專利名稱：誘導(dǎo)性多能干(iPS)細胞的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干(iPQ細胞的方法，其包含將一段或兩段編碼 序列導(dǎo)入靶細胞的步驟，每段編碼序列在轉(zhuǎn)錄時會產(chǎn)生有助于將所述靶細胞重編程為誘導(dǎo) 性多能干細胞的選自0ct3/4的因子或者屬于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，其中靶細 胞內(nèi)源性地表達至少不由待導(dǎo)入的編碼序列所編碼且選自0ct3/4的因子或?qū)儆贛yc、Klf 和Sox因子家族的因子，且其中因所述一段或兩段編碼序列的導(dǎo)入而產(chǎn)生的細胞表達因子 0ct3/4與選自Myc、Klf和Sox的每個因子家族的至少一種因子的組合。此外，本發(fā)明還涉 及通過本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細胞，以及有助于將靶細胞重編程為誘導(dǎo)性多 能干細胞的化合物的鑒定方法。另外，還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法和包含由本發(fā) 明的方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細胞的組合物，所述組合物用于基因療法、再生醫(yī)學(xué)、細胞療 法或藥物篩選。本說明書的正文中引用了一些文獻。通過援引將本文所引用文獻的公開內(nèi)容(包 括制造商的詳細說明書、操作指導(dǎo)等)并入本文。
背景技術(shù)：
多能干細胞，如胚胎干(EQ細胞，其特征是其自我更新并分化為多種細胞類型的 能力。胚胎干細胞在物理誘導(dǎo)因子和生物誘導(dǎo)因子存在的情況下可體外分化為全部三種胚 胎胚層(即外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的特化細胞系。到目前為止，很多前景樂觀的研究已 顯示出由胚胎干細胞分化形成的衍生細胞在動物模型中改善許多疾病的治療潛力。因此， 多能干細胞在組織工程化和移植治療的應(yīng)用中有巨大的潛力。如果可誘導(dǎo)這些細胞使之分 化為某種特定細胞類型，即可提供一種幾乎無限的移植用細胞源，可用于治療諸如糖尿病、 帕金森癥和阿爾茨海默病等多種具破壞性的退行性疾病(Biswas等，2007 ；Kim等，2007 ； Zimmermann 等，2007)。直到最近才發(fā)現(xiàn)，可對體細胞進行遺傳修飾以使其再分化為在表型、基因型和多 功能性(pluripotency)方面都與胚胎干細胞相似的狀態(tài)(Takahashi和Yamanaka，2006 ； Okita等，2007 ；Wernig等，2007)。所謂的體細胞“重編程”是有價值的理解重獲多功能性 的機制的工具，并進一步開拓了產(chǎn)生患者特異性的多能干細胞的可能性。通過轉(zhuǎn)錄因子四 重組Oct4、sox2、c-Myc和Klf4的表達，將小鼠和人類體細胞重編程為多能干細胞(命名為 誘導(dǎo)性多能干細胞(iPS))已成為可能。目前，雖然iPS細胞在醫(yī)學(xué)應(yīng)用(如患者特異性再生細胞療法)中的巨大潛力已 被廣泛承認，目前采用的產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細胞的方法卻阻礙了它們在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用。 具體而言，用于導(dǎo)入和表達幾種重編程因子組合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體會以多拷貝的形式隨機 地整合入基因組中，優(yōu)選整合入活性內(nèi)源基因內(nèi)部或附近，因此可能分別引起癌癥或腫瘤 抑制基因的激活性或失活性變異。因此，使用可使靶細胞基因組的修飾程度最小化的方法 來產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細胞，可以推進該方法的安全臨床應(yīng)用。
因此，在第一實施方式中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干(iPQ細胞的方法， 其包括將一段或兩段編碼序列導(dǎo)入靶細胞的步驟，每段編碼序列在轉(zhuǎn)錄時會產(chǎn)生有助于 將所述靶細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞的選自0ct3/4的因子或?qū)儆贛yc、Klf和Sox 因子家族的因子，其中，所述靶細胞內(nèi)源性地表達至少不由待導(dǎo)入編碼序列所編碼的選自 0ct3/4的因子或?qū)儆贛yc、Klf和Sox因子家族的因子，且其中因所述一段或兩段編碼序列 的導(dǎo)入而產(chǎn)生的細胞表達因子0ct3/4與選自Myc、Klf和Sox的每個因子家族的至少一種 因子的組合?！罢T導(dǎo)性多能干細胞(iPS cell)”是指表現(xiàn)出與胚胎干細胞(ESC)相似的特 征的細胞。所述特征包括例如體外無限自我更新、正常的染色體組型、包括如0ct3/4、 Sox2、Nanog,堿性磷酸酶(ALP)和干細胞特異性抗原3和4 (SSEA3/4)等干細胞標志 基因的特征性基因表達圖譜，以及分化為特化細胞類型的能力(Harma，J.等，(2007). Science 318 (5858) :1920-3 ；Meissner, Α.等，(2007). Nat Biotechnol 25(10) 1177-81 ；Nakagawa, Μ.等，(2007). Nat Biotechnol. ；Okita, K.等，(2007). Nature 448(7151) :313-7 ；Takahashi, K.等，(2007) · Cell 131 (5) :861-72 ；ffernig, M.等， (2007). Nature448 (7151) :318-24 ；Yu, J.等，(2007) · Science 318(5858) :1917-20 ； Park, I. H.等，(2008). Nature 451 (7175) :141_6)。Takahashi，Okita，Nakagawa， Yamanaka(2007)Nature Protocols 2(12)中描述了從成纖維細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生誘導(dǎo)性多 能干細胞的技術(shù)現(xiàn)狀。小鼠iPS細胞的多功能性可例如通過體外分化為神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠 質(zhì)細胞和心肌細胞以及通過囊胚注射產(chǎn)生種系嵌合體小鼠來測試。人類誘導(dǎo)性多能干細胞 系可通過體外分化為神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和心肌細胞來分析，而其體內(nèi)分化能力可通 過注入免疫缺陷SCID小鼠和所產(chǎn)生的作為畸胎瘤的腫瘤的表征來測試。iPS細胞可通常依據(jù)如下細胞生物學(xué)性質(zhì)來評估和分類形態(tài)學(xué)iPS細胞在形態(tài)上類似于胚胎干細胞(ESC)。每個細胞呈圓形，具大核仁 和少量細胞漿。iPS細胞的集群也與ESC集群的類似。與hESC類似，人類iPS細胞形成邊 緣清晰、扁平且堆積緊密的集群，而小鼠iPS細胞形成與mESC相似的集群，不如hESC集群 扁平但比之更密集。生長性質(zhì)倍增時間和有絲分裂活性是ESC的基礎(chǔ)特性，因為干細胞必須如其部 分定義所述進行自我更新。iPS細胞具有絲分裂活性，以與ESC相同的速度進行積極的自我 更新、增殖與分裂。干細胞標記物iPS細胞表達了在ESC上表達的細胞表面抗原標記物。人類iPSC 表達對 hESC 特異的標記物，包括 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E 和 Nanog0小鼠iPS細胞與mESC類似，表達SSEA-I但不表達SSEA3或SSEA-4。干細胞基因iPS細胞表達在尚未分化的ESC中表達的基因，包括例如0ct3/4、 Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4 和 hTERT。端粒酶活性端粒酶在維持不受Hayflick極限(即約50次的細胞分裂)限制的 細胞分裂中必不可少。hESC表達高端粒酶活性以維持自我更新和增殖，而iPS細胞亦顯示 出高端粒酶活性且表達端粒酶蛋白復(fù)合體中的必要組分hTERT (人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)。多功能性iPS細胞能以與ESC相似的方式分化為完全分化的組織。例如，iPS細胞在被注入免疫缺陷型小鼠體內(nèi)9周后自發(fā)地形成畸胎瘤?；チ鍪且环N由多種細胞系 組成的腫瘤，含有源自三種胚層(即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的組織；這與其他通常只由 一種細胞類型構(gòu)成的腫瘤不同?；チ龅男纬墒菣z驗多功能性的界標。此外，培養(yǎng)物中的 hESC可自發(fā)形成稱為“擬胚體(embryoid body) ”的球狀類胚胎結(jié)構(gòu)，其由具有絲分裂活性 且正在分化的hESC核心和來自全部三種胚層的完全分化的細胞的外周所構(gòu)成。iPS細胞也 能形成擬胚體且具有外周分化細胞。囊胚注射hESC天然存在于囊胚內(nèi)層細胞群(成胚細胞)中；當(dāng)囊胚殼(滋養(yǎng)層) 分化為胚外組織的同時，hESC在成胚細胞中分化為胚胎。中空的滋養(yǎng)層并不能形成活胚胎， 因此位于成胚細胞中的胚胎干細胞分化并形成胚胎是必要的?？捎梦⒘考訕悠鲗PS細胞 注入滋養(yǎng)層內(nèi)，進而將囊胚轉(zhuǎn)移至雌性接受體中。如此可產(chǎn)生嵌合體活小鼠幼崽，即全身上 下以不同嵌合程度并入了 iPS細胞衍生物的小鼠。啟動子去甲基化甲基化是指甲基轉(zhuǎn)移至DNA堿基，通常是甲基轉(zhuǎn)移至CpG位點 (相鄰的胞嘧啶/鳥嘌呤序列)的胞嘧啶分子。大范圍的基因甲基化會通過阻礙表達蛋白 的激活或通過募集干擾表達的酶來干擾表達。因此，基因甲基化會通過阻礙轉(zhuǎn)錄而有效地 沉默該基因。多功能性相關(guān)的基因(包括例如0ct3/4、Rexl和Nanog)的啟動子在iPS細 胞中被去甲基化，表現(xiàn)出它們的啟動子活性，并且表現(xiàn)出多功能性相關(guān)基因在iPSC中的積 極啟動和表達。組蛋白去甲基化組蛋白是一類在結(jié)構(gòu)上定位于DNA序列的致密蛋白 (compacting protein)，可通過各種染色質(zhì)相關(guān)修飾發(fā)揮它們的活性。與例如0ct3/4、SoX2 和Nanog等結(jié)合的H3組蛋白被去甲基化，表明0ct3/4、Sox2和Nanog的表達。本發(fā)明中所使用的術(shù)語“導(dǎo)入”是指將編碼序列引入靶細胞內(nèi)和隨后將所述編碼 序列并入靶細胞的基因組DNA中的過程。該過程通常被稱為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法已 為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知并在例如Bonetta，L.