專利名稱：包含變體微生物蛋白酶的組合物和方法
包含變體微生物蛋白酶的組合物和方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)工程化的方法和變體蛋白酶。特別地，本發(fā)明提供了利用位 點(diǎn)評(píng)估文庫(kù)的方法。本發(fā)明還提供了用于多種用途的枯草桿菌蛋白酶變體。
背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶是糖基水解酶的亞類，包含具有寬范圍的特異性和生物學(xué)功能的不 同類別的酶。對(duì)枯草桿菌蛋白酶已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，主要是出于其在清潔和飼料應(yīng)用中 的用途。其他工作則著眼于在各種應(yīng)用中可以負(fù)面影響這些酶的功能的不良環(huán)境條件(例 如，暴露于氧化劑、螯合劑、極端的溫度和/或PH)。盡管如此，本領(lǐng)域仍然需要這樣的酶系 統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)能夠抵抗這些不良條件，并保留或具有提高的本領(lǐng)域目前已知的活性。多種蛋白質(zhì)工程化方法是已知的。通常，修飾蛋白質(zhì)以得到希望的蛋白質(zhì)性質(zhì)。 在多數(shù)方法中，將克隆的編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸序列突變并表達(dá)修飾基因以產(chǎn)生突變 體，對(duì)其篩選目的活性。通常，將突變體性質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)的性質(zhì)比較。歷史上，蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法接近等同于在所有蛋白質(zhì)空間發(fā)現(xiàn)用于所希望的應(yīng)用 一種最佳序列的問(wèn)題。該問(wèn)題是極端困難并且是“NP難度的”。在復(fù)雜性理論中，被定義 為P類的問(wèn)題被認(rèn)為是容易和有效的，對(duì)于它們的解決方法存在多項(xiàng)式-時(shí)間算法。NP 難度問(wèn)題是這樣的問(wèn)題，對(duì)于它們當(dāng)前不知道有效的多項(xiàng)式時(shí)間算法，并且如果可以解 決任何NP難度問(wèn)題，那么可以解決所有NP難度問(wèn)題(見(jiàn)例如，Pierce and ffinfree, ProteinEngineer.，15 :779-782 [2002])。當(dāng)前建立和篩選文庫(kù)的策略一般涉及在整個(gè)序列 隨機(jī)產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列多樣性或者在蛋白質(zhì)內(nèi)的確定位置以受控的隨機(jī)方式產(chǎn)生蛋白質(zhì)序 列多樣性。這些文庫(kù)通常具有對(duì)于主要的目的性質(zhì)為“消極”的許多成員，并且需要大量篩 選來(lái)發(fā)現(xiàn)相對(duì)少數(shù)的積極突變。通常，忽略消極突變，并僅僅得到積極成員的序列信息。飽和誘變(Estell et al.，in World Biotech Report 1984，vol. 2 :USA，Online Publications，London[1984]，181-187 頁(yè)；和 Wells et al.，Gene 34 :315-323[1985])是 可以用于搜索蛋白質(zhì)空間以發(fā)現(xiàn)優(yōu)化蛋白質(zhì)中一些性質(zhì)的突變的一種技術(shù)。一些研究小組 已經(jīng)開(kāi)發(fā)了通過(guò)飽和誘變鑒定待改變位點(diǎn)的策略(Reetz et al.，Agnew. Chem. Int. Edn.， 44 :4192-4196 [2005] ；Kato et al.，J. Mol. Biol.，351 :683-692 [2005]；和 Sandberg et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,90 :8367-8371 [1993])，但是還沒(méi)有提出用于位點(diǎn)鑒定的一般 性系統(tǒng)。此外，因?yàn)槎鄶?shù)蛋白質(zhì)工程化方法產(chǎn)生了大量的氨基酸突變選擇，一般需要篩選 許多變體來(lái)產(chǎn)生希望的蛋白質(zhì)性質(zhì)。通常，不斷重復(fù)篩選來(lái)產(chǎn)生有益變體。從而，多數(shù)方法 是費(fèi)事費(fèi)時(shí)的。本領(lǐng)域不斷需要有效并且產(chǎn)生所希望的結(jié)果的蛋白質(zhì)工程方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)工程方法。特別地，本發(fā)明提供了利用位點(diǎn)評(píng)估文庫(kù)的方法。 具體地，本發(fā)明提供了利用對(duì)許多希望的性質(zhì)所得的信息，以便理性并且有效設(shè)計(jì)將優(yōu)化 那些性質(zhì)的文庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)對(duì)于至少兩種希望的性質(zhì)改進(jìn)的 文庫(kù)。
本發(fā)明提供了鑒定蛋白質(zhì)氨基酸序列中在改進(jìn)蛋白質(zhì)的希望性質(zhì)中相關(guān)的位置 的方法。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定哪些突變是所希望的以便產(chǎn)生 具有這些希望性質(zhì)以及改進(jìn)的性質(zhì)的蛋白質(zhì)的方法。在一些額外尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了鑒定比野生型蛋白質(zhì)具有特定百分?jǐn)?shù)改善(例如，對(duì)于一種性質(zhì)比野生型的 110%更好)的氨基酸位置和突變。在仍然進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定突 變的方法，所述突變提供了比野生型蛋白質(zhì)至少一種改進(jìn)許多的性質(zhì)和至少一種額外的不 比野生型蛋白質(zhì)顯著更差的性質(zhì)(例如，一種性質(zhì)比野生型的110%更好，然而另一種性質(zhì) 不比野生型的90%更差)。在還進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于該信息構(gòu)建了文庫(kù)。在一 些實(shí)施方案中，使用所有鑒定的突變構(gòu)建文庫(kù)，而在一些其他實(shí)施方案中，使用所鑒定突變 的子集構(gòu)建文庫(kù)。實(shí)際上，文庫(kù)不意在局限于任何具體的成員和/或突變類型。本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)工程化的方法，其包括步驟提供蛋白質(zhì)變體文庫(kù)；在目的 測(cè)試中測(cè)試蛋白質(zhì)變體文庫(kù)的至少一種目的性質(zhì)；為所述至少一種目的性質(zhì)鑒定值的范 圍；鑒定該值范圍內(nèi)與目的測(cè)試中的有利結(jié)果相關(guān)的最小值；和提供具有高于所述至少一 種目的性質(zhì)的范圍內(nèi)最小值的至少一種突變的多種蛋白質(zhì)變體，從而提供包含至少一個(gè)突 變的蛋白質(zhì)變體文庫(kù)，并且其中該文庫(kù)富含在目的測(cè)試中具有有利結(jié)果的成員。在一些 實(shí)施方案中，有利的結(jié)果對(duì)應(yīng)于大于在上面第一步中給出的測(cè)試中觀察到的最大值的約 50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、或約95 %的值。在一些備選實(shí)施方案中，在本發(fā) 明的方法中使用一個(gè)以上的目的測(cè)試。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是酶。在一些尤其 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉(zhuǎn)移酶、金屬蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化 酶、角質(zhì)酶和脂肪酶。本發(fā)明還提供了蛋白質(zhì)工程化方法，包括步驟提供蛋白質(zhì)變體文庫(kù)；在目的測(cè) 試中測(cè)試蛋白質(zhì)變體文庫(kù)的至少兩種目的性質(zhì)；為所述至少兩種目的性質(zhì)鑒定值的范圍； 鑒定該值范圍內(nèi)與目的測(cè)試中的有利結(jié)果相關(guān)的最小值；和提供高于所述至少兩種目的性 質(zhì)的范圍的最小值的多種蛋白質(zhì)變體，從而提供富含在目的測(cè)試中具有有利結(jié)果的成員的 蛋白質(zhì)變體文庫(kù)。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，有利的結(jié)果對(duì)應(yīng)于在上面第一步中給出的測(cè)試 中觀察到的最大值的約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或約95%的值。在一些優(yōu) 選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是酶。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉(zhuǎn)移酶、金 屬蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質(zhì)酶和脂肪酶。本發(fā)明還提供了蛋白質(zhì)工程化方法，包括步驟提供野生型蛋白質(zhì)和野生型蛋白 質(zhì)的蛋白質(zhì)變體的文庫(kù)；在目的測(cè)試中測(cè)試蛋白質(zhì)變體文庫(kù)和野生型蛋白質(zhì)的至少一種目 的性質(zhì)；鑒定所述至少一種目的性質(zhì)的值范圍；鑒定與目的測(cè)試中有利結(jié)果相關(guān)的值范圍 中的最小值；鑒定與為野生型所得的結(jié)果相比具有有利結(jié)果的蛋白質(zhì)變體，其中有利結(jié)果 是改進(jìn)的目的性質(zhì)；并提供高于所述至少一種目的性質(zhì)范圍的最小值的多種蛋白質(zhì)變體， 從而提供富含在目的測(cè)試中具有有利結(jié)果的成員的改進(jìn)蛋白質(zhì)變體的文庫(kù)。在一些優(yōu)選 實(shí)施方案中，所述方法還包括確定性能指數(shù)的步驟，其中通過(guò)將為每種改進(jìn)的蛋白質(zhì)變體 得到的值和為野生型蛋白質(zhì)得到的值相除確定性能指數(shù)。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中， 方法還包括鑒定改進(jìn)的蛋白質(zhì)變體的步驟，其中改進(jìn)的蛋白質(zhì)變體在目的測(cè)試中實(shí)現(xiàn)大于 1.1的性能指數(shù)值。在一些額外實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是酶。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述酶選自蛋白酶、轉(zhuǎn)移酶、金屬蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質(zhì)酶和脂肪酶。在一些備選實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)選自抗體和生長(zhǎng)因子。在額外優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述野生型蛋白質(zhì)是選自蛋白酶、轉(zhuǎn)移酶、金屬蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化 酶、角質(zhì)酶和脂肪酶的成熟形式。