專利名稱：通過使用hdac調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)復(fù)能基因而重編程細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞、細(xì)胞分化、體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移和基于細(xì)胞 的治療法的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于重編程細(xì)胞以及基于細(xì)胞的治療 法的方法、組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)學(xué)作為許多人疾病的治療極具潛力，但是還伴隨著一些困難的技術(shù)挑戰(zhàn)， 這些挑戰(zhàn)包括低克隆效率、可能的復(fù)能(pluripotent)組織供應(yīng)不足、和對于如何控制細(xì) 胞分化和哪種類型的胚胎干細(xì)胞可用于選擇的治療的知識的普遍缺乏。盡管ES細(xì)胞具有 極大的可塑性，但是未分化的ES細(xì)胞可以形成含有組織類型混合物的畸胎瘤(良性腫瘤)。 此外，從一種來源向另一來源移植ES細(xì)胞將可能需要施用藥物來防止新細(xì)胞的排斥。已經(jīng)進(jìn)行了嘗試來鑒定由非胎兒來源的組織產(chǎn)生干細(xì)胞的新途徑。一種方法包括 操縱自體的成體干細(xì)胞。使用自體的成體干細(xì)胞用于再生醫(yī)學(xué)的優(yōu)點(diǎn)在于它們來源于并返 回同一患者，并且因此不會經(jīng)受免疫介導(dǎo)的排斥。缺點(diǎn)是這些細(xì)胞缺乏ES細(xì)胞的可塑性 和復(fù)能性，并且因此它們的潛能是不確定的。另一方法著眼于將來自成體組織的體細(xì)胞重 編程以產(chǎn)生復(fù)能ES樣細(xì)胞。然而，這種方法是困難的，因?yàn)槎嗉?xì)胞生物體中的每種細(xì)胞類 型具有獨(dú)特的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，認(rèn)為該標(biāo)記在細(xì)胞分化之后或從細(xì)胞周期退出之后是固定 的。細(xì)胞DNA —般以染色質(zhì)的形式存在，染色質(zhì)是由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體。事 實(shí)上，大部分的細(xì)胞RNA分子還以核蛋白復(fù)合體的形式存在。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，染 色質(zhì)的核蛋白結(jié)構(gòu)已成為廣泛的研究主題。一般而言，染色體DNA被包裝成核小體。核小 體包含核心和連接區(qū)。核小體核心包含核心組蛋白(H2A、H2B、H3和H4各兩個)八聚體， 約150個堿基對的染色體DNA纏繞在該八聚體周圍。此外，約50個堿基對的連接區(qū)DNA區(qū) 段與連接區(qū)組蛋白Hl締合。核小體被組織成更高階的染色質(zhì)纖維并且染色質(zhì)纖維被組織 成染色體。參見,例如,Wolffe" Chromatin Structure and Function(染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功 能)“第 3 版，Academic Press, San Diego,1998。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)不是靜態(tài)的，而是易于經(jīng)受統(tǒng)稱為染色質(zhì)重建的過程的修飾。染色 質(zhì)重建可以用于例如，從DNA區(qū)清除核小體；將核小體從一個DNA區(qū)移到另一個DNA區(qū)； 改變核小體之間的間距；或添加核小體到染色體中的DNA區(qū)。染色質(zhì)重建還可以導(dǎo)致更高階結(jié)構(gòu)的改變，從而影響轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)(開放染色質(zhì)(open chromatin)或常染色質(zhì)) 與無轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)(閉合染色質(zhì)(closed chromatin)或異染色質(zhì))之間的平衡。染色體蛋白易經(jīng)受大量類型的化學(xué)修飾。這些核心組蛋白的翻譯后修飾的一種機(jī) 制是高度保守的堿性N-末端賴氨酸殘基的氨基的可逆乙?；＝M蛋白乙?；姆€(wěn)態(tài) 是由競爭性的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶與組蛋白脫乙酰酶之間的動態(tài)平衡建立的，組蛋白脫乙 酰酶在本文稱為HDAC。HDAC依據(jù)序列同一性和結(jié)構(gòu)域組織被分為至少四類I類HDAC1、HDAC2、 HDAC3、HDAC8 ；II 類HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7A、HDAC9、HDAClO ；III 類哺乳動物中的 sirtuin (SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7)；以及 IV 類HDAC11。I 類 HDAC 是最類似于酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白RPD3的那些HDAC。II類HDAC是最類似于酵母HDAl酶的那 些 HDAC。 早已將組蛋白乙?；兔撘阴；c轉(zhuǎn)錄控制聯(lián)系起來。可逆的組蛋白乙?；梢?導(dǎo)致染色體重建并且如此可以作為基因轉(zhuǎn)錄的控制機(jī)制起作用。一般而言，組蛋白的高度 乙酰化有利于基因表達(dá)，而組蛋白脫乙?；瘎t與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)聯(lián)。據(jù)顯示組蛋白乙?；D(zhuǎn) 移酶充當(dāng)轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白，而脫乙酰酶則被發(fā)現(xiàn)是屬于轉(zhuǎn)錄抑制途徑的。組蛋白乙酰化與脫乙?；g的動態(tài)平衡是正常細(xì)胞生長所必需的。組蛋白脫乙 酰化的抑制導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞分化、凋亡和轉(zhuǎn)化的表型逆轉(zhuǎn)。