專利名稱：L-氨基酸生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用微生物的L-氨基酸生產(chǎn)方法。L-氨基酸用于調(diào)味料、食品添加劑、飼料添加劑、化 學(xué)制品、醫(yī)藥品等各種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-蘇氨酸、L-賴氨酸等L-氨基酸通過使用具有這些L-氨基酸生產(chǎn)能力的埃希氏菌屬細(xì)菌等L-氨基酸生產(chǎn)菌的發(fā)酵法進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。作為這些L-氨基酸生產(chǎn)菌，使用從自然界分離的菌株、該菌株的人工突變株、或通過基因重組而增強(qiáng)了 L-氨基酸生物生產(chǎn)酶活性的重組體等。L-蘇氨酸生產(chǎn)法包括例如專利文獻(xiàn)I 4中記載的方法。另外，L-賴氨酸生產(chǎn)法可以以專利文獻(xiàn)5 8記載的方法為例。L-氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)使用糖類，即葡萄糖、果糖、蔗糖、廢糖蜜、淀粉水解物等作為碳源。在非專利文獻(xiàn)I中記載了大腸桿菌野生株可以使用12碳以上的長鏈脂肪酸作為唯一碳源生長，非專利文獻(xiàn)2顯示其在以豆蘧酸、棕櫚酸、油酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上可以生長。此外，在非專利文獻(xiàn)I和非專利文獻(xiàn)3中記載了脂肪酸同化借助由fadL、fadD、fadE、fadB、fadA、fadj、fadl組成的基因群編碼的酶經(jīng)由稱為β酸化的同化途徑進(jìn)行，并且這群fad基因受到fadR編碼的轉(zhuǎn)錄因子的抑制。此外，如非專利文獻(xiàn)4所示，關(guān)于缺失了 fadR基因的菌株有很多報(bào)道。然而，如非專利文獻(xiàn)5所示，已知脂肪酸溶解度一般極低，迄今為止尚無以脂肪酸作為主要碳源使用直接發(fā)酵法進(jìn)行物質(zhì)生產(chǎn)的實(shí)例。因此，為了用脂肪酸作為L-氨基酸生產(chǎn)的碳源，通過物理處理使培養(yǎng)基中的脂肪酸易于利用，同時(shí)提高發(fā)酵菌的脂肪酸同化能力，都是非常重要的。關(guān)于涉及脂肪酸同化的基因的缺失或擴(kuò)增對以脂肪酸作為碳源的物質(zhì)生產(chǎn)的影響，迄今為止還沒有研究的實(shí)例。在專利文獻(xiàn)9中公開了使用染色體上fadR基因缺失的微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。此外，在專利文獻(xiàn)10中公開了通過增強(qiáng)能量獲取效率高的呼吸鏈途徑，或缺失能量獲取效率低的呼吸鏈途徑來進(jìn)行物質(zhì)生產(chǎn)的方法。然而，兩者都是用葡萄糖作為碳源，不能預(yù)見其使用脂肪酸作為碳源會(huì)有顯著的效果。專利文獻(xiàn)I :特開平5-304969號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :國際公開第98/04715號(hào)小冊子專利文獻(xiàn)3 :特開平05-227977號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 :美國專利申請公開第2002/0110876號(hào)說明書專利文獻(xiàn)5 :特開平10-165180號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6 :特開平11-192088號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7 :特開2000-253879號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8 :特開2001-057896號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9 :特開2004-129666號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)10 :特開2002-017363號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)I :Clark，D. P.和 Cronan，J. Ε· Jr. 1996. 343-357 頁·于F.D.Neidhardt(編)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition，American Society for Microbiology Press,Washington, D. C非專利文獻(xiàn)2 :Weeks，G.等 1969. Control of Fatty Acid MetabolismI. Induction of the Enzymes of Fatty Acid Oxidation in Escherichia coli.J. Bacteriol. 97 :827-836非專利文獻(xiàn)3 :Campbell J. W.等 2003. A new Escherichia coli metaboliccompetency growth on fatty acids by a novel anaerobic beta-oxi dation pathway.Mol. Microbiol. 47 :793-805.非專利文獻(xiàn)4 ；Cronan, J. E. Jr.和 Subrahmanyam，S. 1998. FadR, transcriptionalco-ordination of metabolic expediency. Mol. Microbiol. 29 :937-943非專利文獻(xiàn)5 :Vorum，H.等 1992. Solubility of long-chain fatty acids in phosphate buffer at pH 7.4.Biochimica et Biophysica Acta， Lipids and LipidMetabolism 1126 :135-14
發(fā)明內(nèi)容
與歷來主要以糖類作為碳源利用微生物進(jìn)行的L-氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)方法相對，本發(fā)明提供了一種使用脂肪酸或油脂水解物等新原料，使用對其具有高同化能力的微生物，高效、廉價(jià)的L-氨基酸制造方法。本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了勤奮研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在以歷來被認(rèn)為作為發(fā)酵原料時(shí)細(xì)菌生長遲緩、利用困難的脂肪酸作為碳源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)具有L-氨基酸生產(chǎn)能力且提高了脂肪酸的同化能力的屬于腸桿菌科的細(xì)菌，可以高效地生產(chǎn)L-氨基酸?；谠撝R(shí)完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明如下所述(I). 一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于，在包含脂肪酸或油脂的水解物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)提高了脂肪酸同化能力且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的細(xì)菌，從而在培養(yǎng)基或菌體內(nèi)生產(chǎn)并蓄積L-氨基酸，并從該培養(yǎng)基或菌體收集L-氨基酸。(2).上文所述的方法，其中，所述細(xì)菌是通過修飾選自參與脂肪酸同化的基因群中的I種或2種以上的基因而提高了脂肪酸同化能力的細(xì)菌。(3).上文所述的方法，其中，所述細(xì)菌是通過弱化fadR基因的表達(dá)或者使fadR基因缺損而提高了脂肪酸同化能力的細(xì)菌。(4).上文所述的方法,其中，所述細(xì)菌是通過增強(qiáng)選自fadl、fadj、fadL、fadE、fadD、fadB和fadA中的I種或2種以上的基因的表達(dá)而提聞了脂肪酸同化能力的細(xì)囷。(5).上文所述的方法，其中，所述基因是fadB和fadA。(6).上文所述的方法，其中，所述基因是fadl和fadj。(7).上文任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌是通過增強(qiáng)cyoAB⑶E操縱子的表達(dá)而提高了脂肪酸同化能力的細(xì)菌。(8).上文任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌是屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌。 (9).上文任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌是大腸桿菌。(10).上文任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述L-氨基酸是選自L-蘇氨酸、L-賴氨酸和L-色氨酸中的I種或2種以上的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，能夠使用新的碳源高效率地生產(chǎn)L-氨基酸。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明<1>本發(fā)明的L-氨基酸生產(chǎn)方法本發(fā)明的方法是以通過在含有脂肪酸或油脂水解物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于腸桿菌科，提高了脂肪酸的同化能力，且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌，從而在培養(yǎng)基或菌體內(nèi)生產(chǎn)并蓄積L-氨基酸，并從該培養(yǎng)基或菌體中收集L-氨基酸為特征的L-氨基酸生產(chǎn)方法。本文中本發(fā)明的方法可以使用分批培養(yǎng)(batch culture)、分批補(bǔ)料培養(yǎng)(Fed-batchculture)、連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)中的任何方式,培養(yǎng)基中的脂肪酸或油脂水解物可以包含于初始培養(yǎng)基中、或流加培養(yǎng)基中、或兩者中都含有。 在本文中，本發(fā)明所述的分批補(bǔ)料培養(yǎng)，是指向培養(yǎng)容器中連續(xù)地或間歇地流加培養(yǎng)基，在培養(yǎng)結(jié)束前不將該培養(yǎng)基從容器中移除的培養(yǎng)方法。此外，連續(xù)培養(yǎng)是指向培養(yǎng)容器中連續(xù)地或間歇地流加培養(yǎng)基，并且從容器中移除培養(yǎng)基(通常與流加的培養(yǎng)基等量)的方法。此外，初始培養(yǎng)基意為在分批補(bǔ)料或連續(xù)培養(yǎng)中，在流加流加培養(yǎng)基前用于分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基(培養(yǎng)開始的培養(yǎng)基)，而流加培養(yǎng)基意為在進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)時(shí)向發(fā)酵槽供給的培養(yǎng)基。此外，分批培養(yǎng)意為每次準(zhǔn)備新的培養(yǎng)基，在其中接種菌株，并在收獲前不再添加培養(yǎng)基的方法。脂肪酸是指可由通式CnHniCOOHG^U m+1分別表示脂肪酸中含的碳原子數(shù)和氫原子數(shù))表示的長鏈烴一價(jià)羧酸。一般大多把碳原子數(shù)12以上的稱為長鏈脂肪酸。脂肪酸由于其碳原子數(shù)和不飽和度不同存在各種種類。此外，脂肪酸是油脂的組成成分，已知根據(jù)油脂種類不同，脂肪酸的組成亦不同。豆蘧酸(C13H27COOH)是碳原子數(shù)14的飽和脂肪酸，存在于椰子油和棕櫚油中。棕櫚酸(C15H31COOH)是碳原子數(shù)16的飽和脂肪酸，通常大量存在于植物油脂中。硬脂酸(C17H35COOH)是碳原子數(shù)18的飽和脂肪酸，大量存在于動(dòng)物性脂肪和植物性油中。油酸(C17H33COOH)是碳原子18的一價(jià)不飽和脂肪酸，大量存在于動(dòng)物性脂肪和植物性油中。亞油酸(C17H31COOH)是碳原子數(shù)18，且9位和12位具有兩個(gè)順式雙鍵的多價(jià)不飽和脂肪酸。脂肪酸亦可使用上述長鏈脂肪酸的混合物。當(dāng)使用脂肪酸混合物作為碳源時(shí)，關(guān)于脂肪酸的混合比例，只要是本發(fā)明方法所使用的細(xì)菌能夠作為碳源進(jìn)行同化的濃度比例即可。亦可利用從油脂水解物去除甘油而得到的脂肪酸混合物。在本發(fā)明的方法中，亦可使用油脂水解物。油脂是脂肪酸與甘油的酯，亦稱為甘油三酯(triglyceride)。對于油脂，只要能夠進(jìn)行水解反應(yīng)，無論是脂肪油(oil)(指常溫下為液體者)抑或脂肪(fat)指(指常溫下為固體者)均可加以使用。此外，所有來自動(dòng)物(包括魚類)的油脂以及來自植物的油脂均可使用，亦可I種或2種以上組合使用。作為原料使用的油脂，可以是純油脂，也可以是含有油脂以外物質(zhì)的化合物。當(dāng)油脂是來自植物時(shí)，可以例舉含有油脂的植物提取物或其級分。作為動(dòng)物油脂，可以例舉黃油、豬脂、牛脂、羊脂等、鯨油、沙丁魚油、鯡油等。作為植物油脂，可以舉出椰子油、橄欖油、菜種油、大豆油、米糠油、核桃油、芝麻油、花生油，但是并不僅限于此。棕櫚油是從油棕櫚中提取的油，近年來作為生物柴油(biodiesel)燃料廣為使用，生產(chǎn)量不斷上升。油棕櫚(oil palm)是分類上為椰子科油棕櫚屬(Elaeis)的植物總稱。粗棕櫚油一般而言指榨油工廠生產(chǎn)的未純化椰子油，作為粗棕櫚油交易。此外，已知在微藻類中亦蓄積油脂(Chisti，Y. 2007. Biotechnol Adv. 25 :294-306)，亦可從藻體抽提。藻體內(nèi)除油脂以外雖還含有糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等有機(jī)物，但將含有這些的混合物水解作為碳源使用也毫無問題。就油脂而言，由于通過水解產(chǎn)生的脂肪酸種類作為碳源能夠被本發(fā)明方法中使用的細(xì)菌同化，因此這些物質(zhì)含量較高的油脂是理想的。具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌能夠同化的長鏈脂肪酸包括例如月桂酸、豆蘧酸、軟脂酸、硬脂酸、油酸。在本發(fā)明中所說的油脂水解物是指上述油脂通過化學(xué)方法或酶水解所得之物，是脂肪酸和甘油的混合物。工業(yè)上的水解法一般是在高溫(2 50-260°C )、高壓(5-6MPa)下，將油脂與水交流接觸的連續(xù)高溫水解法。此外，使用酶在低溫(30°C左右)進(jìn)行的反應(yīng)在工業(yè)上亦有使用。(Jaeger,K. E.等 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15 :29-63)。所述酶可使用催化油脂水解反應(yīng)的酶，即脂肪酶。脂肪酶在工業(yè)上是重要的酶，有多種產(chǎn)業(yè)上的用途(Hasan，F(xiàn).等 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39 :235-251)。油脂水解物是脂肪酸與甘油的混合物，已知相對于棕櫚油等一般的油脂的水解物中含有的脂肪酸，甘油的重量比為10%左右。油脂水解物只要含有脂肪酸即可，并沒有特別的限制。舉例而言，可以將油脂水解物直接使用，亦可去除部分脂肪酸、甘油后使用，或添加脂肪酸和甘油后使用。此時(shí)甘油對脂肪酸的重量比優(yōu)選5 20 100，更優(yōu)選7. 5 15 100。就本發(fā)明方法使用的培養(yǎng)基中含有的脂肪酸或油脂水解物的量而言，只要本發(fā)明方法中使用的細(xì)菌能夠?qū)⑵渥鳛樘荚赐?，任何量都是可以的，不過，在作為單獨(dú)的碳源添加到培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選含量為10W/V%以下，優(yōu)選5W/v%以下，更優(yōu)選2W/v%以下。此外，作為單獨(dú)的碳源添加到培養(yǎng)基時(shí)，期望含量為0. 2W/v%以上，優(yōu)選0. 5W/v%以上，更優(yōu)選I. Ow/
以上。此外，在作為流加培養(yǎng)基使用時(shí)，在作為單獨(dú)的碳源向流加培養(yǎng)基中添加的場合，流加后培養(yǎng)基中所含的濃度優(yōu)選為5W/v%以下，優(yōu)選2W/v%以下，更優(yōu)選lW/v%以下。此夕卜，作為單獨(dú)的碳源向流加培養(yǎng)基中添加時(shí)，優(yōu)選將量控制在0. 01w/v%以上，優(yōu)選0. 02w/v%以上,更優(yōu)選0. 05w/v%以上。而且,脂肪酸的濃度可通過質(zhì)譜法(Hashimoto, K.等1996. Biosci. Biotechnol.Biochem. 70 :22-30)和 HPLC(Lin, J. T.等 1998. J. Chromatogr. A. 808 :43-49)測定。關(guān)于向培養(yǎng)基添加的脂肪酸或存在于油脂水解物中的脂肪酸，期望以可將水膠束化的與鈉或者鉀等形成的堿金屬鹽的形式使用。然而，有些情況下甚至脂肪酸的鈉鹽和鉀鹽的溶解度亦不足以作為發(fā)酵原料使用。因此，為了使得具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌可以更加高效地同化作為碳源的脂肪酸，優(yōu)選增加乳化操作等促進(jìn)均一化的步驟。舉例而言，作為乳化方法，可以考慮添加乳化促進(jìn)劑或表面活性劑。在本文中，乳化促進(jìn)劑可舉出磷脂和類固醇。此外，表面活性劑可舉出非離子表面活性劑，如聚(氧乙烯)山梨醇單油酸酯(Tween 80)等聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、正辛基β _D_糖苷等烷基糖苷、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯等聚甘油脂肪酸酯等。兩性離子型表面活性劑可例舉屬于烷基甜菜堿的N，N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜堿。此外，亦可使用Triton X-100、聚氧乙烯(20)十六烷基醚(Brij-58)和壬基苯酚乙氧化物(Tergitol NP-40)等生物學(xué)領(lǐng)域通常使用的表面活性劑。而且，為了促進(jìn)脂肪酸乳化和均一化的操作亦為有效。對于這樣的操作，只要是促進(jìn)脂肪酸乳化和均一化的操作即可。具體而言可以例舉勻漿處理、均勻攪拌(homomixer)處理、超聲波、高壓處理、高溫處理等，更優(yōu)選勻漿處理、超聲波以及兩者的組合。特別優(yōu)選將上述表面活性劑處理與勻漿處理和/或超聲波處理組合。這些處理期望在脂肪酸更穩(wěn)定的堿性條件下進(jìn)行。堿性條件優(yōu)選為PH9以上，較優(yōu)選pHIO以上。而且，本發(fā)明方法中使用的培養(yǎng)基除了脂肪酸或油脂水解物之外，還可以添加其他的碳源。優(yōu)選的是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、廢糖蜜、淀粉水解物和生物質(zhì)水解所得的糖液等糖類，乙醇等醇類，以及富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸。而且，使用其他碳源時(shí)，碳源中的脂肪酸或油脂水解物的比率優(yōu)選為10%重量以上，優(yōu)選30%重量以上，更優(yōu)選50%重量以上。而且，在本發(fā)明中，就脂肪酸或油脂水解物而言，可于培養(yǎng)的所有步驟中均含有一定濃度的脂肪酸或油脂水解物，亦可僅在流加培養(yǎng)基或者初始培養(yǎng)基中添加脂肪酸或油脂水解物，而且只要其他碳源充足，亦可存在一段時(shí)間的脂肪酸或油脂水解物不足的期間。