專利名稱：利用雙相萃取發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
利用雙相萃取發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法本專利申請(qǐng)要求2008年6月4日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/058567的優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物燃料領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及一種通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其中丁醇產(chǎn)品通過(guò)在發(fā)酵期間萃取至一種不能與水混溶的有機(jī)萃取劑而除去。
背景技術(shù)：
丁醇是一種重要的工業(yè)化學(xué)品，具有多種用途，例如用作燃料添加劑，在塑料工業(yè)中用作化學(xué)原料，以及在食品和食用香料工業(yè)中用作食品級(jí)的萃取劑。每年通過(guò)石油化學(xué)方法生產(chǎn)的丁醇有100至120億磅，并且對(duì)這種化學(xué)品的需求可能還會(huì)增長(zhǎng)。有若干種化學(xué)合成方法是已知的，然而這些生產(chǎn)丁醇的方法利用來(lái)源于石油化工產(chǎn)品的原料，并且普遍成本高昂和有害生態(tài)環(huán)境。若干種通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法同樣是已知的，例如ABE方法，這種發(fā)酵方法產(chǎn)生一種丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。通過(guò)丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)進(jìn)行的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵是已知最古老的工業(yè)發(fā)酵之一；負(fù)責(zé)產(chǎn)生這些溶劑的途徑和基因也同樣如此。通過(guò)ABE方法進(jìn)行的1-丁醇生產(chǎn)受1-丁醇對(duì)丙酮丁醇梭菌的毒性效應(yīng)限制。已有報(bào)導(dǎo)稱，利用對(duì)細(xì)菌無(wú)毒的特定有機(jī)萃取劑的原位萃取發(fā)酵方法提高了用丙酮丁醇梭菌發(fā)酵進(jìn)行的1-丁醇生產(chǎn)(Roffler 等人，Biotechnol. Bioeng. 31 135-143,1988 ；RoffIer 等人，Bioprocess Engineering 2
1-12，1987；禾口 Evans 等人，Appl. Environ. Microbiol. 54 1662-1667，1988)。與上述野生型的丙酮丁醇梭菌不同，重組的表達(dá)宿主菌還被報(bào)導(dǎo)表達(dá)1- 丁醇、
2-丁醇和異丁醇的生物合成途徑。這些重組的宿主具有以比ABE方法更高的產(chǎn)量生產(chǎn)丁醇的潛能，因?yàn)樗鼈儾划a(chǎn)生諸如丙酮和乙醇這樣的副產(chǎn)品。然而，這些重組的宿主的問題在于，丁醇的生物生產(chǎn)似乎受限于丁醇對(duì)發(fā)酵中所用宿主微生物的毒性閾值。萃取發(fā)酵方法已被應(yīng)用于利用重組的微生物菌株進(jìn)行的丁醇生產(chǎn)中。本發(fā)明滿足了上述需求，并且提供了從至少一種可發(fā)酵碳源制取丁醇的方法，該方法克服了毒性的問題，從而在利用重組微生物宿主進(jìn)行的發(fā)酵中帶來(lái)丁醇生產(chǎn)的有效滴度、有效速率和有效產(chǎn)量的提升，其中在發(fā)酵過(guò)程中，丁醇被萃取至特定的有機(jī)萃取劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收丁醇的方法，所述方法包括a)提供包含丁醇、水和從至少一種可發(fā)酵的碳源生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基；b)使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與下列接觸i)至少一種選自下列的第一不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以及任選地(ii)選自下列的一種第二不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C2Jg肪醇、 C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；c)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及
d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。本發(fā)明提供了生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)提供從至少一種可發(fā)酵的碳源生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)在包含水相和不能與水混溶的有機(jī)萃取劑的雙相發(fā)酵培養(yǎng)基中使所述微生物生長(zhǎng)足以使丁醇被萃取到所述有機(jī)萃取劑中以形成含丁醇的有機(jī)相的時(shí)間，其中所述不能與水混溶的有機(jī)萃取劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，并且其中所述雙相發(fā)酵培養(yǎng)基包含按體積計(jì)約3%至約60%的不能與水混溶的有機(jī)萃取劑；c)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)提供從至少一種可發(fā)酵的碳源生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)使上述微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中上述微生物將所述丁醇產(chǎn)生到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，從而產(chǎn)生一種含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基；c)使所述含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基與下列接觸i)至少一種選自下列的第一不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以及任選地(ii)選自下列的第二不能與水混溶的有機(jī)萃取劑C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；d)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及e)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)提供從至少一種可發(fā)酵的碳源生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)在有氧條件下，使上述微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)足以達(dá)到預(yù)選的生長(zhǎng)水平的時(shí)間；c)轉(zhuǎn)至微需氧或厭氧條件以刺激向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)丁醇以形成含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基；d)使所述含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基與下列接觸i)至少一種選自下列的第一不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以及任選地(ii)選自下列的第二不能與水混溶的有機(jī)萃取劑C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；e)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及f)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含丁醇、水和從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基；b)通過(guò)一種順流的或逆流的萃取劑流，使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與下列接觸i)至少一種選自下列的第一不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以及任選地(ii)選自的一種第二不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；c)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。本發(fā)明的萃取發(fā)酵法提供丁醇，包括全部的丁醇異構(gòu)體，已知其具有與汽油相似的能含量并能夠與任何化石燃料混合。丁醇是優(yōu)選的燃料或燃料添加劑，因?yàn)樗跇?biāo)準(zhǔn)內(nèi)燃機(jī)中燃燒時(shí)僅生成CO2,并且?guī)缀醪划a(chǎn)生或根本不產(chǎn)生SOx或N0X。另外，丁醇的腐蝕性不及乙醇，因此是目前為止最優(yōu)選的燃料添加劑。除了用作一種生物燃料或燃料添加劑之外，本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的丁醇還具有沖擊燃料電池工業(yè)中的氫分配問題的潛在可能。如今，由于氫的運(yùn)輸和分配存在安全隱患，燃料電池飽受困擾?？梢匀菀椎貙?duì)丁醇重整其氫含量，并且可以通過(guò)現(xiàn)有的加油站以燃料電池或汽車所需的純度進(jìn)行分配。最后，本發(fā)明的方法從植物來(lái)源的碳源生產(chǎn)丁醇，從而避免了標(biāo)準(zhǔn)的石油化學(xué)的丁醇生產(chǎn)工藝所涉及的對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響。附圖簡(jiǎn)沭和序列說(shuō)明

圖1顯示的是如實(shí)施例6中所述的利用油醇作為有機(jī)萃取劑并通過(guò)汽提的一個(gè)發(fā)酵過(guò)程(■)，和如實(shí)施例7中所述的單獨(dú)通過(guò)汽提的一個(gè)發(fā)酵過(guò)程(·)中，發(fā)酵培養(yǎng)基 (即水相)中異丁醇的濃度。圖1所顯示的數(shù)據(jù)系利用一種重組的大腸桿菌(Escherichia coli)生產(chǎn)丁醇而產(chǎn)生。圖2顯示的是如實(shí)施例8中所述的利用油醇作為有機(jī)萃取劑并通過(guò)汽提的一個(gè)發(fā)酵過(guò)程(■)，和如實(shí)施例9中所述的單獨(dú)通過(guò)汽提的一個(gè)發(fā)酵過(guò)程(·)中，發(fā)酵培養(yǎng)基 (即水相)中異丁醇的濃度。圖2所顯示的數(shù)據(jù)系利用一種重組的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生產(chǎn)丁醇而產(chǎn)生。圖3是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中在使發(fā)酵培養(yǎng)基與萃取劑在一個(gè)發(fā)酵容器中接觸之前，所述第一不能與水混溶的萃取劑和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑在一個(gè)容器中被合并。圖4是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中所述第一不能與水混溶的萃取劑和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑被分別加入到一個(gè)發(fā)酵容器中，發(fā)酵培養(yǎng)基在該容器中與萃取劑接觸。圖5是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中所述第一不能與水混溶的萃取劑和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑被分別加入到不同的發(fā)酵容器中，以使發(fā)酵培養(yǎng)基與萃取劑接觸。圖6是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游進(jìn)行，并且在使發(fā)酵培養(yǎng)基與萃取劑在一個(gè)容器中接觸之前，所述第一不能與水混溶的萃取劑和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑在一個(gè)不同的容器中被合并。圖7是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游進(jìn)行，并且所述第一不能與水混溶的萃取劑和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑被分別加入到一個(gè)發(fā)酵容器，發(fā)酵培養(yǎng)基在該容器中與萃取劑接觸。
圖8是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游進(jìn)行，并且所述第一不能與水混溶的萃取劑和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑被分別加入到不同的發(fā)酵容器中，以使發(fā)酵培養(yǎng)基與萃取劑接觸。圖9是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在至少一個(gè)分批發(fā)酵罐中進(jìn)行，通過(guò)與發(fā)酵醪液底部或接近底部處的(使發(fā)酵罐充滿萃取劑)一種萃取劑共流，其中所述萃取劑在該發(fā)酵罐的頂部或接近頂部處的一點(diǎn)流出該發(fā)酵罐。下列序列符合37 C. F. R. 1. 821 1. 825 ( “對(duì)含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請(qǐng)的要求-序列規(guī)則”)，并且與世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST. 25(1998)和 EPO和PCT的序列列表要求(規(guī)則5. 2和49. 5 (a bis)，以及行政指導(dǎo)的208節(jié)和附錄C) 相一致。^ 1基因和蛋白質(zhì)SEO ID號(hào)匯總
描述SEQ ID NO:SEQ ID NO:核酸肽肺炎克雷伯氏菌budB (乙酰乳酸合酶)12大腸桿菌UvC (乙酰羥酸還原異構(gòu)酶)34大腸桿菌UvD (乙酰羥酸脫水酶)56乳酸乳球菌IdvD (支鏈α-酮酸脫羧酶)，78密碼子優(yōu)化的木糖氧化無(wú)色桿菌910丁醇脫氫酶(sadB)基因枯草芽孢桿菌alsS3233(乙酰乳酸合酶)Pf5.IlvC-Z4B8 (KARI)3637S.啤酒酵母/LK54041(乙酰羥酸還原異構(gòu)酶KARI)B.枯草芽孢桿菌酮異戊酸脫羧酶4344(KivD)密碼子優(yōu)化的馬肝臟醇脫氫酶(HADH)密碼子優(yōu)化的4546變形鏈球菌HvD乙酰羥酸脫水酶5859SEQ ID NOs :11至22系用于構(gòu)建下文的實(shí)施例的一般方法部分所描述的重組大腸桿菌菌株的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 23系來(lái)自大腸桿菌菌株K-12MG1655的pflB基因的核苷酸序列。SEQ ID NO 24系來(lái)自大腸桿菌菌株K-12MG1655的IdhA基因的核苷酸序列。
SEQIDNO25系來(lái)自大腸桿菌菌株K-12MG1655的adhE基因的核苷酉I序列。
SEQIDNO26系來(lái)自大腸桿菌菌株K-12MG1655的frdA基因的核苷酉I序列。
SEQIDNO27系來(lái)自大腸桿菌菌株K-12MG1655的frdB基因的核苷酉I序列。
