專利名稱：用于促紅細(xì)胞生成素發(fā)酵生產(chǎn)的方法
用于促紅細(xì)胞生成素發(fā)酵生產(chǎn)的方法本發(fā)明涉及用于促紅細(xì)胞生成素(EPO)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的方法。該方法特征在于其 在具有細(xì)胞保留的灌注反應(yīng)器中進(jìn)行，其發(fā)酵方法僅由幾個(gè)經(jīng)選擇的量度和控制參數(shù)來(lái)控 制以在有利的方式下影響所選宿主生物體對(duì)EPO的生產(chǎn)力以及影響EPO產(chǎn)物的質(zhì)量。促紅細(xì)胞生成素，簡(jiǎn)稱ΕΡ0，是在骨髓中刺激紅細(xì)胞形成的糖蛋白。EPO主要在腎 中產(chǎn)生并由該處通過(guò)循環(huán)到達(dá)其靶標(biāo)。在腎衰竭中，受損的腎產(chǎn)生太少EPO或根本不產(chǎn)生 ΕΡ0，導(dǎo)致由骨髓的干細(xì)胞產(chǎn)生太少的紅細(xì)胞。此“腎貧血(renal anemia) ”可通過(guò)施用生 理量的EPO刺激骨髓中紅細(xì)胞的形成來(lái)治療。該EPO的治療作用和用途在如下文獻(xiàn)中有 詳細(xì)描述，例如，Eckardt K. U.，Macdougall I. C.，Lancet 2006，368，947-953，Jelkmann W. ；Physiol. Rev. 1992，72，449-489，Eschbach J. W.等，N. Engl. J. Med.，1987，316，73-78， EP-B 0148605，EP-B-0209539，EP-B-0205564，Huang S. L.，PNAS 1984,2708-2712, Lai, P. H.，等，J. Biol. Chem. 1986，261，3116-3121，and inDietzfelbinger H.等，以及 Manual Supportive Ma β nahmen undsymptomorientierte Therapie, Tumorzentrum Munich, Germany，2001，70-77。用于施用的EPO可從人尿液中獲得或者通過(guò)基因工程方法來(lái)產(chǎn)生。由于人體中僅 含有非常少量的ΕΡ0，從天然來(lái)源分離EPO用于治療用途實(shí)質(zhì)上是不可能的。因此，基因工 程方法提供了對(duì)于大量產(chǎn)生該物質(zhì)唯一的經(jīng)濟(jì)可行途徑。自從1984年鑒定出人促紅細(xì)胞生成素基因，促紅細(xì)胞生成素可重組產(chǎn)生。從九十 年代初開(kāi)始已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種藥物，所述藥物含有在經(jīng)基因重組修飾的真核細(xì)胞中通過(guò)生物 技術(shù)所生產(chǎn)的人促紅細(xì)胞生成素。其中特別是EP-A-0148605和EP-A-205564描述了重組 人促紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)?！巴僖核峄潭?degree of sialylation) ”，即經(jīng)糖鏈末端連接到蛋白的唾液酸 的含量，對(duì)某些蛋白如例如促紅細(xì)胞生成素或者干擾素的效力非常重要。具有較高唾液酸 化程度的蛋白通常具有較高的比活性。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，那些活性特別依賴于其唾液酸化程 度的蛋白如例如ΕΡ0，t-PA(組織血纖維蛋白溶酶原激活劑)或者凝血因子VIII產(chǎn)生于哺 乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，其能夠在比如必要時(shí)對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后糖基化或者唾液酸化。通常， EPO在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生。而后者從前在補(bǔ)加了胎牛血清以及有時(shí) 也補(bǔ)加了牛胰島素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如今其常規(guī)地在無(wú)血清和無(wú)蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這 消除了牛蛋白、牛病毒、牛DNA或其它不希望物質(zhì)的污染風(fēng)險(xiǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些 無(wú)血清和無(wú)蛋白培養(yǎng)基的成分。它們由不同濃度的氨基酸、脂肪酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽和激素 的混合物組成，如例如在EP-Bl 481791和W088/00967A1中所詳述的。此處的培養(yǎng)基對(duì)宿 主細(xì)胞的生長(zhǎng)率、細(xì)胞密度、翻譯和轉(zhuǎn)錄有相當(dāng)?shù)挠绊?，并且因此也特別對(duì)重組產(chǎn)生的蛋白 的糖基化和唾液酸化模式有重要的影響。因此，通常使用各廠商提供的無(wú)血清培養(yǎng)基，例 如MAM-PF2培養(yǎng)基(特別是由Bioconc印t，Allschwil, Swizerland出售的)或者DMEM和 DMEMU12 培養(yǎng)基(例如由 Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Germany 所提供的)。原則上，培養(yǎng)用于生產(chǎn)重組蛋白如例如EPO的宿主細(xì)胞的過(guò)程可區(qū)分為三種在分批方法(batch process)中，在培養(yǎng)的開(kāi)始將培養(yǎng)基和細(xì)胞引入到生物反應(yīng)器中。