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，目的性質(zhì)選自電荷、洗滌性能、 硬表面清潔性能、溶解度、熱穩(wěn)定性、保存穩(wěn)定性、洗滌劑穩(wěn)定性、底物結(jié)合、酶抑制、表達(dá)水 平、反應(yīng)速率和底物降解。在一些實(shí)施方案中，野生型蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)變體是至少一種洗滌 劑組合物的組分。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，在配制成具有5到12. 0的pH的粉狀或液體洗 滌劑的洗滌劑組合物中測(cè)試洗滌性能。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生在蛋白質(zhì)折疊內(nèi)親本蛋白的改進(jìn)變體的方法，包括在目的 測(cè)試中測(cè)定跨越目的性質(zhì)范圍的蛋白質(zhì)折疊內(nèi)測(cè)試蛋白的多種變體；鑒定與目的測(cè)試中有 利結(jié)果有關(guān)的目的性質(zhì)范圍內(nèi)的最小值；在目的測(cè)試中測(cè)試蛋白質(zhì)折疊的親本蛋白；并通 過(guò)在親本蛋白質(zhì)中引入氨基酸突變產(chǎn)生親本蛋白的改進(jìn)變體使得改進(jìn)的變體高于目的性 質(zhì)范圍的最小值。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，親本蛋白和測(cè)試蛋白是不同的。在一些實(shí)施方 案中，所述方法還包括確定性能指數(shù)的步驟，其中通過(guò)將為每種改進(jìn)的蛋白質(zhì)變體得到的 值和為親本蛋白質(zhì)得到的值相除確定性能指數(shù)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試蛋白和親本蛋白 是酶。在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉(zhuǎn)移酶、金屬蛋白酶、酯酶、淀粉 酶、纖維素酶、氧化酶、角質(zhì)酶和脂肪酶。在一些備選實(shí)施方案中，測(cè)試和親本蛋白質(zhì)選自抗 體和生長(zhǎng)因子。在額外優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述親本蛋白質(zhì)是選自蛋白酶、轉(zhuǎn)移酶、金屬蛋 白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質(zhì)酶和脂肪酶的成熟形式。在一些優(yōu)選實(shí)施方案 中，目的性質(zhì)選自電荷、洗滌性能、硬表面清潔性能、熱穩(wěn)定性、溶解度、保存穩(wěn)定性、洗滌劑 穩(wěn)定性、底物結(jié)合、酶抑制、表達(dá)水平、反應(yīng)速率和底物降解。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試蛋白 和親本蛋白是至少一種洗滌劑組合物的組分。在一些備選實(shí)施方案中，改進(jìn)的蛋白質(zhì)是洗 滌劑組合物的組分。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，在配制成具有約5到約12. 0的pH的粉狀或 液體洗滌劑的洗滌劑組合物中測(cè)試洗滌性能。本發(fā)明還提供了分離的芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶變體，其中枯 草桿菌蛋白酶變體是成熟形式，具有蛋白水解活性并且在選自以下位置的一個(gè)或多個(gè)位置 包含取代1,2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24， 25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52， 53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，72，73，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86， 87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110， 111，112，113，114，115，116，117，118，119，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131， 132，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153， 156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176， 177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196， 197，198，199，200，201，203，204，206，207，209，210，212，213，214，215，216，217，218，219， 220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241， 242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260， 261,262, 263，264，265，267,268, 269，270，271，272，273 和 274，其中所述位置通過(guò)與 SEQ ID NO 2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列對(duì)應(yīng)進(jìn)行編號(hào)。在一些實(shí) 施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)位置選自1，2，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47， 48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，72，73，77，78，79，81，82， 83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106， 107，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，122，123，124，125，126，127，128，129， 131，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153， 156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176， 177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196， 197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222， 223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243， 244，245，246，247，248，249，250，251，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263， 264，265，267，268，269，270，271，272，273和 274，其中所述位置通過(guò)與 SEQ ID NO :2給出的 解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列對(duì)應(yīng)進(jìn)行編號(hào)。在一些其他實(shí)施方案 中，所述一個(gè)或多個(gè)位置選自2，3，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，20，21，21， 22，23，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，44，46，47，48，49，50，51，53，54， 55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91， 92，93，94，95，96，102，105，106，110，111，112，113，114，115，116，122，123，124，125，126， 128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，145，146，147，148，149，150，151，152， 153，156，157，158，159，160，162，165，166，167，169，170，171，173，174，175，176，177，178， 179，180，181，182，183，184，186，187，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199,200, 201，203，204，206，207，212，214，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230， 231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，249，250， 251，253，254，255，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272， 273，和274，其中所述位置通過(guò)與SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶 BPN'的氨基酸序列對(duì)應(yīng)進(jìn)行編號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述枯草桿菌蛋白酶變體還包含選 自18，52，72，117，119，127，144，185，209和213的一個(gè)或多個(gè)位置上的取代，并且其中所述 位置通過(guò)與SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列對(duì)應(yīng)進(jìn)行編號(hào)。