SEQIDNO28系來(lái)自大腸桿菌菌株K-12MG1655的frdC基因的核苷酉I序列。
SEQIDNO29系來(lái)自大腸桿菌菌株K-12MG1655的frdD基因的核苷酉I序列。
SEQIDNO30系pLH475-Z4B8的核苷酸序列。
SEQIDNO31系CUPl啟動(dòng)子的核苷酸序列。
SEQIDNO34系CYCl終止子的核苷酸序列。
SEQIDNO35系ILV5啟動(dòng)子的核苷酸序列。
SEQIDNO38系ILV5終止子的核苷酸序列。
SEQIDNO39系FBAl啟動(dòng)子的核苷酸序列。
SEQIDNO42系PLH468的核苷酸序列。
SEQIDNO47系PNY8的核苷酸序列。
SEQIDNO48系GPDl啟動(dòng)子的核苷酸序列。
SEQIDNOs :49、50、54、55、62 至 71,73 至 83 和85至86系實(shí)施例中所用的'的核苷酉髮序歹Lο
SEQIDNO ;51 系 pRS425: :GPM_sadB 的核苷酸序列。
SEQIDNO ；52系GPMl啟動(dòng)子的核苷酸序列。
SEQIDNO53系A(chǔ)DHl終止子的核苷酸序列。
SEQIDNO:56系pRS423 FBA ilvD(鏈球菌的)的核苷酸序列
SEQIDNO57系FBA終止子的核苷酸序列
SEQIDNO60系GPM-SadB-ADHt片段的核苷酸序列。
SEQIDNO61系pUC19-URA3r的核苷酸序列。
SEQIDNO72系ilvD-FBAlt片段的核苷酸序列O
SEQIDNO84系URA3r2模板DNA的核苷酸序列發(fā)明詳述除非另外指明，如以上及本發(fā)明的整個(gè)說(shuō)明書中所用，以下術(shù)語(yǔ)將定義如下本文所用術(shù)語(yǔ)“丁醇”是指1- 丁醇、2_ 丁醇、異丁醇或它們的混合物。本文所用術(shù)語(yǔ)“有氧條件”是指有氧氣存在下的生長(zhǎng)條件。本文所用術(shù)語(yǔ)“微需氧條件”是指有低水平的氧氣(即低于正常的大氣氧氣水平) 存在的生長(zhǎng)條件。本文所用術(shù)語(yǔ)“厭氧條件”是指不存在氧氣的生長(zhǎng)條件。本文所用術(shù)語(yǔ)“可發(fā)酵的碳源”是指能被本文所公開的微生物代謝的碳源。適當(dāng)?shù)目砂l(fā)酵的碳源包括但不限于單糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖， 如淀粉或纖維素；一碳底物；以及它們的混合物。本文所用術(shù)語(yǔ)“萃取劑”是指用于萃取任何丁醇異構(gòu)體的有機(jī)溶劑。本文所用術(shù)語(yǔ)“雙相發(fā)酵培養(yǎng)基”是指包含一種發(fā)酵培養(yǎng)基(即水相)和一種適當(dāng)量的不能與水混溶的有機(jī)萃取劑的一種雙相生長(zhǎng)培養(yǎng)基。本文所用術(shù)語(yǔ)“丁醇生物合成途徑”是指產(chǎn)生1-丁醇、2-丁醇或異丁醇的一種酶途徑。本文所用術(shù)語(yǔ)“1- 丁醇生物合成途徑”是指從乙酰_輔酶A(aCetyl-CoA)產(chǎn)生 1-丁醇的一種酶途徑。本文所用術(shù)語(yǔ)“2-丁醇生物合成途徑”是指從丙酮酸產(chǎn)生2-丁醇的一種酶途徑。本文所用術(shù)語(yǔ)“異丁醇生物合成途徑”是指從丙酮酸產(chǎn)生異丁醇的一種酶途徑。本文所用術(shù)語(yǔ)“脂肪酸”是指具有一條長(zhǎng)脂肪鏈(即C11-C22)的羧酸，其中的脂肪鏈為飽和的或不飽和的。本文所用術(shù)語(yǔ)“脂肪醇”是指具有一條長(zhǎng)脂肪鏈(即C11-C22)的醇，其中的脂肪鏈為飽和的或不飽和的。本文所用術(shù)語(yǔ)“脂肪醛”是指具有一條長(zhǎng)脂肪鏈(即C11-C22)的醛，其中的脂肪鏈為飽和的或不飽和的。本文所用術(shù)語(yǔ)“有效滴度”是指每升發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的丁醇的總量。丁醇的總量包括發(fā)酵培養(yǎng)基中丁醇的量和從有機(jī)萃取劑中，以及當(dāng)采用了汽提時(shí)從氣相中所回收的丁醇的量。本文所用術(shù)語(yǔ)“基本培養(yǎng)基”是指包含能容許生長(zhǎng)的最低限度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其通常不含氨基酸。一種基本培養(yǎng)基典型地包含一種可發(fā)酵的碳源和多種可隨微生物和生長(zhǎng)條件的不同而不同的鹽類。這些鹽通常提供了必需元素如鎂、氮、磷和硫，從而允許微生物合成蛋白質(zhì)和核酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“確定成分培養(yǎng)基”是指所有成分的量均已知的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。例如， 微生物所需的碳源、氮源以及痕量元素和維生素均為確定的。本文所用術(shù)語(yǔ)“ OD，，是指光密度。本文所用術(shù)語(yǔ)“0D_”是指波長(zhǎng)為600nm時(shí)的光密度。本文所用術(shù)語(yǔ)“ i d，，是指內(nèi)直徑。本文所用術(shù)語(yǔ)“Aq”是指水相。本文所用術(shù)語(yǔ)“Org”是指有機(jī)相。本文所用術(shù)語(yǔ)“IPTG”是指異丙基β -D-硫代半乳糖苷。本文所用術(shù)語(yǔ)“vvm”是指每分鐘的體積對(duì)體積之比。本文所用術(shù)語(yǔ)“ATCC”是指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，馬納薩斯，弗吉尼亞州。術(shù)語(yǔ)“vol”是指體積。術(shù)語(yǔ)“rpm”是指每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)。術(shù)語(yǔ)“sec”是指秒。術(shù)語(yǔ)“min”是指分鐘。術(shù)語(yǔ)“h”是指小時(shí)。術(shù)語(yǔ)“μ L”是指微升。術(shù)語(yǔ)“mL”是指毫升。術(shù)語(yǔ)“L”是指升。術(shù)語(yǔ)“mL/min”是指毫升每分鐘。術(shù)語(yǔ)“mmol”是指毫摩爾。術(shù)語(yǔ)“rnM”是指毫摩爾濃度。
術(shù)語(yǔ)‘‘M”是指摩爾濃度。
術(shù)語(yǔ)‘‘ μ m”是指微米。
術(shù)語(yǔ)‘‘g”是指克。
術(shù)語(yǔ)‘‘ μ g”是指微克。
術(shù)語(yǔ)‘‘g/g”是指克每克。
術(shù)語(yǔ)‘‘g/L”是指克每升。
術(shù)語(yǔ)‘‘yg/mL”是指微克每升。
術(shù)語(yǔ)‘‘mg/L”是指毫克每升。
術(shù)語(yǔ)‘‘mmol/min/mg”是指毫摩爾每分鐘每毫克。
術(shù)語(yǔ)‘‘g/L/h”是指克每升每小時(shí)。
術(shù)語(yǔ)‘‘HPLC”是指高壓液相色譜法。
術(shù)語(yǔ)‘‘GC”是指氣相色譜法。
經(jīng)基因修飾的微牛物
用于生產(chǎn)丁醇的微生物宿主可以選自細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌和酉孝母。所使用的微
生物宿主應(yīng)能耐受所產(chǎn)生的丁醇產(chǎn)物，以使產(chǎn)量不受產(chǎn)物對(duì)宿主的毒性限制。用于丁醇生產(chǎn)的一種微生物宿主的選擇詳述如下。在高滴度水平的丁醇存在下具有代謝活性的微生物并不為本領(lǐng)域所熟知。盡管已從產(chǎn)溶劑梭菌(solventogenic Clostridia)中分離了丁醇耐受性突變體，但有關(guān)其他潛在可用的細(xì)菌菌株的丁醇耐受性方面的信息幾乎沒有。關(guān)于細(xì)菌中醇耐受性的比較的大部分研究表明，丁醇的毒性大于乙醇(de Cavalho等人，Microsc. Res. Tech. 64: 215-22(2004)和 Kabelitz 等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. 220 :223_227 (2003))。Tomas 等人(J. Bacteriol. 186 =2006-2018(2004))報(bào)導(dǎo)稱丙酮丁醇梭菌在發(fā)酵過(guò)程中的1_ 丁醇產(chǎn)量可能受丁醇毒性限制。1-丁醇對(duì)丙酮丁醇梭菌的主要影響是破壞膜功能(Hermann等人， Appl. Environ. Microbiol. 50 :1238_1243(1985))。被選用于丁醇生產(chǎn)的微生物宿主應(yīng)能耐受丁醇，并應(yīng)能利用引入的生物合成途徑將碳水化合物轉(zhuǎn)化為丁醇，如下所述。選擇合適微生物宿主的標(biāo)準(zhǔn)包括如下對(duì)丁醇的內(nèi)在耐受，高效率的碳水化合物利用，用于基因操作的基因工具的可用性，以及產(chǎn)生穩(wěn)定的染色體變化的能力。對(duì)丁醇具有耐受性的適當(dāng)?shù)乃拗骶?，可以通過(guò)基于該菌株的內(nèi)在耐受性的篩選而得到鑒定。微生物對(duì)丁醇的內(nèi)在耐受性，可以通過(guò)測(cè)定當(dāng)其于一種基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)， 導(dǎo)致生長(zhǎng)速率被抑制50%的丁醇濃度(IC50)而得到測(cè)量。IC50值可以利用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定。例如，可以在不同量的丁醇的存在下培養(yǎng)所感興趣的微生物，并通過(guò)測(cè)量600 納米下的光密度監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)速率。倍增時(shí)間可以從生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)部分計(jì)算并用作生長(zhǎng)率的量度。導(dǎo)致生長(zhǎng)受到50%抑制的丁醇濃度，可以通過(guò)生長(zhǎng)受抑制的百分比對(duì)丁醇濃度的作圖而得到測(cè)定。優(yōu)選地，宿主菌株應(yīng)具有大于約0.5%的丁醇的IC50。更適合的宿主菌株具有大于約1. 5%的丁醇的IC50。尤其適合的宿主菌株具有大于約2. 5%的丁醇的IC50。用于丁醇生產(chǎn)的微生物宿主還應(yīng)以高效率利用葡萄糖和/或其他碳水化合物。大多數(shù)微生物都能夠利用碳水化合物。但是，某些環(huán)境微生物不能有效地利用碳水化合物，因此不是適當(dāng)?shù)乃拗鳌?br> 在基因方面修飾宿主的能力對(duì)任何重組微生物的產(chǎn)生來(lái)說(shuō)十分關(guān)鍵?？墒褂玫霓D(zhuǎn)基因技術(shù)的模式包括電穿孔、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)或自然轉(zhuǎn)化?？衫枚喾N宿主接合性質(zhì)粒和藥物抗性標(biāo)記。用于一種微生物的克隆載體系基于能在該宿主微生物中起作用的抗生素抗性標(biāo)記的性質(zhì)而針對(duì)該宿主特別設(shè)計(jì)的。微生物宿主還可以是經(jīng)過(guò)操作，以通過(guò)使多個(gè)基因失活而使碳流的競(jìng)爭(zhēng)性途徑失活的。這需要有轉(zhuǎn)座子或染色體整合載體來(lái)指導(dǎo)失活作用。此外，能經(jīng)受化學(xué)誘變的生產(chǎn)宿主還可通過(guò)進(jìn)行化學(xué)誘變和突變體篩選獲得對(duì)丁醇的內(nèi)在耐受性方面的改進(jìn)。基于上述標(biāo)準(zhǔn)，用于生產(chǎn)丁醇的適當(dāng)?shù)奈⑸锼拗靼ǖ幌抻诎l(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、±矣希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、產(chǎn)喊菌屬 (Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬 (Arthrobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、畢赤酵母屬 (Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)和糖酵母屬(Saccharomyces) 的成員。優(yōu)選的宿主包括大腸桿菌(Escherichia coli)、真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)、惡臭假單胞菌(Rhodococcus erythropolis)、紅串紅球菌(Pseudomonas putida) lif (Lactobacillus ρIantarum)、Μ 求lif (Enterococcus faecium)、_ 雞腸球菌(Enterococcus gallinarium)、獎(jiǎng)腸球菌(Enterococcus faecalis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、枯草芽抱桿菌 (Bacillus subtilis)禾口啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。上述微生物可以是用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行過(guò)基因修飾，以將可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇的，其中所述丁醇具體而言包括1-丁醇、2-丁醇或異丁醇。特別適合的微生物包括埃希氏菌屬、乳桿菌屬和糖酵母屬，其中大腸桿菌植物乳桿菌和啤酒糖酵母為尤其優(yōu)選的。 此外，所述微生物還可以是以上所列微生物之一的一種用Bramucci等人所述的方法(共同待決和共同持有的美國(guó)專利申請(qǐng)11/761497 ；和WO 2007/146377)分離的丁醇耐受的菌株。 一種這樣的菌株的例子是植物乳桿菌菌株P(guān)N0512 (ATCC :PTA_7727，于2006年7月12日因美國(guó)專利申請(qǐng)11/761497進(jìn)行生物保藏)。這些微生物可經(jīng)基因修飾以包含一種1-丁醇生物合成途徑從而產(chǎn)生1-丁醇，如 Donaldson等人在WO 2007/041269中所述，該專利以引用方式并入本文。例如，所述微生物可經(jīng)基因修飾以表達(dá)一種1- 丁醇生物合成途徑，所述途徑包括下列底物向產(chǎn)物的、酶催化的轉(zhuǎn)化a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA ；b)乙酰乙酰-CoA至3-羥丁酸-CoA ；c) 3-羥丁酸-CoA 至丁烯酰-CoA ；d) 丁烯酰-CoA 至丁酰 I-CoA ；e) 丁酰-CoA至丁醛；以及f) 丁醛至 1-丁醇。所述微生物還可經(jīng)基因修飾以表達(dá)一種2- 丁醇生物合成途徑從而產(chǎn)生2- 丁醇，如 Donaldson 等人在美國(guó)專利申請(qǐng)公布 2007/0259410 和 2007/0292927，WO 2007/130518 和TO 2007/130521中所述，這些專利均以引用方式并入本文。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物可經(jīng)基因修飾以表達(dá)一種2-丁醇生物合成途徑，所述途徑包括下列產(chǎn)物向底物的、酶催化的轉(zhuǎn)化a)丙酮酸至α -乙酰乳酸；b) α-乙酰乳酸至乙偶姻；C)乙偶姻至2，3-丁二醇；d) 2，3-丁二醇至 2-丁酮；以及e) 2-丁酮至 2-丁醇。所述微生物還可經(jīng)基因修飾以表達(dá)一種異丁醇生物合成途徑從而產(chǎn)生異丁醇，如 Donaldson等人在美國(guó)專利申請(qǐng)公布2007/0092957和WO 2007/050671中所述，此二專利以引用方式并入本文。例如，所述微生物可經(jīng)基因修飾以包含一種異丁醇生物合成途徑，所述途徑包括下列產(chǎn)物向底物的、酶催化的轉(zhuǎn)化a)丙酮酸至乙酰乳酸；b)乙酰乳酸至2，3-二羥基異戊酸；C) 2，3-二羥基異戊酸至α-酮異戊酸；d) α-酮異戊酸至異丁醛；以及e)異丁醛至異丁醇。