專利名稱：重組病毒、保持該重組病毒的大腸桿菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對疫苗開發(fā)或基因治療載體開發(fā)等有用的重組病毒制備方法、保持單 純皰疹病毒II型的基因組全長的重組病毒和保持該重組病毒的大腸桿菌。
背景技術(shù)：
為了制備稱為基因治療載體或多價疫苗的重組病毒，必須在病毒基因組的任一區(qū) 域插入外源基因。但是，得到的重組病毒存在缺失原來的基因治療載體或疫苗的病毒基因 組的基因，或使其性狀變化的問題。作為重組病毒的制備技術(shù)的現(xiàn)有的方法，已知有利用標(biāo)記(TK，LacZ)基因的培養(yǎng) 細胞內(nèi)的同源重組法(非專利文獻1)和利用黏端質(zhì)粒的培養(yǎng)細胞內(nèi)的同源重組法(非專 利文獻2、等，但這些現(xiàn)有的方法均是涉及要插入的外源基因一方的技術(shù)，而沒有著眼于被 插入一方病毒基因組。而單純皰疹病毒(HSV :herpes simplex virus)感染癥是由HSV-1或HSV-2的感 染引起的。HSV-I主要感染以口腔、上呼吸道粘膜為中心的上半身，誘發(fā)口腔炎或唇皰疹。 另一方面，HSV-2主要感染以生殖器為中心的下半身，誘發(fā)生殖器皰疹。HSV的疫苗仍沒有 被開發(fā)。此外，HSV作為基因治療載體也有用，有幾例進入臨床試驗階段。為了開發(fā)病毒的疫苗或基因治療載體，需要重組病毒制備的技術(shù)。疫苗的開發(fā)中， 必須滅活致病因素，而基因治療載體的開發(fā)中，除了需要滅活致病因素之外，還需要載入外 源基因。近年，報告了利用作為大型DNA克隆系統(tǒng)(DNA cloning system)的桿狀病毒系統(tǒng) (bac system,bacterial artificial chromosome system)進行大腸桿菌內(nèi)的同源重組的 方法，與過去相比，重組病毒的制備變得迅速并且簡便。桿狀病毒系統(tǒng)中作為核心的材料是保持病毒基因組的大腸桿菌。如果能夠獲得這 樣的大腸桿菌，利用大腸桿菌的遺傳學(xué)，則各種病毒基因組的改變成為可能。此外，在桿狀 病毒系統(tǒng)中，在病毒基因組中插入桿狀病毒質(zhì)粒對大腸桿菌保持基因組是必須的，桿狀病 毒質(zhì)粒的插入存在引起病毒基因組的基因缺失、使野生型的病毒性狀變化的問題。但是，在 涉及HSV的利用桿狀病毒的保持病毒基因組的大腸桿菌的制備的現(xiàn)有的報告例中，由桿狀 病毒質(zhì)粒(bacmid)的插入引起包裝信號(Packaging signal)的缺失(非專利文獻3 5)，或者在TK (非必須HSV基因)中插入桿狀病毒質(zhì)粒(非專利文獻6)的情況較多。如果 存在這樣的缺失或插入，則有時出現(xiàn)不適用于制作多功能載體的情況，而且，也成為病毒自 身在基礎(chǔ)研究上應(yīng)用的障礙。此外，由于桿狀病毒質(zhì)粒為71Λρ，比較大，導(dǎo)致重組病毒的病 原性或限定保持其重組病毒的外源基因的長度，因此需要切除的系統(tǒng)。關(guān)于HSV-1，之前報告了通過在UL3以及UL4基因的基因間區(qū)域中插入桿狀病毒質(zhì) 粒，成功制備保持具有野生型的性狀的全長的感染性HSV-I病毒基因組的大腸桿菌(專利 文獻1)。然而，關(guān)于HSV-2，沒有得到含有實質(zhì)上保持基因組全長的重組病毒的大腸桿菌。
專利文獻1 日本特開2003-189882號公報非專利文獻1 =Post L. Ε. et al. Cell24 :555-565,1981非專利文獻2 =CunninghamC. et al. Virol. 197 :116-124，1993非專利文獻3 Saeki Y. et al. Hum. Gen. Ther. 9 :2787-2794,1998非專利文獻4 :Tom Α. S. et al. J. Virol. 72 :7137-7143,1998非專利文獻5 Suter Μ. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :12697-12702，1999非專利文獻6 =Horsburgh B. C. et al. GeneTher. 6 :922-930,1999