復(fù)能細(xì)胞或全能(totipotent)細(xì)胞向分化的、特化的表型的發(fā)育是由發(fā)育期間 表達(dá)的特定組的基因決定的?；虮磉_(dá)是由可以實(shí)現(xiàn)正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)的基因調(diào)節(jié)蛋白的序 列特異性結(jié)合直接介導(dǎo)的。然而，這些調(diào)節(jié)蛋白的任一種直接介導(dǎo)基因表達(dá)的能力至少部 分取決于它們在細(xì)胞DNA內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)的可接近性。如上面所討論的，細(xì)胞DNA中序列的 可接近性通常取決于在其中包裝細(xì)胞DNA的細(xì)胞染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，鑒定可以誘導(dǎo)復(fù)能性所需的基因表達(dá)的方法、組合物和試劑盒，包括可以抑 制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的HDAC活性的方法、組合物和試劑盒將是有用的。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法、組合物和試劑盒。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包括誘 導(dǎo)復(fù)能基因或多能(multipotent)基因表達(dá)的方法。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及制 備重編程的細(xì)胞。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括通過使用HDAC抑制劑抑制至少一 種HDAC的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的方法。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括通過使用 HDAC調(diào)節(jié)劑改變至少一種HDAC的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的方法。方法還包括誘導(dǎo)至少 一種復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)以及重編程細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及重編程細(xì)胞的方法，所述方法包括使細(xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞 培養(yǎng)物、來自細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞亞群、同質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物或異質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物接觸HDAC調(diào)節(jié) 劑；誘導(dǎo)至少一種復(fù)能基因或多能基因表達(dá)；以及重編程細(xì)胞。所述方法還包括使重編程 的細(xì)胞再分化。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用劑以抑制HDAC的表達(dá)、活性、或表達(dá)和活性。 所述劑可以是可以抑制HDAC的表達(dá)、活性、或表達(dá)和活性的任何分子或化合物，包括但不 限于HDAC抑制劑、小分子、核酸序列、DNA序列、RNA序列、shRNA序列以及RNA干擾。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用劑以誘導(dǎo)抑制HDAC活性的蛋白的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)。所述劑可以是可以誘導(dǎo)抑制HDAC的蛋白的表達(dá)、活性、或表達(dá)和活性的 任何分子或化合物，包括但不限于小分子、核酸序列、DNA序列、RNA序列、shRNA序列以及 RNA干擾。HDAC抑制劑可以用于抑制HDAC的活性，并且其包括但不限于TSA、丁酸鈉、丙 戊酸、沃瑞諾斯特(vorinostat)、LBH-589、apicidin、TPX-HA 類似物、CI-994、MS-275、 MG⑶0103以及上面所提及的物質(zhì)的衍生物或類似物。在一些實(shí)施方案中，至少一種HDAC抑制劑可以抑制至少一種HDAC。在又一實(shí)施方 案中，多于一種的HDAC抑制劑可以同時(shí)或順序地抑制至少一種HDAC。HDAC抑制劑可以針 對于I類、II類、III類、IV類的HDAC或未知的或未分類的HDAC。HDAC抑制劑可以針對于 多于一類的HDAC或所有類的HDAC。HDAC抑制劑的組合可以抑制多于一種的HDAC，并且可 以同時(shí)或順序地使用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞群暴露于 抑制組蛋白脫乙酰酶的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)； 選擇表達(dá)指示復(fù)能細(xì)胞或多能細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞；以及擴(kuò)增所述選擇的細(xì)胞以 制備細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞暴露于抑 制HDAC的活性、表達(dá)、或表達(dá)和活性的第一劑；將所述細(xì)胞暴露于抑制第二調(diào)節(jié)蛋白的活 性、表達(dá)、或表達(dá)和活性的第二劑，其中所述第二調(diào)節(jié)蛋白具有與HDAC不同的功能；誘導(dǎo)復(fù) 能基因或多能基因的表達(dá)；以及選擇細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。在另一實(shí)施方案 中，細(xì)胞或細(xì)胞群可以同時(shí)或順序地暴露于第一劑和第二劑。