在-一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述取代包含如下的一個(gè)或多個(gè)位置:A001C,A001D,A001E,A001F,A001G,A001H,A001I,A001K,A001L,A001M,A001N,A001Q,A001R,A001S,A001V,A001W,Q002A,Q002D,Q002E,Q002G,Q002S,S003A,S003D,S003F,S003G,S003I,S003K,S003L,S003M,S003N,S003P,S003Q,S003R,S003T,S003V,S003W,S003Y,P005C,P005E,P005G,P005N,P005Q,P005T,Y006A,Y006C,Y006E,Y006F,Y006G,Y006K,Y006M,Y006N,Y006P,Y006Q,Y006R,Y006T,Y006V,Y006W,S009A,S009C,S009E,S009F,S009G,S009H,S009K,S009L,S009M,S009P,S009Q,S009R,S009T,S009V,S009W,Q010A,Q010C,Q010E,Q010F,Q010G,Q010H,Q010I,Q010K,Q010L,Q010M,Q010R,Q010S,Q010T,Q010V,Q010W,I011C,I011L,I011T,I011V,I011Y,K012A,K012C,K012D,K012E,K012F,K012G,K012H,K012I,K012N,K012Q,K012S,K012T,K012V,K012W,K012Y,A013C,A013F,A013G,A013H,A013L,A013R,A013S,A013T,A013V,P014A,P014C,P014D,P014E,P014F,P014G,P014I,P014K,P014L,P014M,P014N,P014Q,P014R,P014S,P014T,P014V,P014W,P014Y,A015C,A015D,A015E,A015F,A015G,A015H,A015I,A015K,A015L,A015M,A015P,A015Q,A015R, A015T, A015V, 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P225F, P225G, P225H, P225I, P225K, P225L, P225M, P225R, P225S, P225T, P225V, P225Y, A228P，A228R，A228S,A228T,A228W,G229A,G229H,G229I，G229S，A230C，A230E，A230G ，A230Q, A230R, A230S, A230T, A230V, A231C, A231I, A231P, A231R, I234A, I234C, I234L, I234M, I234N, I234P, I234Q, I234S, I234T, I234V, L235A, L235C, L235G, L235I，L235K, L235M, L235N, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, S236A, S236C, S236D, S236E, S236G, S236H, S236N, S236Q, S236T, S236V, S236Y, K237A, K237E，K237F, K237G,K237H,K237I,K237L,K237M,K237N,K237Q,K237R,K237S,K237T,K237V,K237W,K237Y,H238C,H238D,H238E,H238F,H238M,H238R,H238S,P239C,P239D,P239E,P239F,P239H,P239L,P239M,P239N,P239Q,P239R,P239S,P239T,P239V,P239W,P239Y,N240A,N240C,N240D,N240F,N240G,N240K,N240L,N240Q,N240R,N240S,N240T,N240V,N240W,N240Y,W241A,W241F,W241G,W241H,W241I,W241K,W241M,W241Q,W241T,W241V,T242A,T242C,T242E,T242F,T242G,T242K,T242M,T242N,T242P,T242R,T242S,T242W,T242Y,N243C,N243E,N243F,N243G,N243I,N243Q,N243S,N243T,N243V,N243W,N243Y,T244A,T244D,T244F,T244G,T244H,T244K,T244L,T244M,T244N,T244P,T244Q,T244R,T244S,T244V,T244W,T244Y,Q245A,Q245C,Q245D,Q245E,Q245H,Q245I,Q245K,Q245L,Q245M,Q245R,Q245T,Q245V,Q245Y,R247W,S248A,S248E,S248F,S248G,S248H,S248I,S248L,S248M,S248N,S248Q,S248R,S248T,S248V,S248W,S248Y,S249C,S249D,S249H,S249I,S249K,S249L,S249M,S249N,S249Q,S249R,S249T,S249V,S249W,S249Y,L250D,L250F,L250H,L250I,L250M,L250T,L250V,E251A,E251T,E251W,N252A,N252C,N252E,N252G,N252H,N252I,N252L,N252M,N252Q,N252R,N252S,N252T,N252V,N252Y,T253A,T253C,T253E,T253G,T253H,T253K,T253M,T253S,T253V,T254A,T254C,T254L,T254M,T254R,T254S,T254V,T255A,T255C,T255D,T255E,T255F,T255G,T255H,T255I,T255K,T255L,T255M,T255R,T255S,T255V,K256A,K256C,K256D,K256E,K256F,K256H,K256I,K256L,K256M,K256N,K256P,K256Q,K256R,K256S,K256T,K256V,K256W,K256Y,L257A,L257C,L257F,L257G,L257H,L257I,L257K,L257M,L257N,L257R,L257S,L257T,L257V,L257W,L257Y,G258Q,D259A,D259E,D259F,D259G,D259L,D259N,D259P,D259Q,D259R,D259S,D259T,D259V,D259W,D259Y,S260A,S260C,S260D,S260E,S260F,S260G,S260H,S260L,S260M,S260N,S260P,S260R,S260V,S260W,S260Y,F261H,F261W,Y262A,Y262C,Y262E,Y262F,Y262H,Y262L,Y262M,Y262N,Y263F,Y263M,Y263T,G264F,G264I,G264L,K265A,K265C,K265E,K265G,K265H,K265L,K265M,K265N,K265Q,K265R,K265S,K265W,K265Y,G266C,G266F,G266L,G266M,G266P,G266R,G266V,G266W,G266Y,L267A,L267C,L267E,L267G,L267H,L267I,L267M,L267N,L267Q,L267S,L267T,L267V,I268A,I268C,I268K,I268L,I268M,I268P,I268R,I268V,N269D,N269E,N269K,N269L,N269P,N269Q,N269S,Q271A,Q271C,Q271D,Q271E,Q271F,Q271G,Q271H,Q271I,Q271K,Q271L,Q271M,Q271N,Q271P,Q271R,Q271S,Q271T,Q271V,Q271W,Q271Y,A272E,A272F,A272G,A272H,A272K,A272L,A272M,A272N,A272Q,A272R,A272S,A272T,A272V,A272W,A272Y,A274C,A274D,A274F,A274G, A274H, A274I, A274K, A274L, A274Q, A274S, A274T，和 A274V。 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述取代包含選自Y021H-A045V-Y217E，Y02Iff-S10IE-G128R-Y217Q, Y021H-Y217E, YO21H-AO45V-S101 N-Y217Q ,Y021H-A045I-Y217E, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021W-A045I-S101E-Y217E, D036N-S101E-Y217L, YO21H-AO45V-Y217Q , YO2 1H-AO45 I-S 101E-Y217L， Y021H-A045I-Y217E, Y021H-Y217Q, Y021W-S101E-Y217L, Y021W-A045V-S101E-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217E, S101E-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-Y217L, Y021W-A045I-S101N-Y217L, S 101N-K213 I-Y217Q，YO21W-S101 N-Y217L , Y021H-S101E-Y217E, M119F-K213K-Y217Q, Y021W-A045V-Y217E, Y021W-A045I-Y217E, M119F-K213I-Y217Q, Y021W-Y217E-N212S, Ml19F-K213L-Y217E, K213I-Y217Q, A045I-Y217Q, YO21ff-AO45V-S101E-Y217Q , YO21H-AO45V-S101E-Y217L , SlOlS-Ml19F-K213I-Y217Q, K213N-Y217Q, M119F-Y217Q, S024H-A092G-A114G, S101N-M119F-K213I-Y217Q, S101N-K213L-Y217Q, SlOlN-Ml19F-K213K-Y217L, SlOlN-Ml19F-K213I-Y217L, Y021H-A045V-S101E, S101N-K213L-Y217E, A045V-Y217L, S101N-K213I-Y217L, SlOlS-Ml19M-K213K-Y217L, Y021H-Y217L, S101E-K213L-Y217L, K213I-Y217E, S 101N-M119F-Y217E，Y021W-A045V-Y217L, A092G-A114G, S024H-A092G-Q103E, Y021W-S101E, V26Q-K213I, Y021H-S101N, S101E-K213N-Y217E 的組合。在一些實(shí)施方案中，所述取代包含選自S024S-V028V-M050M-A092A-Q10 3E-A114G-V246V, S024S-V028V-M050V-A092A-Q 103Q-A114A-V246V, S024S-V028V -M050V-A092A-Q103Q-A114G-V246V， S024H-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114A-V2 46T, S024H-V028V-M050V-A092A-Q103E-A114A-V246V, S024H-V028V-M050V-A092A -Q103Q-A114G-V246V, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246V, S024H-V 028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246T, S024S-V028V-M050M-A092G-Q103Q-A114 A-V246T, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T, SlOlE-Ml19N-K213N, S101N-K213I, S101N-M119H, Ml19H-K213I-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213N-Y217L, S101N-K213L-Y217E, Ml19N-K213N-Y217L, Ml19F-K213L-Y217E, S101P-K213N, S101N-M119H-K213N, S10IN-Ml19F-K2131-Y217L, K213L, M119N-K213N, K213N, K213I-Y217E, SlOlN-Ml19H-Y217Q, S101P-K213N-Y217L, M119N-K213I, K213N-Y217Q, Ml 19H-K213N, S 1 0 1N-K213L-Y217Q，S101P-K213N, S 1 0 1 E_K213N-Y217E， SlOlE-Ml19H-K213I-Y217Q, S101E-M119H-K213N， K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217Q， M119H-Y217Q, SlOIN-MI19N-K213N-Y217Q，Ml19H-K213I-Y217Q，K213I-Y217Q， S101E-M119N-Y217L, M119F-K213L, Ml19H-K213N-Y217E, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217Q, SlOlN-Ml19H-K213N-Y217Q, Ml19H-K213I-Y217Q， Y217Q, Ml19H-K213N-Y217Q， S101N-M119F-Y217E, M119F-Y217Q， SlOlN-Ml19F-K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217L， SlOlN-Ml19H-K213N-Y217L, S 