所謂一段時(shí)間，例如在發(fā)酵整體時(shí)間的最大30%的時(shí)間內(nèi)脂肪酸或油脂水解物不足亦可。這樣，如下所述的情形就包括在本發(fā)明的“用含脂肪酸或油脂水解物培養(yǎng)基培養(yǎng)”的字面意義范圍內(nèi)在此情形中脂肪酸濃度有時(shí)會(huì)暫時(shí)變?yōu)?，但存在使用含脂肪酸或油脂水解物培養(yǎng)基的培養(yǎng)期間。向培養(yǎng)基中添加的除碳源以外的成分可使用氮源、無機(jī)鹽以及視需要的其他有機(jī)成分。本發(fā)明培養(yǎng)基中含有的氮源可使用氨、硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、醋酸銨、尿素等銨鹽或硝酸鹽等，用于調(diào)節(jié)PH的氨氣或氨水亦可作為氮源使用。此外，亦可利用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、大豆水解物等。培養(yǎng)基中只含有這些氮源中I種亦可，含有2種以上亦可。這些氮源可用于初始培養(yǎng)基或流加培養(yǎng)基。此外，初始培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基可使用相同的氮源，流加培養(yǎng)基使用的氮源與初始培養(yǎng)基不同亦可。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，除碳源、氮源外，優(yōu)選含有磷酸源、硫源。作為磷酸源，可以利用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、焦磷酸等磷酸聚合物等。此外，作為硫源，只要含有硫原子即可，但優(yōu)選為硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽等硫酸鹽，半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸，其中尤其優(yōu)選硫酸銨。此外，在培養(yǎng)基中，除了上述成分外，可以含有生長促進(jìn)因子(具有生長促進(jìn)效果的營養(yǎng)素)。生長促進(jìn)因子可使用微量金屬類、氨基酸、維生素、核酸、以及含有這些物質(zhì)的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解物等。微量元素可以舉出鐵、錳、鎂、鈣等，維生素可以舉出維生素BI、維生素B2、維生素B6、煙酸、煙酰胺、維生素B12等。這些生長促進(jìn)因子可包含于初始培養(yǎng)基中，亦可包含于流加培養(yǎng)基中。此外，使用生長中需要氨基酸等的營養(yǎng)缺陷型時(shí)，優(yōu)選在培養(yǎng)基中補(bǔ)充所需的營養(yǎng)素。就L-賴氨酸生產(chǎn)菌而言，大多如后所述強(qiáng)化了 L-賴氨酸生物合成途徑并弱化了L-賴氨酸分解能力，因而最好是添加選自L-蘇氨酸、L-高絲氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸中的I種或2種以上。初始培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基的組成可以相同，亦可以不同。此外，初始培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基的硫濃度可以相同，亦可以不同。而且，在分多個(gè)階段進(jìn)行流加培養(yǎng)基的流加時(shí)，每階段的流加培養(yǎng)基組成可以相同，亦可以不同。、
培養(yǎng)優(yōu)選發(fā)酵溫度20 45°C，特別優(yōu)選在33 42°C進(jìn)行通氣培養(yǎng)。在本文中，氧濃度調(diào)節(jié)為5 50%，優(yōu)選10%左右。此外，優(yōu)選將pH控制在5 9進(jìn)行通氣培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中如果PH值下降，可以例如添加碳酸鈣，或者用氨氣或氨水等堿進(jìn)行中和。在這樣的條件下，經(jīng)過優(yōu)選10 120小時(shí)左右的培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中蓄積大量的L-氨基酸。就蓄積的L-氨基酸的濃度而言，只要是可以從培養(yǎng)基中收集或回收的濃度即可，但可以為50g/l以上，優(yōu)選75g/l以上，特別優(yōu)選100g/l以上。關(guān)于培養(yǎng)結(jié)束后從培養(yǎng)液收集L-氨基酸的方法，可以遵循公知的回收方法進(jìn)行。舉例而言，從培養(yǎng)液通過離心分離除去菌體后，濃縮結(jié)晶來進(jìn)行收集。在本發(fā)明中，為了保證L-氨基酸蓄積到一定量以上，可將細(xì)菌培養(yǎng)分為種子培養(yǎng)和主培養(yǎng)進(jìn)行，可使用燒瓶振蕩培養(yǎng)或分批培養(yǎng)進(jìn)行種子培養(yǎng)而以流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)方式進(jìn)行主培養(yǎng)，或者可以種子培養(yǎng)和主培養(yǎng)均使用分批培養(yǎng)。在本發(fā)明中，在進(jìn)行流加培養(yǎng)或者連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，可以間歇地流加流加培養(yǎng)基，使得脂肪酸或其他碳源的流加暫時(shí)地停止。此外，流加培養(yǎng)基供應(yīng)的停止優(yōu)選在流加進(jìn)行時(shí)間 的最多30%以下，期望20%以下，特別期望10%以下。當(dāng)間歇地流加流加培養(yǎng)基時(shí)，可進(jìn)行下述控制添加流加培養(yǎng)基一定的時(shí)間，從第二次添加起，在用計(jì)算機(jī)檢測到添加期之前的一段添加停止期中發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源耗盡而PH上升或溶解氧濃度上升時(shí)開始進(jìn)行添加，從而使得培養(yǎng)槽內(nèi)的基質(zhì)濃度總是自動(dòng)保持較低水平(美國專利5，912，113號(hào)說明書)。關(guān)于在流加培養(yǎng)中使用的流加培養(yǎng)基，優(yōu)選含有脂肪酸或油脂水解物和其他碳源以及具有生長促進(jìn)效果的營養(yǎng)素(生長促進(jìn)因子)的培養(yǎng)基，可將發(fā)酵培養(yǎng)基中的脂肪酸濃度控制在一定值以下。添加至流加培養(yǎng)基中的其他碳源優(yōu)選葡萄糖、蔗糖、果糖，生長促進(jìn)因子優(yōu)選氮源、磷酸、氨基酸等。氮源可使用氨、硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、醋酸銨、尿素等銨鹽或硝酸鹽。此外，磷酸源可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，氨基酸優(yōu)選補(bǔ)充在使用營養(yǎng)缺陷型變異體時(shí)所需的營養(yǎng)素。此外，流加培養(yǎng)基可為I種，亦可為2種以上培養(yǎng)基的混合物。在使用2種以上的培養(yǎng)基時(shí)，可將這兩者混合，通過一個(gè)加料罐流加，亦可用多個(gè)加料罐流加。在本發(fā)明中使用連續(xù)培養(yǎng)法時(shí)，移除和流加可同時(shí)進(jìn)行，亦可在移除部分后進(jìn)行流加。此外可使用移除含有L-氨基酸和細(xì)胞的培養(yǎng)液，而僅將細(xì)胞回送到發(fā)酵槽中對菌體進(jìn)行再利用的連續(xù)培養(yǎng)法(參照法國專利2669935號(hào)說明書)。連續(xù)或者間歇的流加營養(yǎng)源的方法可使用與流加培養(yǎng)同樣的方法。對菌體進(jìn)行再利用的連續(xù)培養(yǎng)法，是當(dāng)達(dá)到預(yù)定的氨基酸濃度時(shí)，將發(fā)酵培養(yǎng)基間歇或者連續(xù)的移除，僅取出L-氨基酸，將含有菌體的過濾殘留物再循環(huán)到發(fā)酵槽中的方法，舉例而言，可參照法國專利2669935號(hào)說明書進(jìn)行實(shí)施。在本文中，在間歇地移除培養(yǎng)液的場合，當(dāng)達(dá)到預(yù)定的L-氨基酸濃度時(shí)，可以將部分L-氨基酸移除，重新流加培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。此外，添加的培養(yǎng)基的量優(yōu)選設(shè)定為與最終移除之前的培養(yǎng)液量為相同的量。在本文中，相同的量意為移除前培養(yǎng)液量的93 107%左右的量。在連續(xù)地移除培養(yǎng)液的場合，期望的是在流加營養(yǎng)培養(yǎng)基的同時(shí)，或者在流加之后開始移除。舉例而言，移除開始時(shí)間可以是流加開始后5小時(shí)以內(nèi)，期望為3小時(shí)以內(nèi)，特別期望為I小時(shí)以內(nèi)。此外，移除的培養(yǎng)液量優(yōu)選與移除與流加的量為相同的量。〈2>在本發(fā)明中使用的細(xì)菌在本發(fā)明中，使用屬于腸桿菌科、提高了脂肪酸同化能力、并具有L-氨基酸生廣能力的細(xì)囷。腸桿囷科細(xì)囷包括屬于埃希氏囷屬、腸桿囷屬、歐文氏囷屬、克雷伯氏囷屬、泛菌屬、光桿菌屬(Photorhabdus)、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、摩根氏菌屬、耶爾森菌屬等屬的細(xì)菌。尤其優(yōu)選在根據(jù)NCBI (National Centerfor Biotechnology Information)的數(shù)據(jù)庫(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/wwwta x. CRiyyid = 91347)的分類法,歸類為腸桿菌科的細(xì)菌。屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌無特別的限制，意為根據(jù)微生物學(xué)專家所知的分類法歸類為埃希氏菌屬的細(xì)菌。在本發(fā)明中使用的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌雖可舉出大腸桿菌(E. coli)，但并不限于此。可以在本發(fā)明中使用的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌無特別的限制，包括，例如， Bachmann 等著作的表 I (Bachmann, B. J. 1996. 2460-2488 頁· In F. D. Neidhardt (編)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition,American Society for Microbiology Press, Washington, D. C)中所記載的系統(tǒng)的細(xì)菌。具體而言，可以舉出源自原型野生菌株K12的大腸桿菌W3110(ATCC 47076)。這些菌株例如可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址P.O. Box 1549 Manassas, VA20108,United States of America)通過分售獲得。S卩，各菌株被賦予了對應(yīng)的登錄號(hào)，可以利用該登錄號(hào)通過分售獲得。對應(yīng)于各菌株的登錄號(hào)見美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄。所謂屬于泛菌屬的細(xì)菌，是指所述細(xì)菌依據(jù)微生物學(xué)專家知曉的分類法被歸類在泛菌屬。作為泛菌屬細(xì)菌的代表性菌株，可舉出Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)、成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)、朽1 樣泛菌(Pantoea citrea)。成團(tuán)腸桿菌的某些種，最近基于16S rRNA堿基序列分析等被重新分類為成團(tuán)泛菌、Pantoea ananatis、斯氏泛菌等(Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. 43 :162-173)。在本發(fā)明中，這樣重新分類于泛菌屬的細(xì)菌也包括在屬于泛菌屬的細(xì)菌中。作為腸桿菌屬細(xì)菌，可舉出成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等。作為歐文氏菌屬細(xì)菌，可舉出解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora);作為克雷伯氏菌屬細(xì)菌，可舉出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。所謂“提高了脂肪酸同化能力”意指在細(xì)菌增殖以及L-氨基酸的生產(chǎn)中，作為構(gòu)成菌體成分或者L-氨基酸的碳來源的脂肪酸的貢獻(xiàn)實(shí)質(zhì)上提高。舉例而言，用添加了脂肪酸的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，與未修飾株相比細(xì)菌生長更加良好，或者與非修飾株相比L-氨基酸的生產(chǎn)量提高，因而評價(jià)為脂肪酸同化能力提高。在本發(fā)明中，“提高脂肪酸同化能力”，例如，通過修飾參與脂肪酸同化的基因或者cyoAB⑶E基因而達(dá)成。在本發(fā)明中，所謂“參與脂肪酸同化的基因”，意為受fadR基因和fadR控制的基因群(以下稱 fad 基因群),具體而言，包含 fadR、fadA、fadB、fadI、fadJ、fadL、fadE、和 fadD
坐寸ο〈2-DL-氨基酸生產(chǎn)能力的賦予
在本發(fā)明中，所謂具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌，是指具有在含脂肪酸或油脂水解物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，生產(chǎn)L-氨基酸并將其分泌到培養(yǎng)基中能力的細(xì)菌。此外，優(yōu)選的是能夠在培養(yǎng)基中蓄積優(yōu)選O. 5g/L以上，更優(yōu)選I. Og/L以上量的目標(biāo)L-氨基酸的細(xì)菌。L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-纈氨酸。更優(yōu)選L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸，特別優(yōu)選L-蘇氨酸以及L-賴氨酸。在本發(fā)明方法中可使用迄今為止有報(bào)道的L-氨基酸生產(chǎn)菌，只要其能夠通過提高脂肪酸同化能力，同化脂肪酸或油脂水解物而生產(chǎn)L-氨基酸即可。下面，對在本發(fā)明方法中可使用的各個(gè)L-氨基酸生產(chǎn)菌進(jìn)行說明。 L-蘇氨酸生產(chǎn)菌作為優(yōu)選的具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的微生物，可舉出增強(qiáng)了 L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶中的I種或2種以上酶的活性的細(xì)菌。作為L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶，可例舉天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)、thr操縱子編碼的天冬氨酸激酶I(thrA)、高絲氨酸激酶(thrB)、蘇氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)(aspC)。括號(hào)內(nèi)為該基因的簡記符號(hào)(對于下面的記載亦同樣)。在這些酶中，特別優(yōu)選天冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脫氫酶、天冬氨酸激酶I、高絲氨酸激酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶以及蘇氨酸合酶。L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)基因可以導(dǎo)入蘇氨酸分解受到抑制的埃希氏菌屬細(xì)菌中。作為蘇氨酸分解受到抑制的埃希氏菌屬細(xì)菌，可例舉例如蘇氨酸脫氫酶活性缺損的TDH6株(特開2001-346578號(hào))等。L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶的酶活性受終產(chǎn)物L(fēng)-蘇氨酸的抑制。因此，為了構(gòu)建L-蘇氨酸生產(chǎn)菌，最好對L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶基因進(jìn)行修飾以使其不受L-蘇氨酸的反饋抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因組成蘇氨酸操縱子，蘇氨酸操縱子形成弱化子(attenuator)結(jié)構(gòu)，蘇氨酸操縱子的表達(dá)受到培養(yǎng)液中異亮氨酸和蘇氨酸的抑制，并且通過弱化作用其表達(dá)受抑制。這種修飾可通過去除弱化區(qū)中的前導(dǎo)序列或弱化子來實(shí)現(xiàn)(參照 Lynn，S. P.等 1987. J. Mol. Biol. 194:59-69 ;國際公開第 02/26993 號(hào)小冊子；國際公開第2005/049808號(hào)小冊子)。蘇氨酸操縱子上游存在天然啟動(dòng)子，但亦可用非天然啟動(dòng)子將其取代(參考國際公開第98/04715號(hào)小冊子)，亦可構(gòu)建其中參與蘇氨酸生物合成的基因的表達(dá)受到λ卩遼菌體的阻遏蛋白及啟動(dòng)子的調(diào)控的蘇氨酸操縱子(參考?xì)W洲專利第0593792號(hào)說明書)。此夕卜，為了對細(xì)菌進(jìn)行修飾使其不受L蘇氨酸的反饋抑制，亦可以選擇對α -氨基-β -羥基戊酸(AHV)有抗性的菌株。對于如上所述經(jīng)修飾而不受L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子而言，優(yōu)選的是其在宿主中拷貝數(shù)增加，或者是其連接于強(qiáng)啟動(dòng)子而表達(dá)量提高?？截悢?shù)的增加除了借助質(zhì)粒的擴(kuò)增，還可以通過使用轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體等將蘇氨酸操縱子轉(zhuǎn)移到基因組上來達(dá)成。理想的是，除了 L-蘇氨酸生物合成系統(tǒng)酶之外，亦增強(qiáng)糖酵解系統(tǒng)、TCA循環(huán)和呼吸鏈中涉及的基因、調(diào)控這些基因表達(dá)的基因、或糖攝取基因。這些對L-蘇氨酸生產(chǎn)有效應(yīng)的基因可例舉轉(zhuǎn)氫酶基因(PntAB)(歐洲專利733712號(hào)說明書)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(國際公開95/06114號(hào)小冊子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(歐洲專利877090號(hào)說明書)、棒狀桿菌型細(xì)菌或芽孢桿菌屬細(xì)菌的丙酮酸羧化酶基因(國際公開99/18228號(hào)小冊子、歐洲申請公開1092776號(hào)說明書)。此外，增強(qiáng)賦予L-蘇氨酸抗性的基因、賦予L-高絲氨酸抗性的基因的表達(dá)，或賦予宿主L-蘇氨酸抗性、L-高絲氨酸抗性，亦為理想的。賦予抗性的基因可例舉rhtA基因(Res. Microbiol. 154 :123-135 (2003))、rhtB 基因(歐洲專利申請公開第 0994190 號(hào)說明書)、rhtC基因(歐洲專利申請公開第1013765號(hào)說明書)、yfiK、yeaS基因(歐洲專利申請公開第1016710號(hào)說明書)。此外，對宿主賦予L-蘇氨酸抗性的方法可參考?xì)W洲專利申請公開第0994190號(hào)說明書、國際公開第90/04636號(hào)小冊子記載的方法。