專利名稱：用于擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增子拯救多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于擴(kuò)增核酸的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于使用聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴(kuò)增多種核酸序列的方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的開發(fā)使得能夠使用DNA擴(kuò)增用于多種應(yīng)用，包括分子診 斷測(cè)試。然而存在許多與PCR用于分子鑒別診斷(MDD)測(cè)定的應(yīng)用相關(guān)的挑戰(zhàn)。PCR利用 特異性的引物或引物組、溫度條件和酶。PCR反應(yīng)可能容易被污染，引物結(jié)合對(duì)于不同的引 物可能需要不同的條件，引物應(yīng)該對(duì)于靶序列特異以便僅擴(kuò)增該靶序列，等等。這使得其更 難以從單個(gè)樣品中擴(kuò)增多種序列。過去，診斷測(cè)試臨床樣品以發(fā)現(xiàn)一種或多種疾病病原體需要分離和培養(yǎng)微生物。 然而，這可能需要幾天，并且在許多情況下，如果要挽救患者的生命，診斷必須在幾小時(shí)內(nèi) 作出。分析單個(gè)臨床樣品以鑒定多種生物體從而確定哪一種或哪幾種可能是疾病的(多 種)病原體是期望用于MMD的方法，并且已經(jīng)開發(fā)了許多方法來較好地實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)。例如， 已經(jīng)開發(fā)了多重PCR法以擴(kuò)增樣品內(nèi)的多種核酸以便產(chǎn)生足夠的DNA/RNA從而能夠檢測(cè)和 鑒定多種生物體。然而，多重PCR具有一些缺點(diǎn)。例如，多重PCR反應(yīng)中的每種靶標(biāo)需要其 自己的最佳反應(yīng)條件，因此增加靶標(biāo)的數(shù)目需要每種單個(gè)靶標(biāo)的反應(yīng)條件不是最佳條件。 此外，體系中的多組高濃度引物經(jīng)常產(chǎn)生引物二聚體或獲得非特異性的本底擴(kuò)增。這種特 異性的缺乏也需要PCR后提純和多次雜交后洗滌的額外步驟。密集的引物由于需要利用酶 和消耗底物而降低擴(kuò)增效率。擴(kuò)增效率的差異可能導(dǎo)致擴(kuò)增子產(chǎn)量的顯著差異。例如，一 些基因座可能非常有效地?cái)U(kuò)增，而另一些則擴(kuò)增的效率很低或根本不能擴(kuò)增。這種不均一 擴(kuò)增的可能性也使得難以至不可能準(zhǔn)確地進(jìn)行終點(diǎn)定量分析。—種方法利用以非常低的濃度使用的嵌套式基因特異性引物以在初始PCR循環(huán) 期間富集靶標(biāo)。之后，使用共用引物來擴(kuò)增所有靶標(biāo)。整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)試管中進(jìn)行，不需要 額外輪次的PCR，并且不需要專門的儀器，但代替地，可以使用常規(guī)的熱循環(huán)儀來進(jìn)行。然 而，此方法有缺點(diǎn)。例如，因?yàn)槭褂玫蜐舛鹊囊镌诔跏佳h(huán)期間富集靶標(biāo)，因此測(cè)定的靈 敏度最終降低，初始的富集循環(huán)的每次循環(huán)需要較長的退火時(shí)間，并且在經(jīng)過擴(kuò)增靶標(biāo)所 需的循環(huán)次數(shù)后酶很有可能變得不太有效。對(duì)于更靈敏的、更快速的和更有效的用于擴(kuò)增來自多種靶標(biāo)的DNA和/或RNA以 促進(jìn)那些靶標(biāo)的快速鑒定的方法仍然存在著需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增核酸從而能夠檢測(cè)那些核酸的方法，該方法包括以下步驟 在第一次擴(kuò)增反應(yīng)中使用高濃度、靶標(biāo)特異性引物擴(kuò)增一種或多種靶核酸，從而產(chǎn)生至少
3一種含有至少一個(gè)共用引物結(jié)合位點(diǎn)的核酸擴(kuò)增子；拯救所述至少一種核酸擴(kuò)增子；以及 在第二次擴(kuò)增反應(yīng)中使用與所述至少一個(gè)共用引物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的共用引物擴(kuò)增所述至 少一種核酸擴(kuò)增子。本發(fā)明的一個(gè)方面利用嵌套式靶標(biāo)特異性引物。靶核酸可以包括DNA 和/或RNA，并且可以包括病毒、細(xì)菌和/或真菌來源的DNA和/或RNA，以及人或其他動(dòng)物 來源的基因組DNA和/或RNA。擴(kuò)增可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和/或RT-PCR進(jìn)行。 靶核酸的來源可以是來自一份或多份臨床、環(huán)境、或食品樣品，并且該方法可以以廣泛多樣 的方式使用，包括，例如，臨床診斷、環(huán)境采樣、植物檢測(cè)、食品安全性分析、檢測(cè)遺傳病癥、 和/或檢測(cè)疾病狀況。該方法可以用于人和/或獸的醫(yī)學(xué)診斷。附圖簡要說明

