體片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分保留該部分存在于完整 抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項、多至大多數(shù)或所有功能。在一個實施方案中，抗體 片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個實施方案中， 抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時通常與之有 關(guān)的至少一項生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補體結(jié)合。 在一個實施方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價抗體。例如， 這樣的抗體片段可包含一個抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列相 連。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自 具有一個抗原結(jié)合位點，及一個剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。 胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab' )2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原。
"Fv"是包含完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈 Fv種類由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈 Fv(SCFV)種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連接， 使得輕鏈和重鏈在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中， 每個可變域的三個CDR相互作用而在Vh-V^二聚體表面上限定了一個抗原結(jié)合位點。六 個CDR—起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原 特異性的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合 位點。
Fab片段包含重鏈可變域和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一 恒定域(CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加 了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對其中恒 定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在成 對Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué) 偶聯(lián)形式。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和Vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu) 域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在Vh與Vl結(jié)構(gòu)域之間進一步包含多肽 接頭，其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun， 于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編， Springer-Verlag, New York，第 ^9-3I5 頁，I"4。
術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多 肽鏈(Vh-VJ中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(VJ。通過使用過短的接頭 使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域 配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完 整的記載于例如 EP 404,097 ； W093/1161 ； Hudson et al. (2003)Nat.Med.9 129-134 ；及Hollingeretal., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448(1993)。三抗體(Triabody)和四 抗體(tetrabody)也記載于 Hudson et al. QOO3) Nat.Med.9 1四-134。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體， 即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突 變。如此，修飾語“單克隆”表明抗體不是分立的抗體的混合物的特征。在某些實施 方案中，此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多 肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例 如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中 選擇獨特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物 的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免 疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單 克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同， 單克隆抗體制備物的每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單 克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修飾語“單克隆”表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋 為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通 過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler et al.，Nature256 495(1975)； Harlow et al.，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, 2nd ed.1988 ； Hammerling et al., 于MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas， 563-681，Elsevier, N.Y., 1981)、重組 DNA 法(參見例如美國專利 No.4,816,567)、噬 菌體展示技術(shù)(參見例如 Clackson et al., Nature 352 624-628(1991) ； Marks et al., J. Mol.Biol.222 581-597(1992) ； Sidhuetal., J. Mol.Biol.338 (2) 299-310(2004) ； Leeet al., J. Mol.Biol.340 (5) 1073-1093(2004) ； Fellouse, Proc.Nat.Acad.Sci.USAlOl (34) 12467-12472(2004) ； Leeetal., J. Immunol. Methods 284(1-2) 119-132(2004)),及 用于在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生 成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如WO 98/24893 ； W096/34096 ； WO 96/33735 ； WO 91/10741 ； Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 2551 (1993) ； Jakobovits et al.