作為L-蘇氨酸生產(chǎn)菌和用于衍生L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的親本株的例子，可例舉大腸桿菌 TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美國專利第 5，175，107 號(hào)、美國專利第 5, 705, 371號(hào))、大腸桿菌472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美國專利第5，631，157號(hào))、大腸桿菌 NRRL-21593 (美國專利第5，939，307號(hào))、大腸桿菌FERM BP-3756 (美國專利第5，474，918號(hào))、大腸桿菌FERM BP-3519和FERM BP-3520 (美國專利第5，376，538號(hào))、大腸桿菌MG442 (Gusyatiner 等，1978. Genetika (俄語)，14 :947-956)、大腸桿菌 VL643 和 VL2055 (歐洲專利申請公開第1149911號(hào))等屬于埃希氏桿菌屬的菌株，但不限于此。TDH-6菌株缺失thrC基因，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏(leaky)突變。該菌株亦在rhtA基因上有突變，該突變賦予對高濃度的蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。B-3996菌株攜帶PVIC40質(zhì)粒，該質(zhì)粒是通過將含有突變的thrA基因的thrA*BC操縱子插入到來自RSF1010的載體中而獲得的。這種突變的thrA基因編碼基本上已解除了蘇氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I。B-3996菌株在1987年11月19日以保藏號(hào)RIA 1867 保藏于 All-Union Scientific Center of Antibiotics (全聯(lián)盟抗生素科學(xué)中心)(Nagatinskaya Street 3_A, 117105 Moscow, Russia)。該菌株亦于 1987 年 4 月 7 日以保藏號(hào)B-3996保藏于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection ofIndustrial Microorganisms (VKPM), (I Dorozhny proezd. , I Moscow 117545, Russia)。亦可以使用大腸桿菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作為L-蘇氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生它的親本株。就B-5318菌株而言，它是非異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型的，pVIC40質(zhì)粒中的蘇氨酸操縱子的調(diào)控區(qū)域被溫度敏感型λ噬菌體Cl阻遏蛋白以及PR啟動(dòng)子取代。VKPMΒ-5318于1990年5月3日以保藏號(hào)VKPM Β-5318國際保藏于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (I Dorozhny proezd. , I Moscow 117545, Russia)。編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因已經(jīng)得到闡明(核苷酸編號(hào) 337 2，799，Genbank 登錄號(hào) NC_000913. 2，gi :49175990)。thrA 基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrL基因和thrB基因之間的位置。編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB基因已經(jīng)得到了闡明(核苷酸編號(hào)2801 3733，GenBank登錄號(hào)NC_000913. 2，gi 49175990)。thrB基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrA基因和thrC基因之間。編碼大腸桿菌的蘇氨酸合酶的thrC基因已經(jīng)得到了闡明(核苷酸編號(hào)3734 5020，GenBank登錄號(hào)NC_000913. 2，gi :49175990)。thrC基因位于大腸桿菌K-12染色體thrB基因和yaaX開放閱讀框之間。這三個(gè)基因全部作為單一的蘇氨酸操縱子而起作用。為了增加蘇氨酸操縱子的表達(dá)，優(yōu)選從操縱子上除去影響轉(zhuǎn)錄的弱化子區(qū)域(國際公開第2005/049808號(hào)、國際公開第2003/097839號(hào))。編碼對蘇氨酸的反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA基因，以及thrB和thrC基因，可以從公知存在于蘇氨酸生產(chǎn)株大腸桿菌VKPM B-3996株中的pVIC40質(zhì)粒作為一個(gè)操縱子獲得。PVIC40質(zhì)粒詳細(xì)描述于美國專利No. 5，705，371。大腸桿菌的rhtA基因，存在于靠近編碼谷氨酰胺輸送系統(tǒng)重要組分的glnHPQ操縱子的大腸桿菌染色體18分的位置。rhtA基因與ORFl (ybif基因，核苷酸編號(hào)764 1651，GeneBank 登錄號(hào) AAA218541，gi :440181)是同一的，位于 pexB 基因和 ompX 基因之間。表達(dá)由ORFl編碼的蛋白質(zhì)的單元稱為rhtA 基因(rht :高絲氨酸以及蘇氨酸抗性)。此外，弄清了 rthA23突變是在相對ATG起始密碼子的_1位上G_>A的取代(ABSTRACTSofthe 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology inconjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry andMolecularBiology, San Francisco, California August 24-29,1997, abstract No. 457,EP 1013765 A)。大腸桿菌的asd基因已經(jīng)得到了闡明(核苷酸編號(hào)3572511 3571408，GenBank登錄號(hào)NC_000913. 1，gi :16131307)，使用基于該基因的堿基序列制備的引物進(jìn)行PCR，可獲得該基因(參照White，T. J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))。亦可用同樣方法獲得其他微生物的asd基因。此外，大腸桿菌的aspC基因也已經(jīng)得到了闡明(核苷酸編號(hào)983742 984932，GenBank登錄號(hào)NC_000913. 1，gi :16128895)，可通過PCR獲取該基因。亦可用同樣方法獲得其他微生物的aspC基因。L-賴氨酸生產(chǎn)菌作為屬于埃希氏菌屬的L-氨基酸生產(chǎn)菌的實(shí)例,可例舉對L-賴氨酸類似物具有抗性的突變株。L-賴氨酸類似物可抑制屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的生長，但該抑制作用在L-賴氨酸共存于培養(yǎng)基中時(shí)全部或部分解除。作為L-賴氨酸類似物的實(shí)例，可例舉氧化賴氨酸、賴氨酸氧肟酸、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、Y-甲基賴氨酸、α-氯己內(nèi)酰胺等，但不限于此。對于這些賴氨酸類似物具有抗性的突變株，可以通過對屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌實(shí)施常規(guī)的人工突變處理來獲得。作為對L-賴氨酸生產(chǎn)有用的菌株的具體實(shí)例，可例舉大腸桿菌AJl 1442 (FERM BP-1543、NRRL Β-12185 ;參照美國專利第4346170號(hào))以及大腸桿菌VL611。這些微生物中L-賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制已解除。WC196株可作為大腸桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌使用。該菌株是通過對來自大腸桿菌Κ-12的W3110株賦予AEC耐性而選育得到的。該株命名為大腸桿菌AJ13069，于1994年12月6日以保藏號(hào)FERM Ρ-14690保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心、〒305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)，于1995年9月29日基于布達(dá)佩斯條約移至國際保藏，獲得保藏號(hào)FERMBP 5252 (美國專利第5，827，698號(hào))。作為L-賴氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)酶中I種或2種以上的酶的活性增強(qiáng)的株。這樣的酶可例舉二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(IysC)、二氫卩比唳二羧酸還原酶(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶(ddh)(美國專利第6，040, 160號(hào))、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(dapF)、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶(dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脫?；?dapE)以及天冬氨酸酶(aspA) (EP 1253195A)，但不限于此。這些酶中，特別優(yōu)選二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脫酰基酶。此夕卜，親本株可提高涉及能量效率的基因(cyo) (EP 1170376 A)、編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的基因(pntAB)(美國專利第5，830, 716號(hào))、ybjE基因(W02005/073390)或這些組合的表達(dá)水平。L-賴氨酸生產(chǎn)菌或?yàn)榱搜苌摼挠H本株的實(shí)例還包括催化從L-賴氨酸生物合成途徑分歧生成L-賴氨酸以外化合物的反應(yīng)的酶的活性降低或缺失的菌株。作為催化從L-賴氨酸生物合成途徑分歧生成L-賴氨酸以外化合物的反應(yīng)的酶，可例舉高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(美國專利第5，827，698號(hào)以及蘋果酸酶(W02005/010175)。作為優(yōu)選的賴氨酸生產(chǎn)菌，可例舉大腸桿菌WC196 Δ cadA Δ Idc/ pCABD2(AJ110692/pCABD2) (W02006/078039)。該菌株是向編碼賴氨酸脫羧酶的cadA以及IdcC基因破壞的W196株(大腸桿菌WC196AcadAAldcC :AJ110692株)中導(dǎo)入美國專利第6040160記載的pCABD2質(zhì)粒而獲得的株。pCABD2包含來自具有解除了 L-賴氨酸所導(dǎo)致的反饋抑制的變異的編碼來自大腸桿菌的二氫吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的變異體dapA基因、具有解除了 L-賴氨酸所導(dǎo)致的反饋抑制的變異的編碼來自大腸桿菌的天冬氨酸激酶III的變異體IysC基因、編碼來自大腸桿菌的二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因以及編碼來自乳發(fā)酵短桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因。L-半胱氨酸生產(chǎn)菌作為L-半胱氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉用編碼反饋抑制抗性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的不同cysE等位基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM15(美國專利6，218，168，俄羅斯專利申請2003121601)、具有過表達(dá)編碼適于從細(xì)胞排出有毒物質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因的大腸桿菌W3110 (美國專利5，972，663)、半胱氨酸脫巰基酶(cysteinedesulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(JP11155571A2)、由cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控物活性增強(qiáng)的大腸桿菌W3110(國際公開第0127307號(hào))等屬于埃希氏菌屬的株，但不限于此。L-亮氨酸生產(chǎn)菌作為L-亮氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉對亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美國專利第6，124，121號(hào)))或?qū)Ζ?2-噻吩丙氨酸、3-羥基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等亮氨酸類似物有抗性的大腸桿菌菌株(特公昭62-34397號(hào)和特開平8-70879號(hào))、通過國際公開第96/06926號(hào)中描述的基因工程方法獲得的大腸桿菌菌株、大腸桿菌Η-9068(特開平8-70879號(hào))等屬于埃希氏菌屬的株，但不限于此。用于本發(fā)明的細(xì)菌可以通過增加至少一種參與L-亮氨酸生物合成的基因的表達(dá)來加以改進(jìn)。作為這些基因的實(shí)例，可優(yōu)選舉出以編碼解除了 L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶的突變IeuA基因(美國專利第6，403，342號(hào))為代表的IeuAB⑶操縱子基因。而且，可以通過增加至少一種編碼從細(xì)菌細(xì)胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表達(dá)來改進(jìn)用于本發(fā)明的細(xì)菌。這類基因的實(shí)例可例舉b2682和b2683基因(ygaZH基因)(歐洲專利申請公開第1239041號(hào))。L-組氨酸生產(chǎn)菌作為L-組氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉大腸桿菌24株(VKPM B-5945、RU2003677)、大腸桿菌 80 株(VKPM B-7270、RU2119536)、大腸桿菌 NRRLB-12116-B12121(美國專利第 4,388,405 號(hào))、大腸桿菌 H-9342(FERM BP-6675)以及H-9343 (FERM BP-6676)(美國專利第 6，344，347 號(hào))、大腸桿菌 H-9341 (FERM BP-6674)(歐洲專利申請公開第1085087號(hào))、大腸桿菌AI80/pFM201 (美國專利第6，258，554號(hào))等屬于埃希氏菌屬的菌株，但并不限于此。作為L-組氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例亦可例舉編碼L-組氨酸生物合成系統(tǒng)酶的I種以上的基因的表達(dá)增強(qiáng)的株。相關(guān)基因的實(shí)例可例舉ATP憐酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP環(huán)化水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基亞胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸異構(gòu)酶基因(phosphoribosyIformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase) (hisA)、酉先胺轉(zhuǎn)移酶基因(hisH)、組氨醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(hisC)、組氨醇磷酸酶基因(hisB)、組氨醇脫龜!酶基因(hisD)等。已知hisG和hisBHAFI編碼的L-組氨酸生物合成系統(tǒng)酶被L-組氨酸所抑制，因此還可以通過向ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(hisG)中引入誘導(dǎo)可賦予對反饋抑制的抗性的突變，來有效地增加產(chǎn)生L-組氨酸的能力(俄羅斯專利2003677以及2119536號(hào))。作為具有L-組氨酸生產(chǎn)能力的菌株具體實(shí)例，可例舉導(dǎo)入了攜帶編碼L-組氨酸生物合成系統(tǒng)酶的DNA的載體的大腸桿菌FERM-P 5038和5048 (特開昭56-005099號(hào))，導(dǎo)入了氨基酸輸送的基因的大腸桿菌菌株(EP1016710A)，賦予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素抗性的大腸桿菌80菌株(VKPM B-7270，俄羅斯專利2119536號(hào))
坐寸οL-谷氨酸生產(chǎn)菌作為L-谷氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉大腸桿菌VL334thrC+(EP 1172433)等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。大腸桿菌VL334 (VKPMB-1641)是在thrC和ilvA基因中有突變的L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(美國專利4，278，765)。利用在野生型大腸桿菌菌株K-12(VKPM B-7)細(xì)胞中增殖的噬菌體P1，通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法來導(dǎo)入了 thrC基因的野生型等位基因。其結(jié)果，獲得了 L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型的L-谷氨酸生產(chǎn)菌VL334thrC+(VKPM B-8961)。作為L-谷氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉L-谷氨酸生物合成系統(tǒng)酶中的I種或2種以上酶的活性得到增強(qiáng)的菌株，但不限于此。相關(guān)基因的實(shí)例可例舉編碼下列的基因谷氨酸脫氫酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、異朽1檬酸脫氫酶(icdA)、順烏頭酸水合酶(acnA,acnB)、朽1檬酸合酶(gltA)、甲基檸檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脫氫酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA, pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸變位酶(pgmA,pgml)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醒-3-磷酸脫氫酶(gapA)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpiA)、果、糖二磷酸醒縮酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA, pfkB)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(pgi)等。在這些酶中，優(yōu)選谷氨酸脫氫酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基檸檬酸合酶。作為檸檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脫氫酶基因表達(dá)升高的修飾菌株，可例舉在EP1078989A、EP955368A以及EP952221A中公開的菌株。作為L-谷氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，亦可例舉催化從L-谷氨酸生物合成途徑分歧而合成L-谷氨酸以外的化合物的酶的活性降低或缺損的菌株。作為這樣的酶的實(shí)例，可例舉2_氧代戊二酸脫氫酶(α-酮戊二酸脫氫酶(sucA))、異檸檬酸裂合酶(aceA)、α -酮戊二酸脫氫酶(sucA)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羥基酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvl)、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Pfl)、乳酸脫氫酶(Idh)、谷氨酸脫羧酶(gadAB)等。α-酮戊二酸脫氫酶活性缺損、或α-酮戊二酸脫氫酶活性降低的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌及其獲取方法記載于美國專利第5，378，616號(hào)和第5，573，945號(hào)。作為具體例子，可以舉出