圖1是本發(fā)明的方法的圖示，其中F。代表正向-外側(cè)引物A代表帶有正向共用 引物標(biāo)簽(結(jié)合序列)的正向-內(nèi)側(cè)引物；cf代表正向共用引物；Ri代表帶有反向共用引 物標(biāo)簽(結(jié)合序列)的反向-內(nèi)側(cè)引物況代表反向-外側(cè)引物；Cr代表反向共用引物；Fa 代表附加正向引物；和Ra代表附加反向引物，這些引物通常如所指示的那樣定位。詳述本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種用于擴(kuò)增核酸的新方法，該方法可以用來檢測(cè)來自病 毒、細(xì)菌、真菌、植物和/或動(dòng)物細(xì)胞的核酸的存在，和存在的相對(duì)量，從而用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境、 食品、和其他樣品的評(píng)價(jià)以鑒定那些樣品內(nèi)的微生物和其他因子(agent)。該方法在本文中 稱為擴(kuò)增子拯救多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“arm-PCR")。在此方法中，靶核酸的PCR擴(kuò)增相 繼地在兩個(gè)不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行。這些體系可以包括獨(dú)立的柱、反應(yīng)容器或芯片的部分， 例如，含有一種或多種靶核酸、引物、酶、核苷酸(例如，dNTP)和緩沖液，它們是擴(kuò)增所述一 種或多種靶核酸以產(chǎn)生擴(kuò)增子所必需的。通過在第一次擴(kuò)增反應(yīng)中使用高濃度的引物并且 拯救在該反應(yīng)期間形成的擴(kuò)增子以用于在不同的反應(yīng)體系中的第二次擴(kuò)增反應(yīng)中，本發(fā)明 人已經(jīng)開發(fā)了一種增加靈敏度和特異性，減少產(chǎn)生可檢測(cè)結(jié)果所必需的時(shí)間，并且容易使 其適于自動(dòng)化操作的方法。要理解的是，如本文所使用的術(shù)語“包括”可以用術(shù)語“基本上由......組成”和
“由......組成”代替。當(dāng)使用術(shù)語“反應(yīng)體系”時(shí)，其意在描述向其中置入了必需的引物、
酶、核苷酸、緩沖液和/或其他試劑以便進(jìn)行至少一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一個(gè)或多個(gè)循環(huán) 的Eppendorf管、反應(yīng)室或其他容納裝置。因此不同的“反應(yīng)體系”可以指相同的反應(yīng)容納 容器，但不同的用于進(jìn)行所需的擴(kuò)增步驟的試劑組分(尤其是引物)。“反應(yīng)容納容器”意 在指具有充足的內(nèi)部容積以容納提供反應(yīng)體系所必需的引物、酶、核苷酸、緩沖液和/或其 他試劑的試管、板孔或其他容器。術(shù)語“拯救”意在指將擴(kuò)增子與第一次擴(kuò)增的至少一部分 引物分離?！癙CR”意在指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并且可以包括PCR和/或RT-PCR步驟。在該方法的第一個(gè)步驟中，使用高濃度的靶標(biāo)特異性的嵌套引物來進(jìn)行靶標(biāo)特異 性的第一次擴(kuò)增步驟。引物選自病毒、細(xì)菌、真菌和/或期望使用核酸檢測(cè)進(jìn)行鑒定的其他 靶標(biāo)的已知序列，并且對(duì)于那些靶核酸和/或密切相關(guān)的靶核酸是特異的。靶標(biāo)特異性引 物可以用來擴(kuò)增，例如，細(xì)菌、病毒、真菌和/或其他來源的一種或多種(和優(yōu)選多種)靶核 酸。嵌套引物濃度通常可以為5-50pmol。如圖1中所示，選擇的引物用附加的核苷酸進(jìn)行 “標(biāo)記”以提供對(duì)一種或多種靶核酸不特異的附加序列，使得用此引物對(duì)靶核酸的擴(kuò)增也會(huì) 在所生成的擴(kuò)增子中加入共用引物的結(jié)合位點(diǎn)，該共用引物與靶標(biāo)特異性引物不同，其可以用來進(jìn)一步擴(kuò)增不相關(guān)的靶核酸擴(kuò)增子(見圖1中的A和B)。