， Nature 362 255-258(1993) ； Bruggemannet al., Year in Immuno.7 33(1993)；美國專 利 No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016 ； Marks et al., Bio/TechnologylO 779-783(1992) ； Lonberg et al.，Nature 368 856-859(1994)； Morrison, Nature368 812—813(1994) ； Fishwild et al.，NatureBiotechnol. 14: 845-851 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnol. 14 826(1996) ； Lonberg and Huszar, Intem.Rev.Immunol.13 65-93(1995))。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與 衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩 余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源， 以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利No.4,816,567和 Morrison et al., Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81 6851-6855 (1984))。
非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的 高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、 大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免 疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體 抗體或供體抗體中沒有找到的殘基?？梢赃M行這些修飾以進一步改進抗體的性能。一 般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或 基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫 球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常 是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones et al.，Nature 321 522-525(1986)； Riechmann et al.，Nature 332 323-329 (1988)； 和 Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2 593-596(1992)。還可參見以下綜述及其引用的參考文獻Vaswani andHamilton，Ann. Allergy, Asthma&Immunol.l 105-115 (1998) ； Harris, Biochem.Soc.Transactions 23 1035-1038(1995) ； Hurle and Gross, Curr.Op.Biotech.5 428-433(1994)。
“人抗體”指包含與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和/或使 用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。此類技術(shù)包括篩選人衍生的組 合文庫，諸如噬菌體展示文庫(參見例如Marks等，J.Mol.Biol.，222 581-597(1991) 和 Hoogenboom 等，Nucl.Acids Res., 19 4133-4137(1991))；使用人骨髓瘤和小 鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系來生成人單克隆抗體(參見例如Kozbor J.Immunol.， 133 3001(1984) ； Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 51 頁-第 63 頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；禾口 Boerner 等，J.Immunol.，147 86(1991))；和在轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中生成單克隆抗體， 所述轉(zhuǎn)基因動物能夠在沒有內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況中生成人抗體的完全全集(參見 例如 Jakobovits 等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90: 2551(1993) ； Jakobovits 等，Nature， 362 255(1993) ； Bruggermann 等，Year in Immunol.，7 33(1993))。人抗體的這種定 義明確排除包含來自非人動物的抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
“親和力成熟的”抗體指在抗體的一個或多個HVR中具有一處或多處改 變、導(dǎo)致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。在 一個實施方案，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和 力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。Markset al.，Bio/Technology 10 779-783(1992)記載了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進行的親和力成熟。以下文 獻記載了 HVR和/或框架殘基的隨機誘變Barbas et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91 3809-3813(1994) ； Schier et al., Gene 169 147-155(1995) ； Yelton et al., J. Immunol. 155 1994-2004(1995) ； Jackson et al., J.Immunol. 154 (7) 3310-9(1995)； Hawkins et al., J. Mol.Biol.226 889-896 (1992)。
“阻斷性”抗體或“拮抗性”抗體指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性 的抗體。某些阻斷性抗體或拮抗性抗體部分或完全抑制抗原的生物學(xué)活性。
抗體“效應(yīng)器功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變 體:Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合 和補體依賴性細胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調(diào)；和B細胞活化。
術(shù)語“Fe受體”或“FcR”描述能結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在一些實施方 案中，F(xiàn)cR是天然人FcR。在一些實施方案中，F(xiàn)cR是能結(jié)合IgG抗體的RxEU Y受 體)，包括FcyRI、Fc Y RII和Fc Y RIII亞類的受體，包括那些受體的各等位變體和各 可變剪接形式。？(^1111受體包括^^1111人(“活化受體”)和Fc Y RIIB ( “抑制受 體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏w:Fc Y RIIA 在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc Y RIIB 在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見DaSron，Annu. Rev.Immunol.15 203-234(1997))。FcR 的綜述參見 Ravetch and IGnet，Annu.Rev. Immunol.9 457-492(1991) ； Capel etal.，Immunomethods 4 25-34(1994)；及 de Haas etal.，J. Lab.Clin.Med.126 330-341(1995)。術(shù)語 “FcR” 在本文中涵蓋其它 FcR，包 括那些未來將會鑒定的。