大腸桿菌W3110sucA: :Kmr大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)大腸桿菌AJ12628(FERM BP-3854)大腸桿菌AJ12949(FERM BP-4881)大腸桿菌W31 IOsucA : :Kmr是通過破壞大腸桿菌W3110的α -酮戊二酸脫氫酶基因(以下也稱“sucA基因”)而得到的菌株。該菌株的α-酮戊二酸脫氫酶完全缺損。作為L-谷氨酸生產(chǎn)菌的其他實(shí)例，可例舉屬于埃希氏菌屬且對天冬氨酸代謝拮抗物質(zhì)有抗性的菌株。這些菌株可以缺失α-酮戊二酸脫氫酶，可例舉大腸桿菌AJ13199(FERM BP-5807)(美國專利第5，908，768號(hào))，以及還降低了 L-谷氨酸分解能力的 FFRM P-12379(美國專利第 5,393,671 號(hào))；AJ13138 (FERM BP-5565)(美國專利第6，110，714號(hào))等為例。作為Pantoea ananatis L-谷氨酸生產(chǎn)菌的實(shí)例，可例舉Pantoea ananatisAJ13355株。該菌株是從靜R縣磐田市的土壤中作為能夠在低pH下在含L-谷氨酸和碳源的培養(yǎng)基中增殖的菌株而分離出來的菌株。Pantoea ananatis AJ13355于1998年2月19日以保藏號(hào)FERM P-16644保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(地址〒305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6);于1999年I月11日以保藏號(hào)FERM BP-6614轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國際保藏。而且，該菌株雖在分離出來時(shí)鑒定為成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans),并作為成團(tuán)腸桿菌AJ13355保藏,但近年來通過16S rRNA的堿基序列解析等,重新分類為Pantoea ananatis。此外，作為屬于Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產(chǎn)菌，可例舉α-酮戊二酸脫氫酶(aKGDH)活性缺失或者a KGDH活性降低的屬于泛菌屬的細(xì)菌。作為這樣的菌株為缺失AJ13355株的a KGDH-El亞單位基因(sucA)而得到的AJ13356 (美國專利第6，331，419號(hào))，以及從AJ13355株中作為粘液質(zhì)低生產(chǎn)突變菌株選擇出來的SC17株衍生的sucA基因缺失株SC17sucA(美國專利第6，596，517號(hào))。AJ13356于1998年2月19日以保藏號(hào)FERM P-16645保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心、〒305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)，并于1999年I月11日以保藏號(hào)FERM BP-6616轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國際保藏。AJ13355以及AJ13356在上述保藏機(jī)構(gòu)是作為成團(tuán)腸桿菌保藏的，但是在本說明書中，將其描述為Pantoea ananatis。此外，SC17sucA株的內(nèi)部編號(hào)為AJ417,已于2004年2月26日以保藏號(hào)FERM BP-08646保藏于產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。而且，作為屬于Pantoea ananatis的L-谷氨酸生產(chǎn)菌，可例舉SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株、AJ13601 株、NP 106 株以及 NAl 株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株是在SC17sucA株中導(dǎo)入包含來自大腸桿菌的檸檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppsA)和谷氨酸脫氫酶基因(gdhA)的質(zhì)粒RSFCPG以及包含來自乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Iactofermentum)的朽1樣酸合酶基因(gltA)的質(zhì)粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601株是從該SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株中作為在低pH下顯示出對高濃度L-谷氨酸的抗性的菌株而選擇出的。而NP106株是從AJ13601株脫落質(zhì)粒RSFCPG+pSTVCB而得到的。AJ13601株于1999年8月18日以保藏號(hào)FERM P-17516保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)，并于2000年7月6日以保藏號(hào)FERM BP-7207轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國際保藏。 L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌作為L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌或者用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶以及酪氨酸阻遏物缺損的大腸桿菌AJ12739(tyrA::TnlO，tyrR) (VKPMB-8197) (W003/044191)、攜帶了編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的突變型pheA34基因的大腸桿菌HW1089 (ATCC 55371)(美國專利第5，354，672號(hào))、大腸桿菌 MWEC101-b(KR8903681)、大腸桿菌 NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146 以及NRRLB-12147(美國專利第4，407，952 號(hào))等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。此夕卜，作為親本株亦可使用攜帶了編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因的大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAD] (FERM BP-12659)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)以及命名為 AJ12604 的大腸桿菌1(-12[胃3110(七7^)/ 81 -&1'064，pACMAB] (FERM BP-3579) (EP488424 BI)。而且,還可使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質(zhì)的活性增加的屬于埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌(美國專利申請公開2003/0148473號(hào)以及2003/0157667、W003/044192 號(hào))。L-色氨酸生產(chǎn)菌作為L-色氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉由突變的trpS基因編碼而缺失了色氨酰-tRNA合成酶缺陷的大腸桿菌JP4735/pMU3028 (DSM10122)以及JP6015/pMU91(DSM10123)(美國專利5，756，345);具有編碼不受絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼不受色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因的大腸桿菌SV164 (pGH5)(美國專利
6,180, 373);色氨酸酶缺失的大腸桿菌 AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美國專利4，371，614);磷酸烯醇丙酮酸的生產(chǎn)能力增加的大腸桿菌AGX17/pGX50, pACKG4_pps (W09708333，美國專利6,319,696)等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。亦可使用增強(qiáng)了由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質(zhì)活性的屬于埃希氏菌屬的L-色氨酸生產(chǎn)菌(美國專利申請公開2003/0148473A1和2003/0157667A1)。作為L-色氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，亦可例舉選自鄰氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroG)、3_脫氫奎寧酸合酶(aroB)、莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5_烯醇酸丙酮酸莽草酸 3_ 憐酸合酶(5-enolpyruvylshikimate_3-phosphate synthase) (aroA)、分支酸合酶(aroC)、預(yù)苯酸脫水酶、分支酸變位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的I種或2種以上酶活性增強(qiáng)的菌株。預(yù)苯酸脫水酶以及分支酸變位酶以雙功能酶(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase (CM/PDH))的形式由pheA基因編碼。在這些酶中，特別優(yōu)選磷酸甘油酸脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶、3-脫氫奎寧酸合酶、莽草酸脫水酶、莽草酸激酶、5-烯醇酸丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、預(yù)苯酸脫水酶、分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶兩者都受L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此可以向這些酶中引入使反饋抑制解除的突變。作為具有此類突變的菌株的具體實(shí)例，可例舉具有脫敏型鄰氨基苯甲酸合酶的大腸桿菌SV164以及通過將包含編碼解除了反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的突變serA基因的質(zhì)粒pGH5(國際公開94/08031)導(dǎo)入大腸桿菌SV164而獲得的轉(zhuǎn)化菌株。作為L-色氨酸生產(chǎn)菌或用于誘導(dǎo)該菌的親本株的實(shí)例，亦可例舉導(dǎo)入了包含編 碼抑制解除型鄰氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操縱子的菌株(特開昭57-71397號(hào)，特開昭62-244382號(hào),美國專利第4，371，614號(hào))。而且,可通過增加色氨酸操縱子(trpBA)中編碼色氨酸合酶的基因的表達(dá)來賦予L-色氨酸生產(chǎn)能力。色氨酸合酶由α和β亞單位組成，這兩種亞單位分別由trpA和trpB基因編碼。而且，可通過增強(qiáng)異檸檬酸裂合酶_馬來酸合酶操縱子的表達(dá)來改善L-色氨酸生產(chǎn)能力(W02005/103275)。L-脯氨酸生產(chǎn)菌作為L-脯氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉缺失iIvA基因、能夠生產(chǎn)L-脯氨酸的大腸桿菌702ilvA(VKPM B-8012) (EP1172433)等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。在本發(fā)明中使用的細(xì)菌可通過增加至少一種參與L-脯氨酸生物合成的基因的表達(dá)來進(jìn)行改良。作為L-脯氨酸生產(chǎn)菌優(yōu)選基因的實(shí)例，可例舉編碼解除了 L-脯氨酸反饋抑制的谷氨酸激酶的ProB基因(德國專利第3127361號(hào))。而且，在本發(fā)明中使用的細(xì)菌，可通過增加至少一種編碼從細(xì)菌細(xì)胞中分泌L-氨基酸的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)來進(jìn)行改良。這樣的基因包括例如b2682基因和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。作為具有L-脯氨酸生產(chǎn)能力的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的實(shí)例，可例舉NRRLB-12403以及NRRL B-12404 (英國專利第2075056號(hào))、VKPM B-8012 (俄羅斯專利申請2000124295)、德國專利第3127361號(hào)描述的質(zhì)粒突變體、Bloom F. R等(The 15th Miamiwinter symposium, 1983, p. 34)描述的質(zhì)粒突變體等大腸桿菌株。L-精氨酸生產(chǎn)菌L-精氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉大腸桿菌237菌株(VKPM B-7925)(美國專利申請公開2002/058315A1)及其帶有突變N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase)的衍生菌株(俄羅斯專利申請 2，001，112，869),大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926) (EP1170358A1)，引入了編碼N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acety I glutamate synthetase)的 argA 基因的精氨酸生產(chǎn)株(EP1170361A1)等屬于埃希氏菌屬的菌株，但不限于此。
作為L-精氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，亦可例舉增加了至少I種編碼L-精氨酸生物合成系統(tǒng)酶的基因的表達(dá)的菌株。相關(guān)基因的實(shí)例包括N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶基因(argC)、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(argj)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(argD)、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、精氨琥拍酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。L-纈氨酸生產(chǎn)菌作為L-纈氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生 該菌的親本株的實(shí)例，包括經(jīng)修飾而過表達(dá)ilvGMEDA操縱子的菌株(美國專利5,998，178),但不限于此。優(yōu)選將弱化(attenuation)所需的ilvGMEDA操縱子的區(qū)域移除以使操縱子的表達(dá)不會(huì)被產(chǎn)生的L-纈氨酸所削弱。而且，優(yōu)選將操縱子中的ilvA基因破壞從而降低蘇氨酸脫氨酶的活性。作為L-纈氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，亦可例舉具有氨酰t-RNA合成酶突變的突變株(美國專利5，658，766)。舉例而言，可使用在編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中具有突變的大腸桿菌VL1970。大腸桿菌VL1970于1988年6月24日以保藏號(hào)VKPM B-4411保藏于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (I Dorozhny Proezd. , IMoscow 117545, Russia)ο而且,還可以將生長需要硫辛酸(lipoic acid)的突變株和/或缺失H+-ATPase的突變株(國際公開96/06926)作為親本株使用。作為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉對6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突變株(特開平5-304969號(hào))、對異亮氨酸類似物如硫代異亮氨酸(thiaisoleucine)和異亮氨酸氧I虧酸等具有抗性的突變株、以及對DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突變株(特開平5-130882號(hào))，但不限于此。而且，亦可將用編碼蘇氨酸脫氨酶、乙酰輕酸合酶(acetohydroxate synthase)等參與L-異亮氨酸生物合成的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)化的重組菌株作為親本株使用(特開平2-458號(hào)，F(xiàn)R0356739，以及美國專利第5，998，178號(hào))。L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌作為L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生該菌的親本株的實(shí)例，可例舉L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷株、對正亮氨酸有抗性的突變株(特開2000-139471號(hào))，但不限于此。