，(2005), Nature Methods 2，875-883的文 獻中有所描述。由于在被轉(zhuǎn)染的細胞中重編程事件的發(fā)生率低，采用高效的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法 將十分有益。因此，優(yōu)選通過實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染/感染效率的方法將編碼序列導(dǎo)入靶細胞。例如， 轉(zhuǎn)染/感染效率優(yōu)選為至少30 %、至少50 %或至少80 %。適合的方法包括例如，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、 電穿孔、核轉(zhuǎn)染(rmcleofection)、磁轉(zhuǎn)染或病毒載體感染。優(yōu)選使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來實 現(xiàn)靶細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，這是因為所述載體不僅可介導(dǎo)編碼序列高效地進入靶細胞，而且還 可介導(dǎo)這些編碼序列整合至靶細胞的基因組DNA中。據(jù)顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可對來自不 同動物物種的很多細胞類型進行轉(zhuǎn)導(dǎo)、可將該載體攜帶的遺傳物質(zhì)整合至靶細胞中、可高 水平表達所轉(zhuǎn)導(dǎo)的編碼序列，此外，有利的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在感染后不會傳播或產(chǎn)生病 毒蛋白。適用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如帶有MoMULV LTR、 MESV LTR的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，帶有不同內(nèi)部啟動子(如CMV啟動子)的慢病毒載體，優(yōu)選帶 有在胚胎/多功能細胞中表現(xiàn)出對轉(zhuǎn)基因表達的沉默的增強子/啟動子組合。亦可采用附 加體載體系統(tǒng)，如腺病毒載體、其他非整合性載體、附加體復(fù)制質(zhì)粒。本發(fā)明的方法中優(yōu)選 使用逆轉(zhuǎn)錄病毒 MX 載體系統(tǒng)(Kitamura 等，(2003), Exp Hematol. ,31(11) :1007-1014) 本發(fā)明的方法所用的靶細胞可源自現(xiàn)有細胞系，或通過包括例如獲取組織樣本來 建立原代細胞系在內(nèi)的多種方法來獲得。從不同組織中獲取樣本及建立原代細胞系的方法 是本領(lǐng)域內(nèi)所公知的(參見例如，Jones和Wise，Methods Mol Biol. 1997)。適用的體細胞系也可從很多供應(yīng)商那里購得，例如美國組織培養(yǎng)物保藏庫(ATCC)、德國微生物和細胞培 養(yǎng)物保藏庫(DSMZ)或 PromoCell GmbH, Sickingenstr. 63/65, D-69126Heidelbergo 根據(jù) 本發(fā)明中的方法，合適的靶細胞內(nèi)源性地表達選自0ct3/4的因子或?qū)儆贛yc、Klf和Sox因 子家族的因子，其中所述因子與外源性導(dǎo)入的因子的組合可將非多功能性的靶細胞重編程 為iPS細胞，所述外源性導(dǎo)入因子選自互補性因子組，即0ct3/4或?qū)儆贛yc、Klf和Sox因 子家族的因子。因一段或兩段編碼序列的導(dǎo)入而產(chǎn)生的細胞表達因子0ct3/4與選自Myc、 Klf和Sox的每個因子家族的至少一種因子的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知確定靶細胞中是 否會內(nèi)源性地表達至少兩種上述因子的方法。這些方法包括例如，蛋白質(zhì)印跡、實時PCR或 細胞間染色。技術(shù)人員還能夠立即意識到需要將何種外源因子補充到內(nèi)源性表達的因子組 中，以便產(chǎn)生會表達因子0ct3/4與選自Myc、Klf和Sox的每個因子家族的至少一種因子的 組合的細胞，從而引發(fā)靶細胞重編程為iPS細胞。因此，其中導(dǎo)入有可表達形式的編碼序列 的細胞可以表達一組因子，該組因子由因子0ct3/4和選自Myc、Klf和Sox的每個因子家族 的至少一種因子組成。本發(fā)明還涵蓋了其中導(dǎo)入的編碼序列已經(jīng)內(nèi)源性地存在于靶細胞中的實施方式。 在例如內(nèi)源性編碼序列僅低水平表達以致對應(yīng)的因子不會或不足以促進靶細胞的重編程 的情形中，該實施方式可能有效。術(shù)語“編碼序列”是指在轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生經(jīng)其編碼的產(chǎn)物的核苷酸序列。在與適合的 啟動子連接后，本發(fā)明的編碼序列可以非常容易地發(fā)生轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，編碼序列對應(yīng)于下述 基因的cDNA序列，所述基因在轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生有助于將靶細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞的 因子，其中本發(fā)明的方法中的重編程因子選自0ct3/4或?qū)儆贛yc、Klf和Sox因子家族的因 子?！坝兄趯屑毎鼐幊虨檎T導(dǎo)性多能干細胞的因子”是指能夠幫助誘導(dǎo)靶細胞 重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞的因子，其中所述因子選自0ct3/4和屬于Myc、Klf和Sox因 子家族的因子，這類重編程因子包括例如，0ct3/4、Sox2、Soxl、Sox3、c-Myc、n-Myc、1-Myc, KlfU Klf2、Klf4和Klf5等因子，或這些因子的具有保留的重編程能力的突變體。所述對 重編程的幫助可為如下形式例如將細胞的甲基化模式變?yōu)榕c胚胎干細胞類似的甲基化模 式，將細胞的表達模式轉(zhuǎn)換為胚胎干細胞的表達模式，或者通過將組蛋白的結(jié)合調(diào)節(jié)為與 胚胎干細胞中所觀察到的相類似來影響聚合核DNA的構(gòu)象，其中，通過適合的重編程因子， 上述的每種形式都可單獨或以組合的方式得以實現(xiàn)。除上述的因子之外，技術(shù)人員還了解 鑒定其他適合的重編程因子的方法，諸如亞硫酸氫鹽基因組測序、RT-PCR、實時PCR、微列陣 分析、染色體組型分析、畸胎瘤形成、堿性磷酸酶染色等方法，所有這些方法都為本領(lǐng)域技 術(shù)人員所公知并例如描述于如下文獻中=Okita, K.等，(2007), Nature 448(7151) :313-7 ； Park, I. H.等，(2008)，Nature 451(7175) :141-6 ;Takahashi，K.等，(2007)，Cell 131(5) 861-72 ；ffernig, M.等，(2007), Nature 448(7151) :318-24 ；Takahashi, K.等，(2007)， Nat Protoc 2(12) :3081-9 ；Hogan, B.等，(1994), "Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbour Press。0ct3/4屬于八聚體(“Oct”)轉(zhuǎn)錄因子家族，并在維持多功能性中起作用。在正 常表達0ct3/4的細胞(諸如卵裂球細胞和胚胎干細胞)中0ct3/4的缺失會導(dǎo)致自發(fā)的滋 養(yǎng)細胞分化。因此，0ct3/4的存在有助于胚胎干細胞維持多功能性和分化潛能。Oct家族中包括Octl和0ct6的諸多其他基因不能引發(fā)誘導(dǎo)，由此說明0ct3/4在誘導(dǎo)過程中的排他 性。術(shù)語“0ct4”在此可以和術(shù)語“0ct3/4”互換使用。Sox基因家族和0ct3/4類似，與維持多功能性有關(guān)，雖然與0ct3/4相反，該基因 家族是和專能干細胞(multipotent stem cell)和單能干細胞(unipotent stem cell)有 關(guān)，而0ct3/4只在多能干細胞中表達。Klf基因家族的Klf4最初被鑒定為產(chǎn)生小鼠iPS細胞的因子，亦被表明是產(chǎn)生人 類誘導(dǎo)性多能干細胞的因子。Myc家族中的基因是在癌癥中所涉及的原癌基因。已表明C_MyC是與小鼠iPS細 胞的產(chǎn)生相關(guān)的因子，也是與人iPS細胞的產(chǎn)生相關(guān)的因子。對作為臨床治療的iPS細胞 的不測事件而言，將“Myc”基因家族導(dǎo)入靶細胞來產(chǎn)生iPS細胞會帶來麻煩，因為25%的小 鼠在移植了由c-Myc誘導(dǎo)的iPS細胞后長出了致死性的畸胎瘤。已鑒定N-Myc和I-Myc可 以以相似的效率替換c-myc。本發(fā)明中所用的術(shù)語“重編程”是指改變細胞的基因型和表型特征而產(chǎn)生在基因 型和/或表型上與胚胎干細胞類似的細胞的過程。所述改變包括例如上文所述的甲基化模 式的改變、表達模式的轉(zhuǎn)換或聚合核DNA的構(gòu)象的改變。以上內(nèi)容在作必要修正后適用于本文中下述其他實施方式。本發(fā)明中的方法是基于可以通過導(dǎo)入僅兩種重編程因子而獲得iPS細胞的驚人 發(fā)現(xiàn)。在此發(fā)現(xiàn)之前，現(xiàn)有技術(shù)的信條是在體內(nèi)實驗中具功能性的(即能夠有助于形成三 種胚層)有存活能力的iPS細胞只能通過導(dǎo)入至少三種重編程因子來產(chǎn)生，且通過導(dǎo)入四 種重編程因子的組合更加有效。已舉例表明，通過利用逆轉(zhuǎn)錄病毒MX載體系統(tǒng)導(dǎo)入由四種GF)、三種(3F)和僅兩 種OF)重編程因子組成的組合以及導(dǎo)入僅一種重編程因子可以使小鼠神經(jīng)干細胞(NSC) 重編程。所述NSC是從成年0G2/ROsd6雜合轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦建立的(Ryan，A. K.和 Rosenfeld, M. G.，Genes Devil, 1207-25(1997) ；Do, J. Τ. ^P Scho ler, H. R. ,Stem Cells 22， 941-9(2004) ；Pollard, S. Μ. , Conti, L. , Sun,Y. ,Goffredo,D.禾口 Smith，A. ，Cereb Cortex 16Suppl 1，ill2-2(K2006))，其在 0ct4 啟動子(0ct4_GFP)和來自組成型 Rosa^ 位點的 IacZ轉(zhuǎn)基因的控制下表達GFP。首先觀察到的是在用0ct4和Klf4感染QF 0K)的NSC培養(yǎng)物中出現(xiàn)了 GFP+集 群，1 2周后在用0ct4和c-Myc感染QF 0M)的細胞培養(yǎng)物中也觀察到了同樣集群(表 1)。表1 所用的重編程因子組合、GFP集群形成時機及iPS細胞系的建立總覽
