專利名稱：包含具有與非纖維素物質(zhì)降低的親和力的纖維素酶變體的組合物和方法
包含具有與非纖維素物質(zhì)降低的親和力的纖維素酶變體的組合物和方法I.關(guān)于在聯(lián)邦贊助的研究和研發(fā)中產(chǎn)生的發(fā)明的權(quán)利的陳述本發(fā)明是在政府資助下產(chǎn)生的，具有能源部授予的條件授予編號 DE-FC36-08G018078。政府對本發(fā)明享有一定權(quán)利。II.相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2008年6月6日提交的美國臨時申請?zhí)?1/059，506的權(quán)益，其通過 引用整合到本文中。III.領(lǐng)域本發(fā)明涉及酶，特別是纖維素酶變體。還描述了編碼纖維素酶變體的核酸，包含纖 維素酶變體的組合物，鑒別其它有效的纖維素酶變體的方法，以及使用組合物的方法。IV.背景纖維素和半纖維素是由光合作用產(chǎn)生的最豐富的植物材料。它們可以被多種微生 物(例如，細菌、酵母和真菌)降解并用作能源，所述微生物產(chǎn)生能夠?qū)⒍嗑鄣孜锼鉃閱?體糖的胞外酶(Aro等人，J Biol Chem, 276 =24309-24314,2001) 由于不可再生來源途徑 的限制，纖維素成為主要的可再生能量來源的可能性是極大的(Krishna等人，Bioresource Tech, 77 :193-196,2001)。通過生物學(xué)過程有效的利用纖維素是克服食物、飼料和燃料短缺 的一種方法(Ohmiya 等人，Biotechnol Gen Engineer Rev, 14 :365-414,1997)。纖維素酶是水解纖維素(β-1，4_葡聚糖或β D-糖苷連接)，導(dǎo)致葡萄糖、纖維 二糖、纖維寡糖等形成的酶。纖維素酶傳統(tǒng)上分為三大類內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4) (“EG”)、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC 3.2. 1.91) ( “CBH”)和β-葡糖苷酶 (β-D-葡糖苷葡糖水解酶，EC 3.2. 1.21) ( “BG”) (Knowles 等人，TIBTECH 5 =255-261, 1987 ；和 Schulein, Methods Enzymol，160 :234-243,1988)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用在 纖維素纖維的無定形部分上，而纖維二糖水解酶還能夠降解結(jié)晶纖維素(Nevalainen和 Penttila, Mycota, 303-319，1995)。因此，使結(jié)晶纖維素有效溶解需要纖維素酶系統(tǒng)中存 在纖維二糖水解酶(Suurnakki等人，Cellulose 7 189-209，2000)。β -葡糖苷酶的作用 是從纖維二糖、纖維寡糖和其他葡糖苷中釋放出D-葡萄糖單元(Freer，J Biol Chem, 268 9337-9342，1993)。已知多種細菌、酵母和真菌生產(chǎn)纖維素酶。一些真菌生產(chǎn)完整的纖維素酶系統(tǒng)，所 述系統(tǒng)能夠降解結(jié)晶形態(tài)的纖維素，使得通過發(fā)酵可以方便的大量生產(chǎn)纖維素酶。由于許 多酵母，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)缺少水解纖維素的能力，因此絲狀真 菌扮演了特殊的角色(參見例如,Wood 等人，Methods in Enzymology，160 :87_116，1988)。CBH、EG和BG的真菌纖維素酶分類可以進一步擴展至在每個分類中包括多個組 分。例如，已經(jīng)從多種真菌來源中分離出多個CBH、EG和BG，包括里氏木霉(Trichoderma reesei)(也稱為紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))，其含有以下已知基因兩種CBH，即 CBHI ( “CBH1”)禾口 CBHII ( “CBH2”)；至少 8 種 EG，即 EG I,EG II,EG III、EGIV、EGV、EGVI、 EGVII 和 EGVIII ；以及至少 5 種 BG，即 BG1、BG2、BG3、BG4 和 BG5。EGIV.EGVI 和 EGVIII 也具有木葡聚糖酶的活性。