經(jīng)基因修飾從而能將可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇的微生物可以是一種重組的大腸桿菌菌株，該菌株包含一種如上所述的異丁醇生物合成途徑；對(duì)下列基因的刪除以去除限制異丁醇生產(chǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性途徑，列為SEQ ID N0:23的pflB(編碼丙酮酸甲酸裂解酶)，列為SEQ ID NO 24的IdhA (編碼乳酸脫氫酶)，列為SEQ ID NO 25的adhE(編碼乙醇脫氫酶)；以及至少一種包含frdAB⑶操縱子(編碼延胡索酸還原酶)的基因，具體而言，列為 SEQ ID NO 26 的 frdA,列為 SEQ ID NO 27 的 frdB,列為 SEQ ID NO 28 的 frdC 和列為 SEQ ID NO 29 的 frdDo所述大腸桿菌菌株可包含(a)由下列基因編碼的一種異丁醇生物合成途徑來(lái)自肺炎克雷伯氏菌的budB (列為SEQ ID NO :1)，其編碼乙酰乳酸合酶(列為SEQ ID NO 2), 來(lái)自大腸桿菌的ilvC(列為SEQ ID NO :3)，其編碼乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(列為SEQ ID N0 4)，來(lái)自大腸桿菌的ilvD (列為SEQ ID NO :5)，其編碼乙酰羥酸脫水酶(列為SEQ ID NO 6)，來(lái)自乳酸乳球菌的kivD (列為SEQ ID NO :7)，其編碼支鏈酮酸脫羧酶(列為SEQ ID N0 8)，以及來(lái)自木糖氧化無(wú)色桿菌的sadB(列為SEQ ID NO :9)，其編碼一種丁醇脫氫酶(列為 SEQ ID NO 10)；以及(b)對(duì)下列基因的刪除pflB(SEQ ID NO 23), IdhA(SEQ ID N0: 24),adhE(SEQ ID NO 25)，和frdB (SEQ ID NO :27)。所述異丁醇生物合成途徑的基因所編碼的酶，催化將丙酮酸轉(zhuǎn)換為異丁醇所需的底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，如上所述。具體而言，乙酰乳酸合酶催化丙酮酸向乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化，乙酰羥酸還原異構(gòu)酶催化乙酰乳酸向2，3-二羥基異戊酸的轉(zhuǎn)化，乙酰羥酸脫水酶催化2，3- 二羥基異戊酸向α -酮異戊酸的轉(zhuǎn)化，支鏈酮酸脫羧酶催化α-酮異戊酸向異丁醛的轉(zhuǎn)化，丁醇脫氫酶催化異丁醛向異丁醇的轉(zhuǎn)化。所述重組的大腸桿菌菌株可以采用本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建，如本文的實(shí)施例部分的一般方法部分所示。
所述啤酒糖酵母菌株可包含一種由下列基因編碼的異丁醇生物合成途徑來(lái)自枯草芽孢桿菌的alsS編碼區(qū)(SEQ ID NO 32)，其編碼乙酰乳酸合酶(SEQ ID NO 33)，來(lái)自啤酒糖酵母的ILV5(SEQ ID NO :40)，其編碼乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(KARI ；SEQ ID NO 41)和 / 或一種突變的 KARI 如 Pf5. IlvC-Z4B8(SEQ ID NO :36 ；蛋白質(zhì) SEQ ID NO :37)所編碼的， 來(lái)自變形鏈球菌的iIvD(SEQ ID NO :58)，其編碼乙酰羥酸脫水酶(SEQ ID N0:59)，來(lái)自枯草芽孢桿菌的kivD(SEQ ID NO :43)，其編碼支鏈酮酸脫羧酶(SEQ ID NO 44)，以及來(lái)自木糖氧化無(wú)色桿菌的sadB(SEQ ID NO :9)，其編碼一種丁醇脫氫酶(SEQ ID NO: 10)。所述異丁醇生物合成途徑的基因所編碼的酶，催化將丙酮酸轉(zhuǎn)換為異丁醇所需的底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，如本文所述。一種表達(dá)一種異丁醇途徑的優(yōu)選的酵母菌株在其胞質(zhì)中具有乙酰乳酸合酶(ALS) 活性，并包含對(duì)內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶(PDC)基因的刪除，如共同持有的和共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)#61/058970中所述，該專利以引用方式并入本文。胞質(zhì)的ALS和降低的PDC表達(dá)的組合，被發(fā)現(xiàn)大大提高了從丙酮酸至乙酰乳酸的流量，乙酰乳酸進(jìn)而流向產(chǎn)生丁醇的途徑。這種重組的啤酒糖酵母菌株可采用本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建，如下文的實(shí)施例部分的一般方法部分所示。有機(jī)萃取劑本文所述的方法中有用的萃取劑為不能與水混溶的有機(jī)溶劑。適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)萃取劑應(yīng)符合一種用于商業(yè)化地生產(chǎn)或回收丁醇的雙相萃取發(fā)酵的理想溶劑的標(biāo)準(zhǔn)。具體而言， 所述萃取劑應(yīng)(i)對(duì)生產(chǎn)丁醇的微生物，例如經(jīng)基因修飾的大腸桿菌、植物乳桿菌和啤酒糖酵母無(wú)毒，(ii)充分地與發(fā)酵培養(yǎng)基不能混溶，(iii)對(duì)于丁醇的萃取具有高的分配系數(shù)，(ν)具有低的與發(fā)酵培養(yǎng)基形成乳劑的趨勢(shì)，(vi)為低成本和無(wú)毒害的。用于本文所公開的方法的適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)萃取劑選自=C12-Q2脂肪醇、C12-Q脂肪酸、C12-Q脂肪酸的酯、 C12-Q脂肪醛、以及它們的混合物。如文本所用，術(shù)語(yǔ)“它們的混合物”既包括這些組的成員內(nèi)部的混合物，也包括這些組的成員之間的混合物，例如C12-C22脂肪醇內(nèi)部的混合物，以及C12-C22脂肪醇和C12-C22脂肪酸之間混合物。在某些情況下，小于12-碳鏈長(zhǎng)度的萃取劑可對(duì)所述微生物有害，并因而對(duì)通過(guò)生物合成途徑生產(chǎn)丁醇的過(guò)程有害。就一種11-碳萃取劑而言，其對(duì)微生物的影響可依賴于條件，但亦可為有害的。當(dāng)一種C11脂肪醇、一種C11脂肪酸、一種C12脂肪酸的酯、一種C11醛，以及它們的混合物可對(duì)所述過(guò)程有害時(shí)，例如當(dāng)一種微生物在所采用的條件下受到上述C11混合物的不利影響時(shí)，應(yīng)避免使用這樣的萃取劑。適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)萃取劑進(jìn)一步選自油醇(CAS No. 143-28-2)，二十二醇(CAS No. 661-19-8)，鯨蠟醇(CAS No. 36653-82-4)，月桂醇，亦稱 1-十二烷醇(CAS No. 112-53-8)，肉豆蔻醇(112-72-1)，硬脂醇(CAS No. 112-92-5)，^一醇(CAS No. 112-42-5)，油酸(CAS No. 112-80-1)，月桂酸 (CAS No. 143-07-7)，肉豆蔻酸(CAS No. 544-63-8)，硬脂酸(CAS No. 57-11-4)，肉豆蔻酸甲酯(CAS No. 124-10-7)，油酸甲酯(CAS No. 112-62-9) H^一醛(CAS No. 112-44-7)，月桂醛 (CAS No. 112-54-9),2-甲基4^一醛(CAS No. 110-41-8)，以及它們的混合物。這些有機(jī)萃取劑有多種商品化來(lái)源，例如Sigma-Aldrichd Louis，M0)，其商品有多種等級(jí)，其中許多可適用于生產(chǎn)或回收丁醇的萃取發(fā)酵。工業(yè)級(jí)商品包含化合物的混合物，包括所期望的組分以及高級(jí)和低級(jí)脂肪組分。例如，一種可商購(gòu)獲得的工業(yè)級(jí)油醇包含約65%的油醇和一種高級(jí)和低級(jí)脂肪醇的混合物。具有本領(lǐng)域的適當(dāng)技能的人能夠理解，使用一種所述有機(jī)萃取劑的混合物可能是有利的。例如，可使用溶劑混合物來(lái)提高產(chǎn)物的分配系數(shù)。此外，可使用溶劑混合物來(lái)調(diào)整或優(yōu)化所述溶劑的物理特性，如密度、沸點(diǎn)和粘度。利用雙相萃取發(fā)酵牛產(chǎn)丁醇的方法可于一個(gè)適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵罐內(nèi)在一種適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物以生產(chǎn)丁醇。可使用任何適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵罐，包括攪拌槽發(fā)酵罐，氣升式發(fā)酵罐，氣泡發(fā)酵罐，或它們的任何組合。用于微生物培養(yǎng)物的維持和生長(zhǎng)的材料和方法，為微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(例如參見 Bailey 等人 Biochemical Engineering Fundamentals，第二版，McGraw Hill, New York，1986)。基于所述的微生物、發(fā)酵和方法的具體要求，必須考慮適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵培養(yǎng)基、PH、溫度以及對(duì)有氧、微需氧和厭氧條件的需求。對(duì)所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基要求并不嚴(yán)格，但其必須支持所使用的微生物的生長(zhǎng)并活化生產(chǎn)所期望的丁醇產(chǎn)品所必需的生物合成途徑。可使用一種常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括但不限于，包含有機(jī)氮源如酵母提取物或蛋白胨和至少一種可發(fā)酵的碳源的復(fù)合培養(yǎng)基；基本培養(yǎng)基；以及組合培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)目砂l(fā)酵的碳源包括但不限于，單糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖和蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉或纖維素；一碳底物；以及它們的混合物。除上述適當(dāng)?shù)奶荚粗猓霭l(fā)酵培養(yǎng)基還可包含一種適當(dāng)?shù)牡慈缫环N銨鹽，酵母提取物或蛋白胨，礦物質(zhì)，鹽類，輔因子，緩沖液以及其他組分，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知(Bailey等人，見上文)。所述萃取發(fā)酵的適當(dāng)條件依賴于所使用的具體微生物，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方便地予以確定。利用雙相萃取發(fā)酵回收丁醇的方法可自一種發(fā)酵培養(yǎng)基回收丁醇，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含丁醇，水，至少一種可發(fā)酵的碳源，以及一種經(jīng)基因修飾以通過(guò)一種生物合成途徑從至少一種碳源生產(chǎn)丁醇的(即遺傳工程的)微生物。此類經(jīng)基因修飾的微生物可選自大腸桿菌，植物乳桿菌和啤酒糖酵母。 所述方法的第一步為使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與一種不能與水混溶的有機(jī)萃取劑接觸，如上所述，以形成一種包含一種水相和一種含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物。“接觸”是指所述發(fā)酵培養(yǎng)基與所述有機(jī)萃取劑在所述發(fā)酵過(guò)程的任何時(shí)間發(fā)生物理接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含乙醇，并且所述含丁醇的有機(jī)相可包含乙醇。所述有機(jī)萃取劑可以在發(fā)酵開始的時(shí)候與所述發(fā)酵培養(yǎng)基接觸，從而形成一種雙相的發(fā)酵培養(yǎng)基。作為另外一種選擇，所述有機(jī)萃取劑可以在當(dāng)所述微生物達(dá)到一個(gè)期望的生長(zhǎng)量之后與所述發(fā)酵培養(yǎng)基接觸，其中所述生長(zhǎng)量的達(dá)到可以通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)物的光密度而確定。進(jìn)一步地，所述有機(jī)萃取劑可以在當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的丁醇水平達(dá)到一個(gè)預(yù)先確定的水平時(shí)與所述發(fā)酵培養(yǎng)基接觸，例如在丁醇濃度達(dá)到有毒水平之前。所述丁醇濃度可以利用本領(lǐng)域已知的方法，例如氣相色譜法或高效液相色譜法，在發(fā)酵期間加以監(jiān)測(cè)。發(fā)酵可以在有氧條件下進(jìn)行一段足以使培養(yǎng)物達(dá)到一個(gè)預(yù)先選定的生長(zhǎng)水平的時(shí)間，如通過(guò)測(cè)量光密度確定生長(zhǎng)水平。然后可加入一種誘導(dǎo)劑以在所述經(jīng)修飾的微生物中誘導(dǎo)所述丁醇生物合成途徑的表達(dá)，并將發(fā)酵條件轉(zhuǎn)至微需氧或厭氧條件，以刺激丁醇的生產(chǎn)，如下文的實(shí)施例6中所詳述。所述萃取劑于轉(zhuǎn)至微需氧或厭氧條件之后加入。在所述發(fā)酵培養(yǎng)基與所述有機(jī)萃取劑接觸之后，丁醇產(chǎn)物分配至所述有機(jī)萃取劑，降低了包含所述微生物的水相中的濃度，從而限制了生產(chǎn)丁醇的微生物在抑制性的丁醇產(chǎn)品中的暴露。所使用的有機(jī)萃取劑的體積依賴于多種因素，包括所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積，所述發(fā)酵罐的尺寸，丁醇產(chǎn)物在所述萃取劑中的分配系數(shù)，以及發(fā)酵模式的選擇，如下所述。所述有機(jī)萃取劑的體積為發(fā)酵罐工作容積的約3%至約60%。下一步為利用本領(lǐng)域已知的方法，包括但不限于虹吸、潷析、離心、利用重力分離器以及膜輔助的相分裂等等，將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離。丁醇從所述含丁醇的有機(jī)相中的回收可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，這些方法包括但不限于蒸餾、樹脂吸附、 通過(guò)分子篩分離以及全蒸發(fā)等等。具體而言，可以采用蒸餾從所述含丁醇的有機(jī)相中回收丁醇?？膳c所述有機(jī)萃取劑同時(shí)地采用汽提從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中除去丁醇產(chǎn)物。汽提可以通過(guò)將一種氣體，如空氣、氮?dú)饣蚨趸?，通過(guò)所述發(fā)酵培養(yǎng)基，從而形成一種含丁醇的氣相。丁醇產(chǎn)物可以用本領(lǐng)域已知的方法，如利用一種冷卻水裝置或用一種溶劑洗滌所述氣相，從所述含丁醇的氣相中得到回收。發(fā)酵過(guò)程完成之后存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的任何丁醇均可通過(guò)用新鮮的或循環(huán)利用的有機(jī)萃取劑持續(xù)萃取而得到回收。作為另外的選擇，丁醇可以用本領(lǐng)域已知的方法，如蒸餾、共沸蒸餾、液-液萃取、吸附、汽提、膜蒸發(fā)以及全蒸發(fā)等等，從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中得到回收。所述雙相萃取發(fā)酵方法可于一個(gè)攪拌槽發(fā)酵罐中以連續(xù)模式進(jìn)行。在這種模式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基和所述含丁醇的有機(jī)萃取劑的混合物被從發(fā)酵罐中除去。