被轉(zhuǎn)染的因子GFP陽性集群的出現(xiàn)時機iPS細胞系的建立
OK2 3周+OM3 4周+進一步分析2F OM誘導(dǎo)性多能干細胞，其顯示出具有ESC樣表達圖譜并且有助于 畸胎瘤中三種胚層的形成。將2F OK iPS細胞與4F iPS細胞(使用導(dǎo)入4種重編程因子來產(chǎn)生iPS細胞的標 準方法而產(chǎn)生)和ESC進行比較。在感染后第14天，分離出5個GFP+集群，并使其在ESC培養(yǎng)條件下進行增殖(圖lc、lf)，產(chǎn)生了 3個(即60% )2F OK iPS細胞克隆體(B_2、D_7 和F-4)，其在形態(tài)上與ESC無法區(qū)分(圖ld、lg)。在用對照病毒(MX)感染的NSC中無集 群形成(圖le、Ih)。從0ct4-GFP+集群的數(shù)量和MX-GFP對照病毒對NSC的轉(zhuǎn)導(dǎo)率，按時間 進程估算了 2F OK iPS細胞和4F iPS細胞的重編程效率(圖li、j)。由此，計算出NSC的 4F重編程的重編程效率為3. 6 %，而雙因子法的重編程效率為0. 11 %，這與進行選擇(低 T 0. 08% ；Takahashi, K.和 Yamanaka，S.，Cell 126，663-76 (2006) ；Okita，K.，Ichisaka， Τ.和 Yamanaka，S.，Nature 448,313-7(2007) ；ffernig, M.等，Nature 448，318-24 (2007)) 和未進行選擇(0. 5% ；Meissner, A.，ffernig, M.和 Jaenisch，R.，Nat Biotechnol 25， 1177-81 (2007))(圖Ij)的成纖維細胞的重編程效率相當(dāng)。用全部四種因子進行轉(zhuǎn)導(dǎo)對 GFP+集群的出現(xiàn)時機和數(shù)量都具正面效果。用基因分型PCR可確認病毒轉(zhuǎn)基因的整合。在 4F iPS細胞中可檢測到所有四種因子的病毒轉(zhuǎn)基因，而2F OK iPS細胞只含有0ct4和Klf4 轉(zhuǎn)基因。2F OK iPS細胞在SSEA-I和堿性磷酸酶染色中顯示陽性，并且顯示出與4F iPS細 胞和ESC相似的ES細胞標志基因的表達圖譜(圖加)。實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR) 結(jié)果顯示，2F OK iPS細胞中內(nèi)源性0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4的表達與ESC相當(dāng)，并且在 2F OK iPS細胞中病毒轉(zhuǎn)錄物隨著在30天后減少1000倍而沉默。2F iPS的總體基因表達 也簇集而接近于ESC和4F iPS(圖2b)。DNA微列陣分析的散點圖顯示和2F iPS細胞與 NSC之間的相似度相比，2F iPS細胞與ESC之間的相似度更高(圖2c、2d)。因此，2F iPS 細胞(集群F-4)似乎在總體轉(zhuǎn)錄水平上與小鼠ESC非常相似。通過在體外分化為擬胚體(EB)可確認2F OK iPS細胞的分化能力。這些細胞表 達外胚層標記物(Tujl)、內(nèi)胚層標記物(甲胎蛋白)和中胚層標記物Flkl (由模擬心肌細 胞來使細胞搏動而表達)(圖3a)。畸胎瘤則包含全部三個胚層的衍生細胞(圖3b)且表達 三種胚層的標記物。供體細胞(NSC)中并未形成畸胎瘤。這些數(shù)據(jù)表明，2F OK iPS細胞在 體內(nèi)和體外都顯示多功能性表型。為了研究其發(fā)育潛力，將2F OK iPS細胞與8細胞期胚胎聚集。iPS細胞在囊胚發(fā) 育過程中有助于形成內(nèi)層細胞群(圖如)。將聚集的囊胚導(dǎo)入假孕的雌性體中之后，在胚 齡13. 5天時獲得16個活胚胎，由0ct4-GFP的表達判斷，其中有2個胚胎顯出胎生殖腺中 的生殖細胞的貢獻(圖4b)。用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)對來自全 胚胎的胚胎組織的染色(使攜帶Rosa β-geo26 (IacZ)轉(zhuǎn)基因的NSC供體細胞可視化)揭 示，在所產(chǎn)生的嵌合體中，2F OK iPS細胞有助于全部三個胚層的發(fā)育(圖k、4e)。對四倍 體GN)胚胎聚集體(n = 122)發(fā)育能力的最嚴格測試導(dǎo)致在胚齡13. 5天時產(chǎn)生2個死亡 (停滯)胚胎(圖4d)。對4Ν胚胎聚集體而言這處于正常范圍內(nèi)，與所導(dǎo)入細胞的多功能性 缺失并無關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)表明iPS細胞可以產(chǎn)生后期胚胎的所有組織。在二倍體ON)聚 集體中，PCR基因分型顯示在13個嵌合體中有2個對供體細胞的0ct4-GFP等位基因呈陽性 (圖4f和4g(上圖))。將嵌合體與⑶-1雌性體交配，以評估2F OK iPS細胞是否有助于 形成種系。在12個幼崽中，有2個有0ct4-GFP等位基因，而12只小鼠中有1只具有IacZ 等位基因。由于供體細胞源自異源小鼠(0ct4/-ROsd6+/-)，它們同樣有0ct4和Klf4轉(zhuǎn)基 因(圖4g(下圖))。在成年嵌合體17周齡時和Fl小鼠3周齡時均未觀察到腫瘤的形成。 該發(fā)現(xiàn)說明，2F OK iPS細胞可以參與嵌合體的全程發(fā)育，產(chǎn)生下一代(Fl)可存活幼崽，因此表明iPS細胞具有與ESC相似的發(fā)育性質(zhì)。如下文實施例9中所詳細描述，本發(fā)明人還能夠展示通過導(dǎo)入兩種或僅一種重編 程因子將人類細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉毎?。所述重編程因子?ct4，或者0ct4與Klf4。綜上所述，上述發(fā)現(xiàn)展示了用兩種重編程因子或僅一種重編程因子成功產(chǎn)生了誘 導(dǎo)性多能干細胞。本發(fā)明的方法的優(yōu)越性在于使用僅兩種甚至僅一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來進 行一種或兩種重編程因子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。使用比現(xiàn)有技術(shù)方法數(shù)目更少的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來 誘導(dǎo)iPS細胞的可能性，是實現(xiàn)使得對于待重編程的起始細胞群的遺傳調(diào)節(jié)最小化的重要 一步。因此，形成異常細胞和腫瘤發(fā)生細胞的風(fēng)險顯著降低，因而允許產(chǎn)生適于尤其是治療 目的的iPS細胞。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施方式中，屬于Myc、Klf和Sox因子家族的、且被內(nèi) 源性表達或由待導(dǎo)入靶細胞的編碼序列所編碼的因子，選自由1-Myc、n-Myc、c-Myc、KlfU Klf2、Klf4、Κ1Π5、Soxl、Sox2、Sox3、Soxl5 和 Soxl8 組成的組。例如小鼠0ct3/4、Sox2、c_Myc和Klf4的編碼序列分別可見于SEQID NO :1、5、9和 13。小鼠0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的蛋白序列分別可見于SEQ ID NO :2、6、10禾口 14。 人類0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的編碼序列分別可見于SEQ ID NO :3、7、11和15。人類 0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的蛋白序列分別可見于SEQ ID NO :4、8、12和16。技術(shù)人員 能夠使用本領(lǐng)域中公知的方法，為任何靶物種確定其重編程因子的編碼序列。例如，技術(shù)人 員可以從數(shù)據(jù)庫(諸如由美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)維護的且可通過萬維網(wǎng)地址 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/訪問的數(shù)據(jù)庫)獲取有關(guān)于序列和功能的數(shù)據(jù)。此外，用 于比較基因組學(xué)的數(shù)據(jù)庫包括但不限于網(wǎng)址為http://WWW. dcode. org/的同樣由NCBI維 護的數(shù)據(jù)庫，訪問地址為http://Supfam. org/SUPERFAMILY/的所有完全測序的生物體的 蛋白質(zhì)注釋數(shù)據(jù)庫，訪問地址為http://www. cbs. dtu. dk/services/GenomeAtlas/的包括 諸多物種的基因組信息的數(shù)據(jù)庫，或訪問地址為http://phigs. jgi-psf. org/的包含基因 簇的數(shù)據(jù)庫。所述數(shù)據(jù)庫使得技術(shù)人員能夠從小鼠和人類的已知序列開始，通過例如進行 跨物種序列比對而鑒定同源基因，從而鑒定其他物種的重編程因子的編碼序列。幾篇最近剛剛發(fā)表的科學(xué)論文(Hanna，J.等，Q007). Science318 (5858) 1920-3 ；Meissner, A.等，(2007). Nat Biotechnol 25(10) :1177-81 ；Nakagawa, M.等， (2007). Nat Biotechnol. ；Okita, K.等，(2007), Nature448(7151) :313-7 ；Takahashi, K.等，(2007) , Cell 131 (5) :861-72 ；ffernig, M.等，(2007). Nature 448(7151) 318-24 ；Yu, J.等，(2007). Science 318(5858) :1917-20 ；Park, I. H.等，(2008). Nature 451(7175) :141-6)已顯示，屬于0ct、Sox、Klf和Myc家族的轉(zhuǎn)錄因子能參與誘導(dǎo)小鼠和人 類體細胞的重編程。在另一個優(yōu)選實施方式中，靶細胞不會內(nèi)源性地表達由一段或兩段待導(dǎo)入所述靶 細胞的編碼序列所編碼的因子中的一個。評估因子內(nèi)源表達的方法已為技術(shù)人員所公知，并在本說明書的其他部分有所描 述。為了依據(jù)本發(fā)明的方法來產(chǎn)生iPS細胞，靶細胞可以不內(nèi)源性地表達由一段或兩段待 導(dǎo)入所述靶細胞的編碼序列所編碼的因子中的一個。例如，能夠表明，在作為靶細胞的小鼠 神經(jīng)干細胞中不表達0ct3/4，而Sox2、Klf4和c-Myc被內(nèi)源性表達。外源性導(dǎo)入0ct3/4及 隨后的表達足以補充重編程因子四重組并誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細胞。