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供一種不缺失病毒基因組的基因或使其性狀變化地在病毒 基因組中插入外源基因的方法。另外，本發(fā)明在于提供保持有HSV-2的基因組的全長的重組HSV-2，并提供保持有 該病毒基因組的大腸桿菌。這里，為了對不使目的病毒基因組含有的基因缺失且不對性狀產(chǎn)生影響地插入外 源基因而制備重組病毒，本發(fā)明的發(fā)明人進行了各種研究，發(fā)現(xiàn)作為外源基因的插入?yún)^(qū)域， 如果選擇目的病毒基因組中互相呈逆向編碼的基因PolyA信號間的區(qū)域，則能夠容易地制 備目的重組病毒。并且，發(fā)現(xiàn)在HSV-2中，如果在UL50和UL51的基因的polyA信號間區(qū)域 插入桿狀病毒質(zhì)粒，則可以得到實質(zhì)上保持HSV-2基因組全長的重組HSV-2，通過在大腸桿 菌中保持該病毒基因組，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明在于提供一種重組病毒的制備方法，特征在于在目標(biāo)病毒基因組中互 相逆向編碼的2種基因的polyA信號間的區(qū)域(除了 HSV-I的UL3-UL4之間)插入外源基 因。此外，本發(fā)明在于提供一種實質(zhì)上保持野生型病毒基因組的全長的重組病毒基因 組導(dǎo)入大腸桿菌的制備方法，特征在于將在目標(biāo)病毒基因組中互相呈逆向編碼的2種基 因的PolyA信號間的區(qū)域中(除了 HSV-I的UL3-UL4)插入桿狀病毒質(zhì)粒而得到的重組病 毒基因組導(dǎo)入大腸桿菌中。此外，本發(fā)明在于提供一種重組HSV-2，其實質(zhì)上保持野生型HSV-2的基因組全 長，在其基因組的UL50-UL51基因間區(qū)域中插入桿狀病毒質(zhì)粒。另外，本發(fā)明在于提供一種保持有重組HSV-2基因組的大腸桿菌，該重組單純皰 疹病毒II型實質(zhì)上保持野生型HSV-2的基因組的全長，在其基因組的UL50-UL51基因間區(qū) 域中插入有桿狀病毒質(zhì)粒。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，能夠容易地制備作為疫苗開發(fā)或基因治療載體開發(fā)的工具有用的重 組病毒。此外，作為外源基因，如果使用桿狀病毒質(zhì)粒，可以得到保持該重組病毒基因組的 大腸桿菌。由于得到的大腸桿菌顯著使病毒改變變得簡便，因此利用其而使疫苗開發(fā)或基 因治療載體開發(fā)變?yōu)榭赡?。此外，由于本發(fā)明的重組HSV-2實質(zhì)上保持野生型HSV-2的基因組全長，因此對用 于基因表達或疫苗開發(fā)的載體以及基礎(chǔ)研究有用。

圖1是表示作為插入部位的polyA信號間區(qū)域的圖。圖2是表示YK336、YK338、YK339的構(gòu)建工序的圖。圖3是表示1381和1382的構(gòu)建工序的圖。圖4是表示HSV-I、ΥΚ336、ΥΚ338和ΥΚ339的增殖能力的圖。
圖5是表示HSV-2、ΥΚ381和1382的增殖能力的圖。圖6是表示pBS-2NC-GFP/BAC的構(gòu)建工序的圖。圖7是表示ΥΚ351和YEbac356的構(gòu)建工序的圖。圖8是表示1356(在圖中用BAC表示)的限制性內(nèi)切酶的酶切圖譜的圖。圖中， HSV-2(186)為野生型。圖9是表示1356(在圖中用BAC表示)和野生型HSV-2186 (在圖中用186表示) 的增殖能力的圖。圖中[]內(nèi)表示MOI (感染復(fù)數(shù))。上段表示細胞內(nèi)病毒量，下段表示細胞 夕卜病毒量。圖10表示對小鼠的感染實驗結(jié)果(生存曲線)。BAC為1356，186為野生型。圖11是表示1361的構(gòu)建工序的圖。圖12是表示YK801和YIC356的Southern印跡的結(jié)果的圖。圖13表示野生型(wt)和Us3突變導(dǎo)入(US3-KM)的點突變的結(jié)果。
具體實施例方式首先，對在目標(biāo)病毒基因組的特定部位中插入外源基因的方法進行說明。在本發(fā)明的方法中，在目標(biāo)病毒基因組中互相呈逆向編碼的2種基因的polyA信 號間的區(qū)域中插入外源基因。作為目標(biāo)病毒，只要是DNA類型即可，沒有特別限制，例如，可 以列舉皰疹病毒、腺病毒、痘病毒、乳頭多瘤空泡病毒。目標(biāo)病毒基因組中互相呈逆向編碼的2種基因的polyA信號間的區(qū)域是指2種 基因相鄰存在，且為這2種基因在逆向編碼的區(qū)域中polyA信號和polyA信號之間的區(qū)域 (參照圖1)。這些區(qū)域能夠基于目標(biāo)病毒的基因組的數(shù)據(jù)庫進行選擇。