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，包括但不限于虹吸、潷析、離心、利用重力分離器以及膜輔助的相分裂等等，將此兩相分離，如上所述。分離之后，所述發(fā)酵培養(yǎng)基可放回發(fā)酵罐中回收利用，或者也可用新鮮的培養(yǎng)基取而代之。然后，對(duì)所述萃取劑進(jìn)行處理以回收丁醇產(chǎn)物，如上所述。萃取劑接下來(lái)可被放回發(fā)酵罐中回收利用，用于進(jìn)一步萃取產(chǎn)物。作為另外一種選擇，可持續(xù)地將新鮮的萃取劑加入到發(fā)酵罐中，以替換被移除的萃取劑。這種連續(xù)的運(yùn)行模式具有若干優(yōu)點(diǎn)。由于產(chǎn)物被不斷地從反應(yīng)器中除去，只需較小體積的有機(jī)萃取劑就能允許較大體積的發(fā)酵培養(yǎng)基的使用。結(jié)果帶來(lái)較高的產(chǎn)品收率。所述有機(jī)萃取劑的體積可以為所述發(fā)酵罐工作容積的約3%至約50%;為所述發(fā)酵罐工作容積的3%至約20%;或?yàn)樗霭l(fā)酵罐工作容積的3%至約10%。使用盡可能最小量的萃取劑以使所述水相的體積最大化，從而使所述發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞的量最大化，是有利的。所述過(guò)程可以以一種完全連續(xù)的模式運(yùn)行，在這種模式中，萃取劑在發(fā)酵罐和一種分離設(shè)備之間連續(xù)循環(huán)利用，而發(fā)酵培養(yǎng)基被連續(xù)地從所述發(fā)酵罐中除去并由新鮮的培養(yǎng)基補(bǔ)足。在這種完全連續(xù)的模式中，丁醇產(chǎn)物不被允許達(dá)到毒性臨界濃度，并且新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被連續(xù)地提供，因此發(fā)酵可以長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行?？捎糜谶M(jìn)行這些模式的雙相萃取發(fā)酵的設(shè)備為本領(lǐng)域所熟知。例如，實(shí)例由Kollerup等人描述于美國(guó)專利4，865，973中。也可以采用分批發(fā)酵模式。為本領(lǐng)域所熟知的分批發(fā)酵系一種封閉系統(tǒng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成設(shè)定于發(fā)酵開始的時(shí)候，并且在發(fā)酵過(guò)程中不受人為的調(diào)整。在這種模式中，一定體積的有機(jī)萃取劑被加入發(fā)酵罐中，并且這些萃取劑在發(fā)酵過(guò)程中不被除去。雖然這種模式比上述連續(xù)的或者完全連續(xù)的模式更簡(jiǎn)單，但它需要更大體積的有機(jī)萃取劑，以使發(fā)酵培養(yǎng)基中抑制性的丁醇產(chǎn)物的濃度最小化。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積相對(duì)更少，所生產(chǎn)的產(chǎn)物的量也比采用上述連續(xù)模式時(shí)所獲得的更少。在這種分批模式中，有機(jī)溶劑的體積可以是發(fā)酵罐工作容積的20%至約60% ；或發(fā)酵罐工作容積的30%至約60%?；谏衔乃鲈颍诎l(fā)酵罐中使用盡可能最小體積的萃取劑是有利的。還可采用分批補(bǔ)料發(fā)酵模式。分批補(bǔ)料發(fā)酵是標(biāo)準(zhǔn)的分批系統(tǒng)的一種變型，在這種模式中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖在發(fā)酵期間被分批加入。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加入的量和速率可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。例如，可以在發(fā)酵期間監(jiān)測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基中關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度。作為另外的選擇，可以對(duì)更易測(cè)量的因素，如PH、溶解氧以及廢氣，如二氧化碳的分壓，加以監(jiān)測(cè)。從這些測(cè)量參數(shù)可以確定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加的速率。在這種模式中使用的有機(jī)溶劑的量與在分批模式中所使用的相同，如上文所述。產(chǎn)物的萃取可以在發(fā)酵罐的下游，而不是在原位進(jìn)行。在這種外部模式中，丁醇產(chǎn)物向所述有機(jī)萃取劑中的萃取，系采用已自發(fā)酵罐中移出的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行。所使用的有機(jī)溶劑的量為發(fā)酵罐工作容積的約20%至約60% ；或者為發(fā)酵罐工作容積的30%至約 60%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以連續(xù)地或者間歇地從發(fā)酵罐中移除，并且用所述有機(jī)萃取劑對(duì)丁醇產(chǎn)物進(jìn)行的萃取可以在從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除或者不去除細(xì)胞的情況下進(jìn)行。細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除，所述方法包括但不限于過(guò)濾或離心。在用上述方法將發(fā)酵培養(yǎng)基與萃取劑分離之后，所述發(fā)酵培養(yǎng)基可放入發(fā)酵罐中回收利用，或者被丟棄，或者進(jìn)行取出任何殘余的丁醇產(chǎn)物的處理。類似地，分離出的細(xì)胞也可放入發(fā)酵罐中回收利用。在進(jìn)行回收丁醇產(chǎn)物的處理之后，萃取劑可被回收利用于萃取過(guò)程中。作為另外一種選擇，也可以使用新鮮的萃取劑。在這種模式中，溶劑不存在于發(fā)酵罐中，因此所述溶劑的毒性遠(yuǎn)不是一個(gè)問題。如果在使發(fā)酵培養(yǎng)基與溶劑接觸之前即將細(xì)胞從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中分離，則進(jìn)一步減小了溶劑毒性的問題。此外，采用這種外部模式時(shí)，形成乳液的可能性更小，并且溶劑的蒸發(fā)被最小化，減輕了環(huán)境問題。提供了一種生產(chǎn)丁醇的方法，其中一種微生物被培養(yǎng)于一種雙相發(fā)酵培養(yǎng)基中， 所述微生物系經(jīng)過(guò)基因修飾，從而能將至少一種可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇。所述雙相發(fā)酵培養(yǎng)基由一種水相和一種不能與水混溶的有機(jī)萃取劑組成，如上文所述，其中，這種雙相發(fā)酵培養(yǎng)基包含以體積計(jì)從約3%至約60%的所述有機(jī)萃取劑。所述微生物可于所述雙相發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間，其足以使丁醇被萃取至所述萃取劑，從而形成一種含丁醇的有機(jī)相。當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含乙醇時(shí)，所述含丁醇的有機(jī)相可包含乙醇。然后，將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離，如上文所述。隨后，從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇，如上文所述。異丁醇可通過(guò)萃取發(fā)酵生產(chǎn)，所述萃取發(fā)酵使用一種經(jīng)修飾的大腸桿菌或啤酒糖酵母菌株，并且以油醇作為有機(jī)萃取劑。就異丁醇而言，采用本文所述的方法可提供一個(gè)高的有效滴度。Atsumi等人(Nature 451(3) =86-90,2008)報(bào)導(dǎo)了用一種經(jīng)過(guò)基因修飾從而包含一種異丁醇生物合成途徑的大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，最高22g/L的異丁醇滴度。用本文所公開的方法生產(chǎn)的丁醇具有一個(gè)大于22g每升發(fā)酵培養(yǎng)基的有效滴度。或者，用本文所公開的方法生產(chǎn)的丁醇具有一個(gè)至少25g每升發(fā)酵培養(yǎng)基的有效滴度?；蛘?，用本文所公開的方法生產(chǎn)的丁醇具有一個(gè)至少30g每升發(fā)酵培養(yǎng)基的有效滴度?；蛘?，用本文所公開的方法生產(chǎn)的丁醇具有一個(gè)至少37g每升發(fā)酵培養(yǎng)基的有效滴度。不受理論的約束，據(jù)信用本文所公開的萃取發(fā)酵方法獲得的較高的丁醇滴度，部分地是由于有毒的丁醇產(chǎn)物從發(fā)酵培養(yǎng)基中的移除，從而保持了其水平低于對(duì)所述微生物有毒的水平。油醇作為有機(jī)萃取劑的使用具有一種令人吃驚的，并且在本發(fā)明被提出時(shí)并未得到很好了解的額外的有益效果。具體而言，油醇作為萃取劑的使用與汽提相結(jié)合提供了與單獨(dú)采用汽提時(shí)相比顯著更高的滴度，盡管單獨(dú)采用汽提亦能有效地使丁醇保持在毒性水平以下。包含油醇或者基本上由油醇組成的有機(jī)萃取劑能在本文所述的過(guò)程中提供更高的滴度?，F(xiàn)在參見圖3，顯示的是采用原位萃取發(fā)酵生產(chǎn)和回收丁醇的過(guò)程的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。含至少一種可發(fā)酵的碳源的水流10被引入一個(gè)發(fā)酵罐20，該發(fā)酵罐內(nèi)裝有至少一種經(jīng)基因修飾以將所述至少一種可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能與水混溶的萃取劑的流12和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑的流14被引入一個(gè)容器16，上述萃取劑在該容器中合并形成萃取劑18。上述萃取劑18的流被引入發(fā)酵罐20，上述發(fā)酵培養(yǎng)基和萃取劑在其中發(fā)生接觸，從而形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物。同時(shí)包含上述水相和有機(jī)相的流26被引入一個(gè)容器38，在該容器中，進(jìn)行上述水相和有機(jī)相的分離，從而產(chǎn)生一種含丁醇的有機(jī)相40和一種水相42?，F(xiàn)在參見圖4，顯示的是采用原位萃取發(fā)酵生產(chǎn)和回收丁醇的過(guò)程的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。含至少一種可發(fā)酵的碳源的水流10被引入一個(gè)發(fā)酵罐20，該發(fā)酵罐內(nèi)裝有至少一種經(jīng)基因修飾以將所述至少一種可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能與水混溶的萃取劑的流12和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑的流14被分別引入上述發(fā)酵罐20，上述發(fā)酵培養(yǎng)基和萃取劑在其中發(fā)生接觸，從而形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物。同時(shí)包含上述水相和有機(jī)相的流沈被引入一個(gè)容器38，在該容器中，進(jìn)行上述水相和有機(jī)相的分離，從而產(chǎn)生一種含丁醇的有機(jī)相40和一種水相42?，F(xiàn)在參見圖5，顯示的是采用原位萃取發(fā)酵生產(chǎn)和回收丁醇的過(guò)程的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。含至少一種可發(fā)酵的碳源的水流10被引入第一發(fā)酵罐20，該發(fā)酵罐內(nèi)裝有至少一種經(jīng)基因修飾以將所述至少一種可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能與水混溶的萃取劑的流12被引入上述發(fā)酵罐20，并且包含由上述第一溶劑和發(fā)酵罐20的內(nèi)容物組成的混合物的流22被引入一個(gè)第二發(fā)酵罐24。所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑的流14被引入上述第二發(fā)酵罐M，上述發(fā)酵培養(yǎng)基和萃取劑在其中發(fā)生接觸，從而形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物。同時(shí)包含上述水相和有機(jī)相的流沈被引入一個(gè)容器38，在該容器中，進(jìn)行上述水相和有機(jī)相的分離，從而產(chǎn)生一種含丁醇的有機(jī)相40和一種水相42?，F(xiàn)在參見圖6，顯示的是生產(chǎn)和回收丁醇的過(guò)程的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游，而不是在原位進(jìn)行。含至少一種可發(fā)酵的碳源的水流110被引入一個(gè)發(fā)酵罐120，該發(fā)酵罐內(nèi)裝有至少一種經(jīng)基因修飾以將所述至少一種可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能與水混溶的萃取劑的流112和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑的流114被引入一個(gè)容器116，上述不能與水混溶的萃取劑在該容器中合并形成萃取劑118。發(fā)酵罐120中的發(fā)酵培養(yǎng)基的至少一部分，顯示為流122，被引入容器124。所述萃取劑118的流也被引入容器124，上述發(fā)酵培養(yǎng)基和萃取劑在其中發(fā)生接觸，從而形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物。同時(shí)包含上述水相和有機(jī)相的流126被引入一個(gè)容器138，在該容器中，進(jìn)行上述水相和有機(jī)相的分離，從而產(chǎn)生一種含丁醇的有機(jī)相140和一種水相142?，F(xiàn)在參見圖7，顯示的是生產(chǎn)和回收丁醇的過(guò)程的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游，而不是在原位進(jìn)行。含至少一種可發(fā)酵的碳源的水流110被引入一個(gè)發(fā)酵罐120，該發(fā)酵罐內(nèi)裝有至少一種經(jīng)基因修飾以將所述至少一種可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能與水混溶的萃取劑的流112和所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑的流114被分別引入一個(gè)容器124，上述不能與水混溶的萃取劑在該容器中合并形成萃取劑118。發(fā)酵罐120中的發(fā)酵培養(yǎng)基的至少一部分，顯示為流 122，也被引入容器124，上述發(fā)酵培養(yǎng)基和萃取劑在其中發(fā)生接觸，從而形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物。同時(shí)包含上述水相和有機(jī)相的流1 被引入一個(gè)容器138，在該容器中，進(jìn)行上述水相和有機(jī)相的分離，從而產(chǎn)生一種含丁醇的有機(jī)相140和一種水相 142?，F(xiàn)在參見圖8，顯示的是生產(chǎn)和回收丁醇的過(guò)程的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游，而不是在原位進(jìn)行。含至少一種可發(fā)酵的碳源的水流110被引入一個(gè)發(fā)酵罐120，該發(fā)酵罐內(nèi)裝有至少一種經(jīng)基因修飾以將所述至少一種可發(fā)酵的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇的微生物(未示出)。