在又一個優(yōu)選實施方式中，靶細胞是專能干細胞。專能干細胞可產(chǎn)生幾種其他的 細胞類型，但這些類型的數(shù)量有限制。這與能夠分化為任何細胞類型的多能干細胞迥然不 同。專能干細胞的一個實例是見于例如骨髓、臍帶血或循環(huán)系統(tǒng)中的造血細胞，造血細胞可 發(fā)展為幾種類型的血細胞，但不能發(fā)展為其他類型的細胞。專能干細胞的另一個實例是神 經(jīng)干細胞。由于專能干細胞已經(jīng)含有未經(jīng)調(diào)節(jié)的重編程因子，因而專能干細胞特別適于作 為重編程靶細胞。在更優(yōu)選的實施方式中，專能干細胞是外胚層細胞。外胚層是構(gòu)成極早期胚胎的三種主要胚細胞層的最外層(其他兩層是中胚層和 內(nèi)胚層)。外胚層分化而產(chǎn)生多種重要組織和結(jié)構(gòu)，包括皮膚的外層及其附屬部分(汗腺、 毛發(fā)和指甲)、牙齒、眼球的晶狀體、內(nèi)耳的部件、神經(jīng)組織、大腦和脊髓。由于外胚層細胞和 神經(jīng)干細胞一樣已經(jīng)內(nèi)源性地表達重編程因子，作為專能干細胞的外胚層細胞特別適于用 作靶細胞。在另一個優(yōu)選實施方式中，靶細胞是神經(jīng)干細胞(NSC)。神經(jīng)干細胞不僅存在于正在發(fā)育的哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，還存在于所有哺乳動物 生物體(包括人類)的成熟神經(jīng)系統(tǒng)中。神經(jīng)干細胞還可源于更早期的胚胎干細胞。成體 干細胞的位置以及它們的后代為了進行分化而遷移至的大腦區(qū)域尚未確定，雖然可行的位 置的數(shù)目在成體中非常有限(綜述參見fege，2000)。神經(jīng)干細胞由于已經(jīng)內(nèi)源性地表達重 編程因子而特別適于作為靶細胞。在一個更加優(yōu)選的實施方式中，待導(dǎo)入的編碼序列編碼因子0ct3/4。如上文所概述和下文實施例中所展示，將0ct3/4單獨導(dǎo)入神經(jīng)干細胞中足以 產(chǎn)生iPS細胞。由于G-Myc提高了嵌合體幼崽的致腫瘤性(Okita, K.，Ichisaka, T.和 Yamanaka, S.，Nature 448，313-7 Q007))，最近的研究表明，在沒有c_Myc逆轉(zhuǎn)錄病毒性 整合的情況下可產(chǎn)生 iPS 細胞(Nakagawa，M.等，Nat Biotechnol 26,101-106(2008)； ffernig, Μ. , Meissner, A. , Cassady, J. P.禾口 Jaenisch, R. , Cell Stem Cells 2, 11-12 (2008))，這是一項重大改良。然而，如本實施方式所示不使用c-Myc來誘導(dǎo)iPS細胞 并結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體數(shù)目的減少的可行性，是實現(xiàn)使得對于待重編程的起始細胞群的遺 傳調(diào)節(jié)最小化的一個重要步驟。通過導(dǎo)入僅兩種因子，也可將相同靶細胞重編程。因此，在另一個更優(yōu)選的實施方 式中，待導(dǎo)入的兩段編碼序列編碼因子0ct3/4和c-Myc，或者0ct3/4和Klf4。在一個更加優(yōu)選的實施方式中，靶細胞內(nèi)源性地表達因子c-Myc、Klf4和Sox2?？杀砻靼屑毎趦?nèi)源性地表達上述重編程因子的組合時，其可在導(dǎo)入一種或兩種 外源重編程因子(諸如僅0ct3/4，或者0ct3/4和c-Myc，或者0ct3/4和Klf4)后被修正為 重編程。在一個更加優(yōu)選的實施方式中，靶細胞內(nèi)源性地表達因子c-Myc、Klf4和Sox2，其 表達水平最低10倍低于或最高10倍高于與該靶細胞同屬的胚胎干細胞中相應(yīng)的表達水 平。根據(jù)本發(fā)明的方法，相對于與靶細胞同屬的ESC中的表達水平，內(nèi)源性重編程因 子的表達水平處于一定范圍內(nèi)時是有利的。優(yōu)選的是，靶細胞內(nèi)源性地表達重編程因子 c-Myc,Klf4和Sox2，其表達水平最低10倍低于或最高10倍高于ESC中所述因子的相應(yīng)表達水平。更優(yōu)選的是，Sox的表達水平大約2倍高于、c-Myc表達水平大約10倍高于、和/ 或Klf4表達水平大約8倍低于與該靶細胞屬于同屬的ESC中的對應(yīng)水平。本發(fā)明的上下 文中所用的術(shù)語“大約”是指平均最大偏差為+/_20%，優(yōu)選為+/-10%。此外還考慮到基 因表達水平最低8、6、5、4、3或2倍(或其間的任意數(shù))低于或最高8、6、5、4、3或2倍(或 其間的任意數(shù))高于所述ESC中的對應(yīng)水平。在一個更優(yōu)選的實施方式中，靶細胞為小鼠或人類神經(jīng)干細胞。此外，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細胞。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多能干細胞可用于很多實驗或治療場合。例如，考慮到 在基因或細胞移植治療中使用iPS細胞、由其分化衍生的細胞或從所述iPS細胞產(chǎn)生的組 織、或者由所述iPS細胞衍生的作為治療劑或診斷劑的細胞，來鑒定和驗證基因組靶標和 藥物篩選方法。iPS細胞的培養(yǎng)條件同建立相應(yīng)物種的胚胎干細胞的培養(yǎng)條件相同，并且為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所公知。通常，細胞培養(yǎng)方法(諸如培養(yǎng)基的組分、標記物的選擇和選取、細 胞定量和分離)是本領(lǐng)域的公知方法，并在例如如下文獻中有所描述“!tactical Cell Culture Techniques，，，Boulton et Baker (編)，Humana Press (1992)，ISBN 0896032140 ； “Human Cell Culture Protocols，，，Gareth E. Jones, Humana Press (1996) , ISBN 089603335X ；而且在實施例部分中也有示例性描述。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)和維持細胞的方法在 本領(lǐng)域中是公知的；生長培養(yǎng)基和其他細胞培養(yǎng)相關(guān)原料以及成功培養(yǎng)細胞的操作說明和 方法可例如從Sigma-Aldrich或hvitrogen獲得。此外，本發(fā)明還涉及一種有助于將靶細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞的化合物的 鑒定方法，其包括如下步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的方法重編程靶細胞，其中用待測化合物代替 一段待導(dǎo)入的編碼序列；(b)評估在待測化合物存在和不存在的情況下是否形成iPS細胞， 用其中已導(dǎo)入待測化合物的靶細胞形成iPS細胞表明所述化合物有助于將靶細胞重編程 為誘導(dǎo)性多能干細胞。根據(jù)本發(fā)明，待測化合物可以是一種或多種核酸(如DNA、cDNA、RNA、dsRNA、 siRNA、shRNA、miRNA)、蛋白質(zhì)、肽、小分子(有機或無機)、化學(xué)物質(zhì)或其任意組合。根據(jù)本發(fā)明的方法的靶細胞重編程已在前文描述。根據(jù)待測化合物的性質(zhì)，本發(fā) 明的方法可能需要就將所述化合物導(dǎo)入靶細胞的步驟進行修正。例如，如果要評估其他轉(zhuǎn) 錄因子，可以不經(jīng)修飾如上所述導(dǎo)入對應(yīng)的編碼序列。相反，通過將對應(yīng)化合物外源性地加 入細胞培養(yǎng)基并利用被動或主動細胞攝入機制，可以導(dǎo)入化學(xué)物質(zhì)或小分子。技術(shù)人員熟 知允許將任何待測化合物導(dǎo)入細胞(優(yōu)選導(dǎo)入細胞核)的方法，從而測定該化合物是否可 以真正取代被其替換的因子來誘導(dǎo)靶細胞的重編程。諸如DNA、cDNA、RNA、dsRNA、siRNA、 shRNA、miRNA等核酸可通過轉(zhuǎn)染或感染而導(dǎo)入，而小分子(無機或有機)和化學(xué)物質(zhì)則直 接穿透細胞膜而導(dǎo)入。技術(shù)人員熟知評估在待測化合物存在和不存在的情況下是否形成iPS細胞的方 法。iPS細胞的分類標準已為技術(shù)人員所知并在前文中有所描述。根據(jù)待評估的標準，方法 有所不同且可包括例如，通過顯微鏡直觀控制、標記物的表達分析、畸胎瘤的形成等單獨 方法或其組合。在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性表達有助于所述細胞重編程的因子組的細胞可通過外源性添加其它因子而得到補充，所述因子的外源性添加產(chǎn)生表達重編程因子四重組(即 0ct3/4和來自Myc、Klf和Sox每個因子家族的一種因子)的細胞，從而導(dǎo)致對該靶細胞的 重編程的誘導(dǎo)；上述發(fā)現(xiàn)極大簡化了對可替代重編程過程中的因子的化合物的鑒定。因為 僅需導(dǎo)入一種或兩種因子來產(chǎn)生適于篩選的細胞，替代了所屬領(lǐng)域中所知的三種因子或全 部四種因子的組，從而實現(xiàn)了時間、花費和實驗困難的大幅度減少。此外，通過減少需導(dǎo)入 的因子組，在時間和效率方面將會明顯改進大量篩選新穎重編程因子的方法。另外，本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法，其包括如下步驟(a)將 本發(fā)明中的誘導(dǎo)性多能干細胞或通過本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細胞導(dǎo)入非人 類的植入前胚胎；(b)將步驟(a)中的胚胎轉(zhuǎn)移至雌性非人類動物子宮中；(c)讓該胚胎發(fā) 育并出生。本發(fā)明中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因非人類動物”是指其基因組已通過本文所述的方法 進行慎重修飾的動物。本發(fā)明的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法優(yōu)選根據(jù)通過使用胚胎干細胞來產(chǎn)生轉(zhuǎn) 基因非人類動物的已確立方法來實施，但是將胚胎干細胞替換為本發(fā)明的iPS細胞。所 述方法在本領(lǐng)域中是公知的(Hogan，B.，R. Beddington 等，(1994)，“Manipulating the Mouse Embryo :A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbour Press ；Hanna, J.等， (2007), Science 318(5858) :1920-3 ；Meissner, Α.等，(2007)，Nat Biotechnol 25(10) 1177-81 ；Nakagawa, M.等，(2007), Nat Biotechnol. ；Okita, K.等，(2007), Nature 448(7151) :313-7 ；Takahashi, K.等，(2007)，Cell 131 (5) :861-72 ；ffernig, Μ.等， (2007) ,Nature448 (7151) :318-24 ；Yu, J. (2007), Science 318(5858) :1917-20 ；Park, I. H.等，(2008), Nature 451(7175) :141-6)。