而且，亦可將缺損了甲硫氨酸阻遏物的菌株、或者用編碼高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶、胱硫醚Y-合酶等參與L-甲硫氨酸生物合成的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)化過的重組菌株作為親本株使用(特開2000-139471號(hào))。而且，在通過基因重組來培育上述L-氨基酸生產(chǎn)菌時(shí)，使用的基因并不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，只要不損害所編碼蛋白質(zhì)的功能，亦可使用該基因的同源物和人工修飾體等具有保守突變的基因。即，亦可為這樣的基因，其編碼具有在公知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中一個(gè)或數(shù)個(gè)位置上包含一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的序列的蛋白質(zhì)。有關(guān)“保守突變”，后述關(guān)于參與脂肪酸同化的基因的記載亦適用于上述基因。<2-2>提高脂肪酸同化能力的性狀的賦予在本發(fā)明方法中使用的細(xì)菌，是如上所述具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌經(jīng)修飾而增加了脂肪酸同化能力的細(xì)菌，優(yōu)選指該細(xì)菌被賦予了下述性狀中一種以上的性狀fadR基因的表達(dá)弱化或缺損、fadl基因的表達(dá)增強(qiáng)、fadj基因的表達(dá)增強(qiáng)、fadL基因的表達(dá)增強(qiáng)、fadE基因的表達(dá)增強(qiáng)、fadD基因的表達(dá)增強(qiáng)、fadB基因的表達(dá)增強(qiáng)、fadA基因的表達(dá)增強(qiáng)、fadBA操縱子的表達(dá)增強(qiáng)、fadlJ操縱子的表達(dá)增強(qiáng)、cyoAB⑶E的表達(dá)增強(qiáng)。在本發(fā)明中所謂“fadR”基因，意為這樣的基因，其編碼見于腸桿菌科細(xì)菌的具有脂肪酸代謝調(diào)節(jié)DNA結(jié)合能力的轉(zhuǎn)錄因子FadR(DiRusso，C. C.等1992. J. Biol. Chem. 267 8685-8691 ；DiRusso, C. C.等 1993. Mol. Microbiol. 7 :311-322)。具體而言，作為大腸桿菌的fadR基因，可例舉位于大腸桿菌基因組序列(GeneBank登錄號(hào)U00096)的堿基編號(hào)1234161 1234880，具有SEQ ID NO :1所示的堿基序列的基因。SEQ ID NO :2顯示了該基因編碼的氨基酸序列。為了降低fadR轉(zhuǎn)錄因子的活性，可弱化fadR基因的表達(dá)或使該基因缺損。具體而言，通過使染色體上編碼fadR的基因，具體地說fadR基因編碼區(qū)域的一部分或全部缺損，或者對啟動(dòng)子和Shine-Dalgarno(SD)序列等表達(dá)調(diào)節(jié)序列進(jìn)行修飾等而實(shí)現(xiàn)。此外,通過修飾表達(dá)調(diào)節(jié)序列以外的非翻譯區(qū)域，亦可使基因的表達(dá)量變低。而且，可將包括染色體 上基因前后序列在內(nèi)的基因整體缺失。此外，亦可通過基因重組，在染色體上編碼fadR的區(qū)域中導(dǎo)入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)、以及導(dǎo)入終止密碼子(無義突變)或?qū)胩砑?、缺失I 2 個(gè)堿基的移碼突變而實(shí)現(xiàn)(Wang, J. P.等 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :9405-9410 ；Winkler, ff. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9 :594-602 ；Qiu, Z.和 Goodman, M. F. 1997.J. Biol. Chem. 272 :8611-8617 ；Wente, S. R.和 Schachman, Η. K. 1991. J. Biol. Chem. 266 20833-20839)。優(yōu)選的是，利用同源重組，使染色體上基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子區(qū)域、編碼區(qū)域、或者非編碼區(qū)域的一部分或全部缺損，或在這些區(qū)域中插入其他的序列，而使細(xì)胞內(nèi)fadR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性降低。然而，亦可通過用X射線或紫外線照射、或者N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍等誘變劑的常規(guī)誘變處理而修飾，只要所述修飾使得轉(zhuǎn)錄抑制活性降低。對于表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾，優(yōu)選為I個(gè)堿基以上，更優(yōu)選2個(gè)堿基以上，特別優(yōu)選3個(gè)堿基以上。此外，在缺失編碼區(qū)域時(shí)，只要產(chǎn)生的FadR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)能降低或缺失，缺失的區(qū)域可為N末端區(qū)域、內(nèi)部區(qū)域、C末端區(qū)域中任一區(qū)域，優(yōu)選是含有DNA結(jié)合域的區(qū)域，亦可為全部編碼區(qū)域。通常，缺失的區(qū)域越長越可有把握地使基因失活。而且，優(yōu)選缺失的區(qū)域上游和下游的閱讀框不一致。在編碼區(qū)域中插入其他序列時(shí)，可以在基因的任何區(qū)域；缺失的區(qū)域越長，越可有把握地使編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因失活。優(yōu)選的是，插入部位前后的序列閱讀框不一致。作為其他的序列，只要使轉(zhuǎn)錄因子機(jī)能降低或缺損即可，沒有特別的限制，可例舉搭載抗生素抗性基因和對L-氨基酸生產(chǎn)有用的基因的轉(zhuǎn)座子。如上所述對染色體上的基因的修飾，例如，可通過下述方法實(shí)現(xiàn)制備基因部分序列缺失從而不產(chǎn)生具有正常機(jī)能的酶蛋白質(zhì)的缺失型基因，用含該基因的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，使缺陷型基因和染色體上的基因發(fā)生同源重組，從而使得缺陷型基因置換染色體上的基因。由缺失型基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，即使生成，也具有與野生型轉(zhuǎn)錄因子相異的立體結(jié)構(gòu)，從而機(jī)能降低或消失。這樣利用同源重組進(jìn)行基因置換的基因破壞，可通過Red驅(qū)動(dòng)整合(Red-driven integration)法、Red驅(qū)動(dòng)整合法和來自λ卩遼菌體的切出系統(tǒng)組合方法等使用直鏈DNA的方法、使用含溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒和可接合傳遞的質(zhì)粒的方法以及利用在宿主內(nèi)不攜帶復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體(suicide vector)的方法(美國專利第6303383號(hào)、或特開平05-007491號(hào))等進(jìn)行。fadR基因的表達(dá)減弱可通過Northern印跡、RT-PCR等確認(rèn)，fadR基因缺損可通過Southern印跡確認(rèn)(Sambrook, J.和Russell,D. W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring HarborLaboratory Press, New York)。上述關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子活性減弱的描述，亦適用于前述其他酶的“活性減弱”或其他基因的“破壞”。在本發(fā)明中所謂“fadL基因”，意為這樣的基因，其編碼見于腸桿菌科細(xì)菌、具有攝入長鏈脂肪酸能力的外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。(Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268 15469-15476 ；Stenberg, F. et al.2005. J. Biol. Chem. 280 :34409-34419)。由于fadL基因表達(dá)增強(qiáng)而導(dǎo)致的fadL活性增強(qiáng)，可以通過對fadL基因增強(qiáng)前的細(xì)菌和增強(qiáng)后的細(xì)菌的長鏈脂肪酸攝入活性進(jìn)行比較來加以確認(rèn)。舉例而言，對于油酸 攝入活性，可依照例如 Kumar 和 Black 的方法(Kumar, G. B.和 Black, P. N. 1993. J. Biol.Chem. 268 :15469-15476)來進(jìn)行測定。測定可以這樣進(jìn)行將在培養(yǎng)后收集的細(xì)胞與3H標(biāo)記的油酸反應(yīng)，洗凈后，比較攝入的放射線量。攝入活性以相對于細(xì)胞總蛋白質(zhì)一分鐘時(shí)間內(nèi)攝入的3H油酸量(nM)表示。與親本株比較，期望攝入活性提高優(yōu)選I. 5倍以上、較優(yōu)選2倍以上，更優(yōu)選3倍以上。可以測定FadL與長鏈脂肪酸的結(jié)合活性，也可以通過Western印跡等方法確認(rèn) FadL 蛋白質(zhì)的表達(dá)(Kumar, G. B.和 Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268 15469-15476)。此外，可通過 Northern 印跡、RT-PCR 等(Sambrook, J.和 Russell,D. W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring HarborLaboratory Press, New York)確認(rèn) fadL 基因的 mRNA 量的增加。就編碼FadL的基因而言，具體地說，大腸桿菌的fadL基因的例子包括位于大腸桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)堿基編號(hào)2459322 2460668的位置、具有SEQID NO :3所示堿基序列的基因。SEQ IDNO :4顯示編碼該基因的氨基酸序列。在本發(fā)明中所謂“fadD基因”，意為這樣的基因，其編碼見于腸桿菌科細(xì)菌、催化從長鏈脂肪酸生成脂酰-輔酶A的脂酰-輔酶A合成酶(faty acyl-CoA synthetase)活性、同時(shí)將其透過內(nèi)膜攝入的酶(Dirusso, C.C.和 Black，P. N. 2004. J. Biol. Chem. 279 49563-49566 ；SchmeIter,T.et al.2004.J. Biol. Chem. 279 :24163-24170)。脂酰-Cok合成酶活性指具有下列反應(yīng)(EC 6. 2. I. 3)的催化活性輔酶A+脂肪酸+ATP =酰基輔酶A+ 二磷酸+AMP由于fadD基因表達(dá)增強(qiáng)而導(dǎo)致的FadD活性增強(qiáng)，可以通過比較fadD基因增強(qiáng)前的微生物與fadD基因增強(qiáng)后的微生物的長鏈脂肪酸攝入活性進(jìn)行比較來加以確認(rèn)。舉例而言，油酸的攝入活性可依照例如Schmelter等的方法(Schme I ter, T.等· 2004.J. Biol. Chem. 279 =24163-24170)來測定?？赏ㄟ^從在培養(yǎng)后收集的細(xì)胞，制備內(nèi)膜的囊泡(vesicle),捕獲(trap) ATP和輔酶A (coenzyme A)后,添加3H油酸,洗凈后比較攝入的放射線量而測定。攝入活性，以相對于細(xì)胞總蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)攝入的3H油酸量(nM)來表示。與親本株比較，期望攝入活性提高優(yōu)選I. 5倍以上，較優(yōu)選2倍以上，更優(yōu)選3倍以上?？蓽y定針對長鏈脂肪酸的脂肪酰-輔酶A合成酶活性的增加，亦可通過Western印跡等方法確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。此外,亦可通過Northern印跡、RT-PCR等確認(rèn)fadD基因的mRNA量的增加。關(guān)于編碼FadD的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的fadD基因?yàn)槔?，包括例如位于大腸桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)1887770 1886085(互補(bǔ)鏈)的位置，具有SEQ ID NO :5所示堿基序列的基因。SEQ ID NO :6顯示了編碼該基因的氨基酸序列。在本發(fā)明中，所謂“fadE基因”，意為這樣的基因，其編碼見于腸桿菌科細(xì)菌、催化氧化脂酰-輔酶A的?；?輔酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase)活性的酶(O' Brien,ff. J.和 Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132 :532-540 ；Campbell, J. W.和 Cronan,J. E. 2002. J. Bacteriol. 184 :3759-3764)。?；?輔酶A脫氫酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC1. 3. 99. 3)的活性。?；o酶A+FAD = FADH2+ Δ 2_烯酰輔酶A 由fadE基因表達(dá)增強(qiáng)而導(dǎo)致的FadE活性的增強(qiáng)，可以通過對fadE增強(qiáng)前的細(xì)菌與增強(qiáng)后的細(xì)菌酰-輔酶A氧化活性進(jìn)行比較來加以確認(rèn)。舉例而言，油酰輔酶A的氧化活性可依照例如Brien和Frerman的方法(O' Brien, ff. J.和Frerman, F. E. 1977.J. Bacteriol. 132 =532-540)來測定。活性測定，可通過從培養(yǎng)后收集的細(xì)胞制備粗酶提取液，添加含MTT (3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基四唑氫溴酸鹽)和油酰輔酶A的反應(yīng)液，根據(jù)546nm處的濁度測定還原的MTT的量。?；?輔酶A脫氫酶活性用相對于粗酶提取液蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)氧化的油酰輔酶A量(nM)來表示。與親本株比較，期望FadE活性提高優(yōu)選I. 5倍以上，較優(yōu)選2倍以上，更優(yōu)選3倍以上。亦可通過Western印跡等方法確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。此外,亦可通過Northern印跡、RT-PCR等確認(rèn)fadE基因的mRNA量的增加。關(guān)于編碼FadE的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的fadE基因?yàn)槔?，包括位于大腸桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)243303 240859(互補(bǔ)鏈)，具有SEQ ID NO :7所示堿基序列的基因。SEQ ID NO :8顯示了編碼該基因的氨基酸序列。在本發(fā)明中所謂“fadB基因”，意為這樣的基因，其編碼見于腸桿菌科細(xì)菌、作為脂肪酸氧化復(fù)合體(fatty acid oxidation complex)的α部分、且催化烯酰輔酶 A 水合酶(enoyl-CoA hydratase)、3_ 輕基酸基輔酶 A 脫氧酶(3-hydroxyacyI-CoAdehydrogenase)、3_ 輕基酸基輔酶 A 差向異構(gòu)酶(3-hydroxyacyI-CoA epimerase)、Δ 3_ 順-Δ 2_ 反-烯酸輔酶 A 異構(gòu)酶(Δ 3_cis_ Δ 2-trans-enoyl-CoA isomerase)四種活性的酶(Pramanik, A.等 1979. J. Bacteriol. 137 :469-473 ；Yang, S. Y. and Schulz, Η. 1983.J. Biol. Chem. 258 :9780-9785)。烯酰輔酶A水合酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC4. 2. I. 17)的活性H2O+反-2-烯酰輔酶A = L-3-羥基?；o酶A3-羥基?；o酶A脫氫酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC I. I. I. 35)的活性NAD++L-3-羥基?；o酶A = NADH+3-酮酰輔酶A3-羥基?；o酶A差向異構(gòu)酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC 5. I. 2. 3)的活性D-3-羥基?；o酶A = L-3-羥基?；o酶AΛ 3-順-Λ 2-反-烯酰輔酶A異構(gòu)酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC 5. 3. 3. 8)的活性