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括下列的方法將具有第一表型的細(xì)胞暴露于 抑制至少一種HDAC的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑；比較細(xì)胞的所述第一表型與將所述 細(xì)胞暴露于所述劑后所獲得的表型；以及選擇已被重編程的細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，方法 包括比較在將細(xì)胞暴露于所述劑之前細(xì)胞的基因型與將所述細(xì)胞暴露于所述劑之后所獲 得的細(xì)胞基因型。在再一實(shí)施方案中，方法包括比較在將細(xì)胞暴露于抑制至少一種HDAC的 活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑之前細(xì)胞的表型和基因型與將所述細(xì)胞暴露于所述劑之后 細(xì)胞的表型和基因型。在又一實(shí)施方案中，方法包括將選擇的細(xì)胞培養(yǎng)或擴(kuò)增為細(xì)胞群。在又一實(shí)施 方案中，方法包括使用與由復(fù)能基因或多能基因所編碼的蛋白結(jié)合的抗體或使用與多能 標(biāo)記物或復(fù)能標(biāo)記物結(jié)合的抗體分離細(xì)胞，所述多能標(biāo)記物或復(fù)能標(biāo)記物包括但不限于 SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。還可以使用有效分離細(xì)胞的任何方法分離細(xì)胞，包括 但不限于熒光細(xì)胞激活的分選儀、免疫組織化學(xué)和ELISA。在另一實(shí)施方案中，方法包括選 擇與原始細(xì)胞相比具有較低分化狀態(tài)的細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括比較暴露于所述劑之前復(fù)能基因或多能基因的 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與暴露于所述劑之后所獲得的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將具有第一轉(zhuǎn) 錄模式的細(xì)胞暴露于抑制HDAC的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基 因的表達(dá)；比較細(xì)胞的所述第一轉(zhuǎn)錄模式與暴露于所述劑之后所獲得的轉(zhuǎn)錄模式；選擇細(xì) 胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。
在又一實(shí)施方案中，選擇細(xì)胞包括鑒定轉(zhuǎn)錄模式至少5-10%、10-20%、20_30%、 30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-94%、95%或 95-99%類似于分 析的胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式的細(xì)胞。不需要比較胚胎干細(xì)胞的整個轉(zhuǎn)錄模式，盡管這是可 以的。相反，可以比較的胚胎基因的亞組包括但不限于1-5個、5-10個、10-25個、25-50 個、50-100 個、100-200 個、200-500 個、500-1，000 個、1，000-2，000 個、2，000-2，500 個、 2，500-5, 000個、5，000-10, 000個和多于10，000個基因。轉(zhuǎn)錄模式可以以二元形式比較， 即，可以進(jìn)行比較來確定基因是轉(zhuǎn)錄的還是未轉(zhuǎn)錄的。在另一實(shí)施方案中，可以比較每種基 因或基因亞組的轉(zhuǎn)錄速率和/或程度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法來確定轉(zhuǎn)錄模 式，包括但不限于RT-PCR、定量PCR、微陣列、DNA印跡和雜交。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括包含使用根據(jù)本文所公開的方法產(chǎn)生的重編程的細(xì)胞 治療多種疾病的方法。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及重編程的細(xì)胞和再分化的重編程 的細(xì)胞的治療用途。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及由本發(fā)明的方法制備的重編程的細(xì)胞。重編程的細(xì)胞可 以再分化為單個譜系或多于一種譜系。重編程的細(xì)胞可以是多能的或復(fù)能的。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)包括下列步驟的方法制備的富集的重編程的 細(xì)胞群將細(xì)胞群暴露于抑制組蛋白脫乙酰酶的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑；誘導(dǎo)復(fù)能 基因或多能基因的表達(dá)；選擇表達(dá)指示復(fù)能細(xì)胞或多能細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞；以 及擴(kuò)增所述選擇的細(xì)胞以制備細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。在又一實(shí)施方案中，重編程的細(xì)胞表達(dá)指示復(fù)能細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物，所述細(xì) 胞表面標(biāo)記物選自由下列組成的組SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。在又一實(shí)施方案 中，重編程的細(xì)胞表達(dá)復(fù)能基因，所述復(fù)能基因包括但不限于0ct-4、SoX-2和Nanog。在又 一實(shí)施方案中，重編程的細(xì)胞占富集的細(xì)胞群的至少5-10%、10-20%,20-30^^30-40 ^ 40-50 %、50-60 %、60-70 %、70-80 %、80-90 %、90-95 %、96-98 % ；或至少 99 %。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及用于制備本發(fā)明的方法和組合物的試劑盒。該試劑盒尤 其可用于重編程細(xì)胞和產(chǎn)生ES樣細(xì)胞和干細(xì)胞樣細(xì)胞。附圖簡述