簡言之，優(yōu)選通過顯微注射至桑椹胚或囊胚 中或者通過將iPS細胞與8細胞期胚胎或桑椹胚聚集，來實現(xiàn)將iPS細胞導(dǎo)入非人類的植 入前胚胎(如桑椹胚或囊胚)。而后將所述嵌合體胚胎轉(zhuǎn)移至假孕的非人類雌性體的子宮 中，在此處讓其發(fā)育為胚胎并最終出生(參見實施例8)。由iPS細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類動物系基于所述iPS細胞的多功能性(即在注射至 諸如囊胚或桑椹胚等正在發(fā)育胚胎的宿主內(nèi)后，iPS細胞參與胚胎發(fā)育以及有助于所產(chǎn)生 動物的生殖細胞的形成)。如前文所概述，可以使得含有注入的iPS細胞的囊胚在假孕的非 人類雌性體子宮中發(fā)育并作為嵌合體出生。所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物嵌合有源自iPS細胞的細 胞，將其與野生型非人類動物進行回交并篩選出僅攜帶iPS細胞的遺傳物質(zhì)的動物，由此 可以鑒定出DNA片段組合的純合子轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因非人類動物可以是例如轉(zhuǎn)基因的小鼠、大鼠、倉鼠、狗、猴、兔、豬或牛。所述 轉(zhuǎn)基因非人類動物優(yōu)選為小鼠。因此本發(fā)明亦涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人類動物。最后，本發(fā)明涉及一種含有通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的iPS細胞的組合物，所述組 合物用于基因療法、再生醫(yī)學(xué)、細胞療法或藥物篩選。本文所用的組合物涉及含有iPS細胞且優(yōu)選包含維持所述細胞的細胞活力的其 他組分的組合物。此類組分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，且包括例如細胞培養(yǎng)基組分。另外， 根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用，該組合物可包含額外的組分，例如有助于對患者施用的組分。含有本發(fā)明的iPS細胞的組合物(以及本發(fā)明的iPS細胞本身)可用于很多實驗和治療場合。本發(fā)明中的iPS細胞具有相對較低數(shù)量的轉(zhuǎn)基因表達要素和整體降低的發(fā) 展為癌細胞的風(fēng)險，據(jù)預(yù)期其可在基因療法、再生醫(yī)學(xué)、細胞療法或藥物篩選中產(chǎn)生有益作 用?；虔煼ㄊ腔蜣D(zhuǎn)移的最重要的應(yīng)用之一，其基于利用離體(ex vivo)或體內(nèi) 技術(shù)手段將用于修正遺傳缺陷的治療性DNA構(gòu)建體導(dǎo)入種系細胞中。適合于體外或體內(nèi) 基因療法的載體和方法在文獻中有所描述并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的(Davis PB, Cooper MJ.，MPS J. (2007), 19 ；9(1) :E11_7 ；Li S, Ma Ζ. ,Curr Gene Ther · (2001),1(2) 201-26)。依據(jù)本發(fā)明，獲自患者的細胞可例如通過本領(lǐng)域已知方法進行遺傳校正，并隨后 用本發(fā)明的方法將其重編程為具有ES細胞的表型和基因型的iPS細胞。這證實了 iPS細 胞在基因療法和/或細胞療法中的適用性。通過在體內(nèi)使受損組織再生或者在體外培養(yǎng)組 織和器官并隨后將其植入患者體內(nèi)，可以將再生醫(yī)學(xué)潛在地用于治療任何由機能障礙、損 傷或衰竭的組織所導(dǎo)致的疾病。本發(fā)明的iPS細胞能夠分化為幾乎任何組織(外胚層、中 胚層、內(nèi)胚層細胞)，可以用于再生醫(yī)學(xué)的任何方面，因而大大減少了對ES細胞的需求。本發(fā)明的iPS細胞也可用于鑒定藥物靶標和測試潛在的治療劑，因而減少對ES細 胞和體內(nèi)研究的需求。用于鑒定和/或評估潛在藥物的效果(包括例如靶位點和靶專一性、 毒性、生物利用率)的實驗設(shè)定和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。另外，iPS細胞可用于研究出生缺陷的預(yù)防和治療，或用于研究細胞分化。此外除治療性應(yīng)用以外，本發(fā)明的iPS細胞還可用于實驗設(shè)定中，來研究涉及到 在誘導(dǎo)靶細胞重編程時的細胞去分化的多個方面，例如基因表達圖譜或甲基化圖譜在空間 時間上的轉(zhuǎn)變，或?qū)е戮奂袨樽兓男螒B(tài)學(xué)變化。iPS細胞可進一步用于相關(guān)研究，例如 基因療法、基因靶向、分化研究、藥物安全性和效力檢測、自體同源或同種異源的再生組織 移植、組織修復(fù)(如神經(jīng)系統(tǒng)、心肌)、疾病(例如帕金森癥、心臟病、糖尿病、癌癥、白血病或 脊髓損傷)、胚胎基因表達、胚胎基因的遺傳操縱、早期胚胎學(xué)和胎兒發(fā)育、胚胎細胞標記物 的鑒定、細胞遷移或細胞凋亡。


圖1 由0G2/Rosa^轉(zhuǎn)基因小鼠的成體NSC產(chǎn)生2F 0ct/Klf4 (OK) iPS細胞。a.對ESC和NSC中的0ct4、Nanog、Klf4、Sox2和c_Myc的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) (RT-PCR)和實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)分析。β -肌動蛋白用作內(nèi)參對照。b.對 ESC和NSC中四種因子的蛋白質(zhì)印跡分析。抗肌動蛋白抗體用作內(nèi)參對照。c.感染后第14 天的2F OK iPS細胞集群的形態(tài)。表達0ct4-GFP的ESC樣集群(f)。d.感染后第30天， 在經(jīng)輻照的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上生長的已建立的2F OK iPS細胞(克隆體F-4) 的形態(tài)。顯示出相襯和0ct4-GFP(g)。e.感染后第30天，NSC和模擬物感染的形態(tài)(h)。 i.在2F OK和4F感染后第7、14和21天GFP陽性集群的產(chǎn)生(n = 3 ；誤差條表示標準偏 差)。j.產(chǎn)生2F和4F iPS細胞的重編程效率(n = 3)，所示為感染后第7、14和21天在每 50，000個平板接種的NSC中GFP+集群的總數(shù)。圖2 :iPS細胞的基因表達譜。a.對 ESC、4F iPS 細胞(克隆體 A_2c)、2F OK iPS 細胞(克隆體 B_2、D_7 和 F-4) 和NSC中的ES細胞標志基因的表達的RT-PCR分析。引物對來自各個內(nèi)源性位點的轉(zhuǎn)錄物具特異性。β-肌動蛋白用作內(nèi)參對照。b.NSC、2F(0K)iPS、4F iPS和ESC中的不同表達的 基因的熱力型數(shù)據(jù)圖(heatmap)?；?qū)哟尉垲愑媒^對值距離(cityblock distance)和平 均連鎖(average linkage)進行。c.采用DNA微列陣，在2F iPS細胞(克隆體F-4)和ESC 之間、以及在2F iPS細胞(克隆體F-4)和NSC之間的總體基因表達圖譜進行比較。d.黑 線表示在配對細胞類型之間的基因表達水平的2倍變化。與NSC或ESC相比，在2F iPS細 胞(克隆體F-4)中過表達的基因以藍色顯示，而次表達(imderexpress)的基因則以紅色 顯示。多功能性基因0ct4、Nanog、Sox2、c_Myc、Klf4和Lin28在散點圖中的位置已示出。 基因表達水平以log2來度量。圖3 :2F 0ct/Klf4(0K) iPS細胞(克隆體F-4)具多功能性且在體外和體內(nèi)分化。a.體外分化為全部三種胚層。在擬胚體形成后，將聚集體轉(zhuǎn)移至經(jīng)明膠涂布的培 養(yǎng)板上，讓其再分化10天。細胞用抗Tujl、抗甲胎蛋白(AFP)或抗Flkl染色。細胞核用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。b.包含全部三種胚層的F-4iPS細胞的畸胎瘤。 將F-4iPS細胞(1.5X106個細胞)皮下接種到裸鼠內(nèi)。四周后將畸胎瘤用蘇木精和曙紅 染料染色。所示為含有神經(jīng)花環(huán)(neural rosette)(外胚層)、肌肉(中胚層)和柱狀上皮 (內(nèi)胚層)的畸胎瘤。圖4 :2F 0ct/Klf4(0K) iPS細胞(集群F-4)的體內(nèi)發(fā)育潛力。a.經(jīng)M小時聚集后，F(xiàn)-4iPS細胞形成的嵌合體胚胎發(fā)育為了囊胚。熒光光學(xué)顯 示出位于囊胚的內(nèi)細胞群的0ct4-GFP細胞。b.F-4iPS細胞對小鼠胚胎發(fā)育的種系貢獻 如0ct4-GFP的表達所示。在胚齡13. 5天(E13. 5)用熒光顯微鏡分析胚胎。c，d.配種后 13. 5天(13. 5dpc)的嵌合體胚胎(對照、2N和4N)用5-溴-4-氯-3-叼丨哚- β -D-半乳 糖苷(X-gal)染色。e.對經(jīng)IacZ染色的13. 5dpc嵌合體胚胎QN)的組織學(xué)分析。f.由 F-4iPS細胞產(chǎn)生的嵌合體小鼠(8周齡)。其野灰色外皮的顏色源自F-4iPS細胞。g.源自 F-4iPS細胞的嵌合體的PCR基因分型。對0ct4-GFP進行PCR分析(上圖)。F_4iPS細胞 的種系傳遞。嵌合體雄性與CD-I雌性交配產(chǎn)生的子代的基因分型說明了 0ct4-GFP基因和 IacZ等位基因的存在，以及0ct4和Klf4病毒整合(下圖)。縮寫=Gastroint. tract.胃 腸道。圖5 源自單因子hNSC的iPS(lF hNiPS)細胞的集群形成和細胞系特征。(A)在NSC培養(yǎng)基中生長的hNSC的形態(tài)。(B)感染后10周經(jīng)hOCT4感染的細胞 的集群形成。(C)集群生長為hESC樣形態(tài)，但集群中央仍保留未經(jīng)重編程的神經(jīng)花環(huán)。(D) WSWhESC iPS集群，其在機械分離后生長于通道1的飼養(yǎng)層上(IF hNiPS克隆體C)。 (E)位于通道10的iPS集群的高倍放大圖。(F)對IF hNiPS集群進行AP染色。比例尺為 250 μ m0 (G) 2F hNiPS(克隆體Α)和IF hNiPS(克隆體C)細胞中多功能性標記物(0CT4、 SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)的免疫細胞化學(xué)分析。細胞核用4'，6_ 二脒基-2-苯基吲 哚(DAPI)染色(藍色)。比例尺為250 μ m。圖6 源自hNSC的iPS (hNiPS)細胞中的多功能性標記物的表達水平和DNA甲基 化分析。(A)對 HlhESC, hNSC、2F hNiPS 克隆體(A、B 和 C)以及 IF hNiPS 克隆體(A 和 C) 中的多功能性標記物的定量PCR分析。數(shù)據(jù)所示為使用對內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有特異性的引物 時相對于H9hESC的表達水平。RNA表達水平以對數(shù)標尺顯示。