所述第一不能與水混溶的萃取劑的流112被引入一個(gè)容器128，并且發(fā)酵罐120中的發(fā)酵培養(yǎng)基的至少一部分，顯示為流122，也被引入容器128。 包含由上述第一不能與水混溶的萃取劑和發(fā)酵罐120的內(nèi)容物組成的混合物的流130被引入一個(gè)第二發(fā)酵罐132。所述任選的第二不能與水混溶的萃取劑的流114被引入上述第二發(fā)酵罐132，上述發(fā)酵培養(yǎng)基和萃取劑在其中發(fā)生接觸，從而形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物。同時(shí)包含上述水相和有機(jī)相的流134被引入一個(gè)容器138，在該容器中， 進(jìn)行上述水相和有機(jī)相的分離，從而產(chǎn)生一種含丁醇的有機(jī)相140和一種水相142。本文所述的萃取過(guò)程可以作為分批過(guò)程運(yùn)行，或者可以以一種連續(xù)模式運(yùn)行，其中新鮮的萃取劑被加入而使用過(guò)的萃取劑被泵出，使得發(fā)酵罐中的萃取劑的量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中保持不變。如此對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)物和副產(chǎn)物的連續(xù)萃取能提高有效速率、滴度和產(chǎn)量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還可以在一種柔性順流中，或者作為另外一種選擇，以逆流方式進(jìn)行液-液萃取，其中當(dāng)使用一系列分批發(fā)酵罐時(shí)，所述逆流方式是導(dǎo)致分批操作模式的差異的原因。在這種方案中，只要設(shè)備在運(yùn)行，提供了至少一種可發(fā)酵的碳源和微生物的發(fā)酵醪液就會(huì)以連續(xù)方式一個(gè)接一個(gè)地充滿發(fā)酵罐。參見圖9，一旦發(fā)酵罐FlOO被醪液和微生物填滿，所述醪液和微生物就進(jìn)一步填入發(fā)酵罐F101，繼而填入發(fā)酵罐F102，然后回到發(fā)酵罐FlOO形成一個(gè)連續(xù)循環(huán)。在任何一個(gè)發(fā)酵罐中，一旦醪液和微生物同時(shí)存在， 發(fā)酵即開始，并持續(xù)至發(fā)酵完全。醪液和微生物的充填時(shí)間等于發(fā)酵罐的數(shù)量除以總的循環(huán)時(shí)間(填充，發(fā)酵，排空和清洗)。若總的循環(huán)時(shí)間為60小時(shí)且有3個(gè)發(fā)酵罐，則充填時(shí)間為20小時(shí)。若總的循環(huán)時(shí)間為60小時(shí)且有4個(gè)發(fā)酵罐，則充填時(shí)間為15小時(shí)。適合的順流萃取所根據(jù)的發(fā)酵模式假定，以較高的肉湯相滴度運(yùn)行的發(fā)酵罐能夠利用丁醇濃度最高的萃取溶劑，而以最低的肉湯相滴度運(yùn)行的發(fā)酵罐能受益于丁醇濃度最低的萃取溶劑流。例如，再次參見圖9，考慮此種情況，即發(fā)酵罐FlOO位于一次發(fā)酵的啟始并以相對(duì)低的丁醇肉湯相(B)滴度運(yùn)行，發(fā)酵罐FlOl位于發(fā)酵的中部并以相對(duì)中等的丁醇肉湯相滴度運(yùn)行，并且發(fā)酵罐F102靠近發(fā)酵的末端并以相對(duì)高的丁醇肉湯相滴度運(yùn)行。 這種情況下，不含或僅含極少的萃取的丁醇的貧萃取溶劑(S)，可被供給發(fā)酵罐F100，來(lái)自發(fā)酵罐FlOO的含有萃取的丁醇組分的“流出溶劑”(S’ )可作為“流入溶劑”被供給發(fā)酵罐 F101，而來(lái)自FlOl的流出溶劑可繼而作為流入溶劑供給發(fā)酵罐F102。然后，來(lái)自F102的流出溶劑可接受處理以回收該溶劑流中存在的丁醇。絕大多數(shù)丁醇已被除去的經(jīng)過(guò)處理的溶劑流，可作為貧萃取溶劑加回到體系中，并作為供給上述發(fā)酵罐FlOO的流入溶劑。隨著發(fā)酵以一種有序方式進(jìn)行，可重置萃取溶劑多歧管的閥門，以將最貧的萃取溶劑供給以最低的丁醇肉湯相滴度運(yùn)行的發(fā)酵罐。例如，假定(a)發(fā)酵罐F102完成了其發(fā)酵過(guò)程，已被重新裝料并重新開始發(fā)酵，(b)發(fā)酵罐FlOO處于其發(fā)酵過(guò)程的中期，正以中等的丁醇肉湯相滴度運(yùn)行，以及(c)發(fā)酵罐FlOl接近其發(fā)酵過(guò)程的末期，正以相對(duì)較高的丁醇肉湯相滴度運(yùn)行。在這種情形中，最貧的萃取溶劑將會(huì)供給F102，自F102流出的萃取溶劑將會(huì)供給發(fā)酵罐F100，而自發(fā)酵罐FlOO流出的萃取溶劑將會(huì)供給發(fā)酵罐FlOl。以這種方式運(yùn)行的好處在于可在盡量長(zhǎng)的時(shí)間里保持肉湯相丁醇滴度盡可能地低，從而實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)率的提升。此外，在已進(jìn)一步進(jìn)入以較高的丁醇肉湯相滴度運(yùn)行的發(fā)酵過(guò)程的其他發(fā)酵罐中，是有可能降低溫度的。溫度的降低能允許對(duì)較高丁醇肉湯相滴度的耐受力的提升。
實(shí)施例本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步限定。應(yīng)當(dāng)理解，盡管這些實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過(guò)上述論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特征，并且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修改以適應(yīng)多種用途和條件。所有的溶劑(即萃取劑)均自Sigma-Aldrichd Louis,M0)獲得，并在未經(jīng)進(jìn)一步純化的情況下被使用。所使用的油醇為工業(yè)級(jí)，其包含油醇(65%)以及高級(jí)和低級(jí)脂肪醇的混合物。所使用的其他溶劑的純度如下油酸，65至88% ；辛酸，98% ；壬醇，98% ； 1-十二烷醇，98%; 1-壬醛，95%，以及1-癸醇，98%。異丁醇自Sigma-Aldrich獲得，并在未經(jīng)進(jìn)一步純化的情況下被使用。一般方法重組的大腸桿菌菌株NGCI-031的構(gòu)建如下所述，構(gòu)建了一種重組的大腸桿菌菌株，所述菌株包含一種異丁醇生物合成途徑和對(duì)下列基因的刪除pflB(SEQ ID NO :23，編碼丙酮酸甲酸裂解酶)，IdhA(SEQ ID N0:24，編碼乳酸脫氫酶)，adhE(SEQ ID NO :25，編碼乙醇脫氫酶)，以及frdB (SEQ ID NO: 27，編碼延胡索酸還原酶的一個(gè)亞基)。上述異丁醇生物合成途徑中的基因?yàn)閬?lái)自肺炎克雷伯氏菌的budB(列為SEQ ID NO :1)，來(lái)自大腸桿菌的ilvC(列為SEQ ID N0:3)，來(lái)自大腸桿菌的ilvD(列為SEQ ID NO :5)，來(lái)自乳酸乳球菌的kivD(列為SEQ ID NO 7)，以及來(lái)自木糖氧化無(wú)色桿菌的sadB(列為SEQ ID NO :9)。上述重組菌株的構(gòu)建通過(guò)兩步完成。首先，構(gòu)建了一種具有前述基因刪除的大腸桿菌菌株。然后，將編碼上述異丁醇生物合成途徑的基因引入該菌株。具有DflB、IdhA. adhE和frdB基因刪除的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建大腸桿菌的Keio菌株集(Baba等人，Mol. Syst. Biol. , 2 :1-11, 2006)被用于構(gòu)建具有目的基因刪除的大腸桿菌菌株，所述菌株在本文中稱為四重敲除大腸桿菌菌株。Keio 菌株集是用 Datsenko 禾口 Wanner 的方法(Datsenko,K. A. & Wanner, B. L. ,Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. Α. 976640-6645,2000)在大腸桿菌菌株BW25113中構(gòu)建的一個(gè)單基因敲除庫(kù)。在這個(gè)菌株集中，每一被刪除的基因均被一個(gè)側(cè)翼與FRT相接的卡那霉素標(biāo)記所取代，所述標(biāo)記可被Flp重組酶移除。通過(guò)將上述敲除-卡那霉素標(biāo)記從Keio供體菌株轉(zhuǎn)移至一種受體菌株，構(gòu)建了上述四重敲除的大腸桿菌菌株，其中所述轉(zhuǎn)移系通過(guò)Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行。在每次產(chǎn)生了一個(gè)敲除的Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，通過(guò)Flp重組酶移除了上述卡那霉素標(biāo)記。這種不帶標(biāo)記的菌株被作為下一次Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)的新的供體菌株。所述四重敲除的大腸桿菌菌株系通過(guò)Plvi,轉(zhuǎn)導(dǎo)在Keio菌株JW0886中構(gòu)建，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)系用自JW0886以及另外三種Keio菌株制備的Pl噬菌體溶菌產(chǎn)物進(jìn)行。所用的Keio 菌株如下-JW0886 :kan標(biāo)記被插入至pflB基因-JW4114 :kan標(biāo)記被插入至frdB基因-JWl375 :kan標(biāo)記被插入至IdhA基因-JW1228 :kan標(biāo)記被插入至adhE基因Pl價(jià)轉(zhuǎn)導(dǎo)的進(jìn)行在Miller所述的基礎(chǔ)上有所改變(Miller, J. H. 1992. A Short Course in Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y)。簡(jiǎn)而言之，供體菌株的細(xì)胞在Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中于37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以制備一種轉(zhuǎn)導(dǎo)溶菌產(chǎn)物。在包含0. 005M CaCl2的LB培養(yǎng)基中，并置于不通氣的37°C水浴中，對(duì)生長(zhǎng)過(guò)夜的細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在加入噬菌體之前一小時(shí)，將細(xì)胞于37°C振蕩孵育。 在上述細(xì)胞進(jìn)行最后的生長(zhǎng)之后，將一份1. OmL的等分試樣分配至14-mL管中，并加入大約 IO7 Plvir噬菌體。將上述管在37°C水浴中孵育20min，然后向每管中加入2. 5mL的0. 8% LB 上層瓊脂。將上述管中的內(nèi)容物涂布于一塊LB瓊脂板上，并于37°C孵育。于次日將軟瓊脂層刮入一個(gè)離心管中。用LB培養(yǎng)基清洗板的表面并加入到上述離心管中，加入幾滴CHCl3, 然后用渦旋攪拌器劇烈振蕩離心管。于4，OOOrpm離心IOmin之后，收集包含Plvi,溶菌產(chǎn)物的上清液。將受體菌株在l_2mL的LB培養(yǎng)基中于37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)以一臺(tái)微型離心機(jī)(Eppendorf)在10，OOOrpm室溫離心Imin使培養(yǎng)物沉淀。上述細(xì)胞沉淀被重懸于等體積的MC緩沖液(0. IM MgSO4,0. 005M CaCl2)中，并以0. ImL的等分試樣被分配至管中，然后加入0. ImL和0. OlmL的P1&溶菌產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)同時(shí)包括一不含P1&的對(duì)照管。 將上述管于37°C孵育20min，之后加入0. 2mL 0. IM檸檬酸鈉以終止Pl感染。向每管中加入 ImL LB培養(yǎng)基，然后于37°C孵育lh。孵育之后如上所述使細(xì)胞沉淀，再重懸于50-200 μ L 的LB中，然后涂布于含25 μ g/mL的卡那霉素的LB平板上，于37 °C培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)菌落PCR 對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)體進(jìn)行篩選，所述PCR采用包圍了上述卡那霉素標(biāo)記插入上游和下游區(qū)域的染色體特異性引物。通過(guò)用質(zhì)粒pCP20(Cher印anov，P. and Wackernage 1, W.，Gene, 158 :9-14,1995)轉(zhuǎn)化上述卡那霉素-抗性菌株，然后涂布于LB氨芐青霉素(lOOyg/mL)平板并置于30°C 孵育，實(shí)現(xiàn)上述卡那霉素標(biāo)記自染色體上的移除。上述PCP20質(zhì)粒攜帶受λ ρκ啟動(dòng)子控制的酵母FLP重組酶。來(lái)自該啟動(dòng)子的表達(dá)受位于該質(zhì)粒上的CI857溫度敏感的阻遏子控制。PCP20的復(fù)制起點(diǎn)同樣是溫度敏感的。將氨芐青霉素抗性菌落在LB瓊脂板上劃線，并于42°C孵育。較高的孵育溫度同時(shí)誘導(dǎo)了 FLP重組酶的表達(dá)和從細(xì)胞中活化了 pCP20質(zhì)粒。分離的菌落以網(wǎng)格方式接種至包含卡那霉素05yg/mL)的LB平板、LB氨芐青霉素 (100 μ g/mL)平板和LB平板。通過(guò)菌落PCR對(duì)得到的卡那霉素敏感的、氨芐青霉素敏感的菌落進(jìn)行了篩選，以確認(rèn)上述卡那霉素標(biāo)記從染色體上的移除。菌落PCR 擴(kuò)增使用 HotMarTaq Master Mix(Qiagen, Valencia, CA ；目錄號(hào) 71805-3)按照制造商規(guī)程進(jìn)行。在一個(gè)25 μ L Master Mix反應(yīng)中包含每種染色體特異性 PCR引物0. 2 μ M，并加入了少量體積的一種菌落。擴(kuò)增在DNA熱循環(huán)儀GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster city, CA)中進(jìn)行。典型的菌落 PCR 條件如下95°C 15min ； 95°C 30seC，50-58°C范圍的退火溫度30sec，引物在72°C按照約lmin/kb DNA的時(shí)間延伸， 30個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，然后將溫度保持在4°C。PCR產(chǎn)物的大小通過(guò)凝膠電泳和與已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品的比較確定。coli 如 Ausubel, F. M.等人(Current Protocols in Molecular Biology, 1987, ffiley-Interscience,)所述制備了電感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞，以用于轉(zhuǎn)化。細(xì)胞被培養(yǎng)于25-50mL的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30_37°C，然后通過(guò)在10，OOOrpm離心IOmin收集 0D_在0. 5-0. 7的細(xì)胞。以與上述培養(yǎng)物的初始體積等體積的冰冷無(wú)菌水洗滌收集的細(xì)胞兩遍。在最后一次洗滌之后，細(xì)胞被重懸于無(wú)菌水中，并加入了待轉(zhuǎn)化的DNA。上述細(xì)胞和 DNA被轉(zhuǎn)移到冷的小皿中，并在一臺(tái)Bio-Rad Gene Pulser II中按照制造商的說(shuō)明書進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(Bio-Rad Laboratories, Inc Hercules, CA)。用質(zhì)粒？0 20轉(zhuǎn)化了菌株10886(八？