擴(kuò)增進(jìn)行大致10-15個(gè)循 環(huán)，反應(yīng)終止，并且從反應(yīng)混合物中拯救生成的擴(kuò)增子用于第二個(gè)不依賴靶標(biāo)的擴(kuò)增步驟 中，包括由共用引物引發(fā)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該反應(yīng)將以相對(duì)無差別的方式提供不相關(guān)核 苷酸序列的擴(kuò)增，所述不相關(guān)核苷酸序列由從靶標(biāo)特異性反應(yīng)中拯救的多種擴(kuò)增子代表。然后進(jìn)行擴(kuò)增子拯救以盡量減少或清除第一次反應(yīng)的引物，同時(shí)提供用于使用共 用引物的第二次擴(kuò)增中的擴(kuò)增子。擴(kuò)增子拯救可以以多種方式進(jìn)行。例如，可以取來自完成 的第一次擴(kuò)增反應(yīng)的小樣品以提供用于第二次擴(kuò)增的擴(kuò)增子。當(dāng)取得小樣品時(shí)，其提供足 夠數(shù)目的用于第二次擴(kuò)增的擴(kuò)增子，同時(shí)顯著地減少(例如，稀釋)剩余數(shù)目的第一次擴(kuò)增 的引物。擴(kuò)增子拯救也可以通過如下步驟來進(jìn)行去除第一次擴(kuò)增的反應(yīng)體系的大部分內(nèi) 容物并且向剩余的內(nèi)容物中加入一種或多種共用引物和必需的一種或多種酶、核苷酸、一 種或多種緩沖液和/或其他試劑以進(jìn)行第二次擴(kuò)增，所述第二次擴(kuò)增利用所述一種或多種 共用引物在第二反應(yīng)體系中擴(kuò)增拯救的擴(kuò)增子。分離技術(shù)也可以用來拯救擴(kuò)增子。這些技 術(shù)可以依靠引物和擴(kuò)增子之間的尺寸差異，依靠已經(jīng)連接在擴(kuò)增子、引物或兩者上的標(biāo)簽， 或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。一旦被分離，所有拯救的擴(kuò)增子或一部分拯救的擴(kuò)增 子可以用于第二次擴(kuò)增中。第二次擴(kuò)增在不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行，其可以利用或可以不利用相同的反應(yīng)容納 容器。第二次擴(kuò)增使用新鮮的緩沖液、核苷酸和一種或多種共用引物擴(kuò)增拯救的擴(kuò)增子。選 擇共用引物以提供對(duì)拯救的擴(kuò)增子的有效擴(kuò)增從而在第二次擴(kuò)增結(jié)束時(shí)提供大量拷貝數(shù) 的那些擴(kuò)增子。通過將反應(yīng)分成第一次靶標(biāo)特異性的引物驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)增和第二次不依賴靶標(biāo)的共 用引物驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)增，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種方法，該方法通過使用靶標(biāo)特異性引物僅擴(kuò) 增存在于特定靶標(biāo)中的核酸種類和數(shù)目來提供特異性，和通過使用嵌套引物、高濃度靶標(biāo) 特異性引物實(shí)現(xiàn)靈敏度，并且使用一種或多種共用引物以提供較高拷貝數(shù)的非特異性(不 依賴靶標(biāo)的)擴(kuò)增。此外，在第一次擴(kuò)增中使用高濃度引物，緊接著進(jìn)行擴(kuò)增子拯救，尤其 是當(dāng)通過分離一部分第一次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增拯救時(shí)，所述分離通過去除該部分并將其置 于新的反應(yīng)體系中或通過去除大部分的第一次擴(kuò)增產(chǎn)物并向其加入必需的試劑以形成用 于第二次不依賴靶標(biāo)的擴(kuò)增的第二反應(yīng)體系而進(jìn)行，這使其適于自動(dòng)化操作。不僅這些步 驟可以在相對(duì)密閉的反應(yīng)體系(該體系限制了污染的可能性)內(nèi)進(jìn)行，而且由該方法提供 的第一次擴(kuò)增、擴(kuò)增子拯救和第二次擴(kuò)增的組合產(chǎn)生了在少于2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)的特異性 的、靈敏的用于來自多個(gè)樣品的多種靶標(biāo)的檢測(cè)方法。靶核酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式分離自其各自來源。由該方法產(chǎn) 生的擴(kuò)增子的檢測(cè)也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方式來進(jìn)行，諸如將來自第二擴(kuò) 增步驟的擴(kuò)增子應(yīng)用至用于雜交和檢測(cè)的印刷陣列。共用引物序列可以包括將有效地提供 擴(kuò)增反應(yīng)的有效啟動(dòng)的任何序列。