為了將結(jié)晶纖維素有效轉(zhuǎn)化為葡萄糖，需要完整的纖維素酶系統(tǒng)，其包括來自 CBH、EG和BG分類中的每種的組分，以及水解結(jié)晶纖維素時較不有效的分離組分(Filho等 人，Can J Microbiol，42 :1-5,1996)。在來自不同分類的纖維素酶組分之間已觀察到協(xié)同 關(guān)系。特別是EG類纖維素酶和CBH類纖維素酶協(xié)同的相互作用，更有效的降解纖維素。本領(lǐng)域已知出于增強去垢劑組合物的清潔能力、用作軟化劑、用于改善棉織物的 觸感和外觀等目的，纖維素酶在處理紡織品時是有效的(Kumar等人，TextiIe Chemist and Colorist, 29 =37-42,1997)。已經(jīng)描述了具有改善的清潔性能(美國專利號4，435，307 ；和 英國申請?zhí)?，095，275和2，094，826)的，和用于處理織物來改善紡織品的觸感和外觀(美 國專利號5，648，263,5, 691，178和5，776，757 ；英國申請?zhí)?，358, 599)的含纖維素酶的去 垢劑組合物。因此，在真菌和細菌中生產(chǎn)的纖維素酶已受到了極大關(guān)注。特別是，木霉屬物 禾中(Trichoderma spp)(例如長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)或里氏木霉)的 發(fā)酵已表現(xiàn)出產(chǎn)生能夠降解結(jié)晶形態(tài)的纖維素的完整纖維素酶系統(tǒng)。雖然之前已描述過纖維素酶組合物，仍然需要新的和改良的纖維素酶組合物。改 良的纖維素組合物可用于家用去垢劑、紡織品處理、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和造紙。表現(xiàn)出改善的性能 的纖維素酶是特別令人感興趣的。V.概述本發(fā)明涉及經(jīng)修飾降低了與非纖維素物質(zhì)結(jié)合的纖維素酶變體。通常，在存在非 纖維素物質(zhì)時，與野生型纖維素酶相比，纖維素酶變體具有增加的纖維素分解活性。在一些 實施方案中，與野生型纖維素酶相比，纖維素酶變體具有減少的凈電荷(即，更負)。在一些 實施方案中，纖維素酶變體具有比野生型纖維素酶更少的正電荷。在一些實施方案中，纖維 素酶通過去除一個或多個正電荷而被修飾。在一些實施方案中，纖維素酶通過添加一個或 多個負電荷而被修飾。在一些實施方案中，纖維素酶通過去除一個或多個正電荷且添加一 個或多個負電荷而被修飾。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及纖維二糖水解酶I(CBHl)或纖維二糖水解酶 II (CBffi)變體。在一些實施方案中，纖維素酶變體是具有纖維素酶活性的成熟形態(tài)，其在選 自 63、77、129、147、153、157、161、194、197、203、237、239、247、254、281、285、288、289、294、 327、339、344、356、378和382的一個或多個位置具有取代，其中位置是通過與氨基酸序列 為SEQ ID NO :3的參照(例如，野生型紅褐肉座菌CBH2)纖維素酶相對應(yīng)來編號的，并且 其中在一個或多個位置的取代導(dǎo)致纖維素酶變體與參照纖維素酶相比具有更負的凈電荷。 在一些實施方案中，通過去除了一個或多個正電荷來修飾CBH2，在一些實施方案中這需要 用中性氨基酸替換賴氨酸或精氨酸(例如，通過N或Q或其他中性殘基替換K或R)。在一 些實施方案中，通過添加了一個或多個負電荷來修飾CBH2，在一些實施方案中這需要用帶 負電荷的氨基酸替換中性氨基酸(例如，通過D或E替換N或Q或其他中性殘基)。在一 些實施方案中，通過去除一個或多個正電荷且添加一個或多個負電荷來修飾CBH2，在一些 實施方案中這需要用帶負電荷的氨基酸替換賴氨酸或精氨酸(例如，通過D或E替換K或 R)。一般，與具有SEQ ID N0:3氨基酸序列的野生型紅褐肉座菌CBH2相比，CBH2變體在存 在木質(zhì)素的條件下具有增加的纖維素分解活性。本發(fā)明還提供了在成熟形態(tài)的CBH2中包 含一個或多個取代的CBH2變體，所述取代選自KU9E、K157E、K194E、K288E、K327E、K356E、R63Q、R77Q,R153Q,R203Q,R294Q,R378Q,N161D、N197D、N237D、N247D、N254D、N285D、N289D、 N339D、N344D、N382D、Q147E、Q204E、Q239E、Q281E、D151N、D189N、D211N、D277N、D405N、 E146Q、E208Q和E244Q，其中所述取代是根據(jù)SEQ ID NO 3的成熟形態(tài)的紅褐肉座菌CBH2 來編號的。