順-3-烯酰輔酶A =反-2-烯酰輔酶A由fadB基因表達(dá)增強(qiáng)導(dǎo)致的FadB活性增強(qiáng)，可通過例如對fadB增強(qiáng)前的細(xì)菌與增強(qiáng)后的細(xì)菌巴豆酰輔酶A (crotonyl-CoA)水合活性和乙酰乙酰輔酶A的還原活性進(jìn)行比較來加以確認(rèn)。FadB的四種活性可依照例如Binstock和Schulz的方法(Binstock, J. F.和Schulz, H. 1981. Methods EnzymoI. 71 (Pt C) :403-411)來測定。烯酰輔酶A水合酶活性的測定可通過例如下述方式進(jìn)行從培養(yǎng)后收集的細(xì)胞制備粗酶提取液，添加含巴豆酰輔酶A的反應(yīng)液， 根據(jù)263nm處濁度測定水合的巴豆酰輔酶A的量。烯酰輔酶A水合酶活性用相對于粗酶提取液蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)巴豆酰輔酶A的水合量(nM)來表示。此外，3-羥基酰基輔酶A脫氫酶活性的測定可通過下述方式進(jìn)行從培養(yǎng)后收集的細(xì)胞制備粗酶提取液，添加含乙酰乙酰輔酶A和NADH的反應(yīng)液，根據(jù)340nm處濁度測定脫氫的NADH的量。3-羥基?；o酶A脫氫酶活性用相對于粗酶提取液蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)NADH的氧化量(nM)來表示。與親本株比較，期望FadB活性提高優(yōu)選I. 5倍以上，較優(yōu)選2倍以上，更優(yōu)選3倍以上。亦可通過Western印跡等方法確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。此外,亦可通過Northern印跡、RT-PCR等確認(rèn)fadB基因的mRNA量的增加。作為編碼FadB的基因的實(shí)例，以大腸桿菌的fadB基因?yàn)槔?，包括例如位于大腸桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)4028994 4026805 (互補(bǔ)鏈)的位置、具有SEQ ID NO :9所示堿基序列的基因。SEQ ID NO :10顯示了該基因編碼的氨基酸序列。在本發(fā)明中，所謂“fadA基因”，意為這樣的基因，其編碼見于腸桿菌科細(xì)菌、作為脂肪酸氧化復(fù)合體的β部分、且催化3-酮酰輔酶A硫解酶(3-ketoacyl-CoA thiolase)活性的酶(Pramanik, A.等 1979. J. Bacteriol. 137 :469-473)。3-酮酰輔酶A硫解酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC 2. 3. I. 16)活性。3-酮酰輔酶A+輔酶A =酰基輔酶A+乙酰輔酶A由于fadA基因表達(dá)增強(qiáng)導(dǎo)致的FadA活性增強(qiáng)，可以通過例如對fadA增強(qiáng)前的細(xì)菌與增強(qiáng)后細(xì)菌的乙酰乙酰輔酶A硫解酶活性進(jìn)行比較來加以確認(rèn)。FadA活性，舉例而言，可依照例如 Binstock 和 Schulz 的方法(Binstock, J. F.和 Schulz, H. 1981. MethodsEnzyrmoI. 71 (Pt C) :403-411)來測定。3-酮酰輔酶A硫解酶活性的測定可通過例如下述方式進(jìn)行從培養(yǎng)后收集的細(xì)胞制備粗酶提取液，添加含乙酰乙酰輔酶A、鎂鹽和輔酶A的反應(yīng)液，根據(jù)303nm處濁度測定作為底物的鎂離子與烯醇酸復(fù)合體減少的量來進(jìn)行。3-酮酰輔酶A硫解酶活性用相對于粗酶提取液蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)乙酰乙酰輔酶A的減少量(nM)來表示。與親本株比較，期望FadA活性提高優(yōu)選I. 5倍以上,較優(yōu)選2倍以上,更優(yōu)選3倍以上。亦可通過Western印跡等方法確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。此外,亦可通過Northern印跡、RT-PCR等確認(rèn)fadA基因的mRNA量的增加。作為編碼FadA的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的fadA基因?yàn)槔ù竽c桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)4026795 4025632 (互補(bǔ)鏈)的位置上具有SEQ ID NO: 11所示堿基序列的基因。SEQ ID NO :12顯示了該基因編碼的氨基酸序列。對于腸桿菌科細(xì)菌的脂肪酸氧化復(fù)合體而言，已知FadB和FadA形成復(fù)合體，且其基因亦形成 fadBA 操縱子(Yang, S. Y.等 1990. J. Biol. Chem. 265 :10424-10429)。因而，亦可擴(kuò)增整個(gè)fadBA操縱子。在本發(fā)明中，所謂“cyoABCDE”，是編碼見于腸桿菌科細(xì)菌的末端氧化酶中的一
種-細(xì)胞色素bo型氧化酶復(fù)合體(cytochrome bo terminal oxidase complex)中
的各個(gè)亞基的一群基因，其中cyoB是編碼亞基I的基因、cyoA是編碼亞基II的基因、cyoC是編碼亞基III的基因、cyoC是編碼亞基IV的基因、cyoE是編碼催化血紅素O合酶(heme O synthase)活性的酶的基因(Gennis, R. B.和 Stewart, V. 1996. p. 217-261.In F. D. Neidhardt (編)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition,American Society for Microbiology Press,Washington,D. C ； Chepuri 等 1990. J. Biol. Chem. 265 :11185-11192)。細(xì)胞色素bo型氧化酶復(fù)合體的末端氧化酶(terminal oxidase),是指下述反應(yīng)(ECI. 10. 2.-以及I. 10. 3. _)，用從泛醇(ubiquinol)接受的電子將氧還原的活性，以及每I個(gè)電子排除2個(gè)質(zhì)子的作為質(zhì)子泵的機(jī)能(Puustinen, A.等1991. Biochemistry 30 3936-3942)。2 泛醇 +02+4H+ = 2 泛醌 +2H20+4H+由于cyoAB⑶E基因表達(dá)增強(qiáng)而導(dǎo)致的末端氧化酶活性增強(qiáng)，可以通過，例如，對增強(qiáng)前的微生物與增強(qiáng)后微生物的泛醇氧化酶活性進(jìn)行比較來加以確認(rèn)。泛醇氧化酶活性可依照例如 Kita 等的方法(Kita, K.等 1986. Methods Enzymol. 126 :94-113)來測定。可從培養(yǎng)后收集的細(xì)胞制備粗酶提取液，添加含泛醇的反應(yīng)液，通過氧電極測定同樣作為底物的氧的減少量。泛醇氧化酶活性用相對于粗酶提取液蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)泛醇的減少量(PM)來表示。與親本株比較，期望泛醇氧化酶活性提高優(yōu)選I. 5倍以上，較優(yōu)選2倍以上，更優(yōu)選3倍以上。亦可通過Western印跡等方法確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。此外,亦可通過Northern印跡、RT-PCR等確認(rèn)各基因的mRNA量的增加。作為編碼C1Ok的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的cyoA基因?yàn)槔?，包括位于大腸桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)450834 449887 (互補(bǔ)鏈)、具有SEQ ID NO : 13所示堿基序列的基因。SEQ IDNO :14顯示了該基因編碼的氨基酸序列。作為編碼cyoB的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的cyoB基因?yàn)槔砂ɡ缥挥诖竽c桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)449865 447874 (互補(bǔ)鏈)、具有SEQ ID NO : 15所示堿基序列的基因。SEQ IDNO :16顯示了該基因編碼的氨基酸序列。作為編碼cyoC的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的cyoC基因?yàn)槔砂ɡ缥挥诖竽c桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)447884 447270 (互補(bǔ)鏈)、具有SEQ ID NO : 17所示堿基序列的基因。SEQ IDNO :18顯示了該基因編碼的氨基酸序列。作為編碼cyoD的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的cyoD基因?yàn)槔砂ɡ缥挥诖竽c桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)447270 446941 (互補(bǔ)鏈)、具有SEQ ID NO : 19所示堿基序列的基因。SEQ IDNO :20顯示了該基因編碼的氨基酸序列。作為編碼cyoE的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的cyoE基因?yàn)槔砂ɡ缥挥诖竽c桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)446929 446039 (互補(bǔ)鏈)，具有SEQ ID NO :21所示堿基序列的基因。SEQ IDNO :22顯示了該基因編碼的氨基酸序列。在本發(fā)明中所謂“fadj基因”，意為這樣的基因，其與fadj基因具有同源性，編碼作為在厭氧和有氧條件下有功能的脂肪酸氧化復(fù)合體的α部分(CampbelI，J.W.等2003.Mol. Microbiol. 47 (3) :793-805)、催化烯酰輔酶A水合酶、3-羥基?；o酶A脫氫酶、3-羥基?；o酶A差向異構(gòu)酶、Δ 3-順-Δ 2-反-烯酰輔酶A異構(gòu)酶四種活性的酶(Pramanik,A.等 1979. J. Bacteriol. 137 :469-473 ；Yang, S. Y.和 Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258 9780-9785)。烯酰輔酶A水合酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC 4. 2. I. 17)的活性H2O+反-2-烯酰輔酶A = L-3-羥基?；o酶A3-羥基酰基輔酶A脫氫酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC I. I. I. 35)的活性NAD++L-3-羥基?；o酶A = NADH+3-酮酰輔酶A3-羥基酰基輔酶A差向異構(gòu)酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC 5. I. 2. 3)的活性D-3-羥基?；o酶A = L-3-羥基?；o酶AΛ 3-順-Λ 2-反-烯酰輔酶A異構(gòu)酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC 5. 3. 3. 8)的活性順-3-烯酰輔酶A =反-2-烯酰輔酶A由于fadj基因表達(dá)增強(qiáng)而導(dǎo)致的FadJ活性增強(qiáng)，可以通過例如對fadj增強(qiáng)前的細(xì)菌與增強(qiáng)后的細(xì)菌巴豆酰輔酶A水合活性和乙酰乙酰輔酶A的還原活性進(jìn)行比較來加以確認(rèn)。FadJ的四種活性可依照例如Binstock和Schulz的方法(Binstock, J. F.和Schulz,H. 1981. Methods EnzymoI. 71 (Pt C) :403-411)來測定。烯酰輔酶A水合酶活性的測定可通過例如下述方式進(jìn)行從培養(yǎng)后收集的細(xì)胞制備粗酶提取液，添加含巴豆酰輔酶A的反應(yīng)液，根據(jù)263nm處的濁度測定水合的巴豆酰輔酶A的量。烯酰輔酶A水合酶活性用相對于粗酶提取液蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)巴豆酰輔酶A的水合量(nM)來表示。此外，3-羥基?；o酶A脫氫酶活性的測定，可通過從培養(yǎng)后收集的細(xì)胞制備粗酶提取液，添加含乙酰乙酰輔酶A和NADH的反應(yīng)液，根據(jù)340nm處濁度測定脫氫的NADH的量來進(jìn)行。3-羥基酰基輔酶A脫氫酶活性用相對于粗酶提取液蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)NADH的氧化量(nM)來表示。與親本株比較，期望FadJ活性提高優(yōu)選I. 5倍以上，較優(yōu)選2倍以上，更優(yōu)選3倍以上。亦可通過Western印跡等方法確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。此外,亦可通過Northern印跡、RT-PCR等確認(rèn)fadj基因mRNA量的增加。作為編碼FadJ的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的fadj基因?yàn)槔?，包括例如位于大腸桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)2457181 2455037 (互補(bǔ)鏈)的位置，具有SEQ ID NO :37所示堿基序列的基因。SEQ ID NO :38顯示了該基因編碼的氨基酸序列。在本發(fā)明中，所謂“fadl基因”，是指這樣的基因，其與fadA基因有同源性，編碼作為在厭氧條件和有氧條件下有功能的脂肪酸氧化復(fù)合體的β部分(Campbell，J. ff.等2003. Mol. Microbiol. 47 (3) :793-805)、催化 3-酮酰輔酶 A 硫解酶活性的酶(Pramanik,A.等 1979.J. Bacteriol. 137 :469-473)。3-酮酰輔酶A硫解酶活性是指催化下述反應(yīng)(EC 2. 3. I. 16)活性。3-酮酰輔酶A+輔酶A =酰輔酶A+乙酰輔酶A由于fadl基因表達(dá)增強(qiáng)而導(dǎo)致的FadI活性增強(qiáng)，可以通過例如對fadl增強(qiáng)前的細(xì)菌與增強(qiáng)后細(xì)菌的乙酰乙酰輔酶A硫解活性進(jìn)行比較來加以確認(rèn)。FadI活性，舉例而言，可依照，例如，Binstock 和 Schulz 的方法(Binstock, J. F.和 Schulz, H. 1981. MethodsEnzymoI. 71 (Pt C) :403-411)來測定。3-酮酰輔酶A硫解酶活性的測定可通過例如下述方式進(jìn)行從培養(yǎng)后收集的細(xì)胞制備粗酶提取液，添加含乙酰乙酰輔酶A、鎂鹽和輔酶A的反應(yīng)液，根據(jù)303nm處濁度測定作 為底物的鎂離子與烯醇酸復(fù)合體減少的量。3-酮酰輔酶A硫解酶活性用相對于粗酶提取液蛋白質(zhì)在一分鐘時(shí)間內(nèi)乙酰乙酰輔酶A的減少量(nM)來表示。與親本株比較，期望FadI活性提高優(yōu)選I. 5倍以上,較優(yōu)選2倍以上,更優(yōu)選3倍以上。亦可通過Western印跡等方法確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。此外，亦可通過Northern印跡、RT-PCR等確認(rèn)fadl基因mRNA量的增加。作為編碼FadI的基因的具體實(shí)例，以大腸桿菌的fadl基因?yàn)槔?，包括例如位于大腸桿菌基因組序列(Genbank登錄編號(hào)U00096)的堿基編號(hào)2458491 2457181 (互補(bǔ)鏈)、具有SEQ ID NO :39所示堿基序列的基因。SEQID NO :40顯示了該基因編碼的氨基酸序列。就見于腸桿菌科細(xì)菌的脂肪酸氧化復(fù)合體而言，F(xiàn)adI和FadJ形成復(fù)合體，且其基因亦形成 fadlJ 操縱子(Yang, S. Y.等 1990. J. Biol. Chem. 265 =10424-10429)。因而，亦可擴(kuò)增整個(gè)fadlJ操縱子。就所述fadR基因、fadL基因、fadE基因、fadD基因、fadB基因、fadA基因、cyoA、cyoB、cyoC、cyoD、cyoE基因、fadj基因、fadl基因(下面總稱為本發(fā)明的基因)而言，只要無損于其編碼的蛋白質(zhì)活性(即機(jī)能)，亦可使用這些基因的同源物和人工修飾物等具有保守突變的基因。具體地說，可以是這樣的基因，其編碼具有通過在公知蛋白質(zhì)的氨基酸序列或野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO :2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，38，40)中I或數(shù)個(gè)位置上取代、缺失、插入或添加I個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的保守變體。在本文中，所謂I個(gè)或者數(shù)個(gè)根據(jù)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)立體構(gòu)造中的位置和種類而不同，但優(yōu)選I 20個(gè)，較優(yōu)選I 10個(gè)，特別優(yōu)選I 5個(gè)。這樣的變體，只要保持各蛋白質(zhì)的機(jī)能，可與SEQ ID NO :2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，38，或40的氨基酸序列具有80%以上，優(yōu)選90%以上，較優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選98%以上的同一性(identity)。上述保守突變的代表是保守取代。所謂保守取代，為當(dāng)取代部位是芳香族氨基酸時(shí)，是在Phe、Trp、Tyr間，當(dāng)取代部位是疏水性氨基酸時(shí)，是在Leu、lie、Val間相互取代的突變，當(dāng)取代部位是極性氨基酸時(shí)，是在Gin、Asn間相互取代的突變，當(dāng)取代部位是堿性氨基酸時(shí)，是在Lys、Arg、His間相互取代的突變，當(dāng)取代部位是酸性氨基酸時(shí)，是在Asp、Glu間相互取代的突變，當(dāng)取代部位是攜帶羥基的氨基酸時(shí)，是在Ser、Thr間相互取代的突變。更具體而言，可例舉Ala到Ser或Thr的取代,Arg到GlruHis或Lys的取代,Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，Asp到AsruGlu或Gln的取代，Cys到Ser或Ala的取代，Gln 到 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 的取代，Glu 到 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 的取代，Gly 到 Pro 的取代，His 到 Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 的取代，Ile 到 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代，Leu 到 lie、Met、Val 或 Phe 的取代，Lys 到 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 的取代，Met 到Ile、Leu、Val 或 Phe 的取代，Phe 到 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 的取代，Ser 到 Thr 或 Ala 的取代，Thr到Ser或Ala的取代，Trp到Phe或Tyr的取代,Tyr到His、Phe或Trp的取代以及Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸取代、缺失、插入、附加或倒位等亦包括基于攜帶本發(fā)明基因的微生物的個(gè)體差異，以及種間差異等天然產(chǎn)生的突變(突變體或變體)而產(chǎn)生的取代、缺失、插入、附加或倒位。此外，可以用易于本發(fā)明的基因要分別導(dǎo)入的宿主使用的密碼子來取代。同樣，就本發(fā)明的基因而言，其編碼的蛋白質(zhì)的N末端和/或C末端可以延長或削截，只要有功能即可。舉例而言，延長的長度為氨基酸殘基50個(gè)以下，優(yōu)選20個(gè)以下，較優(yōu)選10個(gè)以下，特別優(yōu)選5個(gè)以下。如上所述保守的變體的編碼基因，例如，通過位置特異性的誘變法，可對編碼的蛋 白質(zhì)的喊基序列修飾使得特定部位包含氣基酸殘基的取代、缺失、摘入或添加而獲得。此夕卜，亦可由向來已知的突變處理來獲得。作為突變處理，可例舉將本發(fā)明的基因用羥胺等體外處理的方法，以及將攜帶該基因的微生物，例如埃希氏菌屬的細(xì)菌，用紫外線或N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍或者こ基甲磺酸(EMS)等作為常規(guī)突變處理使用的誘變劑處理的方法。此外，對于如上所述氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位等，亦包括基于攜帶本發(fā)明基因的微生物的個(gè)體差異，種的不同等情況天然產(chǎn)生的突變(突變體或變體)所產(chǎn)生的氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位等。這些基因是否編碼FadL、FadE, FadD, FadB, FadA或細(xì)胞色素bo型氧化酶復(fù)合體可通過，例如，將這些基因?qū)胛⑸?，并測定各蛋白質(zhì)的活性來加以確認(rèn)。本發(fā)明的基因可為具有上述堿基序列(SEQ ID NO : 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，37，39)的DNA，或可與從具有這些堿基序列的DNA制備探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼FadL、FadE> FadD> FadB> FadA> FadJ> FadI 或細(xì)胞色素 bo 型氧化酶復(fù)合體的 DNA。在本文中，所謂“嚴(yán)格條件”，是指形成所謂特異性雜交體而不形成非特異性的雜交體的條件。將該條件明確的數(shù)值化是困難的，但舉一例，具有高同源性的DNA之間，例如，具有80 %以上，較優(yōu)選90 %以上，特別優(yōu)選95 %以上同源性的DNA之間發(fā)生雜交，而低于此同源性的DNA之間不發(fā)生雜交的條件，或者，可例舉相當(dāng)于通常Southern雜交的洗滌條件，即 60°C、1XSSC、0. I % SDS,優(yōu)選 O. I XSSC,O. I % SDS,更優(yōu)選 68°C>O. I XSSC,O. I %SDS的鹽濃度和溫度下，洗滌I次，較優(yōu)選2 3次的條件。而且，在本說明書中，“同源性，，(homology)可以指“同一性，，(identity)。 探針可具有本發(fā)明基因的一部分序列。這樣的探針可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，以基于各個(gè)基因的堿基序列制備的寡核苷酸作為引物，以含有各個(gè)基因的DNA片段作為模板通過PCR反應(yīng)來制備。而且，對探針使用長300bp左右的DNA片段吋，作為按照上述條件雜交后洗滌的條件，可例舉50°C、2XSSC、0. 1% SDS0涉及上述保守變體的描述，亦適用就前述L-氨基酸生產(chǎn)能力的賦予所記述的酶和基因。