101E-K213L-Y217L，S 101N_K213N-Y217Q， S101N-M119H-K213L, S101N-M119H-K213I， S101P-K213N-Y217L， Ml19F-K213I-Y217Q， S101N-K213I-Y217Q, SlOlE-Ml19H-K213I-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213I-Y217Q, M119H-K213N-Y217E, S10IN-Ml19N-K213N-Y217L, A048E-K213L, A048H-K213L, V026Q-A048Y-K213L, K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, V026Y-K213N, A048D-K213N, V026Q-A048E-K213L, A048H-K213N, V026Q-A048H-K213L, A048H-K213L, K213L, K213N, V147D-K213L, K213I, V026Q-A048E-K213N, V026N-A048E-K213N, A048E-K213L, VO26Y-A048E-K2 1 3 I, A048D-K213N, K213I, A048H-K213N,V147D-K213N, Y021H-A045V-S101E-Y217L, Y021H-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, A045V-Y217L, Y021H-A045V-S101N-Y217Q, YO21W-S101 P-Y217L , YO21ff-AO45 I-Y217E , Y021H-A045V-S101E-Y217E, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, Y021W-S101E-Y217L, S101E-Y217L, Y021H-A045V-Y217Q, Y021H-Y217E, Y021W-Y217E-(N0212S) , A045I-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, Y021W-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-S101E-Y217E, Y021W-S101N-Y217L, S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114A-V246T, Y021H-A045V-S101E, Y021W-A045V-S101E-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213K-Y217Q, SlOlS-Ml19N-K213N-Y217Q, Y021H-A045V-S101P-Y217L, S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T, S10 1 S-Ml19F-K2131-Y217Q, SlOlS-Ml19M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-S101E-Y217E, Y021H-A045V-S101E, Y021H-Y217L, Y021H-A045I-Y217E, Y021W-A045I-S101E-Y217E, S101N-M119F-K213K-Y217L, SlOlE-Ml19H-K213N-Y217E, Y021H-A045I-Y217E, S101S-M119H-K213L-Y217L, Y021H-Y217E, S101S-M119F-K213K-Y217Q，禾P Y021H-A045I-S101E-Y217L的組合。在一些實(shí)施方案中，所述取代包含選自S0MS_ V028T-M050V-A092G-Q103E-A114G-V246T, S101N-M119H, M119N-K213N-Y217L, Y217L, M119N-K213N, K213N, K213N-Y217Q, S101E-K213N-Y217E, SlOlE-Ml19N-Y217L, Y217Q, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217E, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217L, S101E-Y217L, A045I-Y217Q，SlOlS-Ml 19M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217L 的組口 O本發(fā)明還提供了包括在實(shí)施例中提供的表中給出的變體，以及包含這些變體的組 合物。本發(fā)明還提供了分離的編碼枯草桿菌蛋白酶變體的核酸、包含所述核酸的表達(dá)載 體，和包含該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供了包含枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組 合物。在一些實(shí)施方案中，清潔組合物是洗衣洗滌劑。在一些實(shí)施方案中，洗衣洗滌劑是冷 水洗滌劑、低PH洗滌劑或者濃縮洗滌劑。此外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)芽孢桿菌枯草桿菌蛋白 酶的枯草桿菌蛋白酶變體的方法，包括用包含編碼枯草桿菌蛋白酶變體的核酸的表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；并在適于產(chǎn)生該枯草桿菌蛋白酶變體的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在 一些實(shí)施方案中，所述方法還包括收獲產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶變體的步驟。在一些實(shí)施方 案中，宿主細(xì)胞是芽孢桿菌物種，在這些實(shí)施方案的子集中，所述芽孢桿菌物種是枯草芽孢 桿菌。此外，本發(fā)明提供了清潔方法，包括將包含織物的表面和/或物品與包含分離的枯草 桿菌蛋白酶變體的清潔組合物接觸。此外，本發(fā)明提供了蛋白酶工程化方法，包括步驟a)提供多個(gè)位點(diǎn)評(píng)估文庫(kù) (SEL)，每個(gè)文庫(kù)包含在蛋白酶的相同氨基酸位置具有不同取代的多個(gè)蛋白酶變體；b)在 目的性質(zhì)測(cè)試中測(cè)試SEL的蛋白酶變體和標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶；c)為該測(cè)試的蛋白酶變體的每一種 確定性能指數(shù)(PI) ；d)將兩個(gè)或多個(gè)氨基酸位置鑒定為非限制性位置；其中兩個(gè)SEL的每 一個(gè)中所述多種蛋白酶變體的至少一種具有大于0.5的PI ；和f)提供多突變文庫(kù)，其包含 許多多取代的蛋白酶變體，每種變體在兩個(gè)或更多非限制性位置包含取代。在一些實(shí)施方 案中，所述測(cè)試包括選自污漬去除測(cè)定(微樣品)、LAS穩(wěn)定性測(cè)定、洗滌劑穩(wěn)定性測(cè)定和比活性測(cè)定的兩種或多種不同的測(cè)定法。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶選自細(xì)菌絲氨酸蛋白酶、 細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶和細(xì)菌中性金屬蛋白酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的多取代 的枯草桿菌蛋白酶變體的方法，包括在第一種性質(zhì)的第一種測(cè)試和第二種性質(zhì)的第二種 測(cè)試中測(cè)試多種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體，其中親本枯草桿菌蛋白酶的性質(zhì)在每種測(cè) 試中被給予1.0的值，有利的第一種或第二種性質(zhì)具有大于1. 0的值，并且過(guò)分不利的第一 種或第二種性質(zhì)具有小于約0. 80的值或者在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，小于約0. 60 ；鑒定至少 一種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體中與有利的第一種性質(zhì)相關(guān)并且不與過(guò)分不利的第二 種性質(zhì)相關(guān)的取代；鑒定至少一種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體中與有利的第二種性質(zhì)相 關(guān)并且不與過(guò)分不利的第一種性質(zhì)相關(guān)的取代；并將來(lái)自前面步驟的取代引入枯草桿菌蛋 白酶中以產(chǎn)生多取代的枯草桿菌蛋白酶變體。在一些實(shí)施方案中，方法還包括在第一種測(cè) 試和第二種測(cè)試中測(cè)試多取代的枯草桿菌蛋白酶變體，其中改進(jìn)的枯草桿菌蛋白酶變體實(shí) 現(xiàn)在第一種和第二種中測(cè)試中均大于1. 0的值，或者在第一種測(cè)試中大于1. 0的值并且在 第二種測(cè)試中為0. 80到1. 0的值。在一些實(shí)施方案中，方法還包括產(chǎn)生改進(jìn)的枯草桿菌蛋 白酶變體。在一些實(shí)施方案中，第一種和第二種性質(zhì)負(fù)相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，有利的第 一種或第二種性質(zhì)具有大于約1. 2的值。在一些實(shí)施方案中，過(guò)分不利的第一種或第二種 性質(zhì)具有小于約0. 40的值。在一些實(shí)施方案中，第一種性質(zhì)是穩(wěn)定性，第二種性質(zhì)是洗滌 性能。在這些性質(zhì)的子集中，穩(wěn)定性包括洗滌劑中的穩(wěn)定性并且洗滌性能包括洗滌劑中的 血奶墨(BMI)洗滌性能。在一些實(shí)施方案中，親本細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶是具有SEQ ID NO 2給出的氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的野生型成熟形式。在其他實(shí) 施方案中，親本細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶是遲緩芽孢桿菌(B. lentUS)GG36枯草桿菌蛋白酶的 野生型，具有SEQ ID NO :562給出的氨基酸序列，或者是BPN”，包含Y217L取代(SEQ IDNO 565)，單獨(dú)或者與其他修飾組合。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在具有5到12. 0的pH的粉 狀或者液體洗滌劑組合物中測(cè)試洗滌性能。所述步驟不意在局限于上面所列的確切順序， 因?yàn)槿魏魏线m的順序可用于本發(fā)明。然而，在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述取代是在親本枯草 桿菌蛋白酶中具有大于約50%或大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置中。附圖