在一些實施方案中，變體包括在一個或多個其它位置的其它取代，所述其它位置 選自146、151、189、208、211、244、277和405，其中其它位置是通過與SEQ ID NO :3所述的 參照纖維二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列來編號的。在一些實施方案中，在一個或多個 其它位置的其它取代包括用中性氨基酸替換天冬氨酸或谷氨酸(例如，通過N或Q或其他 中性殘基替換D或E)。在一些實施方案中，在一個或多個其它位置的其它取代包括一個或 多個的 D151N、D189N、D211N、D277N、D405N、E146Q、E208Q 和 E244Q，其中位置是通過與 SEQ ID N0:3所述的參照纖維二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列相對應(yīng)來編號的。在一些優(yōu) 選的實施方案中，在一個或多個位置的取代選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10個位置。在一些 優(yōu)選的實施方案中，纖維素酶變體源自親本纖維素酶，所述親本纖維素酶選自紅褐肉座菌 CBH2、康寧肉座菌(Hypocrea koningii)CBH2、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)CBH2、解纖 維素醋弧菌(Acremonium cellulolyticus)CBH2、二孢蘑菇(Agaricus bisporus)CBH2、尖 鍵抱(Fusarium osysporum) EG、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) CBH2、埃 默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)CBH2、褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida. fusca)6B/E3 CBH2、褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida. fusca) 6A/E2 EG和糞肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)CenA EG。在一些優(yōu)選的實施方案中，纖維素酶變體源自這樣的親本纖維素酶，所述親 本纖維素酶的氨基酸序列與 SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12 禾口 SEQ ID NO :13 的成員至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同。在一些 實施方案中，與參照CBH2相比，更負的凈電荷是-1或_2。 本發(fā)明還提供了纖維素酶變體，其中變體是具有纖維素酶活性的成熟形態(tài)，包括 賴氨酸殘基的化學(xué)修飾，去除了賴氨酸殘基的正電荷。在一些優(yōu)選的實施方案中，化學(xué)修飾 包括用以下物質(zhì)來處理，所述物質(zhì)選自琥珀酐、乙酰氧基丁二酸酐、馬來酸酐、酒石酸酐、鄰 苯二甲酸酐、trimetallitic anhydride、順烏頭酸酐、t_硝基鄰苯二甲酸酐、乙酸酐、丁酸 酐、異丁酸酐、己酸酐、戊酸酐、異戊酸酐和新戊酸酐。在一些優(yōu)選的實施方案中，纖維素酶 變體源自親本纖維素酶，所述親本纖維素酶選自紅褐肉座菌纖維二糖水解酶I、紅褐肉座菌 纖維二糖水解酶II、紅褐肉座菌內(nèi)切葡聚糖酶I、紅褐肉座菌內(nèi)切葡聚糖酶II和紅褐肉座 菌葡糖苷酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，纖維素酶變體源自親本纖維素酶，所述親本 纖維素酶選自紅褐肉座菌CBH2、康寧肉座菌CBH2、特異腐質(zhì)霉CBH2、解纖維素醋弧菌CBH2、 二孢蘑菇CBH2、尖鐮孢EG、黃孢原毛平革菌CBH2、埃默森籃狀菌CBH2、褐色嗜熱裂孢菌6B/ E3 CBH2、褐色嗜熱裂孢菌6A/E2 EG和糞肥纖維單胞菌CenA EG。