將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平參照β-肌動蛋白水平進行標準化。誤差條表示來自三等分試樣的標準偏差。(B)對H9hESC、hNSC、2F hNiPS克隆體(A、B和C)以及IF hNiPS克隆體(A和C)中的0CT4和NANOG啟動子區(qū)域的 亞硫酸氫鹽測序分析。對于給定擴增子，每行圓圈表示所在區(qū)域內(nèi)一個細菌克隆體的每個 CpG位點的甲基化狀態(tài)?？招膱A圈代表未甲基化的CpG，而實心圓圈代表甲基化的CpG。每 列底部的數(shù)字表示CpG 二核苷酸相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的位置(TSS ；+1)。圖7 源自hNSC的iPS (hNiPS)細胞在體外分化為全部三種胚層。(A)免疫熒光分析顯示2F和IF hNiPS細胞分化為全部三種胚層內(nèi)胚層(甲胎 蛋白；AFP)、中胚層(α-平滑肌肌動蛋白；α-SMA)和外胚層(β-微管蛋白IUb ；Tujl)0 細胞核用DAPI染色(藍色)。比例尺為100 μ m。(B)對源自2F hNiPS (克隆體Α)和IF hNiPS(克隆體C)細胞的1月齡的擬胚體(EB)分化的定量PCR分析。內(nèi)胚層(AFP、GATA6 和Soxl7)，中胚層(F0XF1和HAND1)和外胚層(NCAM1、PAX6和Soxl)。數(shù)據(jù)所示為相對于 每個未分化的親代hNiPS細胞的表達水平。RNA表達水平以對數(shù)標尺顯示。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平 參照肌動蛋白水平進行標準化。圖8 源自hNSC的iPS (hNiPS)細胞的體內(nèi)多功能性和總基因表達譜。(A)將2F hNiPS (克隆體A)和IF hNiPS (克隆體C)細胞移植入SCID小鼠體內(nèi)后 畸胎瘤的形成，并且在6 8周時將畸胎瘤截面切片并用蘇木精和曙紅染色。經(jīng)鑒定的細 胞的組織學(xué)截面切片代表了全部三種胚層內(nèi)胚層(呼吸上皮r)、中胚層(骨骼肌:m，軟 骨c)和外胚層(神經(jīng)上皮n)。截面切片的放大圖顯示了以箭頭指示的呼吸上皮、肌肉和 神經(jīng)上皮。比例尺為 ΙΟΟμπι。(B)hESCUF hNiPS (克隆體 C)、2F hNiPS (克隆體 A)、H9hESC 和HlhESC(左)的總基因表達的熱力型數(shù)據(jù)圖(左圖)和系統(tǒng)聚類分析(右圖)。(C)比 較總基因表達譜的散點圖，所對比的組合分別為IF hNiPS(克隆體C)和H9hESC(左圖)、 2F hNiPS(克隆體A)和H9hESC(中圖)、以及hNSC和IF hNiPS(克隆體C)(右圖)。黑線 表示在所配對的細胞群之間的基因表達水平的2倍差距。轉(zhuǎn)錄物的表達水平以log2來度 量。
具體實施例方式實施例本發(fā)明由如下實施例闡明實施例1 :0G2小鼠的生成將0G2 品種與 R0SA26 轉(zhuǎn)基因品種雜交(Do, J. Τ.和 Scholer, H. R.，Stem Cells 22,941-9(2004) ；Szabo, P. Ε.，Hubner, K.，Scholer, H.禾口 Mann，J. R.，Mech Dev 115， 157-6(^200 )，幾代之后產(chǎn)生neo/lacZ和0ct4_GFP轉(zhuǎn)基因的混合純合子小鼠。將純合子 0G2XR0SA^雄性小鼠與ICR雌性小鼠雜交產(chǎn)生雜合子幼崽，從而衍生出NSC。從5日齡 0G2 X R0SA26雜合子小鼠中收集腦組織。實施例2 誘導(dǎo)性多能干細胞的產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干(iPS)細胞和ESC生長于在經(jīng)輻照的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上 和ESC培養(yǎng)基(即補充有15% FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、β -巰基 乙醇和1000U/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM)中。使用Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche) 將編碼小鼠0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的pMX基逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別與包裝缺陷(packaging defective)輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293個細胞中。48小時后如此前所述收集 病毒上清液(Zaehres, H.和 Daley, G. Q.，(2006)，Methods Enzymol 420，49-64)。將源自 0G2/Rosa26轉(zhuǎn)基因小鼠的NSC以每個6孔細胞培養(yǎng)板5X IO4個細胞的密度進行接種，并 與含有病毒的上清液(補充有6yg/ml的硫酸魚精蛋白(Sigma))共溫育M小時以獲取四 種因子(1 :1:1: 1)或獲取0ct4和Klf4(l 1)。利用pMX-GFP對照病毒計算出轉(zhuǎn) 染效率。將細胞重新平板接種至新鮮的神經(jīng)擴增培養(yǎng)基中。感染2天后，將細胞在不進行 進一步的篩選的情況下在經(jīng)輻照的MEF上且在含有LIF的ESC培養(yǎng)基中進一步次培養(yǎng)。將 0ct4-GFP陽性的集群機械分離，而后將單個細胞分散并重新平板接種至MEF上。挑選集群 以進行擴增。實施例3 qRT-PCR分析依照制造商的操作說明，用MiniRNeasy試劑盒(Qiagen GmbH, HiIden，德國， http //www. qiagen. com)從細胞中提取出總RNA。依照制造商的操作說明，用High Capacity cDNA Archive 試劑盒(Applied Biosystems GmbH, Darmstadt,德國，http // www. appliedbiosystems. com)以按比例縮減的反應(yīng)體積(20 μ 1)進行互補DNA合成。使用 ABI PRISM Sequence Detection System 7900 (Applied BioSystems)和即用型 5，-核酸 酶Assay-on-Demand測定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平。對每個實時的擴增過程，模板等價于5ng總RNA。 測量以三等分試樣進行；使用無模板空白和每個樣品的RT-空白作為陰性對照。擴增曲線 和基因表達用管家基因Hprt作為內(nèi)參標準物進行標準化。使用Taqman Assay-on-Demand設(shè)計寡聚核苷酸，用于檢測如下基因 Pou5fl(0ct3/4) (Mm00658129_gH)、Sox2 (Mm00488369_sl)、c_Myc (Mm00487803_ml)、 Klf4(Mm00516104_ml)、B-Act (Mm00607939_sl)禾Π Hprtl (Mm00446968_ml)。用于檢測 Nanog和病毒序列的寡聚核苷酸是特別定制的。使用Δ Δ Ct法(ABI PRISM 7700Sequence Detection System,user bulletin#2)在針對每個探針/引物組所獲得的擴增曲線的對數(shù) 線性(log-linear)期在內(nèi)源性Hprt基因上對定量進行標準化。病毒特異性qRT-PCR用引物序列pMXs-0ct4 正向引物(PF) :5，-TGGTACGGGAAATCACAAGTTTG(SEQ ID NO 17)；反向 引物(PR) 5‘-GTCATAGTTCCTGTTGGTGAAGTTCA(SEQ ID NO 18)；探針5，-6FAM_CTTCACCATG CCCCTCA-MGB(SEQ ID NO :19)pMXs-Sox2PF 5' -GTGTGGTGGTACGGGAAATCAC (SEQ ID NO 20) ；PR 5' -TTCAGCTCCGTCTCCATCATG(SEQ ID NO :21)；探針5，-6FAM-TGTACAAAAAAGCAGGCTTGT-MG B(SEQ ID NO 22)pMXs-Klf4 PF -GTGTGGTGGTACGGGAAATCA (SEQ ID NO 23) ；PR 5' -CGCGAACGTGGAGAAGGA(SEQ ID NO :24)；探針5，-6FAM-CTTCACCATGGCTGTCAG-MGB(SEQ ID NO 25)pMXs-cMyc PF : 5，-TGGTACGGGAAATCACAAGTTTG(SEQ ID NO :26) ；PR 5'-GTCATAGTT CCTGTTGGTGAAGTTCA (SEQ ID NO :27)；探針5，-6FAM-CTTCACCATGCCCCTCA_MGB (SEQ ID NO: 28)Nanog PF 5'-AACCAGTGGTTGAATACTAGCMTG (SEQ ID NO :29) ；PR :5，_CTGCAATGGAT GCTG GGATACT (SEQ ID NO :30)；探針5，-6FAM_TTCAGM GGGCTCAGCAC-MGB (SEQ ID NO :31)
實施例4:微列陣分析基本上如前所述(Ruau，D.等，(2008)，StemCells)，使用 Affymetrix Mouse Genome 4302. OGeneChip 陣列(Affymetrix，Santa Clara, CA)進行微列陣研究。簡言之， 使用含脫氧核糖核酸酶酶切作用的RNAeasy kit Oliagen，Hilden，德國)從細胞中提取總 RNA。利用GeneChip One-Cycle標記試劑盒(Affymetrix)從3 μ g總RNA中取得用生物素 標記的 cRNA。將 15 微克 cRNA 切段并于 45°C與 Affymetrix 4302. OGeneChip arrays 雜交 16小時。使用Affymetrix Fluidics裝置和GCS3000掃描儀將DNA芯片沖洗、染色并進行 掃描，并使用GCOS軟件分析所得圖像。胚胎干細胞和誘導(dǎo)性多能干細胞的實驗進行三次平 行測量，而神經(jīng)干細胞的實驗則進行兩次平行測量。利用在BioConductor軟件中施行的 RMA 算法(Irizarry, R. Α.等，(2003)，Nucleic Acids Res 31，el5)計算進行標準化。實施例5 :iPS細胞的體外分化通過FACS分析法收集0ct4_GFP細胞并用于體外分化為擬胚體(EB)，所述分化利 用懸滴在不含LIF的ESC培養(yǎng)基中進行。3天后將擬胚體平板接種至經(jīng)明膠涂布的4孔皿中 并再持續(xù)10天。使用抗Tujl抗體(1 100 ;ChemiC0n)、抗甲胎蛋白(AFP)抗體(1 100 ； R&D Systems)或抗 Flkl 抗體(1 100 ；R&D Systems)對細胞染色。實施例6 蛋白質(zhì)印跡分析、SSEA-I和AP染色對從ESC和NSC制備的全細胞裂解物QXlO6)進行蛋白質(zhì)印跡分析，以分析 0ct4 (Santa Cruz)、Sox2 (Santa Cruz), Klf4 (Abeam)和 c-Myc (Abeam)的表達。在所有樣 品中使用β-肌動蛋白表達水平作為內(nèi)參對照(Abeam)。