簡(jiǎn)述圖IA 提供 了 pHPLT-VAAc 1 的圖，而圖 IB 提供 了 pHPLT-BPN，的圖。圖2A描述了北美洗衣洗滌劑中BPN，_Y217L CCL的BMI清潔性能作為電荷改變的 函數(shù)。類似地，圖2B描繪了在北美洗衣洗滌劑中GG36CCL的BMI清潔性能作為電荷改變的函數(shù)。圖3A描繪了西歐液體洗衣洗滌劑中BPN，_Y217L CCL的BMI清潔性能作為電荷改 變的函數(shù)。類似地，圖3B描繪了西歐液體洗衣洗滌劑中GG36CCL的BMI清潔性能作為電荷 改變的函數(shù)。圖4A描繪了日本粉狀洗衣洗滌劑中BPN，-Y217L CCL的BMI清潔性能作為電荷改 變的函數(shù)。類似地，圖4B描繪了日本粉狀洗衣洗滌劑中GG36 CCL的BMI清潔性能作為電 荷改變的函數(shù)。圖5A描繪了自動(dòng)餐具洗滌劑中BPN’_Y217L CCL的烘焙蛋黃清潔性能作為電荷改 變的函數(shù)。類似地，圖5B描繪了自動(dòng)餐具洗滌劑中GG36CCL的烘焙蛋黃清潔性能作為電荷改變的函數(shù)。圖6描繪了對(duì)于含有80種變體的文庫(kù)，LAS/EDTA穩(wěn)定性作為相對(duì)于親本 BPN，-Y217L的凈電荷改變的函數(shù)。發(fā)明描述本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)工程化方法。特別地，本發(fā)明提供了利用位點(diǎn)評(píng)估文庫(kù)的方法。為了實(shí)際目的，通常不必在蛋白質(zhì)空間中發(fā)現(xiàn)最好的序列以便產(chǎn)生對(duì)于具體應(yīng)用 為最優(yōu)的蛋白質(zhì)。對(duì)于多數(shù)應(yīng)用，待解決的問(wèn)題是鑒定滿足或者超過(guò)許多性質(zhì)所需的最小 值的至少一種蛋白質(zhì)序列。這需要對(duì)于具體性質(zhì)有益的突變的知識(shí)，以及對(duì)于任何希望的 性質(zhì)有害的那些突變的知識(shí)。本發(fā)明通過(guò)鑒定蛋白質(zhì)中可以被改變以改善主要性質(zhì)和將對(duì) 于其他性質(zhì)的值保持在希望的范圍內(nèi)的那些位置，提供了滿足該目標(biāo)的方法。本發(fā)明提供了通過(guò)在每個(gè)位點(diǎn)建立“文庫(kù)評(píng)估文庫(kù)”評(píng)估蛋白質(zhì)中所有位置的所 有目的性質(zhì)的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這些文庫(kù)在每個(gè)位置含有9-19個(gè)突變，并且用于 評(píng)估每個(gè)位置在工程化蛋白質(zhì)和構(gòu)建文庫(kù)中的用途。測(cè)量相對(duì)于親本酶的每種性質(zhì)并且計(jì) 算每種突變體相對(duì)于野生型的表觀自由能差異。然后將這些delta delta G(即，Δ AG”) 表觀值用于確定可加性。一種分析變體的理想方法將是通過(guò)在目的過(guò)程中變體相對(duì)于親本蛋白的自由能 差異。過(guò)程的吉布斯自由能代表系統(tǒng)可以做功的最大量。相對(duì)于親本酶的自由能改變 (Δ AG)在如下給出Δ Δ G = -RT In (k 變體 /k 親本)其中是變體酶的速率常數(shù)，并且是親本酶的速率常數(shù)，R是氣體常數(shù)，T是 絕對(duì)溫度。多數(shù)測(cè)定法沒(méi)有被構(gòu)建成允許測(cè)定真正的自由能，因此我們利用量Δ Δ Gapp = -RT In (P 變體 /P 親本)其中是變體的性能值，P1^是在相同條件下親本酶的性能值?？梢灶A(yù)期 Δ △ Gapp值對(duì)于數(shù)據(jù)分布和可加性具有與Δ △ G相似的方式。然而，因?yàn)棣?Δ G是與親本酶 相比變體可以做功的最大量，所以量Δ AGapp將通常低估了 Δ AG并且導(dǎo)致似乎協(xié)同的結(jié) 果，因?yàn)閮蓚€(gè)相加位置的性質(zhì)可以大于通過(guò)將它們?chǔ)?AGapp值相加預(yù)測(cè)的值。本發(fā)明的方法用于設(shè)計(jì)有效文庫(kù)，該文庫(kù)用于平行地改造多個(gè)性質(zhì)。盡管在本文 描述了一些酶，但是方法適用于任何用于工程化的目的蛋白質(zhì)。通過(guò)在每個(gè)位置引入12到 19個(gè)取代，如本文所述的構(gòu)建位點(diǎn)評(píng)估文庫(kù)(SEL)。使用活性和穩(wěn)定性測(cè)定法分析所得的 突變。將野生型氨基酸列為每個(gè)位置的參考點(diǎn)。對(duì)于每種性質(zhì)，用測(cè)量結(jié)果確定親本蛋白 的Δ AGapp的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。將親本平均值(μ 歸一化為0，并確定Δ AGapp的標(biāo)準(zhǔn) 差(σ ^J。這些值用作分子的每個(gè)位置上每種性質(zhì)的參考值。檢驗(yàn)位點(diǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)的性質(zhì) 之間的相關(guān)性證據(jù)。將每種性質(zhì)的△ AGapp值對(duì)每種其他性質(zhì)作圖并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。蛋白 質(zhì)底物的兩種活性測(cè)量結(jié)果是相關(guān)的。為了分析氨基酸序列內(nèi)的位置，定義了兩種類型的位點(diǎn)?！胺巧a(chǎn)性”位點(diǎn)沒(méi)有好 于親本酶的突變體，而“生產(chǎn)性”位點(diǎn)具有至少一個(gè)好于親本酶的取代。位點(diǎn)將是生產(chǎn)性 的概率通過(guò)生產(chǎn)性位點(diǎn)除以位點(diǎn)總數(shù)給出。盡管任一突變將好于親本酶的概率很低(即， 6% )，但是給定位點(diǎn)將具有至少一個(gè)向上突變(Up mutation)的概率相當(dāng)高。
重要的是確定生產(chǎn)性和非生產(chǎn)性位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)特征(例如，埋藏的氨基酸、相互作 用的氨基酸、活性位點(diǎn)附近的位置，等等)方面在蛋白酶中是怎樣分布的，以及在進(jìn)化中保 守的或者可改變的序列位點(diǎn)。為了做出該確定，檢查結(jié)構(gòu)并將序列與非冗余同源物比對(duì)。如實(shí)施例中指出，任何性質(zhì)的有害突變與每個(gè)其他性質(zhì)的有害突變相關(guān)，不管性 質(zhì)的相關(guān)性如何。僅僅少數(shù)位置(5-10%)具有對(duì)所有性質(zhì)有害的突變。這些位置定義了 “折疊” (fold)并且在進(jìn)化中保守。其含意是盡管對(duì)于任何性質(zhì)，有益突變的鑒定需要該性 質(zhì)的真實(shí)預(yù)測(cè)篩選，但是鑒定可能對(duì)任一性質(zhì)有害的突變可以使用ANY篩選完成。一種簡(jiǎn) 化的蛋白質(zhì)工程化策略是建立SEL并使用簡(jiǎn)單的活性和/或穩(wěn)定性篩選方法進(jìn)行篩選。鑒 定有害突變并且具有很少有害突變的那些位置用于構(gòu)建文庫(kù)和組合突變來(lái)改進(jìn)多種性質(zhì)。 而且，挑選在蛋白質(zhì)表面上、有很少的相互作用并且在序列比對(duì)中可變的位點(diǎn)提供了高比 例的生產(chǎn)性位點(diǎn)。在分子內(nèi)部、具有許多接觸并且在進(jìn)化中強(qiáng)烈保守的位點(diǎn)具有有害突變 的概率很高并且應(yīng)該避免。設(shè)想用于分析序列和/或結(jié)構(gòu)信息的任何合適方法將可用于本 發(fā)明，包括但不限于計(jì)算機(jī)和/或電學(xué)方法和/或程序。方法提供了對(duì)于兩種性質(zhì)的每一種具有大于5% Wt活性和小于5%活性的變體數(shù) 目的逐對(duì)比較，以及這兩種性質(zhì)的相關(guān)系數(shù)。文庫(kù)設(shè)計(jì)在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，位點(diǎn)評(píng)估文庫(kù)用于組合文庫(kù)設(shè)計(jì)。常規(guī)的定向進(jìn) 化建立了隨機(jī)文庫(kù)并且為單一性質(zhì)篩選大量文庫(kù)，將這些組合并重復(fù)該方法。如一些研 究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)例如，Bloom et al.，Curr. Opin. Struct. Biol.，15 :447-452[2005]； Bloom et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 :5869-5874 [2006]；禾口 Guo et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :9205-9210 [2004])，一種性質(zhì)的積極突變的積累通常導(dǎo)致其他性 質(zhì)中的降低。任一突變對(duì)于任一性質(zhì)將是向上的概率是小的，并且任一突變將是向下的概 率是高的(> 85% )，并且積累三個(gè)(3)以上增加活性的突變將導(dǎo)致一些其他性質(zhì)的降低 的概率是相當(dāng)高的。通過(guò)使用位點(diǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)建立將對(duì)于多種性質(zhì)有益的文庫(kù)避免了該問(wèn) 題。在組合文庫(kù)中不包括非生產(chǎn)性位點(diǎn)，并且通過(guò)向上的突變百分比進(jìn)一步對(duì)生產(chǎn)性位點(diǎn) 分類。清潔組合物本發(fā)明的清潔組合物有利地用于例如洗滌應(yīng)用、硬表面清潔、自動(dòng)洗碟應(yīng)用，以及 美容應(yīng)用，如義齒、牙齒、頭發(fā)和皮膚。然而，由于在較低溫度溶液中增加的有效性的獨(dú)特優(yōu) 點(diǎn)，本發(fā)明的酶理想地適于洗滌應(yīng)用。此外，本發(fā)明的酶可用于粒狀和液體組合物中。本發(fā)明的變體蛋白酶也可以用于清潔添加劑產(chǎn)品中。在一些實(shí)施方案中，可用于 低溫溶液清潔應(yīng)用。添加劑產(chǎn)品在其最簡(jiǎn)單的形式中可以是一種或多種蛋白酶。在一些實(shí) 施方案中，將添加劑以劑型包裝用于加入清潔過(guò)程中。任何合適的單一劑型也可以用于本 發(fā)明，包括但不限于，丸劑、片劑、軟膠囊、或者其他單一劑量單位，如預(yù)先測(cè)量的粉劑或液 體。在一些實(shí)施方案中，包括填充劑或載體材料以增加此類組合物的體積。合適的填充劑 或者載體材料包括但不限于，多種硫酸鹽、碳酸鹽和硅酸鹽，以及滑石粉、粘土等等。用于液 體組合物的合適填充劑或載體材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和 二元醇。此類醇的實(shí)例包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實(shí)施方案中，組 合物含有約5%到約90%的此類物質(zhì)。酸性填充劑可用于降低pH。備選地，清潔添加劑包括如下文更詳細(xì)描述的附屬成分。本清潔組合物和清潔添加劑需要有效量的至少一種本文提供的蛋白酶變體，其單 獨(dú)或者與其他蛋白酶和/或額外酶組合。通過(guò)加入一種或多種本發(fā)明的蛋白酶變體實(shí)現(xiàn)酶 的所需水平。典型的，本清潔組合物將包含至少約0.0001重量百分比，約0. 0001到約1、約 0. 001到約0. 5、或甚至約0. 01到約0. 1重量百分比的至少一種本發(fā)明的變體蛋白酶。典型地配制本文的清潔組合物使得在水性清潔操作中使用期間，洗滌水將具有約 5. 0到約11. 5或甚至約7. 5到約10. 5的pH。典型地配制液體產(chǎn)品制劑以具有約3. 0到約 9. 0或甚至約3到約5的凈pH。典型地配制粒狀洗衣產(chǎn)品以具有約9到約11的pH。用于 將PH控制在推薦的使用水平的技術(shù)包括使用緩沖劑、堿、酸等等，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的。