術(shù)語“Fe受體”或“FcR”還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，其負責(zé)將母體:tgG轉(zhuǎn)移 給胎兒(Guyer etal.，J.Immunol.117 587 (1976)及 Kim et al.，J.Immunol.24 249(1994)) 和調(diào)節(jié)免疫球蛋白的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。測量對FcRn的結(jié)合的方法是已知的。可以測定人:FcRn 高親和力結(jié)合多肽對人:FcRn的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達人:FcRn的轉(zhuǎn)基因小 鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染人細胞系中，或者在施用了 Fc變異多肽的靈長類動物中。
W000/42072 (Presta)記載了對FcR的結(jié)合得到改進或消除的抗體變體。將該 專利出版物的內(nèi)容明確收入本文作為參考。還可參見Shields etal.，J.Biol.Chem.9 (2) 6591-6604(2001)。
“人效應(yīng)細胞”指表達一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細胞。在某些實 施方案中，該細胞至少表達Fc Y RIII并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細胞 的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細 胞和嗜中性粒細胞。效應(yīng)細胞可以從其天然來源分離，例如血液。
“抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”或“ADCC”指其中結(jié)合至某些細胞毒 性效應(yīng)細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體 (FcR)的免疫球蛋白使得那些細胞毒性效應(yīng)細胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細胞，隨 后用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。介導(dǎo)ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達 FcyRIII,而單核細胞表達 Fc Y RI、Fc Y RII 禾口 Fc Y RIII。 RavetchandIGnet, Annu.Rev. Immunol.9 457-92 (1991)第464頁表3總結(jié)了造血細胞上的RxR表達。為了評估目的分 子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No.5,500,362或5,821,337或 Presta美國專利No.6,737,056中所記載的。可用于此類測定法的效應(yīng)細胞包括外周血單個 核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC 活性，例如在動物模型中，諸如Clynes etal.，PNAS (USA) 95 652-656(1998)中所披露 的。
“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指存在補體時對靶細胞的溶解。經(jīng)典 補體途徑的激活是由補體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原所結(jié)合的抗體(適宜亞類 的)起始的。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如Gazzano-Santoro etal.， J.Immunol.Methods 202 163(1996)中所記載的。
具有改變的Fc區(qū)氨基酸序列及提高的或降低的Clq結(jié)合能力的多肽變體加載于 美國專利Νο.6,194,551Β1和W099/51642。將那些專利出版物的內(nèi)容明確收入本文作為 參考。還可參見 Idusogie et alJ.Immunol.164 4178-4184(2000)。
術(shù)語“含F(xiàn)c區(qū)多肽”指包含F(xiàn)c區(qū)的多肽，諸如抗體或免疫粘附素。Fc區(qū)的 C-末端賴氨酸(依照EU編號系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化多肽的過程中或者 通過重組改造編碼多肽的核酸。因此，依照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的多肽的組合物可包含 具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有與沒有K447殘基的多肽的混合物。
“細胞毒性抗體”指能夠在結(jié)合至其靶抗原后發(fā)揮效應(yīng)器功能和/或誘導(dǎo)細胞死 亡的抗體。
“免疫偶聯(lián)物”或“抗體偶聯(lián)物”指偶聯(lián)有一種或多種細胞毒劑的抗體。
“小分子”或“有機小分子”在本文中定義為分子量小于約500道爾頓的有機分子。
“ABCC3結(jié)合寡肽”或“結(jié)合ABCC3的寡肽”或“ABCC3多肽結(jié)合寡肽”指能夠以足夠的親和力結(jié)合ABCC3以使得該寡肽作為靶向ABCC3中的診斷劑和/或治療 劑是有用的寡肽。在某些實施方案中，ABCC3結(jié)合寡肽對無關(guān)的、非ABCC3的蛋白質(zhì) 的結(jié)合程度小于約10%的該ABCC3結(jié)合寡肽對ABCC3的結(jié)合，如通過例如表面等離振 子共振測定法所測量的。在某些實施方案中，ABCC3結(jié)合寡肽具有小于等于1 μ M、小 于等于ΙΟΟηΜ、小于等于ΙΟηΜ、小于等于InM、或小于等于O.lnM的解離常數(shù)(Kd)。
"ABCC3結(jié)合有機分子”或“結(jié)合ABCC3的有機分子”或“ABCC3多肽結(jié)合 有機分子”指與如本文中所定義的寡肽或抗體不同的、能夠以足夠的親和力結(jié)合ABCC3 以使得該有機分子作為靶向ABCC3中的診斷劑和/或治療劑是有用的有機分子。在某 些實施方案中，F(xiàn)GFR2結(jié)合有機分子對無關(guān)的、非ABCC3的蛋白質(zhì)的結(jié)合程度小于約 10%的該ABCC3結(jié)合有機分子對ABCC3的結(jié)合，如通過例如表面等離振子共振測定法 所測量的。在某些實施方案中，ABCC3結(jié)合有機分子具有小于等于ΙμΜ、小于等于 ΙΟΟηΜ、小于等于ΙΟηΜ、小于等于InM、或小于等于O.lnM的解離常數(shù)(Kd)。
可以使用表面等離振子共振測定法來方便地測量任何分子結(jié)合靶多肽的解離常 數(shù)(Kd)。此類測定法可以采用于 25°C 的 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BiAcore, Inc., Piscataway, NJ)，其中固定化靶多肽CM5芯片在約10個響應(yīng)單位(RU)。簡言 之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC) 和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉pH 4.8將靶多肽稀釋至5 μ g/ml (約0.2 μ Μ)，然后以5 μ 1/分 鐘的流速注入至獲得約10個響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入靶多肽后，注入IM乙 醇胺以封閉未反應(yīng)基團。為了進行動力學(xué)測量，于25°C以約25μ1/分鐘的流速注入在 含0.05% Tween-20的PBS (PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的結(jié)合分子(0.78nM至500nM)。使 用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcoreEvaluation Softwareversion 3.2)通 過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖來計算結(jié)合速率(k。n)和解離速率(kj。平衡解離常數(shù) (Kd)以比率 k。a/k。n 計算。參見例如 Chen，Y.，等，(1999)J.Mol.Biol.293 865-881 如果根據(jù)上文表面等離振子共振測定法，抗體的結(jié)合速率超過IO6M-1S-1,那么結(jié)合速 率可以使用熒光淬滅技術(shù)來測定，即根據(jù)分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(astop-flow equippedspectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度 計(ThermoSpectranic)中用攪拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量 PBS, pH 7.2中的20nM抗體(Fab形式)于25°C的熒光發(fā)射強度(激發(fā)=295nm ；發(fā)射 =340nm, 16nm帶通)的升高或降低。