依照制造商的操作規(guī)程使用ES細胞表征試劑盒(Chemicon)進行SSEA-I和堿性 磷酸酶(AP)染色。實施例7:畸胎瘤的形成將iPS細胞和NSC細胞(1.5X106個細胞/小鼠)皮下注射至裸鼠背部側(cè)肋。在 注射4周后，用4%的多聚甲醛(PFA)過夜固定已形成的畸胎瘤，隨后將其包埋于石蠟中。 截面切片用蘇木精和曙紅染料染色。實施例8 嵌合體的形成將iPS細胞與裸露的致密化后的8細胞期小鼠胚胎聚集并培養(yǎng)。簡言之，在配種 后1. 5天將2細胞期的胚胎從鼠體KC57BL/6XC3H)F1雌性XOTl雄性]中沖洗出并置于 M2培養(yǎng)基中，并在含0. BSA的KSOM培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至8細胞期。從用胰蛋白酶短期 處理的第2天培養(yǎng)物中選取松散連接的iPS細胞團(10 20個細胞)，并將其轉(zhuǎn)移至在礦 物油下的含10% FCS的KSOM培養(yǎng)基微滴中；將每個細胞團置于微滴的一個凹陷中。與此 同時，將每批含30 40個胚胎的若干批胚胎與酸化Tyrode溶液短期溫育，直至透明帶被 分解。將單個胚胎置于上述細胞團上。所有的聚集體都以此方式組裝，并于37°C在含5% CO2的空氣氣氛中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)M小時后大部分聚集體都已形成囊胚。將總共64個聚 集的囊胚(配種2. 5天后)轉(zhuǎn)移至5只假孕小鼠(CD-I背景)的子宮角中。實施例9 通過0ct4重編程人類神經(jīng)干細胞如前所述，將源自人類胎兒腦組織的hNSC在無血清NSC培養(yǎng)基中擴增(參看圖 5A)(Kim 等.，Exp Neurol 199,222(2006) ；Park 等，Nat Biotechnol 20,1111 (2002)) 首 先用編碼人類0CT4和KLF4(2F)或者0CT4(1F)的pMX感染hNSC。然后，將已被感染的hNSC置于NSC培養(yǎng)基中(Kim等.，Exp Neurol 199，222 (2006))保養(yǎng)至多7天。感染后第8天， 將細胞重新平板接種至hESC培養(yǎng)基中的細胞飼養(yǎng)層上，該hESC培養(yǎng)基中含有l(wèi)Ong/ml堿 性成纖維細胞生長因子(bFGF)和MEF條件培養(yǎng)基(CM)，且二者比例為1 1 ；上述培養(yǎng)物 繼續(xù)生長，直至hESC樣集群出現(xiàn)。在感染后10 11周內(nèi)，鑒定出hESC樣iPS集群，但集 群中央看上去仍像是神經(jīng)花環(huán)(參看圖5B)。在之后的5 6天內(nèi)，上述集群繼續(xù)長大并 顯示典型的hESC樣形態(tài)，但在集群中央仍留有神經(jīng)花環(huán)(參看圖5C)。將神經(jīng)花環(huán)從上述 集群中移除。然后，通過機械分離將一片集群轉(zhuǎn)移至細胞飼養(yǎng)層上(參看圖5D)。通過從 被0CT4感染的hNSC中進行挑揀，在三個hESC樣集群中，成功地建立了其中兩個的克隆體 (IF hNiPS克隆體A和C，重編程效率為0.02% )。此外，在感染后7 8周內(nèi)，在經(jīng)雙因子 (2F)感染的hNSC中的5個hESC樣集群中，成功建立了其中3個的克隆體QF hNiPS A、B 和C，重編程效率為0.15%)。所有上述克隆體可在hESC培養(yǎng)條件下進行擴增。IF hNiPS 細胞在形態(tài)上與hESC類似，并在堿性磷酸酶染色中呈陽性(參看圖5E和F)。免疫熒光染 色證實，2F和IF hNiPS細胞一致表達包括0CT4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81的多功能性 標記物(參看圖5G)。這些結(jié)果表明，可通過0CT4和KLF4以及僅0CT4從hNSC產(chǎn)生人類 iPS細胞。接下來，通過定量RT-PCR分析在分子水平上測試這些iPS細胞中多功能性標記物 基因的表達水平。2F和IF hNiPS細胞內(nèi)源性地表達hESC特異性標記物、與H9和HlhESC 類似、并且與親代hNSC相比被上調(diào)(參看圖6A)?；蛐头中蚉CR顯示IF hNiPS克隆體在 其基因組中僅含有0CT4轉(zhuǎn)基因，而2F nNiPS克隆體含有0CT4和KLF4轉(zhuǎn)基因。此外已確 認，除了 2F hNiPS克隆體B中的0CT4的表達，轉(zhuǎn)基因0CT4或KLF4的表達水平在2F和IF hNiPS克隆體中被顯著沉默。DNA印跡分析確認了在2F和IF hNiPS克隆體中的0CT4轉(zhuǎn)基 因的整合。為了排除在實驗室中iPS細胞克隆體經(jīng)來自hESC的污染物產(chǎn)生的可能性，進行 了 DNA指紋識別分析并確認hNiPS細胞與供體hNSC精確相關(guān)(參看表2)。為了確認來自重編程細胞的0CT4和NANOG啟動子的核外遺傳性重建，進行了亞硫 酸氫鹽測序以確定上述兩個啟動子的去甲基化。相對于供體hNSC，2F和IF hNiPS細胞中 的0CT4和NANOG的啟動子區(qū)域被去甲基化，這與hESC類似。綜上，能夠通過僅轉(zhuǎn)導(dǎo)0CT4 在分子水平上將hNSC重編程為類似于hESC的iPS細胞。接下來，通過擬胚體(EB)分化和直接分化，測試了 2F和IF hNiPS細胞的體外多 功能性。通過EB分化，hNiPS細胞很容易地分化為內(nèi)胚層(AFP)、中胚層(α-SMA)和外胚 層(Tujl)(參看圖5A)，并且通過定量RT-PCR分析，確認了來自直接分化的全部三種胚層 的標記物的表達(參看圖7B)。為了確認這些人類iPS細胞的體內(nèi)多功能性，將這些細胞 皮下移植至重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的小鼠體內(nèi)。在注射6 8周后，2F和IF hNiPS細 胞形成了含有全部三種胚層的畸胎瘤，包括呼吸道、骨骼肌、軟骨和神經(jīng)上皮(參看圖8A)。 這些結(jié)果說明2F和IF hNiPS細胞在體內(nèi)和體外均具有和hESC類似的多功能性。最后，通過cDNA微列陣，對hNSC、源自hNSC的2F和IF hNiPS細胞、H9和HlhESC 進行了總體基因表達分析。熱力型數(shù)據(jù)圖顯示，2F和IF hNiPS細胞與hESC類似，而親代 hNSC被從多能細胞群孤立(參看圖8B，左圖)；系統(tǒng)聚類分析顯示，hNiPS細胞與hESC簇 集，同時卻明顯區(qū)別于親代hNSC(參看圖8B，右圖)。散點圖分析顯示，與親代hNSC相比， hNiPS細胞明顯與hESC更加相似(參看圖8C)，其相似程度類似于不同hESC之間的相似性。IF和2F hNiPS細胞還顯示出與HlhESC的相似性。這些數(shù)據(jù)表明，hNiPS細胞在總基因表 達譜上與hESC類似。所述結(jié)果表明，IF和2F hNiPS細胞在分子水平和多功能性上與hESC 非常類似。表2 對 hNSC 和 hNiPS 的 STR 分析
染色體組基因座
hESC
HNSC
2F NhiPS
IFNhiPS
A
B
C
C
釉原蛋白 CSF1PO D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179
FGA Penta D Penta E TH01 TPOX vWA
X;X
11;11 9;9 12;13 13;13 30;30 13;16 11;12 9;11 8; 14 26;28 9;13 11;14 9；9 10;11 17:17
X;Y 11;13 8;11 9;9 15;16 31;32 16；16 7; 12 11;11 12;14 23;24 11;12 11;18 7;7 8;8 17:17
Χ;Υ 11;13 8；11 9；9 15;16 31;32 16;16 7;12 11;11 12;14 23;24 11;12 11;18 7;7 8;8 17;17
Χ;Υ 11;13 8;11 9;9 15;16 31；32 16;16 7;12 11;11 12;14 23,24 11;12 11;18 7;7 8;8 17:17
X;YΧ;γΧ;Υ11;1311;1311;138;118;118；119;99;99;915;1615；1615;1631;3231;3231；3216；1616;1616;167;127;127;1211;1111;1111;1112;1412;1412;1423,2422,2423;2411;1211;1211;1211;1811;1811;187;77;77；78;88;88;817;1717;1717;17材料與方法細胞培養(yǎng)人類NSC源自端腦(HFT13)，并如前所述建立(Kim等，Exp Neurol 199， 222(2006))。簡言之，將端腦組織新鮮解剖并用0. 的胰蛋白酶分解30分鐘，并以在NSC 培養(yǎng)基中200，000細胞/ml的密度接種于IOcm培養(yǎng)板中。如前所述將這些細胞在NSC培養(yǎng) 基中培養(yǎng)(Kim 等，Exp Neuroll99, 222 (2006) ；Park 等，Nat Biotechnol 20,1111 (2002)) 將人類ES細胞和iPS細胞在人類ESC培養(yǎng)基中的經(jīng)絲裂霉素C處理的CFl小鼠飼養(yǎng) 層(Millipore)上保養(yǎng)，如前所述(Takahashi等，Cell 131,861(2007))該培養(yǎng)基含有 KnockOut DMEManvitrogen)，所述DMEM中補充有20%的敲除血清替代物(knockout serum replacement) (Invitrogen)、ImM的L-谷氨酰胺、1 %的非必需氨基酸、0. ImM的β -巰基乙 醇、青霉素/鏈霉素和lOng/ml的人類堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) (Invitrogen)。IF hNiPS 和 2F hNiPs 細胞的誘導(dǎo)基于pMX的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼人類0CT4和KLF4的cDNA (Takahashi et Yamanaka，Cell 126，663 (2006))，如前所述(Zaehres et Daley, Methods Enzymol 420， 41K2006))，使用Fugene轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將該載體與包裝缺陷輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至四3 個細胞中，以產(chǎn)生水皰性口炎病毒(VSV)G蛋白假型病毒。轉(zhuǎn)染后48小時，收集病毒上清 液并通過超速離心將其濃縮，以感染人類NSC。為產(chǎn)生iPS細胞，將人類NSC以5X IO4個 細胞/6孔板的密度進行接種，并與含有病毒的上清液(補充有6yg/ml的硫酸魚精蛋白 (Sigma))共溫育M小時以獲取0CT4或者0CT4和KLF4。次日，用新鮮的NSC培養(yǎng)基于感染 后1日替換原有培養(yǎng)基，并保養(yǎng)到至多感染后7日。從感染后第8天起，將細胞在人類ESC培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)。在感染2個月或2. 