合適的低pH清潔組合物通常具有約3到約5的凈pH，并且通常沒(méi)有在這種pH環(huán) 境中水解的表面活性劑。此類表面活性劑包括烷基硫酸鈉表面活性劑，其包含至少一個(gè)環(huán) 氧乙烷部分或者甚至約1到約16摩爾的環(huán)氧乙烷。此類清潔組合物通常包含足夠量的pH 修飾劑，如氫氧化鈉、單乙醇胺或者氫氯酸，以提供具有約3到約5的凈pH的此類清潔組合 物。此類組合物通常包含至少一種酸穩(wěn)定的酶。在一些實(shí)施方案中，組合物是液體，而在其 他實(shí)施方案中，它們是固體。此類液體組合物的PH通常測(cè)量為凈pH。此類固體組合物的 PH作為所述組合物的10%固體溶液測(cè)量，其中溶劑是蒸餾水。在這些實(shí)施方案中，在20°C 進(jìn)行所有PH測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)變體蛋白酶用于粒狀組合物或液體中時(shí)，希望變體蛋白酶 為經(jīng)封裝顆粒形式以保護(hù)該變體蛋白酶免于保存期間粒狀組合物的其他組分的作用。此 外，封裝也是在清潔過(guò)程中控制變體蛋白酶可用性的一種手段。在一些實(shí)施方案中，封裝增 強(qiáng)了變體蛋白酶和/或額外酶的性能。在這方面，用本領(lǐng)域已知的任何合適的封裝材料封 裝本發(fā)明的變體蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，封裝材料通常封裝本發(fā)明變體蛋白酶的至少 部分催化劑。通常，封裝材料是水溶性的和/或水可分散的。在一些實(shí)施方案中，封裝材料 具有0°C或更高的玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg)。玻璃轉(zhuǎn)化溫度在WO 97/11151中更詳細(xì)描述。封裝材 料選自糖類、天然或合成的樹(shù)膠、殼多糖、殼聚糖、纖維素和纖維素衍生物、硅酸鹽、磷酸鹽、 硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟和其組合。當(dāng)封裝材料是糖類時(shí)，其通常選自單糖、寡糖、 多糖和其組合。通常，封裝材料是淀粉。合適的淀粉描述于EP 0 922 499 ；US 4,977, 252 ； US 5，354，559，和US 5，935，826。在一些實(shí)施方案中，封裝材料是塑料如熱塑塑料、丙烯腈、 甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和其混合物制成的微球體；可使用的可商購(gòu)微球體包 括以 EXPANCEL (Stockviksverken，Sweden) JPPM 6545，PM 6550，PM 7220，PM 7228， EXTENDOSPHERES ，LUXSIL Q-CEL ⑧，和 SPHERICEL (PQ Corp. ,Valley Forge, PA)提 供的微球體。如本文所述，本發(fā)明的變體蛋白酶可尤其用于清潔工業(yè)，包括，但不限于洗衣和洗 碟洗滌劑。這些應(yīng)用將酶置于多種環(huán)境脅迫下。本發(fā)明的變體蛋白酶由于在多種條件下的 穩(wěn)定性相對(duì)于許多當(dāng)前使用的酶提供了益處。實(shí)際上，有多種洗滌條件，包括參與洗滌的蛋白酶所暴露的不同的洗滌劑制劑、 洗滌水體積、洗滌水溫度、和洗滌時(shí)間長(zhǎng)度。此外，用于不同的地理區(qū)域的洗滌劑制劑 存在于洗滌水中的相關(guān)組分具有不同濃度。例如，歐洲洗滌劑通常在洗滌水中具有約4500-5000ppm的洗滌劑組分，而日本洗滌劑通常在洗滌水中具有約667ppm的洗滌劑組分。 在北美，尤其在美國(guó)，洗滌劑通常在洗滌水中具有約975ppm的洗滌劑組分。低洗滌劑濃度系統(tǒng)包括其中在洗滌水中存在少于約SOOppm洗滌劑組分的洗滌 劑。日本洗滌劑通常被認(rèn)為是低洗滌劑濃度系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈兺ǔＴ谙礈焖写嬖诩s667ppm 的洗滌劑組分。中洗滌劑濃度包括其中在洗滌水中存在約800ppm到約2000ppm洗滌劑組分的洗 滌劑。北美洗滌劑通常被認(rèn)為是中等洗滌劑濃度系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈兺ǔＴ谙礈焖写嬖诩s 975ppm的洗滌劑組分。巴西洗滌劑通常具有存在于洗滌水中約1500ppm的洗滌劑組分。高洗滌劑濃度系統(tǒng)包括洗滌劑，其中洗滌水中存在大于約2000ppm的洗滌劑組 分。通常認(rèn)為歐洲洗滌劑是高洗滌劑濃度系統(tǒng)，其通常在洗滌水中含有約4500-5000ppm的 洗滌劑組分。拉丁美洲洗滌劑通常是高泡磷酸增潔洗滌劑，拉丁美洲使用的洗滌劑范圍可落入 中洗滌劑濃度和高洗滌劑濃度之間，因?yàn)樗鼈冊(cè)谙礈焖械南礈靹┙M分范圍在1500ppm至 6000ppmo如上所述，巴西洗滌劑通常在洗滌水中含有約1500ppm的洗滌劑組分。然而，其 他高泡磷酸增潔洗滌劑地區(qū)，不限于其他拉丁美洲國(guó)家，可具有高洗滌劑濃度系統(tǒng)，在洗滌 水中存在高達(dá)約6000ppm的洗滌劑組分。鑒于上述內(nèi)容，很顯然，典型的洗滌溶液中洗滌劑組合物的濃度在世界范圍內(nèi)變 動(dòng)，從低于約SOOppm的洗滌劑組合物(“低洗滌劑濃度系統(tǒng)”)，例如日本的約667ppm，到在 約800ppm至約2000ppm之間(“中洗滌劑濃度系統(tǒng)”)，例如美國(guó)的約975ppm和巴西的約 1500ppm,到大于約2000ppm( “高洗滌劑濃度系統(tǒng)”)，例如歐洲的約4500ppm至約5000ppm， 以及高泡磷酸增潔洗滌劑地區(qū)的約6000ppm。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定典型洗滌溶液的濃度。例如，在美國(guó)，典型的洗衣機(jī)容納體積約 64. 4L的洗滌溶液。因此，為了獲得洗滌溶液中約975ppm的洗滌劑濃度，應(yīng)該向64. 4L洗滌 溶液中添加62. 79g的洗滌劑組合物。該量是消費(fèi)者利用洗滌劑提供的量杯量入洗滌水中 的典型量。在另一實(shí)例中，不同地區(qū)使用不同的洗滌溫度。日本的洗滌水的溫度通常低于歐 洲使用的溫度。例如，北美和日本的洗滌水溫度通常在10至30°C (如，約20°C )，而歐洲洗 滌水溫度一般在30至60°C (如，約40°C )。在另一實(shí)例中，不同地區(qū)通常具有不同的水硬度。水硬度一般通過(guò)每加侖混合的 Ca2+/Mg2+的格令(grain)數(shù)來(lái)描述。硬度是水中鈣(Ca2+)和鎂(Mg2+)的量的度量。美國(guó)的 多數(shù)水是硬水，但硬度值不同。中等硬度水(60-120ppm)至硬水(121-181ppm)具有60至 ISlppm的硬度礦物(ppm轉(zhuǎn)換成格令/美制加侖是ppm數(shù)除以17. 1等于格令/加侖)。
權(quán)利要求
1.芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋 白酶變體是成熟形式，具有蛋白水解活性并且包含在一個(gè)或多個(gè)位置上的取代，所述位置 選自:1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26， 27，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54， 55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，72，73，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88， 89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112， 113，114，115，116，117，118，119，122，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134， 135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158， 159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179， 180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199， 200，201，203，204，206，207，209，210，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223， 224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244， 245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263， 264，265，267，268，269，270，271，272，273和 274，其中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2給出的 解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述一個(gè)或多個(gè)位置選自1，2，5， 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，28，29，30，31，33， 35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60， 64，65，66，67，71，72，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95， 96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112，113，114，115，116，118， 119，122，124，125，126，127，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145， 146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167， 169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187， 188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，213， 214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235， 236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，253，254，255， 256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273 和 274，其 中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序 列。