打8::1 111)，將轉(zhuǎn)化后的菌株涂布于包含 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板并于30°C培養(yǎng)。然后選擇氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體，在LB 平板上劃線并于42°C培養(yǎng)。分離的菌落被接種至氨芐青霉素和卡那霉素選擇培養(yǎng)基平板和 LB 平板上。利用引物 pflB CkUp (SEQ ID NO 11)和 pflB CkDn (SEQ ID NO 12)進(jìn)行菌落 PCR，對(duì)卡那霉素敏感的和氨芐青霉素敏感的菌落進(jìn)行了篩選。通過(guò)凝膠電泳對(duì)一份10 μ L 的PCR反應(yīng)混合液等分試樣進(jìn)行了分析。觀察到了大約0.41Λ的目的PCR產(chǎn)物，從而確認(rèn)了上述標(biāo)記的移除和“JW0886 markerless”菌株的構(gòu)建成功。該菌株包含pflB基因的刪除。用來(lái)自JW4114(frdB: :kan)的 Plvir 溶菌產(chǎn)物對(duì)上述“JW0886 markerless” 菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)導(dǎo)，并將其涂布接種于包含25 μ g/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物frdB CkUp (SEQ ID NO 13)和frdB CkDn (SEQ ID NO 14)進(jìn)行菌落PCR，對(duì)卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)體進(jìn)行了篩選。如上所述，將產(chǎn)生了所預(yù)期的約1.61Λ PCR產(chǎn)物的菌落制備為電感受態(tài)，并用pCP20對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化以移除標(biāo)記，如上文所述。轉(zhuǎn)化體首先在30°C被涂布于包含100 μ g/ mL氨芐青霉素的LB平板上，然后選擇氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體劃線接種至LB平板上并于 42°C培養(yǎng)。分離的菌落被接種至氨芐青霉素和卡那霉素選擇培養(yǎng)基平板和LB平板上。利用引物 frdB CkUp (SEQ ID NO 13)和 frdB CkDn (SEQ ID NO 14)進(jìn)行 PCR，對(duì)卡那霉素敏感的、氨芐青霉素敏感的菌落進(jìn)行了篩選。觀察到了大約0. 4kb的目的PCR產(chǎn)物，從而確認(rèn)了上述標(biāo)記的移除和雙敲除菌株“ Δρ Β frdB"的構(gòu)建成功。用來(lái)自JW1375(AldhA: :kan)的Plvi,溶菌產(chǎn)物對(duì)上述雙敲除菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)導(dǎo)，并將其涂布于包含25 μ g/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物IdhA CkUp (SEQ ID NO 15) 和IdhA CkDn (SEQ ID NO 16)進(jìn)行菌落PCR，對(duì)卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)體進(jìn)行了篩選。如上所述，將產(chǎn)生了所預(yù)期的約1. Ikb PCR產(chǎn)物的菌落制備為電感受態(tài)，并用pCP20對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化以移除標(biāo)記。轉(zhuǎn)導(dǎo)體在30°C被涂布于包含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上，氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體被劃線接種至LB平板上并于42°C培養(yǎng)。分離的菌落被接種至氨芐青霉素和卡那霉素選擇培養(yǎng)基平板和LB平板上。利用引物IdhA CkUp (SEQ ID NO 15)和IdhA CkDn (SEQ ID NO :16)，針對(duì)0. 3kb的產(chǎn)物進(jìn)行PCR，對(duì)卡那霉素敏感的、氨芐青霉素敏感的菌落進(jìn)行了篩選。產(chǎn)生了所預(yù)期的大約0.31Λ的PCR產(chǎn)物的菌落確認(rèn)了標(biāo)記的移除，從而構(gòu)建了稱為“三敲除菌株”(Δ pflB frdB IdhA)的三重敲除的菌株。用來(lái)自JW12^(AadhE::kan)的溶菌產(chǎn)物對(duì)上述三敲除菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)導(dǎo)，并將其涂布于包含25 μ g/mL卡那霉素的LB平板上。利用引物adhE CkUp (SEQ ID NO 17)和 adhE CkDn(SEQ ID NO :18)進(jìn)行菌落PCR，對(duì)卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)體進(jìn)行了篩選。將產(chǎn)生了所預(yù)期的約1. 6kb PCR產(chǎn)物的菌落制備為電感受態(tài)，并用pCP20對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化以移除標(biāo)記。轉(zhuǎn)導(dǎo)體在30°C被涂布于包含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板上。氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體被劃線接種至LB平板上并于42°C培養(yǎng)。分離的菌落被接種至氨芐青霉素和卡那霉素選擇培養(yǎng)基平板和LB平板上。利用引物adhE CkUp (SEQ ID NO 17)和adhE CkDn (SEQ ID NO 18)進(jìn)行PCR，對(duì)卡那霉素敏感的、氨芐青霉素敏感的菌落進(jìn)行了篩選。產(chǎn)生了所預(yù)期的大約0.41Λ的PCR產(chǎn)物的菌落被命名為“四敲除菌株”(Δρ Β frdB IdhA adhE)。編石馬一種異勿合成涂徑的一組某因向上沭四高祁余大腸桿Iflf株中的弓丨入。如共同待決和共同持有的美國(guó)專利申請(qǐng)公布2007/009^57的實(shí)施例9_14中所述，構(gòu)建了質(zhì)粒PjTrcggA budB-ilvC-ilvD-kivD,上述專利以弓丨用方式并入本文。該質(zhì)粒包含下列基因來(lái)自肺炎克雷伯氏菌的編碼乙酰乳酸合酶的budB(SEQ ID N0:1)，來(lái)自大腸桿菌的編碼乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的ilvC基因(SEQ ID NO :3)，來(lái)自大腸桿菌的編碼乙酰羥酸脫水酶的ilvD(SEQ ID NO :5)，以及來(lái)自乳酸乳球菌的編碼支鏈酮酸脫羧酶的kivD(SEQ ID NO :7)。來(lái)自木糖氧化無(wú)色桿菌的編碼一種丁醇脫氫酶的sadB基因(SEQ ID NO 9)被亞克隆至pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD質(zhì)粒中，如下所述。采用標(biāo)準(zhǔn)條件，從木糖氧化無(wú)色桿菌基因組DNA中擴(kuò)增了來(lái)自木糖氧化無(wú)色桿菌的編碼一種丁醇脫氫酶的一段 DNA 片段(DNA :SEQ ID NO 9 ；protein =SEQ ID NO :10) (公開于共同待決和共同持有的美國(guó)專利申請(qǐng)61/04擬91)。按照針對(duì)革蘭氏陰性菌推薦實(shí)驗(yàn)規(guī)禾呈，使用 Gentra Puregene 試劑盒(Gentra Systems, Inc. , Minneapolis, MN ；產(chǎn)品目錄號(hào)D-5500A)制備了上述DNA。PCR擴(kuò)增系用正向和反向引物N473和N469 (SEQ ID NO 分別為 19 和 20)以及 Phusion high Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA)進(jìn)行。PCR 產(chǎn)物被 TOPO-Blunt 克隆至 pCR4 BLUNT(Invitrogen)，從而得到 pCR4Blunt::sadB，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入了大腸桿菌coli Mach-I細(xì)胞。隨后從四個(gè)克隆中分離了質(zhì)粒，并對(duì)序列進(jìn)行了驗(yàn)證。然后，sadB編碼區(qū)被克隆至載體 pTrc99a(Amann 等人，Gene 69 :301-315,1988)。 用EcoRI消化上述pCR4Blunt sadB,釋放出sadB片段，將該片段與經(jīng)EcoRI消化的pTrc99a連接，從而形成質(zhì)粒pTrc99a: sadB。該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入大腸桿菌Mach 1細(xì)胞，所得到的轉(zhuǎn)化體被命名為MaChl/pTrC99a: :sadB。以異丁醛作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，上述細(xì)胞中表達(dá)自sadB基因的酶的活性經(jīng)測(cè)定在無(wú)細(xì)胞抽提液中為3. 5mmol/min/mg蛋白質(zhì)。然后，上述sadB基因被亞克隆至pTrc99A budB_i 1 vC_i 1 vD_kivD如下。利用 Phusion High Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs, Beverly, MA)禾口弓|物 N695A (SEQ ID NO :21)和 N696A (SEQ ID NO :22)，從pTrc99a: : sadB擴(kuò)增出 sadB編碼區(qū)。擴(kuò)增按以下程序進(jìn)行首先于98°C變性Imin ；然后是98°C變性10seC，62°C退火30seC，72°C 延伸20sec，30個(gè)循環(huán)；然后于72°C進(jìn)行5min最后的延伸，最后將溫度保持于4°C。引物 N695A包含一個(gè)用于克隆的AvrII限制性位點(diǎn)和一個(gè)位于sadB編碼區(qū)的起始密碼子上游的 RBS (核糖體結(jié)合位點(diǎn))。引物N696A包含一個(gè)用于克隆的)(bal位點(diǎn)。以AvrII和)(baI (New England Biolabs, Beverly, MA)對(duì)上述 1. Ikb PCR 產(chǎn)物進(jìn)行了消化，并用 Qiaquick Gel Extraction Kit(Qiagen he.，Valencia，CA))進(jìn)行了凝膠純化。利用 T4 DNA 連接酶 (New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)，將上述經(jīng)純化的片段與已用相同的限制酶酶切過(guò)的 pTrc99A: :budB-ilVC-ilVD-kiVD連接。連接混合物被置于16°C孵育過(guò)夜，然后按照制造商規(guī)程轉(zhuǎn)入大腸桿菌Mach 1 感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。獲得的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)于含100 μ g/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板上。利用 QIApr 印 Spin Miniprep Kit(Qiagen Inc. ,Valencia, CA)，按照制造商規(guī)程制備了來(lái)自上述轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA。得到的質(zhì)粒稱為pTrc99A: :budB -ilvC-ilvD-kivD-sadB。用 pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD_sadB 轉(zhuǎn)化了如上文所述制備的電感受態(tài)四敲除大腸桿菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體被劃線接種至含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。所得到的重組大腸桿菌菌株包含由質(zhì)粒pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB 編碼的一種異丁醇生物合成途徑，和pflB、frdB、ldhA以及adhE基因的刪除，并被命名為菌株 NGCI-031。酵母菌株NGI-049的構(gòu)建NGI-049是一種含內(nèi)源性PDC1、PDC5和PDC6基因的插入失活，并包含表達(dá)載體 PLH475-Z4B8和pLH468的啤酒糖酵母菌株。PDCl、PDC5和PDC6基因編碼丙酮酸脫羧酶的三種主要的同功酶。該菌株表達(dá)編碼一種異丁醇生物合成途徑的酶的基因，所述基因?yàn)檎系幕蛘呶挥谫|(zhì)粒上。表達(dá)載體PLH475-MB8構(gòu)建了用于在酵母中表達(dá)ALS和KARI的質(zhì)粒pLH475-Z4B8(SEQ ID NO :30)。 PLH475-Z4B8是一種包含下列嵌合基因的pHR81載體(ATCC#87M1)。1)CUP1啟動(dòng)子(SEQ ID NO :31)，來(lái)自枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合酶編碼區(qū) (AlsS ；SEQ ID NO 32 ；蛋白質(zhì) SEQ ID NO 33)和 CYCl 終止子(SEQ ID NO 34)；2) ILV5 啟動(dòng)子(SEQ ID NO 35)，Pf5. IlvC_Z4B8 編碼區(qū)(SEQ ID NO :36 ；蛋白質(zhì) SEQ ID NO 37)和 ILV5 終止子(SEQ ID NO :38)；以及3)FBAl 啟動(dòng)子(SEQ ID NO :39)，啤酒糖酵母 KARI 編碼區(qū)(ILV5 ；SEQ ID NO :40 ； 蛋白質(zhì)SEQ ID NO 41)和CYCl終止子。所述Pf5. IlvC-Z4B8編碼區(qū)系一段編碼來(lái)自熒光假單胞菌的KARI但包含突變的序列，其被描述于共同持有的和共同待決的美國(guó)專利申請(qǐng)#12/337736中，該專利以引用方式并入本文。上述Pf5.IlVC-Z4B8編碼的KARI(SEQ ID NO 37 ；)與野生型熒光假單胞菌KARI相比，具有下列的氨基酸變換C33L 位于位點(diǎn)33的半胱氨酸變?yōu)榱涟彼?，R47Y 位于位點(diǎn)47的精氨酸變?yōu)槔野彼幔琒50A 位于位點(diǎn)50的絲氨酸變?yōu)楸彼?，T52D 位于位點(diǎn)52的蘇氨酸變?yōu)樘於０?，V53A 位于位點(diǎn)53的纈氨酸變?yōu)楸彼幔琇61F 位于位點(diǎn)61的亮氨酸變?yōu)楸奖彼?，T80I 位于位點(diǎn)80的蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔珹156V 位于位點(diǎn)156的丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，以及G170A 位于位點(diǎn)170的甘氨酸變?yōu)楸彼帷Ｉ鲜鯬f5. IlvC-Z4B8編碼區(qū)系基于針對(duì)在啤酒糖酵母中的表達(dá)優(yōu)化的密碼子，利用 DNA 2. 0 (Palo Alto, CA ；SEQ ID NO 6)合成的。表汰載體DLH468構(gòu)建了用于在酵母中表達(dá)DHAD、KivD和HADH的質(zhì)粒pLH468 (SEQ ID NO :42)。subtilis基于針對(duì)在啤酒糖酵母中的表達(dá)優(yōu)化的密碼子，利用DNA2. 