直到培養(yǎng)結(jié)束，既未添加營(yíng)養(yǎng)物也未從發(fā)酵器中移除細(xì)胞，且僅加入氧氣。一旦一種 或多種底物(substrate)耗盡，將該過(guò)程停止并從發(fā)酵上清中收集產(chǎn)物。該分批方法的變 種是“重復(fù)分批方法”，其涉及在發(fā)酵結(jié)束時(shí)保留部分的培養(yǎng)物體積用于在生物反應(yīng)器中接 種、用新培養(yǎng)基充滿反應(yīng)器以及重新開(kāi)始發(fā)酵過(guò)程。所述分批方法的優(yōu)點(diǎn)是其技術(shù)執(zhí)行簡(jiǎn)單。然而缺點(diǎn)是用于產(chǎn)生重組蛋白的細(xì)胞 的能力一般未充分利用，這是由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的選擇性耗竭(selective depletion) 以及由于對(duì)細(xì)胞有毒的代謝產(chǎn)物的積聚，如例如銨鹽和乳酸鹽。另一個(gè)缺點(diǎn)是分批發(fā)酵器 中積聚的產(chǎn)物始終暴露于同樣也積聚的代謝酶，而這可對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和/或產(chǎn)量有不利的影 響。如在Gramer M. J.等，Biotechnology 1995，13，692-698中所述，這特別適用于“唾液 酸酶”，其能夠從已經(jīng)形成的糖蛋白中移除末端唾液酸，并且作為結(jié)果使所需高度唾液酸化 的糖蛋白產(chǎn)率降低。所述分批方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是生產(chǎn)時(shí)間和循環(huán)總時(shí)間之間不佳的比 率，所述生產(chǎn)時(shí)間由于用于細(xì)胞培養(yǎng)的有限營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)而受到限制(通常大約5至10天)， 而所述循環(huán)總時(shí)間額外還包括對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行裝配、清洗和消毒的時(shí)間(通常大約達(dá)4 天)。第二個(gè)已知的培養(yǎng)方法是連續(xù)方法，其中連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基并且以同種程度移 除發(fā)酵灌含量(fermenter content)。這導(dǎo)致了營(yíng)養(yǎng)物的連續(xù)供應(yīng)，并且同時(shí)移除或稀釋樂(lè) 不希望的代謝產(chǎn)物如生長(zhǎng)抑制物質(zhì)銨鹽和乳酸鹽。因此，通過(guò)這種方法可獲得并且在相對(duì) 長(zhǎng)的時(shí)間段保持較高的細(xì)胞密度。所述連續(xù)方法類型的特別例子包含“透析反應(yīng)器”，通過(guò) 其將高分子量物質(zhì)例如蛋白保留在發(fā)酵器中，同時(shí)可加入低分子量物質(zhì)如底物或者可將主 要廢產(chǎn)物銨鹽和乳酸鹽從系統(tǒng)中移除。在連續(xù)方法的這些優(yōu)點(diǎn)之外，也存在缺點(diǎn)，特別是對(duì) 于被細(xì)胞保留體系(通常難以清洗的膜過(guò)濾器)的污染物污染的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)增加，以及在該 過(guò)程中細(xì)胞物質(zhì)在過(guò)濾器表面的沉積可降低流動(dòng)直至膜被完全阻斷。超聲支持的保留體系 提供了替代方法，其中通過(guò)超聲駐波(ultrasonic standing wave)來(lái)阻止細(xì)胞脫離發(fā)酵反 應(yīng)器而不再需要使用膜過(guò)濾器。灌注反應(yīng)器用各種細(xì)胞保留系統(tǒng)在化合物和蛋白的細(xì)菌生產(chǎn)中的用途是眾所 周知的且也已經(jīng)被描述用于 EP0(BioProcess International 2004，46 ;GorenfIo 等， Biotech. Bioeng. 2002,80,438 ；www. sonosep. com/biosep. htm ；WO 95/01214)。對(duì)于此背景，例如 Wang Μ. D.等，Biotechnoligy and Bioengineering 2002， 77 O)，194-203探討了各種體系，其中將細(xì)胞結(jié)合于大孔珠上，且由于孔而能夠拓展出大的 表面，導(dǎo)致高的細(xì)胞密度。通過(guò)連續(xù)加料新鮮培養(yǎng)基來(lái)供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物，同時(shí)將細(xì)胞覆蓋的珠子 洗至頂部。也可以包裝具有小的聚酯盤(直徑大約1cm)而不是珠的攪拌槽，并使新鮮培 養(yǎng)基連續(xù)地通過(guò)它們(Jixian D.等，Chinese Journal of Biotechnology 1998,13(4), M7-252)。然而這需要細(xì)胞以粘附方式生長(zhǎng)。不考慮拓殖支持物(colonizing support) 的類型和化學(xué)組成，其缺點(diǎn)在于細(xì)胞能夠在其中密集生長(zhǎng)以致于里層不能夠再被適當(dāng)供給 而在那兒拓殖的細(xì)胞停止生產(chǎn)和/或也釋放出不希望的代謝物以至于達(dá)到不能將其充分 地移除的程度，并因此可不利地影響產(chǎn)物質(zhì)量。最后，第三種可能的方法是加料分批發(fā)酵，其包含在僅部分充滿培養(yǎng)基的發(fā)酵器 中開(kāi)始培養(yǎng)，以及在短的生長(zhǎng)期后，一點(diǎn)一點(diǎn)地加入新鮮培養(yǎng)基。這使得比在分批方法中具 有較高的細(xì)胞密度和較長(zhǎng)的過(guò)程時(shí)間成為可能。