術(shù)語“標(biāo)記物”在用于本文時指可檢測化合物或組合物。標(biāo)記物自身可以是可 檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化底 物化合物或組合物的化學(xué)改變，產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物。可充當(dāng)可檢測標(biāo)記物的放射性核素包 括例如 1-131、1-123、1-125、Y-90、Re-188, Re-186, At-211、Cu_67、Bi-212、和 Pd-109。
“分離的”生物學(xué)分子，諸如核酸、多肽、或抗體，指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán) 境的一種成分分開和/或回收的生物學(xué)分子。
II.對某些實施方案的描述
原發(fā)性乳腺腫瘤可以通過基因表達序型分析歸類入至少三種主要亞型，而且各 亞型在患者存活方面具有不同的預(yù)后結(jié)果(9)。腔乳腺癌通常是雌激素受體陽性的， 而且特征為多種上皮特異性基因的協(xié)同表達、相對較好的預(yù)后、和較好的對靶向激素療 法的響應(yīng)率。HER2陽性乳腺癌特征為HER2癌基因的高水平基因擴增、相對較差的預(yù) 后(如果不治療的話)、和臨床顯著受益于HER2靶向單克隆抗體曲妥單抗(Herceptin， Genentech) (3)?；鶚尤橄侔┩ǔＨ狈ER2、ER和孕酮受體表達，因此有時稱作“三 聯(lián)陰性”腫瘤(10，11)?；鶚尤橄侔┚哂邢鄬^差的預(yù)后，而且當(dāng)前尚未顯示對任何靶 向療法有響應(yīng)(1 。這些亞型對術(shù)前化學(xué)療法方案展示差異響應(yīng)(1 ，但是在極大程度 上尚未確定這些差異下潛伏的藥物抗性機制。
最近的研究揭示了乳腺癌細胞系大集合反映人乳腺腫瘤特征性的許多遺傳和基 因組變化，并因此可充當(dāng)一群分子異質(zhì)的乳腺癌的模型系統(tǒng)(14)。例如，可以基于基因 表達序型分析簽名將細胞歸類入基樣和腔的亞型，而且它們保留原發(fā)性腫瘤中大多數(shù)與 較差結(jié)果有關(guān)的高水平擴增和刪除(14)。
將乳腺癌分子歸類入具有共享特征和相似預(yù)后結(jié)果的亞型提供框架來開始個性 化癌癥療法的努力。本發(fā)明證明乳腺癌亞型在對抗有絲分裂劑的響應(yīng)中顯示清楚的差 異，其中基樣亞型(basal-like subtype)最敏感。這種差異響應(yīng)的一種機制是在腔的和 HER2擴增的細胞系子集中觀察到，但在基樣細胞系中沒有觀察到的ABCC3藥物流出泵 (drag efflux pump)的擴增。
如實施例中所述，本發(fā)明利用經(jīng)過分子表征的一組乳腺癌細胞系作為藥物基因 組學(xué)分析模型來鑒定對如下兩種基于抗有絲分裂的治療劑的抗性機制和亞型響應(yīng)差異， 單甲基-auristatin-E(MMAE)和帕利他塞。MMAE在結(jié)構(gòu)上與多拉司他汀10相關(guān)，后 者是一種五肽天然產(chǎn)物，已經(jīng)進行了癌癥治療的數(shù)項人體臨床試驗，而且展現(xiàn)有力的抗 腫瘤活性通過抑制微管蛋白聚合并如此使細胞微管失穩(wěn)(1 。已經(jīng)開發(fā)了 auristatin-單 克隆抗體偶聯(lián)物，基本原理是經(jīng)由抗體的特異性抗原識別實現(xiàn)的靶向投遞藥物會導(dǎo)致增 強的化療功效同時不表達靶物的組織免于毒性(1 。帕利他塞及相關(guān)化合物多西他塞是 抗癌細胞毒性藥物，它們穩(wěn)定微管，而且在乳腺癌的治療中廣泛使用(16)。
基于實施例中列出的這些發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)染色體17 —個區(qū)域(17q21)的擴增與體外對紫杉烷類和auristatin類的抗性有強聯(lián)系。擴增的區(qū)域包含至少100個基因。為了鑒定 有關(guān)基因，使用由RNA干擾和大容量分析組成的無偏辦法來顯示ABCC3基因的擴增和 伴隨的過表達最有可能負責(zé)賦予對帕利他塞和MMAE的抗性。還顯示了此擴增子存在于 原發(fā)性乳腺腫瘤中，而且它在HER2擴增的和腔的腫瘤(luminal tumors)中是常見的，但 是在基樣細胞(basal-likecell)中并非如此(圖6和9)。
因而，本發(fā)明的一個方面提供用于確定癌癥是否會對抗有絲分裂劑處理有抗性 的方法。在一個實施方案中，該方法包括檢測ABCC3基因是否在癌細胞樣品中擴增。 ABCC3基因的擴增指示該癌癥對抗有絲分裂劑有抗性。ABCC3基因擴增的檢測可通過 本領(lǐng)域已知的任何方法來實施。在一個實施方案中，ABCC3基因擴增(的檢測)是通過 檢測癌細胞樣品中ABCC3基因的拷貝數(shù)是否增加來實施的。在一些實施方案中，若拷貝 數(shù)為至少3、或者至少4、或者至少5、或者至少7、或者至少9、或者至少10，則基因是 擴增的。
基因拷貝數(shù)可通過本領(lǐng)域已知的任何手段來測定，例如通過熒光原位雜 交(FISH)、Southern印跡、免疫組織化學(xué)(IHC)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、定 量PCR(qPCR)、定量實時PCR(qRT-PCR)、比較基因組雜交、基于微陣列的比較 基因組雜交、或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。 參見例如Avison，M.，MeasuringGene Expression, New York Taylor&Francis Group，2007, Allison, D.B., et al，ed.DNA Microarrays and Related Genomics Techniques Design, Analysis, andlnterpretation of Experiments (Biostatistics)，Boca Raton Chapman&Hill/CRC，2006; Hayat M.A., ed.， Handbook of Immunohistochemistry and in SituHybridization of Human Carcinomas， Burlington Elsevier Academic Press，2004。
在又一個實施方案中，確定癌癥是否會對抗有絲分裂劑有抗性的方法包括檢測 癌細胞樣品中ABCC3基因是否過表達。ABCC3基因的過表達指示該癌癥對抗有絲分 裂劑有抗性。ABCC3過表達的檢測可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來實施。在一個實施 方案中，ABCC3基因過表達是通過測定來自ABCC3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平來檢測的。 mRNA轉(zhuǎn)錄水平可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的各種方法定性或定量地測定。mRNA 轉(zhuǎn)錄水平還可以通過檢測自mRNA生成的cDNA的水平直接或間接地測定。用于測定 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的例示性方法包括但不限于PCR、實時定量RT-PCR和基于雜交的測定 法，包括基于微陣列的測定法和基于濾器的測定法諸如Northern印跡。在某些實施方案 中，若mRNA轉(zhuǎn)錄水平與適宜的對照樣品相比升高至少3、5、7、10、15、20、25、30、 35、40、45、或50倍，則ABCC3基因是過表達的。