圖1是報(bào)道在用丙戊酸(VPA)處理的原代人肺細(xì)胞中Oct-4的上調(diào)的柱形圖。圖2是報(bào)道在用HDAC抑制劑(VPA)處理的原代人肺細(xì)胞中賦予干細(xì)胞樣特征的 幾種基因的上調(diào)的柱形圖。圖3是報(bào)道在用VPA處理的細(xì)胞中Oct-4的第一外顯子中的兩個胞嘧啶脫甲基化 的圖解。圖4A是報(bào)道在成人皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA干擾期 間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對基因Nanog的作用的圖。圖4B是報(bào)道在人新生兒皮 膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA干擾期間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的 對基因Nanog的作用的圖。圖4C是報(bào)道在人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7或 HDACllshRNA干擾期間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對基因Nanog的作用的圖。圖5A是報(bào)道在成人皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA干擾期 間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對基因Oct-4的作用的圖。圖5B是報(bào)道在人新生兒皮 膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA干擾期間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對基因Oct-4的作用的圖。圖5C是報(bào)道在人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7或 HDACllshRNA干擾期間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對基因0ct_4的作用的圖。
圖6是報(bào)道在人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7或HDACllshRNA干擾期間 mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對基因Sox-2的作用的圖。 圖7是報(bào)告在人皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7shRNA干擾期間的mRNA表達(dá)而 測量的對各種HDAC和SIRT基因的作用的圖。圖8是報(bào)道在成人皮膚成纖維細(xì)胞(HDh)、人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞(HDi^n)和人 胎兒皮膚成纖維細(xì)胞(HDFf)中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙干擾期間mRNA表達(dá)的倍 數(shù)改變而測量的對基因Nanog的作用的圖。圖9是報(bào)道在成人皮膚成纖維細(xì)胞(HDh)、人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞(HDi^n)和人 胎兒皮膚成纖維細(xì)胞(HDFf)中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙干擾期間mRNA表達(dá)的倍 數(shù)改變而測量的對基因Oct-4的作用的圖。圖10是報(bào)道在成人皮膚成纖維細(xì)胞(HDh)、人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞(HDi^n)和 人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞(HDFf)中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙干擾期間mRNA表達(dá)的 倍數(shù)改變而測量的對基因Sox-2的作用的圖。圖11是報(bào)道在成人皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙干擾期 間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對多種HDAC基因和SIRT基因的作用的圖。圖12是報(bào)道在人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙干擾 期間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對多種HDAC基因和SIRT基因的作用的圖。圖13是報(bào)道在人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞中如通過在HDAC7和HDACllshRNA雙干 擾期間mRNA表達(dá)的倍數(shù)改變而測量的對多種HDAC基因和SIRT基因的作用的圖。圖14A是報(bào)道在成人皮膚成纖維細(xì)胞中HDAC7a shRNA對HSAC7a和HDACl 1表達(dá) 的作用的圖。報(bào)道了在不存在和存在嘌呤霉素兩種情況下細(xì)胞生長的數(shù)據(jù)。圖14B是報(bào)道在人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞中HDAC7a shRNA對HSAC7a和HDACll 表達(dá)的作用的圖。報(bào)道了在不存在和存在嘌呤霉素兩種情況下細(xì)胞生長的數(shù)據(jù)。圖14C是報(bào)道在人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中HDAC7a shRNA對HSAC7a和HDACll表 達(dá)的作用的圖。