此方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以通過(guò)加料程度4來(lái)影響細(xì)胞代謝，其可導(dǎo)致產(chǎn)生較少的廢物。與連續(xù)方法相比，此處細(xì)胞的產(chǎn)物在較長(zhǎng)的時(shí) 間段內(nèi)于發(fā)酵器中積聚，由此達(dá)到較高的產(chǎn)物濃度，且這有助于后續(xù)操作。然而，這需要當(dāng) 在發(fā)酵器中若干天時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)品足夠穩(wěn)定而使其不被酶降解或者以另一種方式分解。此方 法的另一個(gè)缺陷是生物反應(yīng)器中的生理?xiàng)l件會(huì)由于所加料的濃縮底物溶液而產(chǎn)生不利的變化。培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要問(wèn)題在于向細(xì)胞供應(yīng)充足的營(yíng)養(yǎng)物，且所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的 降解產(chǎn)物不積聚超過(guò)細(xì)胞生理的臨界極限。動(dòng)物細(xì)胞使用的主要能量來(lái)源是葡萄糖和谷氨 酰胺，其主要降解產(chǎn)物分別為乳酸和銨鹽，在相對(duì)高的濃度下，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝并導(dǎo) 致細(xì)胞死亡(Hassell 等，Applied Biochemistry and Biotechnology 1991，30，29-41)。 因此當(dāng)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，為了達(dá)到較高的細(xì)胞密度和較高的產(chǎn)量，當(dāng)供給細(xì)胞充足量的營(yíng) 養(yǎng)物時(shí)減少乳酸和銨鹽的積聚是有利的。減少?gòu)U產(chǎn)物產(chǎn)生的可能的途徑是以控制的方式加入底物，其也稱作“分解代謝 控制”。這利用了細(xì)胞代謝對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中所提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的依賴。已顯示出谷 氨酰胺和/或葡萄糖的限制性加料導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞中銨鹽和乳酸鹽的產(chǎn)生顯著地減少 (Ljunggren &HaggStrom, Biotechnology andBioengineering 1994，44，808—818)。在其中已經(jīng)通過(guò)以控制方式加入濃縮培養(yǎng)基而調(diào)節(jié)了葡萄糖濃度的加料分批培 養(yǎng)中，在一段時(shí)間后觀察細(xì)胞代謝的變化，其也稱作代謝轉(zhuǎn)換(metabolic shift)。此代謝 轉(zhuǎn)換通過(guò)在若干天內(nèi)限制培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺的濃度來(lái)誘導(dǎo)，且導(dǎo)致較少營(yíng)養(yǎng)物被 細(xì)胞攝取和代謝。隨后，培養(yǎng)基中葡萄糖和谷氨酰胺含量增加，而廢物乳酸鹽和銨鹽的產(chǎn)生 由于經(jīng)減少的消耗而顯著地降低(Zhou等，Biotechnology and Bioengineering 1995,46, 579-587)。所述的代謝轉(zhuǎn)換不僅在雜交瘤細(xì)胞中觀察到，也在細(xì)胞系如SP0、HEK-293, BHK 和CHO中觀察到。代謝轉(zhuǎn)換可達(dá)到超過(guò)IO7細(xì)胞每毫升的細(xì)胞密度，同時(shí)伴隨相對(duì)較長(zhǎng)的方法時(shí)間， 因?yàn)閺U產(chǎn)物乳酸鹽和銨鹽未積聚至不利地調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度。此處重要的是使加料溶 液與細(xì)胞的需要相適應(yīng)以保證達(dá)到代謝轉(zhuǎn)換并阻止特定營(yíng)養(yǎng)物的耗盡和過(guò)量積聚以及隨 之發(fā)生的滲透度的強(qiáng)烈增加(Xie 和 Wang，Biotechnology and Bioengineering，1994，43， 1175-1189，以及 Biotechnology and Bioengineering, 1996，51，725-729)。進(jìn)一步重要的 是仍然向細(xì)胞提供足夠的葡萄糖作為重組蛋白糖基化的底物。為使所供應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物濃度能被調(diào)節(jié)為適應(yīng)細(xì)胞消耗，通常使用復(fù)雜的方法以決定 細(xì)胞的當(dāng)前消耗并隨后根據(jù)需要調(diào)節(jié)加料比例。這特別包括測(cè)量葡萄糖濃度，例如通過(guò)流 動(dòng)注射分析(flow injection analysis)，或者測(cè)量細(xì)胞的氧氣消耗。因此，例如，US6180401公開(kāi)了加料分批細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中連續(xù)測(cè)量葡萄糖濃度 并通過(guò)將加料作為所測(cè)數(shù)據(jù)的函數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，來(lái)使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度保持在一定范圍 內(nèi)。也根據(jù)US 2002/0099183的教導(dǎo)，葡萄糖加料的比率根據(jù)葡萄糖濃度來(lái)確定，由此使培 養(yǎng)基中所述葡萄糖濃度保持在一個(gè)特定范圍內(nèi)。EP-A-1036179在加料分批方法的基礎(chǔ)上描述了根據(jù)需要作為培養(yǎng)基中葡萄糖濃 度的函數(shù)來(lái)添加營(yíng)養(yǎng)物。WO 97/33973公開(kāi)了培養(yǎng)方法，其涉及在培養(yǎng)基導(dǎo)電性的基礎(chǔ)上檢測(cè)帶電代謝產(chǎn) 物的產(chǎn)生，并相應(yīng)調(diào)節(jié)加料比率。