0合成了枯草芽孢桿菌酮異戊酸脫羧酶(KivD)和馬肝臟醇脫氫酶(HADH)的編碼區(qū)(SEQ ID NO分別為43和45)，并提供于質(zhì)粒pKivDy-DNA2. 0和pHadhy_DNA2. 0中。所編碼的蛋白質(zhì)為別為SEQ ID NOs 44和46。構(gòu)建了 KivD和HADH單獨(dú)的表達(dá)載體。用AscI和SfiI酶對(duì)載體pNY8 (SEQ ID NO :47 ；也稱為pRS426. GPD-ald-GPDt，描述于共同持有的和共同待決的 US Patent App. Pub. US2008/0182308，實(shí)施例17，該專利以引用方式并入本文)進(jìn)行了消化，從而切下上述GPDl啟動(dòng)子和aid編碼區(qū)，以裝配pLH467(pRS426: :PGPD1-kivDy-GPDlt) 。用 5，引物 0T1068 和 3，引物 0T1067(SEQ ID NOs :49 和 50)對(duì)來(lái)自 pNY8 的一段 GPDl 啟動(dòng)子片段(SEQ ID NO :48)進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增，以在5’端加上一個(gè)AscI位點(diǎn)，并在3’端加上一個(gè)SpeI位點(diǎn)。將上述經(jīng)Ascl/Sfil消化的pNY8載體片段，與經(jīng)AscI和SpeI消化的 GPDl啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物，以及分離自載體pKivD-DNA2. 0的包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的kivD編碼區(qū)的SpeI-SfiI片段相連接。這種三方連接產(chǎn)生了載體pLH467(pRS426: :PGPD1-kivDy-GPDlt) 。通過(guò)限制性圖譜和測(cè)序?qū)LH467進(jìn)行了驗(yàn)證。pLH435(pRS425: :PGPM1-Hadhy-ADHlt)源自載體 pRS425: :GPM-sadB(SEQ ID NO: 51)，后者描述于共同持有的和共同待決的US Patent App. #61/058970，實(shí)施例3，該專利以引用方式并入本文。pRS425::GPM-SadB系包含了一個(gè)嵌合基因的pRS425載體 (ATCC#77106)，所述嵌合基因包含GPMl啟動(dòng)子(SEQ ID NO :52)，來(lái)自木糖氧化無(wú)色桿菌的一種丁醇脫氫酶的編碼區(qū)(sadB;SEQ ID NO :9;蛋白質(zhì)SEQ ID N0:10:公開于共同持有的和共同待決的US Patent App. #61/048291)，以及ADHl終止子(SEQ ID NO :53)。 pRS425: :GPMp-sadB在上述sadB編碼區(qū)的5，和3，端分別包含BbvI和PacI位點(diǎn)。通過(guò)利用引物0T1074和0T1075(SEQ ID NO :54和55)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，在上述sadB編碼區(qū)的 5，端加上了一個(gè)NheI位點(diǎn)，從而產(chǎn)生載體pRS425-GPMp-sadB-NheI，該載體經(jīng)過(guò)了測(cè)序驗(yàn)證。用NheI和I^acI消化pRS425: PGPM1-sadB-Nhe以釋放出sadB編碼區(qū)，并將來(lái)自載體 pHadhy-DNA2. 0的包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的HADH編碼區(qū)的NheI-PacI片段與上述經(jīng)消化的質(zhì)粒連接，從而得到pLH4;35。
用^icI和NotI消化了酵母載體pRS411 (ATCC#87474)，并在一個(gè)三方連接反應(yīng)中， 將上述經(jīng)消化的載體與來(lái)自PLH467的包含PePD1-kivDy-GPDlt表達(dá)盒的Mcl-SalI片段和來(lái)自pLH435的包含Pepm-Hadhy-ADHlt表達(dá)盒的MlI-NotI片段相連接，以將KivD和HADH 表達(dá)盒聯(lián)合于同一載體中。這樣就產(chǎn)生了載體pRS411: TepDrkivDy-P^-HadhybLMM)， 該載體經(jīng)過(guò)了限制性圖譜驗(yàn)證。為了構(gòu)建下游的異丁醇途徑ilvD、kivDy和Hadhy中的全部三種基因的一種共表達(dá)載體，我們使用描述于共同持有的和共同待決的美國(guó)專利申請(qǐng)#61/100792中的pRS423 FBA iIvD (鏈球菌的)(SEQ ID NO 56)作為IlvD基因的來(lái)源。這種穿梭載體包含一個(gè)在大腸桿菌中共生所需的Fl復(fù)制起點(diǎn)(nt 1423至1879)和一個(gè)在酵母中復(fù)制所需的2微米起點(diǎn)(nt 8082至9似6)。該載體含有一個(gè)FBA啟動(dòng)子(nt 2111至3108 ;SEQ ID NO :39)和 FBA終止子(nt 4861至5860 ;SEQ ID NO :57)。此外，它還攜帶用于在酵母中進(jìn)行選擇的 His標(biāo)記(nt 504至116 和用于在大腸桿菌中進(jìn)行選擇的氨芐青霉素抗性標(biāo)記(nt 7092 至 7949)。來(lái)自變形鏈球菌 UA159(ATCC#700610)的 ilvD 編碼區(qū)(nt 3116 至 4^8;SEQ ID NO :58;蛋白質(zhì)SEQ ID NO 59)位于上述FBA啟動(dòng)子和FBA終止子之間，從而構(gòu)成了一個(gè)用于表達(dá)的嵌合基因。此外，上述ilvD編碼區(qū)還融合了一個(gè)Iumio標(biāo)簽(nt 4829-4849)。第一步是用SacI 和 SacII 將 pRS423 FBA iIvD (Strep)(也叫做 pRS423_FBA (Spe I)-IlvD (Streptococcus mutans)-Lumio)線性化(并利用 T4 DNA 聚合酶將 SacII 位點(diǎn)平末端化)，從而得到一種全長(zhǎng)為9，482bp的載體。第二步是用McI和KpnI從pLH441分離出kivDy-hADHy盒(并利用T4 DNA聚合酶將KpnI位點(diǎn)平末端化)，得到一種6，063bp的片段。將該片段與來(lái)自 pRS423-FBA(SpeI)-IIvD(Sti^ptococcus mutans)-Lumio 的 9，482bp 載體片段相連接。如此產(chǎn)生了載體 pLH468(pRS423: :PFBA1-ilvD (Strep) Lumiο-FBAIt-Pgpdi-kivDy-GPD 1 t-PGPM1-hadhy-ADHlt)，該載體經(jīng)過(guò)了限制性圖譜和測(cè)序確認(rèn)。pdc6: :GPMpl-sadB整合盒和PDC6刪除的構(gòu)建通過(guò)將來(lái)自pRS425: :GPM_sadB (如上所述)的 GPM-sadB-ADHt 片段(SEQ ID NO 60)，與來(lái)自 pUC19-URA3r 的 URA3r 基因相聯(lián)，構(gòu)建了一種 pdc6: GPMlp-sadB-ADHlt-URA3r 整合盒。pUC19-URA3r(SEQID NO :61)包含來(lái)自pRS似6 (ATCC#77107)的URA3標(biāo)記，該標(biāo)記兩翼為75bp的同源重復(fù)序列，以允許體內(nèi)同源重組和URA3標(biāo)記的移除。以pRS425: :GPM-sadB 和pUC19-URA3r質(zhì)粒DNA作為模板，利用 Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs Inc., Beverly，MA ；目錄號(hào) F-540S)和引物 114117-11A 至 114117-11D (SEQ ID NOs :62，63，64 和 65)以及 114117-13A 和 114117-13B(SEQ ID NOs :66 和 67)，通過(guò)重疊延伸 PCR(SOE PCR) (如Horton等人(1989) Gene 77 :61-68所述)將上述兩種DNA片段相連。SOE PCR 的外側(cè)引物(114117-13A 和 114117-13B)包含 5，禾口 3， 50bp 分別與 PDC6啟動(dòng)子和終止子的上游和下游區(qū)域同源的區(qū)域。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)技術(shù)(Methods in Yeast Genetics,2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-20 ，將完整的盒PCR片段轉(zhuǎn)入了 BY4700 (ATCC#200866)，并將轉(zhuǎn)化體在30°C 培養(yǎng)于不含尿嘧啶且補(bǔ)充了 2%葡萄糖的合成的完全培養(yǎng)基上。利用引物112590-34G 和 112590-34H(SEQ ID NOs :68 和 69)，以及 112590-34F 和 112590-49E(SEQ ID NOs 70 和71)，通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了篩選，以驗(yàn)證PDC6編碼區(qū)的刪除在PDC6基因座處的整合。通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在30°C涂布于補(bǔ)充了 2%葡萄糖和5-F0A的合成的完全培養(yǎng)基上，對(duì)上述URA3r標(biāo)記進(jìn)行了回收利用。通過(guò)將來(lái)自上述5-F0A平板的菌落接種至SD-URA 培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)的被抑制確認(rèn)了標(biāo)記的移除。得到的經(jīng)過(guò)鑒定的菌株具有下列基因型 BY4700pdc6: :PGPM1-sadB_ADHlt。pdcl: :PDCl-ilvD 整合盒 PDCl 刪除的構(gòu)建利用SOE PCR(如 Horton 等人(1989) Gene 77 :61-68 所述)，通過(guò)將來(lái)自 pLH468(參見上文)的 i IvD-FBA It 片段(SEQ ID NO 72)與來(lái)自 pUC19_URA3r 的 URA3r 基因相連，構(gòu)建了一種 pdcl: :PDClp-ilvD-FBAlt-URA3r 整合盒，其中所述 SOE PCR 系用 pLH468 和pUC19-URA3r質(zhì)粒DNA作為模板，利用 Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs Inc., Beverly，MA ；目錄號(hào) F-540S)和引物 114117-27A 至 114117-27D (SEQ ID NOs :73，74，75 和 76)進(jìn)行。SOE PCR 的外側(cè)引物(114117-27A 和 114117-27D)包含 5，和 3， 50bp 與 PDCl 啟動(dòng)子的下游區(qū)域和PDCl編碼區(qū)的下游區(qū)域同源的區(qū)域。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)技術(shù)(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202)，將完整的盒 PCR 片段轉(zhuǎn)入了 BY4700 pdc6: :PGPM1-sadB-ADHlt,并將轉(zhuǎn)化體在30°C培養(yǎng)于不含尿嘧啶且補(bǔ)充了 2%葡萄糖的合成的完全培養(yǎng)基上。利用引物 114117-36D 和 135(SEQ ID NOs :77 和 78)，以及 112590-49E 和 112590_30F(SEQ ID NOs 70和79)，通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了篩選，以驗(yàn)證PDCl編碼區(qū)的刪除在PDCl基因座處的整合。通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在30°C涂布于補(bǔ)充了 2%葡萄糖和5-F0A的合成的完全培養(yǎng)基上， 對(duì)上述URA3r標(biāo)記進(jìn)行了回收利用。通過(guò)將來(lái)自上述5-F0A平板的菌落接種至SD-URA培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)的被抑制確認(rèn)了標(biāo)記的移除。得到的經(jīng)過(guò)鑒定的菌株“NYLA67”具有下列基因型BY4700 pdc6: :GPMlp-sadB-ADHlt pdcl :PDClp_ilvD_FBAlt。HI S3 刪除為了刪除內(nèi)源的HIS3編碼區(qū)，從URA3r2模板DNA(SEQ ID NO :84) PCR擴(kuò)增了一種 his3 :URA3r2盒。URA3r2包含來(lái)自pRS似6 (ATCC#77107)的URA3標(biāo)記，該標(biāo)記兩翼為500bp 的同源重復(fù)序列，以允許體內(nèi)同源重組和URA3標(biāo)記的移除。PCR系利用Wiusion DNA聚合酶和引物 114117-45A 和 114117-45B(SEQ ID NOs :85 和 86)進(jìn)行，其產(chǎn)生了一種 2. 3kb PCR產(chǎn)物。每種引物的HIS3部分來(lái)源于HIS3啟動(dòng)子上游的5’區(qū)域和編碼區(qū)下游的3’區(qū)域，如此URA3r2標(biāo)記的整合導(dǎo)致HIS3編碼區(qū)的置換。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)技術(shù)(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY,pp. 201-202)，將上述PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入了 NYLA67，并在30°C于不含尿嘧啶且補(bǔ)充了 2%葡萄糖的合成的完全培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了選擇。通過(guò)在30°C利用復(fù)制平板培養(yǎng)法在不含組氨酸且補(bǔ)充了 2%葡萄糖的合成的完全培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了篩選，以驗(yàn)證正確的整合。 通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在30°C涂布于補(bǔ)充了 2%葡萄糖和5-F0A的合成的完全培養(yǎng)基上，對(duì)上述URA3r標(biāo)記進(jìn)行了回收利用。通過(guò)將來(lái)自上述5-F0A平板的菌落接種至SD-URA培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)的被抑制確認(rèn)了標(biāo)記的移除。得到的經(jīng)過(guò)鑒定的菌株“NYLA73”具有下列基因型 BY4700 pdc6::GPMlp-sadB-ADHlt pdcl:PDClp_ilvD_FBAltΔhis3。pdc5: :kanMX整合盒以及PDC5刪除的構(gòu)建利用Phusion DNA 聚合酶和引物 PDC5: KanMXF 和 PDC5: KanMXR(SEQ ID NOs 80 和 81)，從菌株 YLR134W 染色體 DNA (ATCC No. 4034091) PCR 擴(kuò)增了一種 pdc5: :kanMX4 盒，產(chǎn)生了一種 2. 21Λ PCR產(chǎn)物。每種引物的PDC5部分來(lái)源于PDC5啟動(dòng)子上游的5’區(qū)域和編碼區(qū)下游的3’區(qū)域，如此kanMX4標(biāo)記的整合導(dǎo)致PDC5編碼區(qū)的置換。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)技術(shù)(Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-202)，將上述 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入了 NYLA73，并在 30°C于補(bǔ)充了 乙醇和基因霉素(geneticinM200yg/ml)的YP培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了選擇。