在其它實施方案中，ABCC3基因的表達是通過測定ABCC3多肽表達水平來檢 測的。ABCC3多肽水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的某些方法定性或定量地測定，包括 基于抗體的檢測方法。在一個實施方案中，檢測測試癌癥樣品中的ABCC3基因表達包括 使測試癌癥樣品與抗ABCC3抗體接觸并通過檢測抗ABCC3抗體對ABCC3多肽的結(jié)合來 測定測試癌癥樣品中的ABCC3表達水平(定性或定量)。在某些實施方案中，抗ABCC3 抗體對ABCC3多肽的結(jié)合可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的各種方法來檢測，包括但不限于 免疫組織化學(xué)、熒光激活細胞分選、Western印跡、放射免疫測定法、ELISA、等等。在 某些實施方案中，ABCC3過表達意味著ABCC3多肽水平與適宜的對照樣品相比升高至少 3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、或 50 倍。
癌細胞樣品或測試癌癥樣品優(yōu)選包含直接取自癌癥腫瘤的細胞，但是測試癌癥 樣品也可包含轉(zhuǎn)移的癌細胞、循環(huán)中的腫瘤細胞、或鑒定癌癥中ABCC3基因擴增或表達 狀態(tài)的細胞的任何合適樣品?？蓽y試的癌癥的例子包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、 前列腺癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、 肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肝癌、膀胱癌、肝肉瘤、結(jié)腸癌、 直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、白 血病和其它淋巴增殖性病癥、各種類型的頭頸癌、和適合于使用抗有絲分裂劑治療的任 何其它癌癥。
用于確定癌癥中ABCC3過表達的適宜對照可例如通過測定表達正常水平 ABCC3的細胞或組織的對照樣品中的ABCC3表達水平并將癌癥中的ABCC3表達水平 與對照樣品中的ABCC3表達水平比較來生成?；蛘?，對照可通過測定用于確定ABCC3 過表達的相同測試癌癥樣品中或來自要測試ABCC3過表達的相同癌癥的樣品中持家基因 (諸如肌動蛋白家族成員)表達來生成。持家基因充當(dāng)比較對照，以此確定ABCC3基因 過表達。
因而，ABCC3擴增和/或過表達的檢測容許患有癌癥的患者選擇最有可能成功 治療其癌癥的適宜治療方法。
因而，本發(fā)明的一個方面是提供用于為基于抗有絲分裂劑的化學(xué)療法選擇癌癥 患者的方法。那些其癌癥顯示ABCC3擴增或過表達的患者可使用該信息與他們的內(nèi)科醫(yī) 師一起來決定他們是否應(yīng)當(dāng)采用抗有絲分裂療法以外的治療劑。在一個實施方案中，該 方法包括檢測ABCC3基因是否在來自患者的測試癌癥樣品中擴增，并且，若在測試癌癥 樣品中沒有檢測到ABCC3基因擴增則選擇該患者進行基于抗有絲分裂藥物的化學(xué)療法。 在另一個實施方案中，該方法包括檢測ABCC3基因是否在來自患者的測試癌癥樣品中過 表達，并且，若在測試癌癥樣品中沒有檢測到ABCC3基因過表達則選擇該患者進行基于 抗有絲分裂藥物的化學(xué)療法。
在一個實施方案中，患者是乳腺癌患者。在又一個實施方案中，患者具有Her2 陽性乳腺癌。與具有HER2陰性、雌激素受體陽性、結(jié)節(jié)陽性乳腺癌的患者相比，乳腺 癌中HER2的表達或擴增(Her2陽性乳腺癌)與多柔比星輔助治療后添加抗有絲分裂劑 帕利他塞的臨床受益增強有關(guān)(5 。然而，顯著比例的具有HER2陽性腫瘤的女性未 能顯示存活受益于這種治療(5 ，提示帕利他塞抗性機制存在于一定比例的HER2陽性 乳腺腫瘤中。對于利用偶聯(lián)有抗有絲分裂劑的抗Her2抗體諸如例如曲妥單抗-DMl抗 體偶聯(lián)物的治療方案，這種對抗有絲分裂劑的抗性特別受關(guān)注。如實施例中所例示的， ABCC3過表達與對曲妥單抗-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物處理的抗性有關(guān)。相反，用SiRNA敲 低ABCC3基因提高細胞對曲妥單抗-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物處理的敏感性。因而，本發(fā)明 提供為抗Her2抗體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物處理選擇Her2陽性乳腺癌患者的方法。在一 個實施方案中，該方法包括檢測ABCC3基因是否在來自患者的測試乳腺癌樣品中擴增， 并且，若在該測試乳腺癌樣品中沒有檢測到ABCC3基因擴增則選擇該患者進行抗Her2 抗體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物處理。在另一個實施方案中，該方法包括檢測ABCC3基因 是否在來自患者的測試乳腺癌樣品中過表達，并且，若在該測試乳腺癌樣品中沒有檢測到ABCC3基因過表達則選擇該患者進行抗Her2抗體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物處理。在 一些實施方案中，該方法涉及確定患者是否具有Her2陽性乳腺癌(如果此信息早先不知 道的話)，如此確定用抗Her2抗體療法治療的合適性。在一些實施方案中，抗Her2抗 體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物是曲妥單抗-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物諸如曲妥單抗-DMl或曲妥單 抗-MMAE。
本發(fā)明還提供根據(jù)患者癌癥的ABCC3擴增狀態(tài)來治療癌癥患者的方法。在一 個實施方案中，該方法包括檢測ABCC3基因是否在來自患者的測試癌癥樣品中擴增， 并且，若在測試癌癥樣品中沒有檢測到ABCC3基因擴增則對患者施用治療有效量的基于 抗有絲分裂藥物的化學(xué)療法。在另一個實施方案中，該方法包括檢測ABCC3基因是否 在來自患者的測試癌癥樣品中過表達，并且，若在測試癌癥樣品中沒有檢測到ABCC3基 因過表達則對患者施用治療有效量的基于抗有絲分裂藥物的化學(xué)療法。在一個實施方案 中，患者具有Her2陽性乳腺癌，而且，若在測試癌癥樣品中沒有檢測到ABCC3基因擴 增或過表達則施用抗Her2抗體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物。在一些實施方案中，抗Her2抗 體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物是曲妥單抗-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物諸如曲妥單抗-DMl或曲妥單 抗-MMAE。
在又一個實施方案中，根據(jù)患者的癌癥中沒有ABCC3擴增或過表達來選擇患者 進行基于抗有絲分裂藥物的化學(xué)療法，并且施用治療有效量的基于抗有絲分裂藥物的化 學(xué)療法。在一個實施方案中，所選擇的患者具有Her2陽性乳腺癌且施用抗Her2抗體-抗 有絲分裂劑偶聯(lián)物。在一些實施方案中，抗Her2抗體-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物是曲妥單 抗-抗有絲分裂劑偶聯(lián)物諸如曲妥單抗-DMl或曲妥單抗-MMAE。
本發(fā)明的另一個方面提供鑒定與藥物敏感性改變有關(guān)的基因擴增變異的方法。 迄今為止大多數(shù)致力于了解藥物抗性的體外序型分析努力集中于基因表達分析。本發(fā)明 描述經(jīng)由分析高密度SNP陣列序型(Affymetrix)來鑒定與藥物敏感性改變有關(guān)的DNA拷 貝數(shù)改變的。最近的研究顯示了高密度單核苷酸多態(tài)性6NP)陣列在它們的預(yù)定基因分 型應(yīng)用之外可用于檢測人類癌癥中的基因組范圍DNA拷貝數(shù)變化和雜合性損失(17)。這 些陣列已經(jīng)顯示出可用于通過查明經(jīng)常刪除或擴增的染色體區(qū)域來鑒定腫瘤抑制基因和 癌基因基因座(18)。
本文中所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示這些陣列可用于鑒定包含可能調(diào)控治療性藥物活性的 基因的擴增區(qū)域。這種辦法的一項關(guān)鍵優(yōu)點在于基因擴增事件相對穩(wěn)定且最終能在來自 臨床試驗的歸檔樣品上化驗。一種特別適合于檢測歸檔樣品中基因擴增事件的測定法是 熒光原位雜交(FISH)。FISH測定法早就成為HER2陽性MBC診斷的例行臨床實踐的一 部分(50)，而且當(dāng)前正在作為用于檢測EGFR擴增的診斷測試進行評估，EGFR擴增是對 Tarceva或Erbitux的響應(yīng)的一種可能的生物標(biāo)志物(51)。