這些序列和用于設(shè)計(jì)它們的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是 已知的。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)選自 SEQ ID NO :1(5' -TTCTTAGCGTATTGGAGTCC-3‘ ) ,SEQ ID NO 2(5' -AATGTACAGTATTGCGTTTTG-3‘)或二者組合的引物在第二次擴(kuò)增反應(yīng)中提供非 常好的結(jié)果。本發(fā)明還提供了用于PCR擴(kuò)增靶核苷酸的引物試劑盒，所述試劑盒包括選自下列 各項(xiàng)組成的組的引物SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ IDN0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:
55、SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ IDNO 17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23,SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ IDNO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ IDNO :35,SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41,SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ IDNO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、 SEQ IDNO :53,SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ IDNO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70,SEQ IDN0:71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76,SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ IDNO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82, SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :88, SEQ IDNO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :91、SEQ ID NO :92 和它們的組合。用于該方法的自動(dòng)化操作的方法的一個(gè)實(shí)例可以這樣提供，其中使用在密閉系統(tǒng) 中的“芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-chip)”裝置來進(jìn)行擴(kuò)增、分離和檢測(cè)。例如，第一次靶標(biāo)特異性 的擴(kuò)增可以在第一反應(yīng)體系(PCRl)中進(jìn)行，其中嵌套的、未標(biāo)記的高濃度靶標(biāo)特異性引物 可以與dNTP、緩沖液和酶一起預(yù)先加入，以進(jìn)行所需的PCR或RT-PCR擴(kuò)增。在允許第一次 擴(kuò)增進(jìn)行所需的循環(huán)次數(shù)后，未使用的引物可以利用毛細(xì)管電泳而與核苷酸擴(kuò)增子分離， 其借助于PCRl (負(fù)極)和廢液室(正極)之間的活化電極使引物與擴(kuò)增子分離。在引物移 動(dòng)至廢液室時(shí)，廢液室中的電極可以關(guān)閉并且第二反應(yīng)體系(PCR2)帶正電。因此較大分子 量的擴(kuò)增子可以移動(dòng)至PCR2室，在此它們與預(yù)先加入的共用引物和新鮮的酶、dNTP和緩沖 液混合。在PCR2中進(jìn)行第二次擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)可以經(jīng)電泳移動(dòng)至檢測(cè)室，與 共價(jià)固定在珠子上的探針雜交，所述珠子在陣列中的位置代表特定的分子靶標(biāo)。因此靶標(biāo) 檢測(cè)可以通過成像分析來進(jìn)行，例如，其中陽性結(jié)果可以由發(fā)光的珠子來指示，因?yàn)閿U(kuò)增子 產(chǎn)物可以用熒光染料或其他化學(xué)/生物化學(xué)標(biāo)記物來標(biāo)記。然后未使用的PCR產(chǎn)物和引物 可以被去除和沉積在廢液室中。