US 5912113描述了微生物的發(fā)酵方法，其涉及每次在培養(yǎng)基中碳源耗盡時(shí)就進(jìn)行 加料，并且作為結(jié)果在培養(yǎng)基中測(cè)量到增加了的PH或增加了的溶解氧濃度。除了技術(shù)過(guò)程參數(shù)例如如上所討論的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)(以培養(yǎng)基組成的方式)之外， 可以表示為不同生長(zhǎng)速率、生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞活力、糖基化和唾液酸化的翻譯后處理的細(xì)胞 系特異性質(zhì)，在獲得的EPO產(chǎn)物質(zhì)量和發(fā)酵方法的總生產(chǎn)力方面也發(fā)揮了重要作用。例如， 如在Lloyd D.R.等，Cytotechnology 1999，30，49-57中描述的，已知根據(jù)生產(chǎn)宿主細(xì)胞所 處的生命周期階段，細(xì)胞代謝可有本質(zhì)不同，且作為本方法中的結(jié)果，可以不同的量和質(zhì)量 產(chǎn)生ΕΡ0，特別是對(duì)于糖基化和唾液酸化的度而言。由于在真核細(xì)胞中EPO的發(fā)酵生產(chǎn)因所述復(fù)雜方法、通常發(fā)酵上清中比較低的產(chǎn) 物濃度、以及具有高價(jià)格組分的無(wú)蛋白和無(wú)血清培養(yǎng)基的使用而很昂貴，因此對(duì)更有效生 產(chǎn)方法的開(kāi)發(fā)具有相當(dāng)?shù)闹匾?。因此本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是開(kāi)發(fā)用于促紅細(xì)胞生成素發(fā)酵生產(chǎn)的方法，與現(xiàn)有 技術(shù)的方法相比，該方法在過(guò)程管理的簡(jiǎn)單性方面和高質(zhì)量促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)量方面均 具有優(yōu)勢(shì)。所獲得的EPO應(yīng)該滿足所有的官方標(biāo)準(zhǔn)的要求以及特別要滿足同種型組成和糖 基化及唾液酸化模式的所有需要(Ph. Eur. 04/2002 :1316)。該技術(shù)問(wèn)題由用于促紅細(xì)胞生成素連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的方法來(lái)解決，該方法包含在具 有細(xì)胞保留的灌注反應(yīng)器中培養(yǎng)真核產(chǎn)EPO細(xì)胞，其中反應(yīng)器中的葡萄糖濃度通過(guò)培養(yǎng)基 的灌注比率來(lái)調(diào)節(jié)，以及反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)量通過(guò)細(xì)胞保留的比率來(lái)調(diào)節(jié)，在每種情況其 均在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)。在有利的情況下，用于促紅細(xì)胞生成素發(fā)酵生產(chǎn)的該創(chuàng)造性連續(xù)方法包含以合適 的方式在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)調(diào)節(jié)a)作為發(fā)酵反應(yīng)器中葡萄糖濃度(作為測(cè)量參數(shù))函數(shù)的培養(yǎng)基灌注比率(作為 控制參數(shù))，和b)作為發(fā)酵反應(yīng)器中細(xì)胞密度(作為測(cè)量參數(shù))函數(shù)的細(xì)胞保留裝置的細(xì)胞保留 比率(作為控制參數(shù))。作為b)的替代或與b)相結(jié)合，也可能根據(jù)需要間歇式地將給定量的含細(xì)胞的培 養(yǎng)基的從生物反應(yīng)器中輸出并且以方式在反應(yīng)器中達(dá)到特定的細(xì)胞密度。其他相關(guān)過(guò)程參數(shù)例如例如pH、溫度、氧分壓(oxygen partial pressure)、攪拌 速度和供應(yīng)的培養(yǎng)基的組成優(yōu)選在整個(gè)發(fā)酵期間保持恒定。所述方法將增加促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)量和產(chǎn)物質(zhì)量的各種措施以新的方式結(jié) 合(1)灌注確保細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物均被持續(xù)輸出且新鮮營(yíng)養(yǎng)物被持續(xù)供應(yīng)，從而在 生物反應(yīng)器中達(dá)到非常高的細(xì)胞密度以及使細(xì)胞在非常長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)有生產(chǎn)力。(2)為減少通常在灌注方法中非常高的昂貴培養(yǎng)基的消耗，以及為使在經(jīng)濟(jì)改善 的生產(chǎn)方法成為可能，進(jìn)一步選擇灌注的比率以使培養(yǎng)物上清中的葡萄糖含量首先不下降 到低于有效細(xì)胞生長(zhǎng)所需的下限，而其次以此方式限制葡萄糖含量使代謝轉(zhuǎn)換在細(xì)胞代謝 中發(fā)生，且毒性代謝物乳酸鹽和銨鹽僅以減少的量產(chǎn)生并因而在灌注期間需要用僅僅小量 的新鮮培養(yǎng)基來(lái)輸出。