本發(fā)明的又一個方面提供為那些其癌癥包含ABCC3擴增和/或過表達的患者確 定抗有絲分裂劑劑量給藥適宜水平的方法。在一個實施方案中，該方法包括確定ABCC3 是否在患者的測試癌癥樣品中擴增和/或過表達，并且，若ABCC3擴增或過表達則對患 者使用劑量增大的抗有絲分裂劑?？褂薪z分裂劑的劑量增大至癌癥顯示對抗有絲分裂劑 處理有響應(yīng)的量。在一些實施方案中，對患者施用的抗有絲分裂劑劑量是對其癌癥不包 含ABCC3擴增和/或過表達的患者施用的量的至少1.2倍、或至少1.3倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少2.5倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍。
本發(fā)明的又一個方面提供降低癌細胞對抗有絲分裂劑的抗性的方法，包括使癌 細胞與ABCC3的拮抗劑接觸。在一些實施方案中，ABCC3拮抗劑用于阻止ABCC3擴增 和/或過表達及降低由該擴增和/或過表達賦予的藥物抗性。在其它實施方案中，ABCC3 拮抗劑用于抑制ABCC3活性。在這些方法中有用的拮抗劑包括ABCC3抗體，基于RNA 干擾(RNAi)的 ABCC3 拮抗劑尤其是反義 RNA、miRNA、siRNA、和 shRNA，ABCC3 多肽結(jié)合寡肽，和ABCC3結(jié)合有機分子。
本發(fā)明的又一個方面提供用于治療具有對抗有絲分裂劑有抗性的癌癥的患者的 聯(lián)合療法，包括對該患者施用ABCC3的拮抗劑和抗有絲分裂劑。在一些實施方案中，該 拮抗劑選自ABCC3抗體和與ABCC3結(jié)合的siRNA。在一些實施方案中，該抗有絲分裂 劑選自紫杉烷類、美登木素生物堿類、和auristatin類，及其類似物和衍生物。在一些實 施方案中，該抗有絲分裂劑偶聯(lián)至抗體，諸如美登木素生物堿-抗Her2抗體偶聯(lián)物，例 如曲妥單抗-DM1。在一個實施方案中，該聯(lián)合療法包括用與ABCC3結(jié)合的siRNA和 曲妥單抗-DMl處理。
上文所述此類聯(lián)合療法涵蓋聯(lián)合施用(其中兩種或更多種治療劑包括在相同或 分開的配制劑中)和分開施用，其中ABCC3拮抗劑的施用可發(fā)生于抗有絲分裂劑的施用 的之前、同時、和/或之后。
在一個實施方案中，ABCC3拮抗劑是抗ABCC多肽抗體。例示性的抗體包括 多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的、和異源偶聯(lián)的抗體。
多克隆抗體優(yōu)選通過在動物中多次皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑 來生成。將相關(guān)抗原(尤其在使用合成肽時)與在待免疫的物種中有免疫原性的蛋白質(zhì) 偶聯(lián)可能是有用的。例如，可使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲?；腔?珀酰亞胺酯(經(jīng)半胱氨酸殘基的偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(經(jīng)賴氨酸殘基)、戊二醛、 琥珀酸酐、S0C12、或R1N = C = NR,其中R和R1是不同的烴基，將抗原與匙孔i威.血 藍蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑偶聯(lián)。在某些實 施方案中，用于生成抗體的動物可以是轉(zhuǎn)基因動物。在某些此類實施方案中，可以改造 動物使得它們展現(xiàn)編碼ABCC3的多核苷酸的完全缺失，使得它們沒有ABCC3表達(稱 作“敲除”動物)。生成此類動物的方法是本領(lǐng)域公知的，參見例如Snouwaertet al.， Science 257 1083，1992 ； Lowell etal.，Nature 366 740-42，1993 ； Capecchi, M.R., Science 244 1288-1292, 1989。在敲除了特定蛋白質(zhì)或肽的動物中生成針對該蛋白質(zhì)或 肽的抗體可能是有利的，因為該動物中不會發(fā)生可能降低該抗體生成和/或產(chǎn)量的抗自 身反應(yīng)，正如本領(lǐng)域公知的。
通過將例如100 μ g或5 μ g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的 弗氏完全佐劑混和，并將溶液皮內(nèi)注射于多個部位，由此將動物針對抗原、免疫原性偶 聯(lián)物或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中肽或 偶聯(lián)物初始量的1/5-1/10對動物進行強化。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的 抗體滴度。對動物進行強化直到滴度達到穩(wěn)定。偶聯(lián)物還可在重組細胞培養(yǎng)物中作為蛋 白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應(yīng)答。
單克隆抗體可以通過最初由Kohler etal.，Nature 256 495 (1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利4,816,567)。
本發(fā)明的抗ABCC3抗體還可包括人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠源)抗 體的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫 球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)。 人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)中的互補決定區(qū)(CDR)殘基用具有期望特異 性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的CDR殘基替換的免疫 球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。人源 化抗體還可包含在受體抗體或輸入CDR或框架序列中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化 抗體包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變區(qū)，其中整個或基本上整個CDR區(qū) 對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，且整個或基本上整個FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列 的FR區(qū)。人源化抗體最好還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋 白的恒定區(qū)(Jones et al.，Nature 321 522-525(1986) ； Riechmannet al.，Nature 332 323-329(1988) ； Presta, Curr.Op.Struct.Biol.2 593-596(1992))。
用于將非人抗體人源化的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。通常，人源化抗體 具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸 入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)。人源化可基本上依照Winter及其同事的 方法進行(Jones et al., Nature 321 522-525(1986) ； Riechmann et al., Nature 332 323-327(1988) ； Verhoeyen et al., Science 239 1534-1536 (1988))，通過用嚙齒類 CDR序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利 4,816,567)，其中本質(zhì)上少于整個人可變區(qū)用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中， 人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位 點的殘基替代的人抗體。