3.權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述一個(gè)或多個(gè)位置選自2，3，5，6，7，8， 9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，20，21，21，22，23，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39， 40，41，42，44，46，47，48，49，50，51，53，54，55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，73，77， 78，79，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91，92，93，94，95，96，102，105，106，110，111，112， 113，114，115，116，122，124，125，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，145， 146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，165，166，167，169，170， 171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，186，187，189，190，191，192， 194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，214，216，217，218，219，220， 222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242， 243，244，245，246，247，249，250，251，253，254，255，257，258，259，260，261，262，263，264，-265，267，268，269，270，271，272，273，和 274，其中所述位置對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO :2 給出的解 淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體還包含在選自 18，52，72，117，119，127，144，185，209和213的一個(gè)或多個(gè)位置上的取代，其中所述位置對(duì) 應(yīng)于SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述取代包含如下的一個(gè)或多個(gè):A001C,A001D,A001E,A001F,A001G,A001H,A001I,A001K,A001L,A001M,A001N,A001Q,A001R,A001S,A001V,A001W,Q002A,Q002D,Q002E,Q002G,Q002S,S003A,S003D,S003F,S003G,S003I,S003K,S003L,S003M,S003N,S003P,S003Q,S003R,S003T,S003V,S003W,S003Y,P005C,P005E,P005G,P005N,P005Q,P005T,Y006A,Y006C,Y006E,Y006F,Y006G,Y006K,Y006M,Y006N,Y006P,Y006Q,Y006R,Y006T,Y006V,Y006W,S009A,S009C,S009E,S009F,S009G,S009H,S009K,S009L,S009M,S009P,S009Q,S009R,S009T,S009V,S009W,Q010A,Q010C,Q010E,Q010F,Q010G,Q010H,Q010I,Q010K,Q010L,Q010M,Q010R,Q010S,Q010T,Q010V,Q010W,I011C,I011L,I011T,I011V,I011Y,K012A,K012C,K012D,K012E,K012F,K012G,K012H,K012I,K012N,K012Q,K012S,K012T,K012V,K012W,K012Y,A013C,A013F,A013G,A013H,A013L,A013R,A013S,A013T,A013V,P014A,P014C,P014D,P014E,P014F,P014G,P014I,P014K,P014L,P014M,P014N,P014Q,P014R,P014S,P014T,P014V,P014W,P014Y,A015C,A015D,A015E,A015F,A015G,A015H,A015I,A015K,A015L,A015M,A015P,A015Q,A015R,A015T,A015V,A015Y,L016A,L016C,L016I,L016M,L016Q,L016S,L016T,H017F,H017I,H017L,H017M,H017V,H017W,H017Y,S018A,S018E,S018F,S018G,S018H,S018I,S018K,S018L,S018M,S018N,S018P,S018Q,S018R,S018T,S018V,S018W,S018Y,Q019A,Q019C,Q019D,Q019E,Q019G,Q019I,Q019K,Q019M,Q019R,Q019T,Q019V,G020A,G020C,G020D,G020E,G020F,G020H,G020K,G020M,G020N,G020P,G020Q,G020R,G020S,G020W,Y021A,Y021C,Y021D,Y021E,Y021F,Y021G,Y021H,Y021K,Y021M,Y021R,Y021S,Y021T,Y021V,Y021W,T022A,T022C,T022E,T022F,T022G,T022H,T022I,T022K,T022L,T022M,T022N,T022Q,T022S,T022V,T022W,T022Y,S024C,S024F,S024G,S024H,S024I，S024K ，S024L, S024M, S024N, S024Q, S024R, S024T, S024W, S024Y, N025C, N025E, N025F, N025G, N025H, N025I, N025K, N025L, N025M, N025P, N025R, N025S, N025T, N025V, N025W, K027A, K027D, K027E, K027F, K027G, K027H, K027L, K027M, K027P, K027R, K027S, K027W, K027Y, D032A, D032C, D032E, D032G, D032I, D032K, D032L, D032M, D032N, D032R, D032S, D032T, D032V, D032Y, S033A, S033F, S033G, S033H, S033P, S033T, S033W, I035A, I035C, I035D, I035R, I035S, I035T, I035V, D036A, D036C, D036E, D036Q, D036S, D036W, S037A, S037C, S037E, S037F, S037G ， S037H, S037K, S037L, S037M, S037P, S037Q, S037R, S037T, S037W, H039C, H039Q, H039T, H039V, P040A, P040C, P040E, P040F, P040G, P040G, P040H, P040I, P040K, P040L，P040M, P040N, P040Q, P040R, P040S, P040T, P040V, P040W, D041E, L042I, L042M, L042V, K043A, K043C, K043D, K043E, K043F, K043G, K043I, K043L, K043M, K043N, K043R, K043S, K043T, K043V, K043W, K043Y, V044A, V044C, V044I, V044L, V044M, V044P, V044S, V044T, A045C, A045E, A045F, A045H, A045I, A045K, A045L, A045M, A045N, A045P, A045Q, A045S, A045T, A045V, A045Y, G046A, G046C, G046E, G046H, G046K, G046M, G046N,G046Q,G046T,G046W, G046YA048C,A048D,A048E,A048F,A048H,A048I, A048K,A048L,A048M,A048Q,A048R, A048SA048T,A048V,A048W,A048Y,M050A,M050C, M050F,M050H,M050I,M050K,M050L, M050QM050R,M050S,M050T,M050V,M050W,M050Y, V051A,V051C,V051D,V051E,V051H,V051I，V051L, V051PV051QP052C,P052D,P052E, P052F,P052H,P052I,P052K,P052L,P052QP052R,P052S,P052T,P052V,P052W,P052Y,S053E,S053F,S053G,S053H,S053I,S053KS053L,S053M,S053N,S053Q,S053R,S053T,S053V,S053W,E054A,E054N,E054Q,E054ST055A,T055C,T055D,T055F,T055G,T055H,T055I,T055K,T055M,T055P,T055Q,T055RT055S,T055V,T055W,T055Y,N056D,N056M,N056P,N056Q,N056S,N056T,N056V,P057NP057Q,P057T,P057V,P057W,F058C,F058E,F058G,F058H,F058L,F058M,F058N,F058QF058S,F058V,F058Y,Q059A,Q059C,Q059D,Q059E,Q059F,Q059G,Q059H,Q059K,Q059LQ059M,Q059N,Q059P,Q059R,Q059S,Q059T,Q059V,Q059W,Q059Y,D060E,D060G,H064CH064D,H064F,H064I,H064L,H064M,H064Q,H064R,H064S,H064T,H064V,H064Y,T066ST066W,T066Y,H067A,H067C,H067F,H067I,H067L,H067M,H067N,H067P,H067R,H067SH067T,T071I,T071Y,N077S,S078A,S078C,S078D,S078F,S078G,S078I,S078K,S078LS078M,S078N,S078P,S078Q,S078R,S078T,S078V,S078W,S078Y,I079A,I079C,I079EI079F,I079G,I079H,I079K,I079L,I079N,I079Q,I079R,I079S,I079T,I079V,I079WI079Y,V081F,V081I,V081L,V081M,V081T,G083F,G083P,Q084A,Q084C,Q084H,Q084IQ084N,Q084T,A085C,A085F,A085G,A085R,A085S,P086A,P086D,P086E,P086G,P086MP086N,P086Q,P086R,P086S,P086T,P086W,P086Y,S089C,S089D,S089E,S089F,S089GS089H,S089K,S089L,S089V,S089W,S089Y,L090A,L090D,L090E,L090G,L090H,L090ML090Q,L090T,L090V,Y091A,Y091C,Y091D,Y091E,Y091F,Y091H,Y091I,Y091L,Y091MY091Q,Y091S,Y091T,Y091V,L096F,L096H,L096I,L096K,L096M,L096T,L096V,G097AG097C,G097D,G097E,G097H,G097K,G097L,G097M,G097P,G097Q,G097R,G097S,G097TG097V,A098C,A098D,A098F,A098G,A098H,A098I,A098L,A098P,A098Q,A098R,A098SA098T,A098V,A098Y,D099C,D099E,D099I,D099K,D099L,D099N,D099P,D099Q,D099RD099S,D099T,S101A,S101C,S101E,S101F,S101G,S101I,S101K,S101L,S101M,SlOlNS101P,S101Q,S101R,S101T,S101V,S101Y,G102A,G102C,G102E,G102F,G102I,G102NG102S,G102V,G102Y,Q103A,Q103C,Q103E,Q103F,Q103G,Q103I,Q103K,Q103L,Q103MQ103N,Q103R,Q103S,Q103T,Q103V,Q103W,S105A,S105C,S105D,S105E,S105F,S105GS105I,S105K,S105L,S105M,S105N,S105P,S105R,S105V,S105W,W106A,W106C,W106EW106F,W106G,W106H,W106I,W106L,W106M,W106N,W106R,W106S,W106T,W106V,W106YN109A,N109C,N109E,N109F,N109G,N109H,N109L,N109M,N109P,N109Q,N109R,N109SN109T,N109V,N109W,N109Y,I111C,I111F,I111L,I111M,I111N,I111P,I111T,IlllVIlllff,E112A,E112C,E112D,E112F,E112G,E112I,E112L,E112M,E112N,E112Q,E112RE112S,E112T,E112V,E112W,E112Y,W113D,W113E,W113F,W113N,W113P,W113Q,W113SW113V,W113Y,I115E,I115H,I115N,I115R,I115T,I115V,I115W,I115Y,A116C,A116DA116E,A116F,A116G,A116H,A116I,A116K,A116L,A116M,A116N,A116P,A116Q,A116RA116S,A116T,A116V,A116W,A116Y,N118A,N118C,N118D,N118E,N118F,N118G,N118HN118I,N118K,N118L,N118M,N118Q,N118R,N118S,N118T,N118V,N118W,N118Y,I122A,I122C,I122H,I122K,I122L,I122M,I122N,I122P,M124C,M124D,M124I,M124L,M124S, 