(3)通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)可控制細(xì)胞保留系統(tǒng)的細(xì)胞保留比率和/或通過(guò)重復(fù)輸出給定6量的含細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)而可以在發(fā)酵溶液中產(chǎn)生一組細(xì)胞，所述一組細(xì)胞具有比例增加了 的那些生長(zhǎng)還未穩(wěn)定但仍在指數(shù)生長(zhǎng)期并且能夠以特定方式產(chǎn)生符合官方標(biāo)準(zhǔn)的高質(zhì)量 EPO的細(xì)胞。所提到的措施，設(shè)定了合適的細(xì)胞保留比率并規(guī)律地輸出給定量的含細(xì)胞培養(yǎng)基 以及同時(shí)設(shè)定了合適的灌注比率，協(xié)同發(fā)揮作用，并因此可令人驚奇地通過(guò)方法在極其長(zhǎng) 的時(shí)間段內(nèi)以很高的產(chǎn)量獲得促紅細(xì)胞生成素，所述方法對(duì)于一個(gè)連續(xù)過(guò)程來(lái)說(shuō)，是非常 簡(jiǎn)單且在技術(shù)上能容易實(shí)現(xiàn)，其促紅細(xì)胞生成素具有極高比例滿足藥物法律要求的ΕΡ0，特 別是對(duì)于其糖基化和唾液酸化的程度以及同種型的分布而言。根據(jù)本發(fā)明，葡萄糖濃度和細(xì)胞數(shù)量可連續(xù)地或者在特定時(shí)間點(diǎn)測(cè)量和/或監(jiān) 測(cè)。優(yōu)選是連續(xù)調(diào)節(jié)葡萄糖濃度和細(xì)胞數(shù)量。葡萄糖濃度通過(guò)灌注比率來(lái)調(diào)節(jié)，即通過(guò)添 加作為發(fā)酵反應(yīng)器中葡萄糖濃度函數(shù)的含葡萄糖的新鮮培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。在如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的的優(yōu)選的方法中，將培養(yǎng)物上清中的葡萄糖濃度調(diào) 節(jié)為在0. 05至1. 5g/l的范圍內(nèi)，并將細(xì)胞數(shù)量調(diào)節(jié)為在0. 5 X IO7至5. 0 X IO7細(xì)胞/ml的 范圍內(nèi)。進(jìn)一步優(yōu)選真核產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞和特別優(yōu)選 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，使用可優(yōu)選由連續(xù)調(diào)節(jié)控制的超聲細(xì)胞保留系統(tǒng)來(lái)保留 細(xì)胞。進(jìn)一步優(yōu)選過(guò)程參數(shù)pH、溫度、氧分壓、攪拌速度和培養(yǎng)基組成在整個(gè)發(fā)酵期間恒 定保持在技術(shù)偏差范圍內(nèi)。在本發(fā)明方法特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，生產(chǎn)力至少是10、優(yōu)選至少是20、更優(yōu)選 至少是25、和非常特別優(yōu)選至少是30mg促細(xì)胞生成素/1發(fā)酵上清。平均生產(chǎn)能力優(yōu)選至 少是10、優(yōu)選至少是15mg促細(xì)胞生成素/1發(fā)酵上清。進(jìn)一步優(yōu)選每細(xì)胞和每天的平均比生產(chǎn)力是至少0. 5pg、更優(yōu)選至少1. Opg、和特 別優(yōu)選至少1. 2pg、和非常特別優(yōu)選至少1. 4pg的促紅細(xì)胞生成素。本發(fā)明的方法使用的細(xì)胞的平均活力是至少70%、優(yōu)選至少75%、特別優(yōu)選至少 80%、進(jìn)一步優(yōu)選至少90%、和非常特別優(yōu)選至少95%。進(jìn)行本發(fā)明方法優(yōu)選在發(fā)酵期間灌注的比例在0. 5和3之間、優(yōu)選在1和2. 5之 間和特別優(yōu)選在1. 5和2. 0之間。根據(jù)本發(fā)明方法有利的是在至少10、優(yōu)選至少20、特別優(yōu)選至少30天、和非常特 別優(yōu)選至少40天的期間進(jìn)行。在本方法進(jìn)一步的實(shí)施方案中，優(yōu)選將培養(yǎng)物上清中的葡萄糖濃度調(diào)節(jié)為在0. 25 至1. 25g/l、和特別優(yōu)選在0. 5至1. Og/Ι的范圍內(nèi)。生物反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)選被調(diào)節(jié)為在1.0X IO7至4. OX IO7細(xì)胞/ml，和特別 優(yōu)選在1. 5 X IO7至3. OX IO7細(xì)胞/ml發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。本發(fā)明的詳細(xì)描述(最優(yōu)實(shí)施方案)本發(fā)明涉及用于促紅細(xì)胞生成素連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的方法，其中將真核的產(chǎn)EPO細(xì)胞 在具有細(xì)胞保留的灌注反應(yīng)器中培養(yǎng)，其中通過(guò)灌注比率來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)物上清中的葡萄糖濃 度以及通過(guò)細(xì)胞保留裝置的細(xì)胞保留比率和/或有規(guī)律地輸出給定量的含細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，在每種情況中均在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)。