例如HSV-2中，存在 UL3-UL4 區(qū)域、UL7-UL8 區(qū)域、UL10-UL11 區(qū)域、UL15-UL18 區(qū)域、UL21-UL22 區(qū)域、UL26-UL27 區(qū)域、UL35-UL36 區(qū)域、UL40-UL41 區(qū)域、UL45-UL46 區(qū)域、UL50-UL51 區(qū)域、UL55-UL56 區(qū)域、 Usl-Us2區(qū)域和Us9-Usl0區(qū)域13處。如果在目標(biāo)病毒基因組中同一方向編碼的2種基因之間的區(qū)域中插入外源基因， 則存在破壞啟動子的擔(dān)心。在這點上，如果是本發(fā)明方法中所用的polyA信號間區(qū)域，則沒 有目標(biāo)病毒的基因的缺失或性狀改變。作為外源基因，可以列舉桿狀病毒質(zhì)粒、報告基因、編碼具有免疫原性的蛋白質(zhì)的 基因和用于基因治療的基因等，在以在大腸桿菌中保持重組病毒基因組為目的時，優(yōu)選桿 狀病毒質(zhì)粒。作為桿狀病毒質(zhì)粒，例如也可以使用在2個IoxP之間夾有桿狀病毒質(zhì)粒的載 體，也可以使用在2個IoxP之間夾有桿狀病毒質(zhì)粒和能夠檢測的報告基因的載體。這里，作 為能夠檢測的報告基因，可以使用GFP(綠色熒光蛋白)、CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、DsRed、 ⑶S(i3葡萄糖醛酸酶)、laCZ、Kaede蛋白、熒光素酶等。其中特別優(yōu)選為GFP。外源基因向polyA信號間區(qū)域的插入，能夠利用限制性內(nèi)切酶位點的通常的克隆方法進行。例如，在質(zhì)粒中克隆含有目標(biāo)病毒基因組中作為目的插入位置的上述polyA信 號間區(qū)域的片斷。通過在所得的質(zhì)粒的2個polyA信號之間插入在2個IoxP之間夾有外 源基因(根據(jù)需要也可導(dǎo)入報告基因)的片段，可以得到在目的PolyA信號間區(qū)域中插入 有外源基因的質(zhì)粒。接著將目標(biāo)病毒DNA和上述插入外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到目標(biāo)病毒感染的細胞，再 進行同源重組，則能夠得到目的的重組病毒。從該感染細胞中，例如通過選擇表達報告基因 的細胞，則能夠選擇目標(biāo)重組病毒。當(dāng)?shù)玫降闹亟M病毒含有桿狀病毒質(zhì)粒時，通過使該重組病毒基因組導(dǎo)入到大腸桿 菌等的細菌中，則能夠得到保持有重組病毒的細菌。可以使得到的重組病毒感染Vero細胞、兔皮膚細胞(rabbit skin cells)等病毒 感染細胞，從其細胞中收集環(huán)狀病毒DNA，再將其環(huán)狀病毒DNA導(dǎo)入大腸桿菌中。接著，說明本發(fā)明的重組HSV-2的制備方法。本發(fā)明的重組HSV-2采用UL50-UL51 間區(qū)域作為上述polyA信號間區(qū)域，采用桿狀病毒質(zhì)粒作為外源基因。HSV-2中，欲向 UL3-UL4間區(qū)域插入桿狀病毒質(zhì)粒，但是沒能插入。因此，在向HSV-2中插入桿狀病毒質(zhì)粒 時，UL50-UL51間區(qū)域比較適合。首先，構(gòu)建含有包括UL50-UL51間區(qū)域片斷的質(zhì)粒。在該 質(zhì)粒的UL50-UL51間區(qū)域插入桿狀病毒質(zhì)粒。具體而言，使用含有夾在2個IoxP序列中 的桿狀病毒質(zhì)粒的質(zhì)?；蛘吆袏A在2個IoxP序列中的桿狀病毒質(zhì)粒和報告基因(例如 GFP)的質(zhì)粒，將夾在2個IoxP序列中的桿狀病毒質(zhì)?；蛘邐A在2個IoxP序列中的桿狀病 毒質(zhì)粒和報告基因插入上述質(zhì)粒的UL50-UL51間區(qū)域。接著將野生型HSV-2DNA和所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HSV-2感染的細胞，進行同源重 組，則可以得到實質(zhì)上保持野生型HSV-2的基因組全長，在其基因組的UL50-UL51基因間區(qū) 域中插入桿狀病毒質(zhì)粒的重組HSV-2。這里，實質(zhì)上是指在不損害功能范圍內(nèi)保持基因組的 全長。如果將得到的重組HSV-2基因組導(dǎo)入到大腸桿菌中，則可以得到保持該重組 HSV-2基因組的大腸桿菌。另外，得到的重組HSV-2由于具有IoxP部位，因此能夠用Cre重組酶除去桿狀病 毒質(zhì)?；蛘邨U狀病毒質(zhì)粒和報告基因。