圖15A是人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖15B是用DNMTlshRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖15C是用HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖15D是用DNMTl和HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖15E是用DNMTl和HDACllshRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖15F是用HDACll和HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖15G是人胚胎干細(xì)胞的照片。圖16A是人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖16B是用DNMTlshRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖16C是用DNMTl和HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖16D是用DNMTl和HDACllshRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖16E是用HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。
圖16F是用HDACll和HDAC7shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖16G是人胚胎干細(xì)胞的照片。優(yōu)選實(shí)施方案詳述定義除非另外指明，否則本公開內(nèi)容中的數(shù)字范圍是近似的，并且因此可以包括該范 圍之外的值。數(shù)字范圍包括來自以一個單位遞增的下限值和上限值之間的所有值并且包 括下限值和上限值，前提條件是在任何下限值和任何上限值之間存在至少兩個單位的分 隔。作為實(shí)例，如果成分特征、物理特征或其他特征諸如分子量、粘度、熔化指數(shù)等是100至 1，000，則旨在清楚地列舉所有單個的值，例如100、101、102等，和子范圍，例如100至144、 155至170、197至200等。對于含有小于1的值或含有大于1的分?jǐn)?shù)數(shù)字(例如，1. 1、1.5 等)的范圍，一個單位視情況被認(rèn)為是0.0001、0.001、0.01或0.1。對于含有小于10的單 數(shù)字的范圍(例如，1至5)，通常認(rèn)為一個單位是0. 1。這些僅是具體意指的實(shí)例，認(rèn)為在所 列舉的最低值和最高值之間的所有可能的數(shù)值組合均清楚地在本公開內(nèi)容中陳述。在本公 開內(nèi)容中尤其提供的數(shù)字范圍是混合物中組分的相對量和方法中所引用的各種溫度以及 其他參數(shù)范圍。除非明確限制為相反的情況，否則細(xì)胞(“cell”或“cells”)包括任何體細(xì) 胞、胚胎干(EQ細(xì)胞、成體干細(xì)胞、器官特異性干細(xì)胞、核轉(zhuǎn)移(NT)單位以及干樣細(xì)胞 (stem-like cell)。細(xì)胞可以由任何器官或組織獲得。細(xì)胞可以是人或其他動物的。例如， 細(xì)胞可以是小鼠的、豚鼠的、大鼠的、牛的、馬的、豬的、綿羊的、山羊的等。細(xì)胞還可以來自 非人的靈長類?！芭囵B(yǎng)基”或“生長培養(yǎng)基”意指能夠支持細(xì)胞生長的合適的培養(yǎng)基?！胺只币庵冈谂咛グl(fā)育期間細(xì)胞變得在結(jié)構(gòu)和功能上特化的過程?！氨碛^遺傳學(xué)”意指關(guān)于在不改變核苷酸序列的條件下功能上的可遺傳改變的DNA 狀態(tài)。表觀遺傳學(xué)改變可以是由諸如甲基化和脫甲基化等DNA修飾引起的，而沒有任何DNA 核苷酸序列改變。“組蛋白”意指存在于染色體中的一類蛋白質(zhì)分子，它負(fù)責(zé)將DNA壓縮得足以使 DNA適于在核內(nèi)?！敖M蛋白脫乙酰酶抑制劑”和“組蛋白脫乙酰酶的抑制劑”意指能夠與組蛋白脫乙 酰酶相互作用并抑制其酶活性的化合物。“抑制組蛋白脫乙酰酶活性”意指降低組蛋白脫乙 酰酶從合適的底物例如組蛋白或其他蛋白移除乙?；哪芰?。在一些實(shí)施方案中，組蛋白 脫乙酰酶活性的這種降低是至少約10-25 %，在另一實(shí)施方案中，至少約50 %，在其他實(shí)施 方案中，至少約75 %，并且還在其他的實(shí)施方案中，至少約90 %。還在其他實(shí)施方案中，組 蛋白脫乙酰酶活性降低了至少95 %，并且在其他實(shí)施方案中降低至少99 %?！扒玫?knock down)”意指以基因特異性方式阻抑基因的表達(dá)。具有一種或多種 基因被“敲低”的細(xì)胞被稱為敲低生物體或簡單稱為“敲低”。“復(fù)能”意指能夠分化成3胚層細(xì)胞類型或基本組織類型。“復(fù)能基因”意指促使細(xì)胞為復(fù)能的基因。“復(fù)能細(xì)胞培養(yǎng)物”在表現(xiàn)出將它們與胚胎或成體來源的分化的細(xì)胞明顯區(qū)別開 的形態(tài)時(shí)被稱為是“基本上未分化的”。復(fù)能細(xì)胞通常具有高的核/胞質(zhì)比、突出的核仁以及具有差的辨識度的細(xì)胞連接的緊密集落形成，并且容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員識別。認(rèn)識到 未分化的細(xì)胞集落可以被分化的鄰近細(xì)胞環(huán)繞。然而，當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)時(shí)，基本上未 分化的集落繼續(xù)存在，并且在分離培養(yǎng)的細(xì)胞后，未分化的細(xì)胞構(gòu)成了大部分的細(xì)胞。本公 開內(nèi)容中描述的可用的細(xì)胞群含有任何比例的具有這些標(biāo)準(zhǔn)的基本上未分化的復(fù)能細(xì)胞。 基本上未分化的細(xì)胞培養(yǎng)物可以含有至少約20^^40^^60%或甚至80%未分化的復(fù)能細(xì) 胞(以群中總細(xì)胞的百分比計(jì))。“調(diào)節(jié)蛋白”意指調(diào)節(jié)生物過程的任何蛋白，包括正向和負(fù)向的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)蛋白可 以對生物過程具有直接或間接的作用，并且可以直接施加影響或通過參與到復(fù)合體中來施 加影響?！爸鼐幊獭币庵敢瞥酥械谋碛^遺傳學(xué)標(biāo)記，然后建立不同組的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記。 在多細(xì)胞生物體的發(fā)育期間，不同的細(xì)胞和組織獲得不同的基因表達(dá)程序。