在用于促紅細(xì)胞生成素發(fā)酵生產(chǎn)的連續(xù)方法中，優(yōu)選用CHO細(xì)胞的手段，在具有 連續(xù)可調(diào)的超聲細(xì)胞保留系統(tǒng)的灌注反應(yīng)器中，通過(guò)以適宜的方式根據(jù)本發(fā)明將下述參數(shù) 調(diào)節(jié)至在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)另外的值a)作為發(fā)酵反應(yīng)器中葡萄糖濃度函數(shù)(作為測(cè)量參數(shù))的培養(yǎng)基的灌注比率(作 為控制參數(shù))，和b)作為發(fā)酵反應(yīng)器中細(xì)胞密度(作為測(cè)量參數(shù))的函數(shù)的細(xì)胞保留裝置的細(xì)胞保 留比率(作為控制參數(shù))以在發(fā)酵溶液中獲得一組細(xì)胞，所述一組細(xì)胞具有比例增加了的那些生長(zhǎng)還未穩(wěn) 定但仍在指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。這些細(xì)胞以特定方式而能夠產(chǎn)生符合官方標(biāo)準(zhǔn)的高質(zhì)量ΕΡ0。設(shè)定了單一的細(xì)胞保留比率同時(shí)設(shè)定了適宜的灌注比率的兩種措施協(xié)同作用，并 且作為結(jié)果在過(guò)程中可令人驚奇地獲得高達(dá)到30g/l發(fā)酵上清的EPO產(chǎn)量，所述過(guò)程對(duì)于 一個(gè)連續(xù)方法來(lái)說(shuō)是令人驚奇地簡(jiǎn)單并且在技術(shù)上容易實(shí)現(xiàn)，其中EPO具有極其高比例的 滿足藥物的法律要求的ΕΡ0，特別是對(duì)于其糖基化和唾液酸化程度和同種型的分布而言。通過(guò)調(diào)節(jié)灌注比率，已經(jīng)證明培養(yǎng)物上清中在0.05至1.5g/l、優(yōu)選在0.25至 1. 25g/l、和特別優(yōu)選在0. 5至1. Og/Ι的葡萄糖含量有利于本CHO細(xì)胞系。根據(jù)反應(yīng)器中 葡萄糖含量的測(cè)量來(lái)控制灌注比率。與此相結(jié)合，通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)超聲細(xì)胞保留和有規(guī)律地 輸出給定量的含細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)將反應(yīng)器中的細(xì)胞密度維持在0. 5X IO7至5. OX IO7細(xì)胞/ ml的范圍內(nèi)。進(jìn)一步優(yōu)選的是細(xì)胞密度在1.0X IO7至4. OX IO7細(xì)胞/ml以及特別優(yōu)選細(xì) 胞密度在1. 5 X IO7至3. 0 X IO7細(xì)胞/ml。通過(guò)反應(yīng)器中的細(xì)胞密度測(cè)量來(lái)控制這些參數(shù) 調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明，所有其他相關(guān)過(guò)程參數(shù)如例如pH、溫度、氧分壓、攪拌速度和培養(yǎng)基 組成，優(yōu)選在整個(gè)發(fā)酵期間內(nèi)保持恒定。優(yōu)選在無(wú)血清和無(wú)蛋白的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些無(wú)血清和 無(wú)蛋白的培養(yǎng)基的成分。它們由不同濃度的氨基酸、脂肪酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽和激素的混合 物組成，如例如在EP-Bl 481791和W088/00967A1中所詳述的。此處的培養(yǎng)基對(duì)宿主細(xì)胞的 生長(zhǎng)速率、細(xì)胞密度、翻譯和轉(zhuǎn)錄有相當(dāng)?shù)挠绊?，并因此也特別對(duì)重組產(chǎn)生的蛋白的糖基化 和唾液酸化模式有相當(dāng)?shù)挠绊憽１景l(fā)明使用由各種廠商提供的無(wú)血清培養(yǎng)基，例如MAM-PF2 培養(yǎng)基(特別是由Bioconc印t，Allschwil，Swizerland出售的)、DMEM和DMEMU12培養(yǎng)基 (例如由 Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Germany 提供的)或 HyQPF CHO Liquid Soy 培 養(yǎng)基(特別是由 HyClone/Perbio，Bonn, Germany 提供的)。根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的EPO優(yōu)選是由真核細(xì)胞產(chǎn)生的重組人促紅細(xì)胞生成素。所 述的重組EPO優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生，特別優(yōu)選在人細(xì)胞和非常特別優(yōu)選在CHO細(xì)胞 中產(chǎn)生，如例如在EP-A-0205564和EP-A-0148605中所一般性地描述的。對(duì)本發(fā)明目的的促紅細(xì)胞生成素(EPO)是指能夠刺激骨髓中紅細(xì)胞產(chǎn)生的以及 能通過(guò)如European Pharmacopoeia (Ph. Eur. ；01/2002 :1316)中所述的測(cè)定法(在紅細(xì)胞 增多的或正常紅細(xì)胞的小鼠中確定活性)而毫無(wú)疑義地鑒定為促紅細(xì)胞生成素的任何蛋 白。該EPO可以是人野生型促紅細(xì)胞生成素或其具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或添加 的變體。如果其是EPO的變體，則優(yōu)選由于氨基酸取代、缺失或添加而與人野生型促紅細(xì)胞生成素僅在1至20、優(yōu)選僅在1至15、特別優(yōu)選僅在1至10和非常特別優(yōu)選僅在1至5個(gè) 氨基酸位點(diǎn)上不同的所述變體。