在一些實(shí)施方案中，PCR芯片可以包括與廢液槽和第二反應(yīng)體系兩者流體連接的 第一反應(yīng)體系，所述廢液槽和第二反應(yīng)體系各另外地包括至少一個(gè)電極，所述電極包括用 于分離由所述第一反應(yīng)體系產(chǎn)生的擴(kuò)增子的裝置。所述第二反應(yīng)體系可以與雜交和檢測(cè)室 流體連接，所述雜交和檢測(cè)室包括微球體，或珠子，所述珠子被配置成使得珠子的物理位置 是借助于芯片分析的樣品中特定靶多核苷酸的存在的指示。芯片可以預(yù)先加入試劑，或試劑可以由用戶加入。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)先加入的 試劑可以包括用于第一反應(yīng)體系的嵌套的、高濃度的靶標(biāo)特異性引物、dNTP、聚合酶和一種 或多種緩沖液。第二反應(yīng)體系可以與共用引物、dNTP、緩沖液和聚合酶一起預(yù)先加入。使 用該芯片，例如，患者樣品可以通過將該樣品通過覆蓋芯片的全部或一部分的軟橡膠樣聚 二甲基硅氧烷(PDMS)材料注射而加入至至少一個(gè)第一反應(yīng)體系中。在第一反應(yīng)體系中，對(duì) 于第一次擴(kuò)增可以進(jìn)行第一系列的PCR循環(huán)以擴(kuò)增靶序列并且將共用引物結(jié)合序列引入至所生成的擴(kuò)增子的至少一部分中。然后來自第一反應(yīng)體系的擴(kuò)增子產(chǎn)物可以通過在微流 體通道中進(jìn)行的芯片上電泳來分離，所述第一反應(yīng)體系與至少一個(gè)第二反應(yīng)體系和至少一 個(gè)廢液槽流體連接，每個(gè)第二反應(yīng)體系和廢液槽另外包括至少一個(gè)電極，所述電極促進(jìn)來 自第一擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子和未使用的引物分別移動(dòng)至第二反應(yīng)體系和廢液槽。移動(dòng)至第二 PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增子然后可以使用共用引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增以擴(kuò)增在第一反應(yīng)體系中的 第一次擴(kuò)增期間已經(jīng)向其中引入了至少一個(gè)共用引物結(jié)合位點(diǎn)的擴(kuò)增子。在第二反應(yīng)體系 中完成所需的擴(kuò)增循環(huán)后，PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)可以通過微流體電泳從第二反應(yīng)體系移動(dòng) 至至少一個(gè)雜交和檢測(cè)室，第二反應(yīng)體系與至少一個(gè)雜交和檢測(cè)室流體連接。在所述雜交 和檢測(cè)室內(nèi)，可以存在微球體或珠子，其形成陣列，所述珠子的物理位置指示用于檢測(cè)的特 定靶標(biāo)。珠子陣列可以包含約1-約200個(gè)靶標(biāo)，每個(gè)靶標(biāo)由約1-約100個(gè)珠子代表。如 果特定的靶標(biāo)不由第一次擴(kuò)增反應(yīng)中適當(dāng)?shù)囊锎?，則可以使用軟件掩膜(mask)來覆 蓋相關(guān)的珠子使得它們將不會(huì)干擾分析。雜交和檢測(cè)室可以與至少一個(gè)洗滌室和至少一 個(gè)檢測(cè)室流體連接，所述洗滌室包含輔助去除未使用的標(biāo)記的引物和探針以減少本底的試 劑，且所述檢測(cè)室包含用于標(biāo)記擴(kuò)增的DNA以進(jìn)行成像分析的試劑諸如鏈霉親和素-量子 點(diǎn)(streptavidine-Quantumdots)，或鏈霉親禾口素-PE0本發(fā)明的方法還可以使用標(biāo)準(zhǔn)的或改良的PCR熱循環(huán)儀來進(jìn)行。例如，核苷酸、緩 沖液和引物可以加入至用于第一次擴(kuò)增的第一臺(tái)熱循環(huán)儀的標(biāo)準(zhǔn)PCR試管中。所述管的 內(nèi)容物可以通過手工或自動(dòng)裝置去除從而拯救擴(kuò)增子，并且剛分離的擴(kuò)增子可以放置在第 二個(gè)擴(kuò)增管中，其中引入了緩沖液、核苷酸和一種或多種酶，從而在第一臺(tái)或第二臺(tái)熱循環(huán) 儀中進(jìn)行第二次擴(kuò)增，所述熱循環(huán)儀被編程從而通過適當(dāng)?shù)臏囟仁狗磻?yīng)循環(huán)所需的時(shí)間長 度。應(yīng)該理解循環(huán)時(shí)間和循環(huán)次數(shù)可以發(fā)生變化，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。嵌套引物的使用似乎改善聚合酶的結(jié)合親和力，在第一次擴(kuò)增反應(yīng)期間產(chǎn)生顯著 較多的擴(kuò)增子。這些擴(kuò)增子可以使用高濃度靶標(biāo)特異性引物，由樣品內(nèi)多種靶多核苷酸產(chǎn) 生。