5個月后，將iPS集群機械分離，并隨后重新平板 接種并保養(yǎng)在人類ESC培養(yǎng)基中的CFl小鼠飼養(yǎng)層(Millipore)上。定量RT-PCR使用帶有柱上DNA消化功能的RNeasy柱^jiagen)從本體細胞培養(yǎng)物樣本或人 工揀選的未分化集群中分離出總RNA。按制造商的操作說明，用0lig0-dT15引物和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(USB)在42°C進行1小時cDNA制備。在20 μ 1 SYBR Green PCR反應(yīng)物(在 Applied Biosystems 7300儀器上進行40個15秒95°C /60秒60°C的循環(huán))中，通常使用 大約50ng總RNA等價序列作為模板，所述PCR反應(yīng)物中另外含有0. 375 μ M的每種引物和 10 μ 1 SYBR Green PCR混合物(ABI)。已確認所有所用引物都以準最佳效率擴增預(yù)期產(chǎn)物， 并且沒有副產(chǎn)品。引物序列在表3中給出?；谏飳φ諛颖竞蛢煞N管家基因，使用比較 Ct法(comparative Ct method)計算出相對表達水平，以進行標準化。誤差條反映了來自 生物學(xué)重復(fù)實驗(標記物基因表達數(shù)據(jù))或來自使用獨立管家基因(轉(zhuǎn)基因沉默數(shù)據(jù))進 行標準化的標準誤差?？傮w基因表達分析依照制造商的操作說明(IVT 10小時)，用400ng不含DNA的總RNA作為經(jīng)標記的 cRNA合成的輸入序列(Illumina TotalPrep RNA擴增試劑盒-Ambion)來進行轉(zhuǎn)錄分析。 遵循制造商指引并使用其提供/建議的原料/儀器，將經(jīng)過質(zhì)量檢驗的cRNA樣品作為生物 學(xué)復(fù)制樣品或技術(shù)性復(fù)制樣品在HumanRef-8 v3 Expression BeadChips芯片(Illumina) 雜交18小時，而后將其沖洗、染色并進行掃描。微列陣數(shù)據(jù)可從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO) 網(wǎng)站獲得，登陸編號為GSE GSE15355。亞硫酸氫鹽測序使用DNeasy柱^jiagen)從本體細胞培養(yǎng)物樣本或人工揀選的未分化細胞集群 中分離出基因組DNA。將300ng用作亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的輸入序列(Epi1Tect Bisulfite Kit-Qiagen)。將50ng經(jīng)轉(zhuǎn)化的DNA用作常規(guī)巢式PCR的模板，以分別擴增0CT4啟動子的 467bp區(qū)和NANOG啟動子的336bp區(qū)。引物對于DNA正義鏈的轉(zhuǎn)化具特異性，并在表3中給 出。將純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)TA-克隆接入pCR2. I-TOPO(Invitrogen)。在遵循BiQAnalyzer 程序的基于質(zhì)量檢驗的建議適當(dāng)去掉個別克隆體后，使用該程序?qū)﹄S機揀選的克隆體的插 入序列進行分析。來自相對于0CT4翻譯起始密碼子的+20位置處的一個CpG位點的數(shù)據(jù) 因其不提供信息而未顯示。短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分析使用DNeasy柱Oliagen)從培養(yǎng)的細胞樣本中分離出基因組DNA。將所述基因 組DNA用作短串聯(lián)重復(fù)序列分析中的模板，該分析使用PowerPlex 16System(Promega)和 ABI PRISM儀器。所示數(shù)字表示15個常染色體片段的堿基對長度。此分析在Eurofins Medigenomix (Martinsried,德國)進行?；チ龅男纬蓪NiPS細胞和hNSC(3X106細胞/小鼠 5X106細胞/小鼠)皮下注射至SCID 小鼠背部側(cè)肋。在注射6 8周后，用4% PFA過夜固定畸胎瘤，隨后將其包埋于石蠟中。 截面切片用蘇木精和曙紅染料染色。堿性磷酸酶(AP)和免疫熒光染色
依照制造商提供的方案使用ES細胞表征試劑盒(Chemicon)進行堿性磷酸酶 (AP)染色。免疫熒光染色使用如下原發(fā)性抗體進行AFP(Sigma，1 100), a-SMA(Sigma, 1 50)、TuJl (Chemicon, 1 500)、0CT4 (Santa Cruz, 1 200)、SSEA4 (Chemicon， 1 200),TRA-1-60(Chemicon,1 200)、TRA-1-81(Chemicon, 1 200)。表3 實時PCR和亞硫酸氫鹽測序的引物實時聚合酶鏈式反應(yīng)引物
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干(iPQ細胞的方法，所述方法包括將一段或兩段編碼序列 導(dǎo)入靶細胞的步驟，每段所述編碼序列在轉(zhuǎn)錄時會產(chǎn)生有助于將所述靶細胞重編程為誘導(dǎo) 性多能干細胞的選自0ct3/4的因子或者屬于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，其中，所述 靶細胞內(nèi)源性地表達至少不由待導(dǎo)入的所述編碼序列所編碼的選自0ct3/4的因子或?qū)儆?Myc、Klf和Sox因子家族的因子，且其中因所述一段或兩段編碼序列的導(dǎo)入而產(chǎn)生的細胞 表達因子0ct3/4與選自Myc、Klf和Sox的每個因子家族的至少一種因子的組合。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中屬于Myc、Klf和Sox因子家族的、且被內(nèi)源性表達 或被待導(dǎo)入靶細胞的編碼序列所編碼的所述因子選自由1-Myc、n-Myc、c-Myc、Klf 1、Klf2、 Klf4、Κ1Π5、Soxl、Sox2、Sox3、Soxl5 和 Soxl8 組成的組。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述靶細胞不內(nèi)源性地表達由待導(dǎo)入所述靶細 胞的所述一段或兩段編碼序列所編碼的因子。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的方法，其中所述靶細胞是專能干細胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述專能干細胞是外胚層細胞。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項所述的方法，其中所述靶細胞是神經(jīng)干細胞(NSC)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中待導(dǎo)入的所述編碼序列編碼因子0ct3/4。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中待導(dǎo)入的所述兩段編碼序列編碼因子0ct3/4和 c-Myc 或者 0ct3/4 和 Klf4。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述靶細胞內(nèi)源性地表達因子c-Myc、Klf4和 Sox20
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述靶細胞內(nèi)源性地表達因子c-Myc、Klf4和 Sox2，且與所述靶細胞同屬的胚胎干細胞中的相應(yīng)表達水平相比，所述表達的表達水平比 其低最低10倍或高出最高10倍。
11.如權(quán)利要求7 10中任一項所述的方法，其中所述靶細胞是小鼠神經(jīng)干細胞。
12.—種誘導(dǎo)性多能干細胞，其由權(quán)利要求1 11中任一項所述的方法產(chǎn)生。
13.一種化合物的鑒定方法，所述化合物有助于將靶細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞， 所述方法包括如下步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項所述的方法重編程靶細胞，其中用待測化合物代替 一段待導(dǎo)入的編碼序列；和(b)評估在待測化合物存在和不存在的情況下是否形成誘導(dǎo)性多能干細胞，其中從已導(dǎo)入所述待測化合物的靶細胞形成誘導(dǎo)性多能干細胞表明所述化合物有助 于將靶細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞。
14.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法，所述方法包括如下步驟(a)將誘導(dǎo)性多能干細胞導(dǎo)入非人類的植入前胚胎，所述誘導(dǎo)性多能干細胞由權(quán)利要 求1 11中任一項或權(quán)利要求12所述的方法產(chǎn)生；(b)將步驟(a)中的胚胎轉(zhuǎn)移至雌性非人類動物子宮中；和(c)讓所述胚胎發(fā)育及出生。
15.一種轉(zhuǎn)基因非人類動物，其由權(quán)利要求14所述的方法產(chǎn)生。
16.一種含有誘導(dǎo)性多能干細胞的組合物，所述誘導(dǎo)性多能干細胞由權(quán)利要求1 11 中任一項所述的方法產(chǎn)生，所述組合物用于基因療法、再生醫(yī)學(xué)、細胞療法或藥物篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干(iPS)細胞的方法，其包括將一段或兩段編碼序列導(dǎo)入靶細胞的步驟，每段編碼序列在轉(zhuǎn)錄時會產(chǎn)生有助于將所述靶細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞的選自O(shè)ct3/4的因子或者屬于Myc、Klf和Sox因子家族的因子，其中，靶細胞內(nèi)源性地表達至少不由待導(dǎo)入的編碼序列所編碼且選自O(shè)ct3/4的因子或?qū)儆贛yc、Klf和Sox因子家族的因子，且其中因所述一段或兩段編碼序列的導(dǎo)入而產(chǎn)生的細胞表達因子Oct3/4與選自Myc、Klf和Sox的每個因子家族的至少一種因子的組合。此外，本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細胞，以及有助于將靶細胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細胞的化合物的鑒定方法。另外，還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法和包含由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細胞的組合物，所述組合物用于基因療法、再生醫(yī)學(xué)、細胞療法或藥物篩選。
文檔編號C12N5/074GK102066556SQ200980119690
公開日2011年5月18日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者漢斯·羅伯特·斯科勒, 金正范, 霍爾姆·策雷爾 申請人:馬克斯-普朗克科學(xué)促進協(xié)會