如上所述為了增強(qiáng)本發(fā)明基因表達(dá)而進(jìn)行的修飾，可以使用與就L-氨基酸生產(chǎn)能力的賦予所記述的增強(qiáng)基因表達(dá)的方法同樣的方法來實(shí)施。本發(fā)明的基因可以攜帶其的微生物染色體DNA作為模板通過PCR法獲取。舉例而言，大腸桿菌的fadL基因可用基于SEQ ID NO :3的堿基序列制備的引物，例如SEQ ID NO :25、26所示的引物，通過以大腸桿菌染色體DNA為模板的PCR法(polymerase chain reaction)法(參照 White, T. J.等 1989. Trends Genet. 5 :185-189)獲取。大腸桿菌的fadD基因可用基于SEQ ID NO :5的堿基序列制備的引物，例如SEQ IDNO 27,28所示的引物，通過以大腸桿菌染色體DNA為模板的PCR獲取。大腸桿菌的fadE基因，可用基于SEQ ID NO 7的堿基序列制備的引物，例如SEQID NO 29,30所示的引物，通過以大腸桿菌染色體DNA為模板的PCR獲取。大腸桿菌的fadB基因，可用基于SEQ ID NO 9的堿基序列制備的引物，例如SEQID NO :31、32所示的引物，通過以大腸桿菌染色體DNA為模板的PCR獲取。大腸桿菌的fadA基因，可用基于SEQ ID NO 11的堿基序列制備的引物，例如SEQID NO 33,34所示的引物，通過以大腸桿菌染色體DNA為模板的PCR獲取。大腸桿菌的fadBA操縱子，可用基于SEQ ID NO 9和11的堿基序列制備的引物，例如SEQ ID NO :35、36所示的引物，通過以大腸桿菌染色體DNA為模板的PCR獲取。此外，大腸桿菌的cyoAB⑶E基因，可用基于SEQ ID NO 13和21的堿基序列制備的引物，例如SEQ ID NO :37、38所示的引物，通過以大腸桿菌染色體DNA為模板的PCR獲取。大腸桿菌的fadlj操縱子，可用基于SEQ ID NO 37和39的堿基序列制備的引物，例如SEQ ID NO :41、42所示的引物，通過以大腸桿菌染色體DNA為模板的PCR獲取。來自其他微生物的本發(fā)明基因亦可通過將基于上述各個(gè)基因的序列信息以及該微生物中公知的基因或蛋白質(zhì)的序列信息而制備的寡核苷酸作為引物的PCR法，或?qū)⒒谇笆鲂蛄行畔⒍苽涞墓押塑账嶙鳛樘结樀碾s交法，從微生物的染色體DNA或染色體DNA文庫獲取。此外，染色體DNA可通過，例如，齋藤和三浦的方法(Saito，H.和Miura，K. I. 1963. Biochem. Biophys. Acta，72，619-629 ;參照《生物工程實(shí)驗(yàn)書》，日本生物工學(xué)會(huì)編，97 98頁，培風(fēng)館，1992年)等來從DNA供體微生物制備。本發(fā)明基因(fadL、fadE、fadD、fadB、fadA、cyoA、cyoB、cyoC、cyoD、cyoE、fadj、fadl)以及L-氨基酸生物合成系基因表達(dá)的增強(qiáng)，可利用如上所述的方法，通過轉(zhuǎn)化或同源重組提高本發(fā)明基因的拷貝數(shù)，修飾本發(fā)明基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列等方法來實(shí)現(xiàn)。此外，本發(fā)明基因表達(dá)的增強(qiáng)，亦可通過對可提高本發(fā)明基因表達(dá)的激活子進(jìn)行擴(kuò)增，和/或?qū)山档捅景l(fā)明基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)子進(jìn)行缺失或弱化來實(shí)現(xiàn)。下面，就增強(qiáng)基因表達(dá)的方法加以說明。第一種方法，是提高目的基因拷貝數(shù)的方法。舉例而言，將目的基因克隆到合適的載體上，用所得載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌，可使該基因拷貝數(shù)提高。轉(zhuǎn)化用的載體可例舉在適用的微生物中可自主復(fù)制的質(zhì)粒。舉例而言，作為在屬于腸桿菌科細(xì)菌的微生物中可自主復(fù)制的質(zhì)粒，可例舉PUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29 (pHSG、pSTV 可得自 TakaraBio 公司)、、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW 可得自 Nippongene 公司)。而且，亦可使用噬菌體DNA代替質(zhì)粒作為載體。轉(zhuǎn)化法包括，例如，用氯化鈣處理受體細(xì)菌增加DNA透過性的方法，如據(jù)報(bào)道用于大腸桿菌 K-12 的(Mandel, M.和 Higa，A. J. Mol. Biol. 1970,53 :159-162)、從增殖階段的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞而導(dǎo)入DNA的方法，如據(jù)報(bào)道用于枯草桿菌的(Duncan，C. H. ,Wilson,G. A.和Young，F(xiàn). E. 1997. Gene 1:153-167)。或者，亦可應(yīng)用將DNA受體細(xì)胞變?yōu)槿菀讛z入重組DNA的原生質(zhì)體(protoplast)或球狀體(spheroplast)狀態(tài)而將重組DNA導(dǎo)入DNA受體的方法，如已知用于枯草桿菌、放線菌類和酵母的(Chang，S.和Choen，S. N. 1979.Mol. Gen. Genet. 168 111-115 ；Bibb, M. J. , Ward, J. M.和 Hopwood, 0. A. 1978. Nature274 :398-400 ；Hinnen, A.，Hicks, J. B.和 Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 1929-1933)。此外，亦可通過電脈沖法(特開平2-207791號(hào)公報(bào))進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化?；蚩截悢?shù)的提高亦可通過向微生物染色體DNA上導(dǎo)入目的基因的多個(gè)拷貝而實(shí)現(xiàn)。向微生物染色體DNA上導(dǎo)入基因的多個(gè)拷貝，可利用在染色體DNA上存在多個(gè)拷貝 的序列作為目標(biāo)，通過同源重組法(Millerl, J. H. Experiments in Molecular Genetics,1972, Cold Spring Harbor Laboratory)來進(jìn)行。作為在染色體DNA上存在多個(gè)拷貝的序列，可利用重復(fù)(repetitive)DNA和轉(zhuǎn)座元件端部存在的反向重復(fù)序列(invertedrepeat)。或者，亦可如特開平2-109985號(hào)公報(bào)所公開的那樣，將目的基因搭載在轉(zhuǎn)座子上，使其轉(zhuǎn)移，從而在染色體DNA上導(dǎo)入多個(gè)拷貝。而且,亦可使用Mu噬菌體(特開平2-109985號(hào))將目的基因摻入宿主染色體。可通過將目的基因一部分作為探針，進(jìn)行Southern雜交來確認(rèn)該基因轉(zhuǎn)移到了染色體上。此外，在提高基因拷貝數(shù)時(shí)，只要能夠增強(qiáng)目的基因產(chǎn)物的活性，則對拷貝數(shù)并無特別的限制，在該微生物本來就具有目的基因吋，優(yōu)選為2個(gè)拷貝以上。此外，微生物本來不具有本發(fā)明基因吋，導(dǎo)入的基因拷貝數(shù)是I個(gè)亦可，2個(gè)以上亦可。第二種方法，是將染色體DNA上或質(zhì)粒上目的基因的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列用適當(dāng)強(qiáng)度的相應(yīng)序列取代，從而增強(qiáng)目的基因表達(dá)的方法。舉例而言，thr啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、pL啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子等是已知的常用啟動(dòng)子。啟動(dòng)子強(qiáng)度的評價(jià)法和強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例記載于Goldstein和Doi的論文(Goldstein, Μ. Α.和Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotecnnol. Annu. Rev.，1，105-128)等。此外，如在國際公開W000/18935中公開的，亦可向基因的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)霐?shù)個(gè)堿基的堿基取代，從而將其修飾為適當(dāng)強(qiáng)度的啟動(dòng)子。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的取代，例如，可與使用溫度敏感型質(zhì)粒的基因取代同樣的方法進(jìn)行。可在大腸桿菌和Pantoea ananatis中使用的具有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的載體包括例如WO 99/03988號(hào)國際公開小冊子所述的溫度感受性質(zhì)粒PMAN997及其衍生物等。此外，亦可通過使用λ噬菌體的Red重組酶，稱為“Red驅(qū)動(dòng)整合”的方法(Datsenko, K. A.和 Wanner, B. L. , 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 6640-6645)和Red驅(qū)動(dòng)整合法與來自入噬菌體的切出系統(tǒng)(Cho, E. H.，Gumport, R. I.，和Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184 :5200-5203)的組合方法(參照 W02005/010175 號(hào))等使用直鏈DNA的方法，進(jìn)行表達(dá)調(diào)節(jié)序列的取代。而且，表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾，可與如上所述提高基因拷貝數(shù)的方法組合使用。
而且，已知核糖體結(jié)合位置與起始密碼子之間的間隔區(qū)(spacer)，特別是緊鄰起始密碼子上游的序列中數(shù)個(gè)核苷酸的取代對mRNA的翻譯效率有非常大的影響，可通過修飾它們來提高翻譯量。對于編碼細(xì)胞色素bo型氧化酶的cyo操縱子(cyoABCDE)，可以個(gè)別地增強(qiáng)其編碼各個(gè)亞基的基因，亦可將它們作為多順反子(polycistron)同時(shí)增強(qiáng)。此外，用載體將基因?qū)胛⑸飼r(shí)，可以將編碼各個(gè) 亞基的基因裝載在單ー載體上，亦可將它們分別裝載在不同載體上。同樣，將基因插入到染色體中時(shí)，編碼各個(gè)亞基的基因既可同時(shí)插入染色體上同一部位，也可以各別插入不同的位置。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作更具體的說明。在實(shí)施例中，作為代表性的脂肪酸，使用油酸(C17H33COOH)的鈉鹽(Nacalai Tesque公司生產(chǎn))?！矊?shí)施例I〕構(gòu)建缺損fadR的大腸桿菌L-賴氨酸生產(chǎn)菌〈l-l>fadR基因缺損株的構(gòu)建調(diào)節(jié)大腸桿菌脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子FadR由fadR基因(SEQ ID N0:1)編碼(DiRusso, C.C.等 1992. J. Biol. Chem. 267 :8685-8691)。該基因破壞的親本株使用國際專利公報(bào)W02006/078039中記載的大腸桿菌L-賴氨酸生產(chǎn)株WC196 Λ cadA Λ I dcC株(AJl 10692 FERM BP-11027)。該株是在 WC196 株(FERM BP-5252)中破壞了 cadA 基因和IdcC基因而成的株。AJ110692株于2008年10月7日以保藏號(hào)FERM BP-11027基于布達(dá)佩斯條約國際保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(地址〒305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)。調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因fadR的缺失是借助由Datsenko和Wanner最初開發(fā)的稱為“Red區(qū)動(dòng)整合”的方法(Datsenko, K. A.和Wanner, B. L. 2000. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645)和來源于 λ 噬菌體的切出系統(tǒng)(Cho, E. H.，Gumport,R. I.和Gardner，J. F. 2002. J. Bacteriol. 184 :5200-5203)來進(jìn)行的。根據(jù)“Red驅(qū)動(dòng)整合”，可以使用5’側(cè)設(shè)計(jì)為目標(biāo)基因的一部分、3’側(cè)設(shè)計(jì)為抗生素抗性基因的一部分的合成寡核苷酸作為引物，使用所得的PCR產(chǎn)物ー步構(gòu)建基因破壞株。而且，通過與來源于λ噬菌體的切出系統(tǒng)組合使用，可從基因破壞株中去除摻入的抗生素抗性基因(特開2005-058227)。作為PCR 的模板，使用質(zhì)粒 pMW118-attL-kan_attR(特開 2005-058227)。pMW118-attL-kan-attR是在pMW118 (TakaraBio公司生產(chǎn))中插入了作為附著位點(diǎn)(attachment site)的attL和attR基因以及作為抗生素抗性基因的kan基因而得到的質(zhì)粒，插入順序是attL-kan-attR。使用SEQ ID NO :23和24所示的合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR，其中上述引物在3’末端具有對應(yīng)于該attL和attR兩端的序列，在5’末端具有對應(yīng)于作為目的基因的fadR基因一部分的序列。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖膠純化,通過電穿孔法(electroporation)將其導(dǎo)入含具有溫度敏感性復(fù)制能力的質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌AJl 10692株。質(zhì)粒pKD46 (Datsenko,K. A.和 Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645)包含 λ 噬菌體總計(jì)2154堿基的DNA片段(GenBank/EMBL登錄號(hào)J02459、第31088號(hào) 33241號(hào))，該片段包含由阿拉伯糖誘導(dǎo)性ParaB啟動(dòng)子控制的λ Red同源重組系統(tǒng)中的Red重組酶編碼的基因(Y > β > exo基因)。質(zhì)粒pKD46對于將PCR產(chǎn)物重組入AJ110692株而言是必須的。電穿孔用的感受態(tài)細(xì)胞如下所述制備。即，將在含100mg/L的氨芐青霉素(ampicillin)的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中30°C培養(yǎng)過夜的大腸桿菌WC196株，用含氨芐青霉素(100mg/L)和L-阿拉伯糖(IOmM)的5mL LB培養(yǎng)基稀釋100倍。使所得的稀釋物在30°C通氣條件下生長到0D600為約O. 6后，濃縮100倍，用10%甘油洗滌三次而使其可用于電穿孔。電穿孔用70μ L的感受態(tài)細(xì)胞和約IOOng的PCR產(chǎn)物進(jìn)行。向電穿孔后的細(xì)胞中添加ImL的SOC培養(yǎng)基(Sambrook，J.和Russell，D. W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring HarborLaboratory Press, New York), 37°C培養(yǎng) I 小時(shí)后，在 37°C在含 Km(卡那霉素)(40mg/L)的LB瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L、瓊脂15g/L)上平板培養(yǎng)，選擇Km抗性的重組體。接著，為了去除pKD40質(zhì)粒，在含Km的LB瓊脂培養(yǎng)基上，42V傳代兩次，測試所得菌落的氨芐青霉素抗性，獲得了脫落PKD46的氨芐青霉素敏感株。針對借助卡那霉素抗性基因可識(shí)別的突變體，通過PCR確認(rèn)了其fadR的缺失。將 所得的fadR缺損株命名為AJl 10692 Δ fadR: : att-kan株。接著，為了去除導(dǎo)入到fadR基因內(nèi)的att-kan基因，使用上述的輔助質(zhì)粒(helperplasmid) pMW-intxis-ts (特開 2005-058227)。pMW-intxis-ts 是攜帶了 λ 卩遼菌體的整合酶(integrase) (Int)的編碼基因和切離酶(excisionase) (Xis)的編碼基因，具有溫度敏感型復(fù)制能力的質(zhì)粒。遵循常規(guī)方法制備如上所述所得的AJ110692 Δ fadR: : att-kan株的感受態(tài)細(xì)胞，用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts轉(zhuǎn)化，于30°C在含100mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，選擇氨芐青霉素抗性株。接著，為了去除pMW-intxis-ts質(zhì)粒，在LB瓊脂培養(yǎng)基上，在42°C兩次傳代，測試所得菌落的氨芐青霉素抗性和卡那霉素抗性，獲得對卡那霉素和氨芐青霉素敏感的株，即att-kan和pMW-intxis-ts脫落的fadR破壞株。將該株命名為AJ110692 Δ fadR。<1-2>將賴氨酸生產(chǎn)用質(zhì)粒導(dǎo)入AJl 10692 Δ fadR株將41110692ムデ&(11 株用攜帶(1& 4、(1& 8、1780以及ddh基因的賴氨酸生產(chǎn)用質(zhì)粒PCABD2 (W095/16042)按照常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到 AJl 10692 Δ fadR/pCABD2 株。將如上所述制備的菌株用25mg/L含鏈霉素的LB培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)至0D600為約0. 6之后，添加與培養(yǎng)液等量的40%甘油溶液，攪拌后以合適的量等分，在-80°C下以甘油保存液形式保藏。[實(shí)施例2]fadR缺損L-賴氨酸生產(chǎn)株的培養(yǎng)將AJl 10692 Δ fadR/pCABD2株和對照株AJ110692/pCABD2株的甘油保存液融解，各取100 μ L均勻涂布在含25mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，在37°C下培養(yǎng)24小吋。將所得平板的約1/8量的菌體接種在500mL容量的坂ロ燒瓶內(nèi)的20mL含25mg/L鏈霉素如下所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于往復(fù)振蕩培養(yǎng)裝置中37°C培養(yǎng)48小時(shí)。在主培養(yǎng)中，作為碳源，使用葡萄糖或油酸鈉。對于油酸鈉，以終濃度0.5% (w/v)添加了作為乳化促進(jìn)劑的聚(氧こ烯)山梨醇單油酸酯(Tween 80 Nacalai Tesque公司生產(chǎn))后加以使用?？偺荚戳繛槠咸烟?0g/L，油酸鈉20g/L。通過其他途徑確認(rèn)了這樣的菌株無法同化TWeen80。培養(yǎng)用的培養(yǎng)基組成如下所示[埃希氏菌屬細(xì)菌L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基]碳源葡萄糖40g/L或油酸鈉20g/LTween 805g/L其他成分