通過在第一次擴(kuò)增期間將用于至少一個(gè)共用引物的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)引入至所述擴(kuò)增 子的至少一部分中，則有可能在第二次擴(kuò)增期間甚至更顯著地增加由該擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的 擴(kuò)增子的數(shù)目。針對(duì)其在第二次擴(kuò)增期間的結(jié)合親和力和引發(fā)擴(kuò)增的能力來選擇共用引 物。通過使用此三步法(第一擴(kuò)增步驟，擴(kuò)增子拯救，第二擴(kuò)增步驟)，因此可能增加用于從 含有多種生物體的樣品中鑒定一種或多種靶生物體的PCR方法的特異性和靈敏度。本發(fā)明 人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此方法與先前所述的PCR方法相比，的確顯著地增加特異性和靈敏度兩者。使擴(kuò)增-分離-擴(kuò)增過程自動(dòng)化能夠在1-3小時(shí)的時(shí)間內(nèi)鑒定大量的靶標(biāo)，并且 已經(jīng)顯示有效地在1. 5小時(shí)的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增來自多種微生物的靶核酸，使得能夠快速地鑒定 疾病的可能病原體，從而能夠立即針對(duì)用于限制與傳染性病原體、生物恐怖劑(bioterror agent)等接觸的處理、分離、公眾衛(wèi)生計(jì)劃的實(shí)施采取措施。為進(jìn)行PCR反應(yīng)，樣品可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式進(jìn)行制備。例如， 這些方法可以作為由包含緩沖液和酶的PCR試劑盒提供的使用說明來提供，或使用說明可 以獲自各種期刊或?qū)＠霭嫖?。在用于PCR擴(kuò)增步驟的制備前處理樣品的方法對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說也是已知的，并且可以根據(jù)樣品的來源而發(fā)生變化。用于擴(kuò)增的酶是商購的，并且可以包括，例如，Qiagen Multiplex mix或Qiagen Hot Start mix。緩沖液也是商購的，核苷酸(dNTPs)和其他試劑也如此。熱循環(huán)儀由多個(gè)公司制造并分銷，這些公司包括，例如，AppliedBiosystemM應(yīng)用生物系統(tǒng))和Bio-Rad。 PCR試劑盒也可以獲自多種來源，包括，例如，Qiagen (蓋瑟斯堡(Gaithersburg)，馬里蘭)。本發(fā)明提供了一種方法，該方法適合于例如，從可能含有多種微生物的樣品中鑒 定一種微生物或多種微生物。這樣的樣品可以獲自臨床標(biāo)本(例如，血液、唾液、組織)，獲 自環(huán)境樣品(例如，水、土壤)，獲自食物樣品，或其他來源。可以被鑒定的微生物可以包括 細(xì)菌、病毒的多種屬和種，以及其他含有DNA和/或RNA的生物體。為了鑒定微生物，可以利用諸如Luminex xMAP 技術(shù)的方法，并且檢測(cè)步驟可以 與擴(kuò)增一起合并至自動(dòng)化系統(tǒng)中，使得該自動(dòng)化系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)第一次擴(kuò)增、擴(kuò)增子拯救、第二次 擴(kuò)增和檢測(cè)。在Luminex χΜΑΡ 系統(tǒng)中，例如，混懸液中的微球體提供探針結(jié)合的固體支
持，其也稱為“液體芯片”或“懸浮陣列(suspension array) 采用xMAP 技術(shù)，分子反
應(yīng)發(fā)生在顏色編碼的微球體的表面上。對(duì)于每種病原體，靶標(biāo)特異性俘獲探針可以共價(jià)地 連接至特定組的顏色編碼的微球體。標(biāo)記的PCR產(chǎn)物在雜交混懸液中被結(jié)合珠子的俘獲探 針俘獲。微流體系統(tǒng)將懸浮雜交反應(yīng)混合物遞送至雙激光器檢測(cè)裝置。紅色激光器通過其 顏色編碼鑒定每個(gè)珠子，而綠色激光器檢測(cè)與每個(gè)珠子相關(guān)的雜交信號(hào)。使用軟件來采集 數(shù)據(jù)并且以秒的方式報(bào)告結(jié)果。所述數(shù)據(jù)以平均熒光強(qiáng)度(MPS)的形式報(bào)告。本文所述的方法能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員將高特異性、高靈敏度擴(kuò)增和檢測(cè)結(jié)合在 一個(gè)自動(dòng)化系統(tǒng)中。使用這樣的系統(tǒng)，可能在較短的時(shí)間周期內(nèi)以比以前采用現(xiàn)有系統(tǒng)可 能達(dá)到的靈敏度更高的靈敏度分析一個(gè)或多個(gè)臨床樣品。本發(fā)明可以通過下列非限制性的實(shí)施例進(jìn)一步描述實(shí)施例1設(shè)計(jì)arm-PCR反應(yīng)以擴(kuò)增和檢測(cè)造成食源性疾病的病原體。對(duì)于每種病原體使用 的靶基因列舉在下面的表1中。表 權(quán)利要求