這些不同的基 因表達(dá)模式表現(xiàn)為實(shí)際上由諸如DNA甲基化、組蛋白修飾和其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白等表觀遺 傳學(xué)修飾調(diào)節(jié)。因此多細(xì)胞生物體中的每種細(xì)胞類型具有獨(dú)特的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，常規(guī)上 認(rèn)為該標(biāo)志在細(xì)胞分化后或退出細(xì)胞周期之后變成“固定的”且不變的。然而，一些細(xì)胞在 正常發(fā)育或某些疾病期間會進(jìn)行主要的表觀遺傳學(xué)“重編程”?！叭堋币庵改軌虬l(fā)育成整個胚胎或器官。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)的 方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為多能的至少一種基因表達(dá)的方 法。在一些實(shí)施方案中，方法包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)；和制備 能夠定向分化成至少一個譜系的重編程的細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及包括下列的方法修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和將細(xì)胞重編程為復(fù) 能或多能的。在又一實(shí)施方案中，修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)包括抑制HDAC的活性。在另一實(shí)施方案中，方法包括抑制HDAC的活性，以及誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能 的至少一種基因表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，方法包括抑制HDAC的活性和制備重編程的細(xì) 胞。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞暴露于抑 制HDAC的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達(dá)；以及選擇細(xì)胞， 其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。復(fù)能基因或多能基因可以被誘導(dǎo)為表達(dá)增加任何倍數(shù)，包 括但不限于 0. 25-0. 5,0. 5-1,1. 0-2. 5,2. 5_5、5_10、10-15、15-20、20-40、40-50、50_100、 100-200,200-500和大于500。在另一實(shí)施方案中，方法包括鋪板分化的細(xì)胞；將所述分化 的細(xì)胞暴露于抑制HDAC的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑；培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及鑒定已被重 編程的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞暴露于誘 導(dǎo)抑制HDAC活性的調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)、活性、或表達(dá)和活性的劑，誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因 的表達(dá)；以及選擇細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。調(diào)節(jié)蛋白的活性或表達(dá)可以增 加任何量，包括但不限于1-5 %,5-10 %、10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 %、 60-70 70-80 80-90 90-95 % 和 95-99 99-200 200-300 300-400 400-500 % 以及大于 500 %。在又一實(shí)施方案中，方法還包括使用針對由復(fù)能基因或多能基因編碼的蛋白或蛋白片段的抗體或針對復(fù)能表面標(biāo)記物的抗體選擇細(xì)胞?？梢允褂萌魏晤愋偷目贵w，包括但 不限于單克隆的、多克隆的、抗體片段、肽模擬物、活性區(qū)域的抗體以及蛋白保守區(qū)域的抗 體。在又一實(shí)施方案中，方法還包括使用由復(fù)能基因或多能基因驅(qū)動的報(bào)道分子或復(fù) 能或多能表面標(biāo)記物選擇細(xì)胞?？梢允褂萌魏晤愋偷膱?bào)道分子，包括但不限于熒光蛋白、 綠色熒光蛋白、青色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、細(xì)菌螢光素酶、水母發(fā)光蛋白、 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、dsRED、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。在又一實(shí)施方案中，方法還包括使用抗性作為選擇標(biāo)記來選擇細(xì)胞，所述抗性包 括但不限于抗生素抗性、殺真菌劑抗性、嘌呤霉素抗性、潮霉素抗性、二氫葉酸還原酶抗 性、胸苷激酶抗性、新霉素抗性(neo)、G418抗性、麥考酚酸抗性(gpt)、博來霉素(zeocin) 抗性蛋白和鏈霉素抗性。在又一實(shí)施方案中，方法還包括比較在將細(xì)胞暴露于抑制HDAC的活性、表達(dá)、或 活性和表達(dá)的劑之前所述細(xì)胞的復(fù)能基因或多能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與用所述劑處理之后 所獲得的復(fù)能基因或多能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。可以比較染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何方面，包括但不 限于常染色質(zhì)、異染色質(zhì)、組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、組蛋白或組蛋白組分的存在和不 存在、組蛋白的定位、組蛋白的排列以及與染色質(zhì)締合的調(diào)節(jié)蛋白的存在或不存在。