得到的重組HSV-2，或者在大腸桿菌中保持得到的重組HSV-2基因組并從其病毒 基因組再構(gòu)建的重組HSV-2，具有與野生型HSV-2同程度的增殖能力和病原性，能夠作為病 毒載體、疫苗的平臺使用。[實施例]接著，列舉實施例，詳細說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受任何限定。在本實施例中，基因克隆及其解析根據(jù)Maniates等的分子克隆一實驗手冊 (Molecular Cloning-Α Laboratory Manual) VXR^^M^^M (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)進行。實驗方法按照Ausubel. F等的分子生物學(xué)的現(xiàn)有方法(Current Protocols in Molecular Biology) (1987)中詳細記載的標(biāo)準(zhǔn)的實驗室的方法。實施例1(在基因間區(qū)域中插入熒光蛋白質(zhì)表達框的重組病毒的制備方法)(1)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建
將含有p26. 5-Venus、HSV-I (F)的 UL26. 5 啟動子區(qū)域(nt 51388 至 nt 51673)、 Venus熒光蛋白質(zhì)基因、HSV-I UL21和UL22的雙向polyA信號的270bp的片段克隆到 pBluescript II KS+(Stratagene)中。將M6· 5-Venus 的 SacI-KpnI 片段克隆到pBR442 (J. Virol. 65 :938-944,1991)的 BamHI 位點中，制備轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 M6. 5-Venus in UL3-4。制備 在將含有 UL50、UL51 的 HSV-I (F)的 BglII-EcoRI 片段(nt 106750 至 nt 110095)克隆至Ij pBluescript II KS+中的質(zhì)粒的UL50和UL51的polyA信號間區(qū)域中導(dǎo)入I^acI位點的質(zhì)粒 pUL50-51pac。在 pUL50_51pac 的 PacI 位點中克隆入 p26. 5-Venus 的 &icI-KpnI 片段，制備 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 p26. 5-Venus in UL50-51。制備在將含有 Usl、Us2 的 HSV-1 (F)的 EcoRI-BamHI 片段(nt 131535至nt 136沘9)克隆到pBluescript II KS+中的質(zhì)粒的Usl和Us2的 PolyA信號間區(qū)域中導(dǎo)入I^acI位點的質(zhì)粒pUsl-2pac。在pUsl-2pac的I^acI位點中克隆 入 p26. 5-Venus 的 SacI-KpnI 片段，制備轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 p26. 5-Venus in Us 1-2。制備在將含有UL3、UL4基因的HSV-2186病毒基因組的BamHI片段(nt 6772至 nt 14950)克隆入pBluescript II KS+中的質(zhì)粒的UL3和UL4的polyA信號間區(qū)域中導(dǎo) 入I^ac I位點的質(zhì)粒p2UL3-4pac。在p2UL3_4pac的I^acI位點中克隆入p26. 5-Venus的 SacI-KpnI 片段，制備轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 p26. 5-Venus in 2UL3-4。將含有 UL50、UL51 基因的 HSV-2 186 株的基因組 DNA Not I-ClaI 片段(η. η. 106473 至 η· η. 110443)克隆入 pBluescript II KS+(Stratagene)的 NotI-ClaI 位點(pBS_2NC)中。在 pBS_2NC 的 UL50 和 UL51 基因 的PolyA信號區(qū)域的NdeI位點中，克隆入p26. 5-Venus的Mcl-Kpnl片段，制備轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 p26.5-Venus in2UL50_51o(2)重組病毒的構(gòu)建將p26. 