1.一種方法，包括在第一次擴(kuò)增反應(yīng)中使用高濃度靶標(biāo)特異性引物擴(kuò)增一種或多種靶核酸，從而產(chǎn)生至 少一種含有至少一個(gè)共用引物結(jié)合位點(diǎn)的核酸擴(kuò)增子；拯救所述至少一種核酸擴(kuò)增子；以及在第二次擴(kuò)增反應(yīng)中使用與所述至少一個(gè)共用引物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的至少一種共用引 物擴(kuò)增所述至少一種核酸擴(kuò)增子。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高濃度靶標(biāo)特異性引物是嵌套引物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種靶核酸選自由病毒、細(xì)菌和真菌核 酸組成的組。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種靶核酸獲自人臨床樣品。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種靶核酸獲自來自動(dòng)物的臨床樣品。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種共用引物選自由SEQIDN0:USEQ ID NO 2和其組合組成的組。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述拯救所述至少一種核酸擴(kuò)增子的步驟還包括從 在第一反應(yīng)體系中完成的擴(kuò)增中取小樣品以提供用于在第二反應(yīng)體系中第二次擴(kuò)增的擴(kuò) 增子。 . 7. 一種引物試劑盒，其包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的引物SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO 20,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ IDNO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO 32,SEQ IDNO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38,SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO :41、SEQ IDNO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、 SEQ ID NO :50、SEQ IDNO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO 55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ IDNO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO 67,SEQ ID NO 68、SEQ IDNO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73,SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ IDNO :78、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、 SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ IDNO :87、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO 90、SEQ ID N0:91、SEQ ID NO :92 和它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種擴(kuò)增和檢測(cè)多核苷酸的方法，該方法可以在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)提供對(duì)來自臨床樣本的多種靶標(biāo)的靈敏的、特異性的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12P19/34GK102066573SQ200980118968
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者韓建 申請(qǐng)人:哈森阿爾法生物技術(shù)研究院