實(shí)施例將包含0. 44 X IO6細(xì)胞/ml的CHO細(xì)胞培養(yǎng)溶液以101的體積通過(guò)接種而引入到 裝備了 Bios印50 (Applikon)的101灌注反應(yīng)器(Applikon)中并保持3天同時(shí)維持培養(yǎng) 參數(shù)。在第4天，開(kāi)始0.25倍灌注。在每種情況下以0.25倍至最大2. 5倍的步驟順次提 高灌注比率，并隨后根據(jù)在每種情況下測(cè)定的葡萄糖濃度來(lái)將葡萄糖濃度設(shè)定在目標(biāo)范圍 內(nèi)(0. 5-1. 2g/l)。通過(guò)調(diào)適超聲裝置的細(xì)胞保留比率和通過(guò)輸出相應(yīng)量的含細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái) 設(shè)定細(xì)胞數(shù)量的目標(biāo)范圍。其它發(fā)酵條件如下接種物0.44X IO6 細(xì)胞/ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)自HyClone/Perbio 的 HyQPF CHO Liquid Soy反應(yīng)器容積101pH 7. 2溫度37°C氧分壓；35%攪拌速度200rpm細(xì)胞保留Bios印50發(fā)酵時(shí)間47天使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基富含蛋白水解產(chǎn)物(來(lái)自Becton Dickinson的hastolate，來(lái) 自 Kerry Bio Science 的 HyPEP SR3)和痕量元素(來(lái)自 Lonza 的 CHO 4A TE Sock)。該發(fā)酵是關(guān)于EPO含量分析參數(shù)、葡萄糖含量、谷氨酰胺含量、有活力的細(xì)胞含量 (絕對(duì)的和相對(duì)的)、細(xì)胞保留和灌注而進(jìn)行記錄的。數(shù)據(jù)在圖1至4中總結(jié)。在發(fā)酵過(guò)程中，收集了包含總量12g粗EPO的7761。平均生產(chǎn)力是15 μ g/ml其 平均細(xì)胞數(shù)量是1. 6 X IO7細(xì)胞/ml，以及最大的細(xì)胞數(shù)量是2. 6 X IO7細(xì)胞/ml其具有超過(guò) 30 μ g/ml的最大生產(chǎn)力。每個(gè)細(xì)胞每天的比生產(chǎn)力是1.4pg以及平均灌注比率是1.9。細(xì) 胞的活力在76和98%之間。通過(guò)Bios印系統(tǒng)的手段的平均細(xì)胞保留是85% (7-97% )0通過(guò)過(guò)濾將產(chǎn)生的收獲物制備為無(wú)細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的處理 和純化方法，其由3至4個(gè)色譜步驟組成。結(jié)果表明本發(fā)明方法能夠產(chǎn)生令人驚奇地高產(chǎn)量的促紅細(xì)胞生成素，其具有極高比例滿足藥物法律要求的ΕΡ0，特別是對(duì)于其糖基化和唾液酸化的程度和同種型的分布而 、曰ο


圖1分別描述了通過(guò)本發(fā)明方法獲得的培養(yǎng)物上清中葡萄糖濃度和EPO生產(chǎn)力 (yg ΕΡΟ/ml)的時(shí)間進(jìn)程。圖2描述了根據(jù)本發(fā)明的有活力細(xì)胞數(shù)量(vit. zz)的時(shí)間進(jìn)程和培養(yǎng)物上清中 EPO生產(chǎn)力的時(shí)間進(jìn)程以及灌注的時(shí)間進(jìn)程。圖3描述了培養(yǎng)物上清中有活力的細(xì)胞相對(duì)于總細(xì)胞的百分比的時(shí)間進(jìn)程和通9過(guò)本發(fā)明的方法所保留細(xì)胞的百分比的時(shí)間進(jìn)程。 圖4分別描述了通過(guò)本方面的方法獲得的培養(yǎng)物上清中乳酸鹽濃度和谷氨酸鹽 濃度的時(shí)間進(jìn)程。
權(quán)利要求
1.一種用于連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其中真核產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞在 被保留的同時(shí)在灌注反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，特征在于通過(guò)培養(yǎng)基的灌注比率來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)器中 的葡萄糖濃度以及通過(guò)細(xì)胞保留比率來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)量，每種情況下均在預(yù)設(shè)區(qū) 域內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，特征在于a)培養(yǎng)基的灌注比率作為反應(yīng)器中葡萄糖濃度的函數(shù)在預(yù)設(shè)的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)，和b)細(xì)胞保留裝置的細(xì)胞保留比率作為反應(yīng)器中細(xì)胞密度的函數(shù)在預(yù)設(shè)的范圍內(nèi)進(jìn)行 調(diào)節(jié)，和/或間歇式地通過(guò)輸出給定量的含細(xì)胞培養(yǎng)基到反應(yīng)器外而調(diào)節(jié)反應(yīng)器中特定的 細(xì)胞密度。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，特征在于使用真核產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞的連續(xù)發(fā) 酵方法產(chǎn)生優(yōu)選為野生型人促紅細(xì)胞生成素變體的促紅細(xì)胞生成素，所述變體優(yōu)選具有不 超過(guò)10個(gè)、特別優(yōu)選不超過(guò)5個(gè)氨基酸取代、缺失或添加，以及非常特別優(yōu)選具有不超過(guò)1 個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的變體。