可以比 較基因任一區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括但不限于增強(qiáng)子元件、激活子元件、啟動子、TATA盒、 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子。在又一實(shí)施方案中，方法包括抑制至少一種HDAC的活性；去甲基化CpG 二核苷酸 中的至少一個胞嘧啶；以及誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，方法包括使細(xì)胞接觸HIDAC抑制劑；抑制HDAC的活性；以及 誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，方法還包括制備重 編程的細(xì)胞。重編程的細(xì)胞可以是復(fù)能或多能的。本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒的HDAC抑制劑可以與任何HIDAC相互作用。例 如，本發(fā)明的HDAC抑制劑可以與來自HDAC的四種已知類之一的HDAC相互作用。本發(fā)明的 HDAC抑制劑可以與I類、II類、III類或IV類的HDAC相互作用。HDAC抑制劑可以與一種 特定類的HDAC、所有類的HDAC或與多類HDAC相互作用，所述多類HDAC包括但不限于I類 和II類；I類和III類；I類和IV類；II類和III類；II類和IV類；III類和IV類；I、II 和III類；II、III和IV類；以及I、II、III和IV類。HDAC抑制劑還可以與不屬于已知類 之一的HDAC相互作用。HDAC抑制劑可以具有不可逆的作用機(jī)制或可逆的作用機(jī)制。HDAC抑制劑可以具 有任何結(jié)合親和力，包括但不限于毫摩爾(mM)、微摩爾(μΜ)、納摩爾(ηΜ)、皮摩爾(ρΜ) 和分摩爾(fentamolar，fM)。優(yōu)選地，這種抑制是特異性的，S卩，組蛋白脫乙酰酶抑制劑降低組蛋白脫乙酰酶從 組蛋白移除乙?；哪芰λ玫臐舛鹊陀谠撘种苿┊a(chǎn)生另一不相關(guān)的生物作用所需的濃 度。優(yōu)選地，組蛋白脫乙酰酶抑制活性所需的抑制劑濃度比產(chǎn)生不相關(guān)的生物作用所需的 濃度低至少2倍、更優(yōu)選低至少5倍，甚至更優(yōu)選低至少10倍，并且最優(yōu)選低至少20倍。在另一實(shí)施方案中，HDAC抑制劑可以通過與含鋅的HDAC催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合而起作 用。具有這種作用機(jī)制的HDAC抑制劑屬于幾組⑴氧肟酸，例如曲古抑菌素A ;(ii)環(huán)四肽；(iii)苯甲酰胺；(iv)親電子的酮；和(ν)化合物的脂肪酸基團(tuán)，例如苯丁酸鹽和丙戊酸。在又一實(shí)施方案中，HDAC抑制劑可針對于sertuin III類HDAC，它們是NAD+依賴 性的，并且包括但不限于煙酰胺、NAD的衍生物、二氫香豆素、萘吡喃酮和2-羥基萘醛。在又一實(shí)施方案中，HDAC抑制劑可以改變非組蛋白效應(yīng)分子的乙?；潭炔亩?增加基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒的HDAC抑制劑不應(yīng)被認(rèn)為是僅作為HDAC 的酶抑制劑起作用。已知大量非組蛋白轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔調(diào)蛋白通過乙?；恍揎?，包括 但不限于ACTR、cMyb、p300、CBP、E2Fl、EKLF、FEN l、GATA、HNF-4、HSP90、Ku70、NF κ B、PCNA、 p53、RB、Runx, SF1、Sp3、STAT、TFIIE、TCF和YYl。可以用本發(fā)明的方法增加參與激活轉(zhuǎn)錄 的被乙?；娜魏无D(zhuǎn)錄因子或蛋白的活性。表I提供了可以充當(dāng)HDAC抑制劑的化合物的代表性列表。表I中“同種型”的含 義是指僅提供了關(guān)于化合物對于特定類的HDAC是否具有偏愛的理解。列出特定同種型或 類的HDAC不應(yīng)解釋為意指化合物僅對該同種型或類具有親和力。本發(fā)明的HDAC抑制劑包 括本文所提及的任何HDAC抑制劑的衍生物和類似物。丁酸或丁酸鹽是被鑒定的首個HDAC抑制劑。然而，毫摩爾濃度的丁酸鹽可能對 HDAC不是特異性的，它還可以抑制核蛋白的磷酸化和甲基化以及DNA甲基化。類似物苯基 丁酸鹽以類似方式起作用。更具體的是曲古抑菌素A(TSA)和trapoxinCTPX)。TPX和TSA 已作為組蛋白脫乙酰酶抑制劑出現(xiàn)。TSA可逆地抑制HDAC酶，而TPX不可逆地結(jié)合并滅活 HDAC酶。與丁酸鹽不同，還沒有報(bào)道TSA或TPX對其他酶系統(tǒng)的非特異性抑制。丙戊酸也抑制組蛋白脫乙酰酶活性。VPA是依據(jù)不同的分子作用機(jī)制而具有多種 生物活性的已知藥物。VPA是抗癲癇藥物。VPA是致畸的。當(dāng)在妊娠期間用作抗癲癇藥物 時(shí)，VPA可以在少數(shù)百分比的出生兒中誘導(dǎo)出生缺陷(神經(jīng)管閉合缺陷和其他畸形)。在小 鼠中，VPA在正確給藥時(shí)在大多數(shù)小鼠胚胎中是致畸的。VPA激活核激素受體(PPAR-δ)。表I.可以充當(dāng)HDAC抑制劑的化合物的代表性列表。
權(quán)利要求
1.一種重編程細(xì)胞的方法，所述方法包括將細(xì)胞群暴露于抑制組蛋白脫乙酰酶的活 性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑；誘導(dǎo)復(fù)能基因的表達(dá)；選擇表達(dá)指示復(fù)能細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo) 記物的細(xì)胞；以及擴(kuò)增所述選擇的細(xì)胞以制備細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇細(xì)胞還包括比較所述細(xì)胞在暴露于所述劑 之前和之后的表型，以及鑒定具有與復(fù)能細(xì)胞一致的表型的細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇細(xì)胞還包括使用針對由復(fù)能基因編碼的蛋 白的抗體或針對細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞表面標(biāo)記物選自由下列組成的組SSEA3、 SSEA4、Tra-1-60 和 Tra-1-81。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括在擴(kuò)增所述細(xì)胞之前，比較所述細(xì)胞在 暴露于所述劑之前存在的復(fù)能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與暴露于所述劑之后獲得的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。