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A274K, A274L, A274Q, A274S,A274T，和A274V，其中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO 2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述取代包含選自Y021H-Y217E， Y021H-Y217Q, S101E-Y217L, Y021H-Y217L, K213I-Y217Q, A045I-Y217Q, M119F-Y217Q, A045V-Y217L, Y021H-Y217L， K213I-Y217E， A092G-A114G， Y021W-S101E, V26Q-K213I,和 Y021H-S101N的取代組合，其中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草 桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述取代包含選自S101N-K213I， S101N-M119H, K213L, M119N-K213N， K213N, K213I-Y217E， M119N-K213I， K213N-Y217Q， M119H-K213N, S101P-K213N, M119H-Y217Q, K213I-Y217Q, M119F-K213L, Y217Q, M119F-Y217Q, A048E-K213L, A048H-K213L, K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, V026Y-K213N, A048D-K213N, A048H-K213N, A048H-K213L, K213L, K213N, V147D-K213L, K213I, A048E-K213L, A048D-K213N, K213I, A048H-K213N, V147D-K213N, Y021H-Y217L, Y021H-Y217Q, A045V-Y217L, S101E-Y217L, Y021H-Y217E, A045I-Y217Q, Y021H-Y217L, Y021H-Y217E的組合，其中所述位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌 蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述取代包含選自S101N-M119H，Y217L， M119N-K213N, S101E-Y217L, A045I-Y217Q 的組合，其中所述位置對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO 2 給出 的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
9.編碼權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體的分離的核酸。
10.包含權(quán)利要求9的核酸的表達(dá)載體。
11.包含權(quán)利要求10的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
12.包含權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物。
13.其中所述清潔組合物是洗衣洗滌劑。
14.其中所述洗衣洗滌劑是冷水洗滌劑、低PH洗滌劑，或者濃縮洗滌劑。
15.產(chǎn)生芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶變體的方法，包括步驟a)用包含編碼權(quán)利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和b)在適于產(chǎn)生枯草桿菌蛋白酶變體的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生枯草桿菌蛋 白酶變體。
16.權(quán)利要求15的方法，還包括收獲所產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶變體的步驟。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬物種。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述芽孢桿菌屬物種是枯草芽孢桿菌。
19.清潔方法，包括將表面和/或包含織物的物品與包含權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的分離的 枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物接觸的步驟。
20.蛋白酶工程化方法，包括a)提供多個(gè)位點(diǎn)評(píng)估文庫(kù)(SEL)，每個(gè)文庫(kù)包含在所述蛋白酶的相同氨基酸位置具有 不同取代的多個(gè)蛋白酶變體；b)在目的性質(zhì)測(cè)試中測(cè)試所述SEL的所述蛋白酶變體和標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶；c)為所述測(cè)試確定所述蛋白酶變體的每一種的性能指數(shù)(PI)；d)鑒定兩個(gè)或更多所述氨基酸位置為非限制性位置，其中兩個(gè)所述SEL的每一個(gè)中所 述多個(gè)蛋白酶變體的至少一個(gè)具有大于0. 5的PI ；和f)提供多突變文庫(kù)，其包含多個(gè)多取代的蛋白酶變體，每個(gè)變體在所述兩個(gè)或更多非 限制性位置中包含取代。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述測(cè)試包括選自污物去除測(cè)定法(微樣品)、LAS穩(wěn)定 性、EDTA穩(wěn)定性、洗滌劑穩(wěn)定性測(cè)定法和比活性測(cè)定法的兩種或多種不同的測(cè)定法。
22.權(quán)利要求20和21任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白酶是細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶。
23.產(chǎn)生芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的多取代的枯草桿菌蛋白酶變體的方法，包括a)在第一種性質(zhì)的第一種測(cè)試和第二種性質(zhì)的第二種測(cè)試中測(cè)試多個(gè)單取代的枯草 桿菌蛋白酶變體，其中在每個(gè)測(cè)試中給予親本枯草桿菌蛋白酶的性質(zhì)1.0的值，有利的第 一種或第二種性質(zhì)具有大于1.0的值，并且過(guò)度不利的第一種或第二種性質(zhì)具有小于約0.80或在一些優(yōu)選實(shí)施方案中小于約0. 60的值；b)鑒定至少一種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體中與有利的第一種性質(zhì)相關(guān)并且不與 過(guò)度不利的第二種性質(zhì)相關(guān)的取代；c)鑒定至少一種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體中與有利的第二種性質(zhì)相關(guān)并且不與 過(guò)度不利的第一種性質(zhì)相關(guān)的取代；d)將來(lái)自前面步驟的取代引入枯草桿菌蛋白酶以產(chǎn)生多取代的枯草桿菌蛋白酶變體。
24.權(quán)利要求23的方法，還包括在第一種測(cè)試和第二種測(cè)試中測(cè)試所述多取代的枯草 桿菌蛋白酶變體，其中改進(jìn)的枯草桿菌蛋白酶變體在所述第一種和第二種測(cè)試中實(shí)現(xiàn)大于1.0的值，或者在第一種測(cè)試中大于1. 0的值并且在第二種測(cè)試中0. 80到1. 0的值。
25.權(quán)利要求對(duì)的方法，還包括產(chǎn)生所述改進(jìn)的枯草桿菌蛋白酶變體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述第一種和第二種性質(zhì)負(fù)相關(guān)。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中有利的第一種或第二種性質(zhì)具有大于約1.2的值。
28.權(quán)利要求M的方法，其中過(guò)度不利的第一種或第二種性質(zhì)具有小于約0.40的值。
29.權(quán)利要求M的方法，其中所述第一種性質(zhì)是穩(wěn)定性，并且第二種性質(zhì)是洗滌性能。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述穩(wěn)定性包括在洗滌劑中的穩(wěn)定性并且所述洗滌性能 包括在洗滌劑中的血奶墨(BMI)洗滌性能。
31.權(quán)利要求M的方法，其中在具有5到12.0的pH的粉末或液體洗滌劑組合物中測(cè) 試洗滌性能。
32.權(quán)利要求M的方法，其中所述親本細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶是具有如SEQID N0:2給 出氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的野生型成熟形式。
33.權(quán)利要求M的方法，其中所述位置在親本枯草桿菌蛋白酶中具有大于約50%的溶 劑可及表面(SAS)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述親本枯草桿菌蛋白酶中所述一個(gè)或多個(gè)位置是具有 大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。
全文摘要
本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)工程化的方法。特別地，本發(fā)明提供了利用位點(diǎn)評(píng)估文庫(kù)設(shè)計(jì)優(yōu)化蛋白質(zhì)的兩種或多種性質(zhì)的文庫(kù)的方法。本發(fā)明還提供了適于多種用途的變體枯草桿菌蛋白酶。
文檔編號(hào)C12N9/54GK102046783SQ200980120416
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者D·A·伊斯泰爾, F·齊德戈伯, J·T·小凱利斯, L·G·卡斯康-佩雷拉 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司