4.如權(quán)利要求1至3所述的方法，特征在于將培養(yǎng)物上清中的葡萄糖濃度調(diào)節(jié)為在 0. 05至1.5g/l的范圍內(nèi)，以及將細(xì)胞數(shù)量調(diào)節(jié)為在0.5 X IO7至5. OX IO7細(xì)胞/ml的范圍 內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1至4所述的方法，特征在于所述真核產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞是哺乳動(dòng) 物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞，和特別優(yōu)選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，特征在于用超聲細(xì)胞保留系統(tǒng)來(lái)保留細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，特征在于發(fā)酵溶液包含細(xì)胞群，該細(xì)胞群具有 相對(duì)比例增加了的仍在指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的方法，特征在于過(guò)程參數(shù)pH、溫度、氧分壓、攪拌速 度和加料的培養(yǎng)基組成在整個(gè)發(fā)酵期間保持恒定。
9.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法，特征在于生產(chǎn)力至少是10，優(yōu)選至少是20，更 優(yōu)選至少是25，和非常特別優(yōu)選至少是30mg促細(xì)胞生成素/1發(fā)酵上清。
10.如權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的方法，特征在于每細(xì)胞和每天的平均比生產(chǎn)力是至 少0. 5pg，優(yōu)選至少1. Opg，特別優(yōu)選至少1. 2pg，和非常特別優(yōu)選至少1. 4pg的促紅細(xì)胞生 成素。
11.如權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法，特征在于細(xì)胞平均活力是至少70%，優(yōu)選 至少75 %，特別優(yōu)選至少80 %，進(jìn)一步優(yōu)選至少90 %，和非常特別優(yōu)選至少95 %。
12.如權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的方法，特征在于在發(fā)酵期間的灌注比率在0.5至 3之間，優(yōu)選在1至2. 5之間和特別優(yōu)選在1. 5至2. 0之間。
13.如權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的方法，特征在于其在至少10天，優(yōu)選至少20天， 特別優(yōu)選至少30天，和非常特別優(yōu)選至少40天的期間進(jìn)行。
14.如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的方法，特征在于培養(yǎng)物上清中的葡萄糖濃度被調(diào) 節(jié)為在0. 25至1. 25g/l的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0. 5至1. Og/Ι的范圍內(nèi)。
15.如權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的方法，特征在于發(fā)酵反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)量被調(diào) 節(jié)為在1. 0 X IO7至4. 0 X IO7細(xì)胞/ml發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，優(yōu)選被調(diào)節(jié)為在1. 5 X IO7至 3. 0 X IO7細(xì)胞/ml發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于促紅細(xì)胞生成素的發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)的方法，其中在保留細(xì)胞的同時(shí)在灌注反應(yīng)器中培養(yǎng)真核產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞，通過(guò)灌注比率來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)物上清中的葡萄糖濃度以及通過(guò)細(xì)胞保留比率和/或從生物反應(yīng)器中在預(yù)設(shè)區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)移出給定量的含細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102057053SQ200980120765
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月4日
發(fā)明者C·比爾, D·朔波爾-柯尼希, D·賴歇特, F-R·孔茨, L·法貝爾, M·辛霍費(fèi)爾-沃夫拉, R·漢科, W·奧伊爾, W·維南德 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限公司