5-Venus in UL3_4、p26. 5-Venus in UL50-51 或者 p26. 5-Venusin UL1-2 和HSV-I (F)株的病毒DNA轉(zhuǎn)染兔皮膚細胞(RSC)。之后，在熒光顯微鏡下，通過選取發(fā) 熒光的噬菌斑選擇由同源重組發(fā)生的、各基因間區(qū)域中插入有Venus表達框的重組病毒 YK336 (UL3-UL4 基因間)、YK338 (UL50-UL51 基因間)、YK339 (Usl_Us2 基因間)(圖 2)。此 外，在熒光顯微鏡下進行噬菌斑的純化直到100%的噬菌斑都發(fā)熒光。通過Southern雜交 法確認1336、YK338, YK339為目的的重組病毒。將p26. 5-Venus in 2UL3-4 或者 5-Venus in 2UL50-51 和 HSV-2186 株的病 毒DNA轉(zhuǎn)染兔皮膚細胞(RSC)。之后，在熒光顯微鏡下，通過選取發(fā)熒光的噬菌斑選擇由同 源重組發(fā)生的、各基因間區(qū)域中插入有Venus表達框的重組病毒1381 (UL3-UL4基因間)、 YK382(UL50-UL51基因間)(圖3)。此外，在熒光顯微鏡下進行噬菌斑的純化直到100%的 噬菌斑都發(fā)熒光。通過Southern雜交法確認1381、1382為目的的重組病毒。(3)重組病毒的性狀解析將YK336、YK338、YK339 和野生型 HSV-1 (F)以 MOI 0. 01 或者 MOI 5 感染 Vero 細 胞，通過測定病毒的細胞內(nèi)外的病毒量，比較增殖能力(圖4)?？芍?336，YK338, YK339 在培養(yǎng)細胞中具有與野生體同等程度的增殖能力。將YK381、YK382 和野生型 HSV-2 186 以 MOI 0. 01 或者 MOI 3 感染 Vero 細胞，通 過測定病毒的細胞內(nèi)外的病毒量，比較增殖能力(圖5)?？芍?(381， (382在培養(yǎng)細胞中 具有與野生體同等程度的增殖能力。對1336、ΥΚ338, ΥΚ339和野生型HSV-I (F)，將各種量的病毒接種于小鼠的腦內(nèi)，7算出LD50。其結(jié)果，各種病毒的LD50的值沒有觀察到顯著差別(表1)。對1381、YK382和野生型HSV-2 (186)，將各種量的病毒接種于小鼠的腦內(nèi)，算出 LD50。其結(jié)果，兩種病毒的LD50的值沒有觀察到顯著差別(表2)。[表 1]
權(quán)利要求
1.一種重組病毒的制備方法，其特征在于在目標(biāo)病毒基因組中互相呈逆向編碼的2種基因的POlyA信號間的區(qū)域(除了 HSV-I 的UL3-UL4之間)插入外源基因。
2.如權(quán)利要求1所述的重組病毒的制備方法，其特征在于外源基因選自桿狀病毒質(zhì)粒、報告基因、編碼具有免疫原性的蛋白質(zhì)的基因和用于基 因治療的基因。
3.一種實質(zhì)上保持野生型病毒基因組的全長的重組病毒基因組導(dǎo)入大腸桿菌的制備 方法，其特征在于將在目標(biāo)病毒基因組中互相呈逆向編碼的2種基因的polyA信號間的區(qū)域中(除了 HSV-I的UL3-UL4)插入桿狀病毒質(zhì)粒而得到的重組病毒基因組導(dǎo)入大腸桿菌中。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的制備方法，其特征在于病毒選自皰疹病毒、腺病毒、痘病毒和乳頭多瘤空泡病毒。
5.一種重組單純皰疹病毒II型，其特征在于實質(zhì)保持野生型單純皰疹病毒II型的基因組的全長，在其基因組的UL50-UL51基因間 區(qū)域中插入桿狀病毒質(zhì)粒。
6.一種保持有重組單純皰疹病毒II型基因組的大腸桿菌，其特征在于該重組單純皰疹病毒II型實質(zhì)上保持野生型單純皰疹病毒II型的基因組的全長，在 其基因組的UL50-UL51基因間區(qū)域中插入有桿狀病毒質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明在于提供一種保持目標(biāo)病毒基因組的性狀的重組病毒的制備方法。該重組病毒的制備方法特征在于在目標(biāo)病毒基因組中互相呈逆向編碼的2種基因的polyA信號間的區(qū)域插入外源基因。
文檔編號C12N7/02GK102046790SQ20098012031
公開日2011年5月4日 申請日期2009年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者川口寧, 森本智美 申請人:國立大學(xué)法人東京大學(xué)