(NH4)2SO424g/LKH2PO4lg/LMgSO4 7H20lg/LFeSO4 7H200. Olg/LMnSO4 7H200. Olg/L酵母提取物2g/LCaCO3 (日本藥局方)30g/L用KOH調(diào)整至pH7. 0，在120°C下進(jìn)行20分的蒸汽滅菌。但碳源和MgSO4 *7H20系單獨(dú)殺菌后混合。CaCO3在干熱滅菌后添加。在48小時(shí)后，通過Biosensor-BF-5 (王子計(jì)測機(jī)器)測定培養(yǎng)上清中L-賴氨酸的量。生長度在葡萄糖培養(yǎng)的場合利用濁度(OD)測定，在用脂肪酸作為碳源的場合則將適當(dāng)稀釋后的培養(yǎng)液在LB平板上涂布，測定活菌數(shù)。每次使用兩個(gè)燒瓶培養(yǎng)結(jié)果的平均值表不于表I (對于葡萄糖培養(yǎng))和表2 (油酸鈉培養(yǎng))中。在用葡萄糖作為碳源時(shí)，fadR缺損株(AJl 10692 A fadR/pCABD2)的L-賴氨酸生產(chǎn)不及親本株(AJ110692/pCABD2)。然而，在用油酸鈉作為碳源時(shí)，fadR缺損株(AJ110692 AfadR/pCABD2)與親本株(AJ110692/pCABD2)相比顯示了顯著的生長提高和L-賴氨酸生產(chǎn)。[表 I]表I :fadR缺損L-賴氨酸生產(chǎn)菌以葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)結(jié)果
____' --------- --
菌株O.D.L-賴氨酸(g/L)AJ110692/pCABD216.714.8AJl 10692AfadR/pCABD2 17.4 14.3表2 fadR缺損L-賴氨酸生產(chǎn)菌以油酸鈉作為碳源的培養(yǎng)結(jié)果
菌株活菌數(shù)L-賴氨酸(g/L)
(108/mL)-
AJ110692/pCABD242.53.0
AJl 10692AfadR/pCABD2 65.0_3A_
〔實(shí)施例3〕擴(kuò)增了fad基因群的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的構(gòu)建<3-l>fad基因群擴(kuò)增株的構(gòu)建脂肪酸P 氧化途徑的酶由 fadL(SEQ ID NO 3)、fadD(SEQ ID NO 5)、fadE(SEQID NO 7)、fadB(SEQ ID NO 9)、fadA(SEQ ID NO :11)所組成的基因群編碼(Clark,D. P.和Cronan Jr. , J. E. 1996. 343-357 頁 于 F. D. Neidhardt(編)，Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society forMicrobiology Press, Washington, D. C)。此外，fadB 和 fadA 形成由 fadBA 組成的操縱子。fadL基因用SEQ ID NO :25、26所示的引物、fadD基因用SEQ ID NO :27、28所示的引物、fadE基因用SEQ ID NO :29、30所示的引物、fadB基因用SEQ ID NO :31、32所示的引物、fadA基因用SEQ ID NO :33、34所示的引物、fadBA操縱子用SEQ ID NO :35、36所示的引物，以大腸桿菌野生株W3110株染色體DNA作為模板通過PCR法獲得。<3-2>fadL基因擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建 使用SEQ ID NO 25所示的具有EcoRI位點(diǎn)的引物與SEQ ID NO 26所示的具有HindIII位點(diǎn)的引物以W3100株染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，得到含fadL基因的PCR產(chǎn)物。將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadL基因的基因片段。將經(jīng)純化的fadL基因片段與用EcoRI和HindIII消化的pTWV228載體(TakaraBio公司生產(chǎn))相連接，構(gòu)建了用于擴(kuò)增fadL基因的質(zhì)粒pTWV-fadL。<3-3>fadD基因擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建使用SEQ ID NO 27所示的具有EcoRI位點(diǎn)的引物與SEQ ID NO 28所示的具有HindIII位點(diǎn)的引物，以W3100株染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，得到含fadD基因的PCR產(chǎn)物。將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadD基因的基因片段。將經(jīng)純化的fadD基因片段與用EcoRI和HindIII消化的pTWV228載體(TakaraBio公司生產(chǎn))連接，構(gòu)建了用于擴(kuò)增fadL基因的質(zhì)粒pTWV-fadD。<3-4>fadE基因擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建使用SEQ ID NO 29所示的具有EcoRI位點(diǎn)的引物與SEQ ID NO 30所示的具有HindIII位點(diǎn)的引物以W3100株染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，得到含fadE基因的PCR產(chǎn)物。將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadE基因的基因片段。將經(jīng)純化的fadE基因片段與用EcoRI和HindIII消化的pTWV228載體(TakaraBio公司生產(chǎn))相連接，構(gòu)建了用于擴(kuò)增fadE基因的質(zhì)粒pTWV-fadE。<3-5>fadB基因擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建使用SEQ ID NO 31所示的具有EcoRI位點(diǎn)的引物與SEQ ID NO 32所示的具有HindIII位點(diǎn)的引物以W3100株染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，得到含fadB基因的PCR產(chǎn)物。將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadB基因的基因片段。將經(jīng)純化的fadB基因片段與用EcoRI和HindIII消化的pTWV228載體(TakaraBio公司生產(chǎn))相連接，構(gòu)建了用于擴(kuò)增fadB基因的質(zhì)粒pTWV-fadB。<3-6>fadA基因擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建如前所述用SEQ ID N0:33和SEQ ID NO :34所示的引物以W3100株染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，得到含fadA基因的PCR產(chǎn)物。將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物與將載體pTWV228 (TakaraBio公司生產(chǎn))經(jīng)SalI純化所得的質(zhì)粒片段用In-Fusion Dry-Down PCRCloning Kit (Clonetech公司生產(chǎn))相連接，構(gòu)建了用于擴(kuò)增fadA基因的質(zhì)粒pTWV-fadA。<3-7>fadBA操縱子擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建使用SEQ ID NO 35所示的具有EcoRI位點(diǎn)的引物與SEQ ID NO 36所示的具有HindIII位點(diǎn)的引物以W3100株染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，得到含fadBA操縱子的PCR產(chǎn)物。將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物用限制性酶EcoRI和HindIII消化，得到含fadBA操縱子的基因片段。將經(jīng)純化的fadBA操縱子片段與用EcoRI和HindIII消化的pTWV228載體(TakaraBio公司生產(chǎn))相連接，構(gòu)建了用于擴(kuò)增adBA操縱子的質(zhì)粒pTWV-fadBA。<3-8>向AJ110692株導(dǎo)入賴氨酸生產(chǎn)用質(zhì)粒作為大腸桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)株，使用上述AJ110692/pCABD2株。將AJ110692株用前項(xiàng)中制備的攜帶fad基因群的質(zhì)粒pTWV-fadL、pTWV-fadD、pTWV-fadE、pTWV-fadB、pTWV-fadA、pTWV-fadBA、以及對照載體pTWV228遵循常規(guī)方法轉(zhuǎn)化，分別得到AJ110692/pCABD2/pTWV-fadL, AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadD, AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadE,AJ110692/pCABD2/pTWV-fadB,AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadA, AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadBA、以及 AJ110692/pCABD2/pTWV228 株。將如上所述制備的菌株用含50mg/L的氨芐青霉素與20mg/L的鏈霉素的LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)到0D600為約0. 6之后，添加與培養(yǎng)液等量的40%甘油溶液攪拌之后，以合適的量等分，在_80°C下以甘油保存液形式保藏。[實(shí)施例4]fad基因群擴(kuò)增L-賴氨酸生產(chǎn)株的培養(yǎng)將在實(shí)施例3中得到的fad基因群擴(kuò)增株的甘油保存液融解，各取IOOii L均勻涂布在含50mg/L氨芐青霉素和20mg/L的鏈霉素的LB平板上，在37°C下培養(yǎng)24小時(shí)。將所得平板上的約1/2量的菌體接種在AGC Techno Glass公司制的試管(直徑x長度x壁厚(mm) = 25x200x1. 2)內(nèi)的5mL含50mg/L氨節(jié)青霉素和20mg/L鏈霉素如下所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于往復(fù)振蕩培養(yǎng)裝置中37°C培養(yǎng)72小時(shí)。作為主培養(yǎng)中的碳源，向油酸鈉中以終濃度0.5% (w/v)添加作為乳化促進(jìn)劑的聚(氧乙烯)山梨醇單油酸酯(Tween 80:Nacalai Tesque公司生產(chǎn))后加以使用?？偺荚戳繛橛退徕c10g/L。培養(yǎng)用的培養(yǎng)基組成如下所示[埃希氏菌屬細(xì)菌L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基]碳源油酸鈉10g/LTween 805g/L其他成分(NH4)2SO424g/LKH2PO4lg/LMgSO4 7H20lg/LFeSO4 7H200. Olg/LMnSO4 7H200. Olg/L酵母提取物2g/LPIPES (pH7. 5)20g/L用KOH調(diào)整至pH7. 5，在115°C下進(jìn)行10分的蒸汽滅菌。但碳源、MgSO4 7H20及PIPES單獨(dú)殺菌后混合。在72小時(shí)后,通過BioTech Analyzer (Sakura精機(jī))測定培養(yǎng)上清中L-賴氨酸的量。對于主培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液與等量10% Tween80溶液混合測定濁度(OD)，以確定生長度。每次使用三個(gè)燒瓶培養(yǎng)結(jié)果的平均值，在表3中表示。相對于導(dǎo)入載體pTWV228 的對照株，fadL、fadD、fadE、fadB、fadA、fadBA 基因?qū)胫觑@示L-賴氨酸生產(chǎn)顯著升高。[表3]表3 :fadR基因群擴(kuò)增L-賴氨酸生產(chǎn)菌培養(yǎng)結(jié)果 菌株O.D.L-賴氨酸(g/L)
AJ110692/pCABD2/pTWY2288,53.2
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadL7.74.7
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadD104.6
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadE8.25.0
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadB11.33.9
AJ110692/pCABD2/pTWV-fadA9.73.9
AJl 10692/pCABD2/pTWV-fadBA9.54.3
--7-〔實(shí)施例5〕擴(kuò)增了fad基因群的L_蘇氨酸生產(chǎn)菌的培養(yǎng)作為L-蘇氨酸生產(chǎn)菌，使用EP 0593792所述的大腸桿菌VKPM B-5318株。用在實(shí)施例〈3-1>中制備的攜帶fad基因群的質(zhì)粒pTWV-fadL、pTWV-fadD、pTWV-fadE、以及對照載體PTWV228 遵循常規(guī)方法轉(zhuǎn)化B-5318 株，分別得到 B-5318/pTWV-fadL、B_5318/pTWV-fadD、B-5318/pTWV-fadE 以及 B_5318/pTWV228 株。將如上所述制備的菌株用含50mg/L的氨芐青霉素與20mg/L的鏈霉素的LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)到0D600為約0. 6之后，添加與培養(yǎng)液等量的40%甘油溶液，攪拌之后以合適的量等分，在_80°C下以甘油保存液形式保藏。[實(shí)施例6]fad基因群擴(kuò)增L-蘇氨酸生產(chǎn)株的培養(yǎng)將B-5318/pTWV-fadL 株、B-5318/pTWV-fadD 株、B-5318/pTWV-fadE 株以及B-5318/pTWV228株的甘油保存液融解，各取100 u L均勻涂布在含50mg/L氨芐青霉素和25mg/L的鏈霉素的LB平板上，在37°C下培養(yǎng)24小時(shí)。將所得平板約1/4量的菌體接種在容積500ml的帶擋流板三角燒瓶內(nèi)的40mL含50mg/L氨節(jié)青霉素和25mg/L鏈霉素如下所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于往復(fù)振蕩培養(yǎng)裝置中40°C培養(yǎng)48小時(shí)。主本培養(yǎng)中，作為碳源，向油酸鈉中以終濃度0.5% (w/v)添加作為乳化促進(jìn)劑的聚(氧乙烯)山梨醇單油酸酯(Tween80 =Nacalai Tesque公司生產(chǎn))后使用?？偺荚戳繛橛退徕c10g/L。培養(yǎng)用的培養(yǎng)基組成如下所示[埃希氏菌屬細(xì)菌L-蘇氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基]
碳源油酸鈉10g/LTween 805g/L其他成分(NH4)2SO416g/LKH2PO4lg/L
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于，在包含脂肪酸或油脂的水解物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)提高了脂肪酸同化能力且具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的屬于腸桿菌科的細(xì)菌，從而在培養(yǎng)基或菌體內(nèi)生產(chǎn)并蓄積L-氨基酸，并從該培養(yǎng)基或菌體收集L-氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述細(xì)菌是通過修飾選自參與脂肪酸同化的基因群中的I種或2種以上的基因而提高了脂肪酸同化能力的細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述細(xì)菌是通過弱化fadR基因的表達(dá)或者使fadR基因缺損而提高了脂肪酸同化能力的細(xì)菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述細(xì)菌是通過增強(qiáng)選自fadl、fadj、fadL、fadE、fadD、fadB和fadA中的I種或2種以上的基因的表達(dá)而提高了脂肪酸同化能力的細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述基因是fadB和fadA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述基因是fadl和fadj。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌是通過增強(qiáng)cyoABCDE操縱子的表達(dá)而提高了脂肪酸同化能力的細(xì)菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌是屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌是大腸桿菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述L-氨基酸是選自L-蘇氨酸、L-賴氨酸和L-色氨酸中的I種或2種以上的氨基酸。
全文摘要
通過將屬于腸桿菌科，提高了脂肪酸同化能力，具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌以脂肪酸或油脂水解物作為碳源在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生產(chǎn)蓄積L-氨基酸，自該培養(yǎng)物收集L-氨基酸，來生產(chǎn)L-氨基酸。
文檔編號(hào)C12P13/08GK102741420SQ20098011858
公開日2012年10月17日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月22日
發(fā)明者土井秀高, 寺下優(yōu), 星野康, 臼田佳弘 申請人:味之素株式會(huì)社