利用引物PDC5kofor和N 175 (SEQ ID NOs :82和83)，通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行了篩選，以驗(yàn)證PDC5編碼區(qū)的刪除在PDC基因座處的整合。經(jīng)鑒定的正確的轉(zhuǎn)化體具有下列基因型 BY4700pdc6::GPMlp-sadB_ADHlt pdcl:PDClp_ilvD_FBAlt Ahis3pdc5::kanMX4。利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳學(xué)技術(shù)(Methodsin Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，pp. 201—202)，Mf 質(zhì)粒載體 pLH468 禾口 PLH475-Z4B8 同時(shí)轉(zhuǎn)入了菌株 BY4700pdc6: :GPMlp-sadB_ADHlt pdcl :PDClp_ilvD_FBAlt Ahis3pdc5: :kanMX4，并在30°C培養(yǎng)于不含組氨酸和尿嘧啶且補(bǔ)充了乙醇的合成的完全培養(yǎng)基上。用于測(cè)定異丁醇的GC方法下列GC方法用于在下述的實(shí)施例1-7中測(cè)定所述水相和有機(jī)相中的異丁醇的量。 所述 GC 方法利用來(lái)自 Agilent Technologies (Santa Clara, CA)的一種 HP-InnoWax 柱 (30mX0. 32mm ID，0. 25μπι膜)。載氣為流速lmL/min的氦氣，測(cè)量于150°C、恒定的頭部壓力；注射分流比在200°C為1 10 ；爐溫為45°C lmin,以10°C /min從45°C至230°C，以及230°C30sec。在沈01并使用40mL/min氦尾吹氣，進(jìn)行火焰離子化檢測(cè)。在注射前先通過(guò)0. 2μπι旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器對(duì)培養(yǎng)物肉湯樣品進(jìn)行了過(guò)濾。根據(jù)所期望的分析靈敏度，使用了 0. IyL或0.5yL的注射體積。對(duì)于下列化合物，產(chǎn)生了校準(zhǔn)過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)曲線乙醇，異丁醇， 乙偶姻，內(nèi)消旋-2，3-丁二醇，以及QS，3S)-2，3-丁二醇。還利用了分析標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)鑒定異丁醛、異丁酸和異戊醇的保留時(shí)間。這這些條件下，異丁醇的保留時(shí)間為約5. 33分鐘。用于測(cè)定水相中的葡萄糖和異丁醇的HPLC方法對(duì)于實(shí)施例7和8，采用上述GC方法測(cè)定了所述有機(jī)相中的異丁醇。對(duì)于實(shí)施例7 和8，所述水相中的異丁醇和葡萄糖濃度系利用一Shodex sugar SH1011柱，8. OmmX 300mm， (Showa Denko K. K. ,Kanagawa, Japan (通過(guò) Thompson Instruments, Clear Brook,VA)),用 0. OlN硫酸溶液作為洗脫劑等度洗脫，通過(guò)HPLC(Waters Alliance Model, Milford, MA或 Agilent 1100 Series, Santa Clara, CA)測(cè)量。樣品通過(guò)一個(gè) 0. 2 μ m 注射式過(guò)濾器(PALL GHP膜)注入一個(gè)HPLC樣品瓶。HPLC運(yùn)行條件如下注射體積10yL流速0.80mL/ 分鐘運(yùn)行時(shí)間32分鐘柱溫50°C檢測(cè)器折射指數(shù)檢測(cè)器溫度40°CUV 檢測(cè)210nmjnm 帶寬運(yùn)行結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定每個(gè)化合物在樣本中的濃度。異丁醇和葡萄糖的保留時(shí)間分別為27. 0和8. 7分鐘。
實(shí)施例1溶劑的篩選本實(shí)施例的目的是篩選用于丁醇的萃取發(fā)酵的各種有機(jī)溶劑。所研究的溶劑特性為丁醇在所述溶劑與一種水相之間的分配、所述溶劑在上述雙相體系中的乳液形成趨勢(shì)、 以及所述溶劑與一種野生型啤酒糖酵母菌株的生物相容性。研究了丁醇在水與下列溶劑之間的分配油酸(CAS No. 112_80_1)，油醇(CAS No. 14348-2)，辛酸(CAS No. 124-07-2)，1-壬醇(CAS No. 28473-21-4)，1-十二烷醇(CAS No. 112-53-8)，1-壬醛(CAS No. 124-19-6)，和 1_ 癸醇(CAS No. 112-30-1)。異丁醇被加入水中，以形成異丁醇終濃度為10、30、50和70g/L的水溶液。這些異丁醇水溶液(12mL)被分別加入到試管中，并加入4mL的待測(cè)溶劑。每種溶劑在每一異丁醇濃度均以一式兩份進(jìn)行測(cè)試。上述試管邊混勻邊于30°C孵育3小時(shí)。之后，通過(guò)離心將來(lái)自每一試管的水相和溶劑相分離，并用上文的一般方法部分中所描述的GC方法對(duì)異丁醇進(jìn)行了分析。對(duì)異丁醇在每種溶劑相和水相之間的分配系數(shù)進(jìn)行了計(jì)算，即Kp = [Isobutano 1 ]0rg/[isobutano 1] Aq0結(jié)果總結(jié)于表2中。表2丁醇的分配系數(shù)
權(quán)利要求
1.用于從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收丁醇的方法，所述方法包括a)提供包含丁醇、水和從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基；b)使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與下列接觸i)至少一種選自下列的第一不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以及任選地(ii)選自下列的第二不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C2Jg肪醇、C12-C2Jg 肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；c)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述丁醇為異丁醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述有機(jī)萃取劑選自油醇、二十二醇、鯨蠟醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、 十一醛、月桂醛、2-甲基十一醛、以及它們的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述有機(jī)萃取劑包含油醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述丁醇的一部分通過(guò)包括以下步驟的方法同時(shí)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中被移除a)用氣體從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中汽提丁醇，形成含丁醇的氣相；以及b)從所述含丁醇的氣相回收丁醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的丁醇具有每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基至少約37克的有效滴度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含乙醇，并且所述含丁醇的有機(jī)相包含乙醇。
8.用于生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)提供從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)在包含水相和不能與水混溶的有機(jī)萃取劑的雙相發(fā)酵培養(yǎng)基中使所述微生物生長(zhǎng)足以使丁醇被萃取到所述有機(jī)萃取劑中以形成含丁醇的有機(jī)相的時(shí)間，其中所述不能與水混溶的有機(jī)萃取劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、 以及它們的混合物，并且其中所述雙相發(fā)酵培養(yǎng)基包含按體積計(jì)約3%至約60%的所述不能與水混溶的有機(jī)萃取劑；c)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述丁醇為異丁醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述有機(jī)萃取劑選自油醇、二十二醇、鯨蠟醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、 十一醛、月桂醛、2-甲基十一醛、以及它們的混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述有機(jī)萃取劑包含油醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述丁醇的一部分通過(guò)包括以下步驟的方法同時(shí)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中被移除a)用氣體從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中汽提丁醇，從而形成含丁醇的氣相；以及b)從所述含丁醇的氣相回收丁醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述回收的丁醇具有每升所述水相至少約37克的有效滴度。
14.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含乙醇，并且所述含丁醇的有機(jī)相包含乙醇。
15.用于生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)提供從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)使上述微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中上述微生物將所述丁醇產(chǎn)生到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中以制得含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基；c)使所述含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基與下列接觸i)至少一種選自下列的第一不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以及任選地(ii)選自下列的第二不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C2Jg肪醇、 C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；d)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及e)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述丁醇為異丁醇。
17.用于生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)提供從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)在有氧條件下，使所述微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)足以達(dá)到預(yù)先選定的生長(zhǎng)水平的時(shí)間；c)轉(zhuǎn)至微需氧或厭氧條件以刺激向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)丁醇以形成含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基；d)使所述含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基與下列接觸i)至少一種選自下列的第一不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以及任選地(ii)選自下列的第二不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C2Jg肪醇、 C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；e)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及f)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述丁醇為異丁醇。
19.用于生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含丁醇、水和從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基；b)通過(guò)順流的或逆流的萃取劑流，使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與下列接觸i)至少一種選自下列的第一不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、 C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以及任選地(ii)選自下列的第二不能與水混溶的有機(jī)萃取劑=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；C)將所述含丁醇的有機(jī)相從所述水相分離；以及d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述丁醇為異丁醇。
21.根據(jù)權(quán)利要求1、8、15、17和19中任一項(xiàng)的方法，其中所述經(jīng)基因修飾的微生物選自細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌和酵母。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述細(xì)菌選自發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒桿菌屬 (Corynebacterium)禾口短桿菌屬(Brevibacterium)。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述酵母選自畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬 (Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)和糖酵母屬(Saccharomyces)。
全文摘要
本發(fā)明公開了從至少一種可發(fā)酵的碳源生產(chǎn)丁醇的方法，通過(guò)利用一種重組的微生物宿主進(jìn)行發(fā)酵，其中在發(fā)酵過(guò)程中丁醇被萃取到特定的有機(jī)萃取劑中，所述方法克服了毒性問題，并導(dǎo)致丁醇生產(chǎn)的有效滴度、有效速率和有效產(chǎn)量的提升。
文檔編號(hào)C12P7/16GK102177243SQ200980120545
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月4日
發(fā)明者M·C·格拉迪, M·賈希克, R·帕特奈克 申請(qǐng)人:布特馬斯先進(jìn)生物燃料有限責(zé)任公司