6 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述比較染色質(zhì)結(jié)構(gòu)包括比較組蛋白的乙?；癄顟B(tài)。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述復(fù)能基因選自由下列組成的組0ct-4、SOX-2和Nanog0
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述劑選自由下列組成的組小分子抑制劑、核酸序 列和shRNA構(gòu)建體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述組蛋白脫乙酰酶選自由下列組成的組HDAC1、 HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7A、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、 SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6 和 SIRT7。
10.一種重編程細(xì)胞的方法，所述方法包括將細(xì)胞暴露于抑制HDAC的活性、表達(dá)、或 表達(dá)和活性的第一劑；將所述細(xì)胞暴露于抑制第二調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達(dá)、或表達(dá)和活性的 第二劑，其中所述第二調(diào)節(jié)蛋白具有與HDAC不同的功能；誘導(dǎo)復(fù)能基因的表達(dá)；以及選擇 細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中將所述細(xì)胞同時(shí)暴露于所述第一劑和所述第二劑。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述選擇細(xì)胞包括使用針對由復(fù)能基因編碼的蛋 白的抗體或針對細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體來分離細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細(xì)胞表面標(biāo)記物選自由下列組成的組 SSEA3、SSEA4、Tra-1-60 和 Tra-1-81。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中選擇所述細(xì)胞包括比較所述細(xì)胞在暴露于所述第 一劑和所述第二劑之前和之后的表型。
15.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第一劑和第二劑選自由下列組成的組小分 子抑制劑、核酸序列和shRNA構(gòu)建體。
16.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第二調(diào)節(jié)蛋白選自由下列組成的組組蛋白 脫乙酰酶、組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶、賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫甲基酶、 賴氨酸脫甲基酶、sirtuin和sirtuin激活蛋白。
17.一種富集的重編程的細(xì)胞群，所述重編程的細(xì)胞群根據(jù)包括下列步驟的方法制備 將細(xì)胞群暴露于抑制組蛋白脫乙酰酶的活性、表達(dá)、或活性和表達(dá)的劑；誘導(dǎo)復(fù)能基因的表達(dá)；選擇表達(dá)指示復(fù)能細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞；以及擴(kuò)增所述選擇的細(xì)胞以制備細(xì) 胞群，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。
18.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述重編程的細(xì)胞表達(dá)選自由 下列組成的組的細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA3、SSEA4、Tra-I-60和Tra-I-81。
19.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述復(fù)能基因選自由下列組成 的組0ct-4、Nanog 和 Sox_2。
20.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述重編程的細(xì)胞占所述群的 至少60%。
全文摘要
本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法、組合物和試劑盒。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)的方法。在又一實(shí)施方案中，方法包括用HDAC抑制劑抑制HDAC的活性，并誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程的方法，該方法包括將細(xì)胞暴露于抑制多于一種類型的調(diào)節(jié)蛋白的多于一種的劑。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程的細(xì)胞或富集的重編程的細(xì)胞群，該重編程的細(xì)胞或富集的重編程的細(xì)胞群可以具有ES樣細(xì)胞的特征，它可以再分化或轉(zhuǎn)分化為多種分化的細(xì)胞類型。
文檔編號C12N15/113GK102083981SQ200980120752
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者K·J·埃勒特森, 瓊·S·瑞姆, 瑞秋·A·帕沃爾 申請人:紐珀滕索有限公司