當(dāng)抗體意圖在于人類治療性用途時，用于制備人源化抗體的人可變區(qū)的選擇， 包括輕鏈和重鏈，對于降低抗原性和HAMA應(yīng)答(人抗小鼠抗體)非常重要。根據(jù)所 謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變區(qū)序列對已知的人可變區(qū)序列的整個文 庫進行篩選。鑒定與嚙齒類最接近的人V結(jié)構(gòu)域序列，并接受其中的人框架區(qū)(FR)用 于人源化抗體(Simset al.，J.Immunol.151 2296(1993) ； Chothiaetal.，J.Mol.Biol.196 901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞型的所有人抗體的共有序列衍生的 特定框架區(qū)。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter etal.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA39 4285(1992) ； Presta etal., J.Immunol.151 2623 (1993))
更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高結(jié)合親和力以及其它有利的生 物學(xué)特性。為了實現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三 維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋 白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候 選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基 在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原 的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得所需抗 體特征，諸如對靶抗原的親和力提高。通常，高變區(qū)殘基直接且最實質(zhì)地涉及對抗原結(jié) 合的影響。
設(shè)想了人源化抗ABCC3多肽抗體的各種形式。例如，人源化抗體可以是抗體片 段，諸如Fab，任選偶聯(lián)有一種或多種細胞毒劑以生成免疫偶聯(lián)物?；蛘撸嗽椿贵w可 以是完整的抗體，諸如完整的:tgGl抗體。
作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免 疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。 例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源 抗體生成的完全抑制。將大量人種系免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)移到此類種系突變小鼠中將導(dǎo) 致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 2551 (1993) ； Jakobovits etal.，Nature 362 255-258(1993) ； Braggemann et al.，Year in Immuno.7 33(1993)；美國專利 5,545,806，5,569,825，5,591,669 (都是 GenPharm 的)； 5,545,807 ；及 WO 97/17852。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCaffertyetal.，Nature ；348 552-553 (1990))可用于 在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因全集生成人抗體和抗體片段。根 據(jù)這種技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白 基因的讀碼框中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬 菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那 些特性的抗體的基因的選擇。由此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以 多種形式進行，綜述參見例如 Johnson，Kevin S.and Chiswell, David J.，Current Opinion inStructural Biology 3 564-571(1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于噬菌體展示。 Clackson et al., Nature 352 624-628(1991)從衍生自免疫小鼠脾的小型V基因隨機組 合文庫分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體?？杀举|(zhì)上依照Markset al.，J.Mol.Biol.222 581-597(1991)或 Griffith etal.，EMBO J.12 725_7；34 (1993)所述技術(shù)，由未免疫人供體 構(gòu)建V基因全集，并分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專 利 5,565,332 和 5,573,905。
如上所述，還可通過體外激活B細胞(參見美國專利5,567,610和5,229,275)來 生成人抗體。
在某些情況中，使用抗體片段而非完整抗體是有利的。片段的大小較小，容許 快速清除，可導(dǎo)致對實體瘤的進入提高。
已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整 抗體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto et al., Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24 107-117(1992) ； Brennan et al.，Science 229 81(1985))。然而，現(xiàn)在可 直接由重組宿主細胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達和 由大腸桿菌分泌，由此容許容易地生成大量的這些片段?？蓮纳衔挠懻摰目贵w噬菌體文 庫分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段，并通過化學(xué)方法偶聯(lián) 形成 F(ab' )2 片段(Carteret al.，BioATechnology 10 163-167(1992))。依照另一種方 法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab' )2片段。包含補救受體結(jié)合表位殘基、具 有延長的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab' )2片段描述于美國專利5,869,046。用于生成抗體片 段的其它技術(shù)對熟練從業(yè)人員是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv 片段(scFv)。參見WO 93/16185 ；美國專利5,571,894 ；和美國專利5,587,458。Fv和SFv是具有完整結(jié)合位點且缺乏恒定區(qū)的唯一種類；因此，它們適合于在體內(nèi)使用過程中 降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建SFv融合蛋白以生成效應(yīng)物蛋白質(zhì)位于SFv氨基末端或羧基 末端的融合。參見《AntibodyEngineering》，Borrebaeck編，見上文。抗體片段還可以 是“線性抗體”，例如美國專利5,641,870中描述的抗體。此類線性抗體片段可以是單特 異性的或雙特異性的。
可能希望在效應(yīng)物功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如為了增強抗體的抗體依賴 性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可通過在抗 體Fc區(qū)中引入一個或多個氨基酸替代來實現(xiàn)。或者/另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨 酸殘基，從而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的 內(nèi)在化能力和/或提高的補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)。 參見 Caron et al.，J.Exp.Med.176 1191-1195 (1992)禾Π Shopes，B., J.Immunol.148 2918-2922 (1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff et al.， Cancer Research 53 2560-2565 (199 中描述的異雙功能交聯(lián)劑來制備?；蛘?，抗體可改 造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson et al., Anti-Cancer Drag Design 3 219-230 (1989)。為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美 國專利5,739,277中所述將補救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文 時，術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgGp IgG2, IgG3或IgG4)Fc區(qū)中負 責(zé)提高:tgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。
另一種潛在的ABCC3拮抗劑是使用反義技術(shù)制備的反義RNA或DNA構(gòu)建 物，其中例如反義RNA或DNA分子通過與靶mRNA雜交并防止蛋白質(zhì)翻譯來起直接 阻斷mRNA翻譯的作用。反義技術(shù)可用于通過三股螺旋形成或反義DNA或RNA來控 制基因表達，二者都基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，可將編碼本文中成 熟ABCC3多肽的多核苷酸序列的5'編碼部分用于設(shè)計長度為約10-40個堿基對的反義 RNA寡核苷酸。將DNA寡核苷酸設(shè)計成與基因中參與轉(zhuǎn)錄的區(qū)互補(三股螺旋-參見 Lee 等，1979，Nucl.Acids Res.6 3073 ； Cooney 等，1988，Science 241 456 ； Dervan 等，1991，Science 251 1360),由此防止轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生ABCC3多肽。反義RNA寡核苷 酸與mRNA在體內(nèi)雜交并阻斷mRNA分子翻譯成為ABCC3多肽(反義-Okano，1991， Neurochem.56 560 ； Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRCPress Boca Raton, FL, 1988)。上述寡核苷酸還可遞送至細胞，使得反義RNA或 DNA可在體內(nèi)表達以抑制ABCC3多肽的生成。在使用反義DNA時，優(yōu)選衍生自靶基因 核苷酸序列的翻譯起始位點(例如約-10到+10位置之間)的寡脫氧核糖核苷酸。
小干擾RNA(siRNAs)指長度一般小于30個核苷酸且降低靶基因表達的雙鏈 RNA分子。SiRNA已經(jīng)證明可用作其中傳統(tǒng)拮抗劑諸如小分子或抗體失敗的調(diào)控基因表 達的研究中的工具(ShiY.，Trends in Genetics 19(1) 9-12(2003))。長度為 21 到 23 個 核苷酸的體外合成的雙鏈RNA可起干擾RNA(iRNA)的作用，且能特異性抑制基因表達 (FireA., Trends in Genetics 391 ； 806-810 (1999)) 這些 iRNA 通過介導(dǎo)其靶 RNA 的降 解起作用。然而，由于它們的長度低于30個核苷酸，因此它們不會觸發(fā)細胞抗病毒防御 機制。在本發(fā)明的一些實施方案中，SiRNA與ABCC3編碼多核苷酸的編碼序列的一部分 或其互補序列具有至少約 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99%,或100%核酸序列同一性。
本發(fā)明的ABCC3多肽結(jié)合寡肽指結(jié)合(優(yōu)選特異性結(jié)合)本文所述ABCC3多 肽的寡肽。ABCC3多肽結(jié)合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法學(xué)化學(xué)合成，或者可以 使用重組技術(shù)制備和純化。ABCC3多肽結(jié)合寡肽的長度是至少約5個氨基酸，或者長 度為至少約 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24,25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個氨基酸或更長，其中此類寡肽能夠結(jié)合(優(yōu)選特異性結(jié)合)本文所述ABCC3 多肽。ABCC3多肽結(jié)合寡肽無需過多試驗就可使用公知技術(shù)來鑒定。在這點上，注 意到用于對寡肽文庫篩選能夠特異性結(jié)合多肽靶物的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見 例如美國專利號 5,556,762，5,750,373，4,708,871，4,833,092，5,223,409，5,403,484， 5,571,689，5,663,143 ； PCT 公布號 W084/03506 和 WO 84/03564 ； Geysen 等，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.81 3998-4002(1984) ； Geysen 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82 178-182(1985) ； Geysen 等，in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)； Geysen 等，J.Immunol.Meth.102 259-274(1987) ； Schoofs 等，J.Immunol. 140 611-616(1988) ； Cwirla, S.E.等，(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 6378 ； Lowman, H.B.等，(1991)Biochemistry 30 10832 ； Clackson, T.等，(1991)Nature 352 624 ； Marks, J.D.等，(1991)，J.Mol.Biol.222 581 ； Kang, A.S.等，(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 88 8363 ； Smith, G.P., (1991) Current Opin.Biotechnol.2 668)。
在這點上，噬菌體展示是一種可以篩選大型寡肽文庫來鑒定那些文庫中能夠 特異性結(jié)合多肽靶物的成員的公知技術(shù)。噬菌體展示是將變體多肽作為與外殼蛋白的 融合蛋白展示在噬菌體顆粒表面的一種技術(shù)6cott，J.K.andSmith, G.P. (1990)Science 249 386)。噬菌體展示的效用在于，可以對選擇性隨機化蛋白質(zhì)變體(或隨機克隆 cDNA)的大型文庫迅速且有效的分選那些以高親和力結(jié)合靶分子的序列。在噬菌體上展 示肽(Cwirla, S.E.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 6378)或蛋白質(zhì)(Lowman， H.B.等，(1991)Biochemistry 30 10832 ； Clackson, T.等，(1991)Nature 352 624 ； Marks, J.D.等，(1991) J.Mol.Biol.222 581 ； Kang，A.S.等，(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.USA88 8363)文庫已經(jīng)用于對數(shù)百萬多肽或寡肽篩選具有特異結(jié)合特性的那些 (Smith, G.P. (1991) Current Opin.Biotechnol.2 668)。分選隨機突變體的噬菌體文庫需要 構(gòu)建和擴增大量變體的策略，使用靶受體進行親和純化的流程，及評估結(jié)合富集的結(jié)果 的手段。參見美國專利 5,223,409，5,403,484，5,571,689 和 5,663,143。
產(chǎn)生肽文庫和篩選這些文庫的方法還公開于美國專利No.5,723,觀6，5,432,018， 5,580,717，5,427,908，5,498,530，5,770,434，5,734,018，5,698,426，5,763,192， 和 5,723,323。
ABCC3多肽結(jié)合小分子優(yōu)選指本文所定義的寡肽或抗體以外，結(jié)合(優(yōu)選特異 性結(jié)合)本文所述ABCC3多肽的有機分子。ABCC3多肽結(jié)合有機小分子可以使用已知方 法學(xué)來鑒定和化學(xué)合成(參見例如PCT
發(fā)明者卡羅爾·奧布賴恩, 盧卡斯·C·阿姆勒, 蓋伊·卡維特, 阿杰伊·潘迪塔, 馬克·拉克納 申請人:健泰科生物技術(shù)公司