還提供了源自這樣的親 本纖維素酶的纖維素酶變體，所述親本纖維素酶的氨基酸序列與SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4、SEQ ID NO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12 禾口 SEQ ID NO :13 的成員至少 75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%相同。在一些實施方案中，纖維素酶變體包括在選自63、77、129、 147、153、157、161、194、197、203、237、239、247、254、281、285、288、289、294、327、339、344、 356、378和382的一個或多個位置上的取代，其中所述位置是通過與SEQ ID NO :3所述的參照纖維二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列對應(yīng)來編號的。本發(fā)明還涉及包含1個至沈個取代的CBH2變體，所述取代選自KU9E、K157E、 K194E、K288E、K327E、K356E、R63Q、R77Q,R153Q,R203Q,R294Q,R378Q,N161D、N197D、N237D、 N247D、N254D、N285D、N289D、N339D、N344D、N382D、Q147E、Q204E、Q239E 和 Q281E。在一些 實施方案中，CBH2變體包括取代的組合，選自:i)K157E/K129E ；ii)K157E/K129E/K288E/ K194E ；iii)K157E/K129E/K288E/K194E/K356E/K327E ；iv)K157E/K129E/K288E/K194E/ K356E/K327E/R153Q/R294Q/R203Q/R378Q ；ν)K157E/K129E/K288E/K194E/K356E/K327E/ R153Q/R294Q/R203Q/R378Q/N382D/N344D/N327D/N339D ；vi)Κ157Ε/Κ129Ε/Κ288Ε/Κ194Ε/ K356E/K327E/R153Q/R294Q/R203Q/R378Q/N382D/N344D/N327D/N339D/N289D/N161D/ Q204E/Q147E ；vii)K157E/K129E/K288E/K194E/K356E/K327E/R153Q/R294Q/R203Q/R378Q N382D/N344D/N327D/N339D/N289D/N161D/Q204E/Q147E/N285D/N197D/N254D/N247D ；和 viii)K157E/K129E/K288E/K194E/K356E/K327E/R153Q/R294Q/R203Q/R378QN382D/N344D/ N327D/N339D/N289D/N161D/Q204E/Q147E/N285D/N197D/N254D/N247D/Q239E/Q281E/R63Q/ R77Q。在一些實施方案中，CBH2變體包括1個至8個取代，選自D151N、D189N、D211N、 D277N、D405N、E146Q、E208Q和E244Q。在一些實施方案中，CBH2變體包括取代的組合，選自 i)D189N/E208Q/D211N/D405 ；禾口 ii)D189N/E208Q/D211N/D405/E244Q/D277N/D151/E146Qo還描述了編碼CBH2變體的分離的核酸，所述變體具有如前述段落描述的纖維二 糖水解酶活性。在第一個方面，本發(fā)明涵蓋了編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的分離 的核酸，所述多肽是糖基水解酶家族6的變體，并且其中所述核酸編碼在這樣的殘基上的 取代，所述殘基的取代與野生型紅褐肉座菌CBH2相比降低凈電荷。在另一個方面，本公開文本涉及編碼CBH2變體的分離的核酸，其中所述變體包括 在成熟形態(tài)的CBH2中選自以下位置上的取代KU9E、K157E、K194E、K288E、K327E、K356E、 R63Q、R77Q,R153Q,R203Q,R294Q,R378Q,N161D、N197D、N237D、N247D、N254D、N285D、N289D、 N339D、N344D、N382D、Q147E、Q204E、Q239E、Q281E、D151N、D189N、D211N、D277N、D405N、 E146Q、E208Q和E244Q，其中所述取代是根據(jù)SEQ ID NO 3的成熟形態(tài)的紅褐肉座菌CBH2 編號的。在一些實施方案中，本公開文本涉及包含編碼CBH2變體的核酸的表達盒，包含與 調(diào)控序列有效連接的編碼CBH2變體的核酸的構(gòu)建體，包含編碼CBH2變體的核酸的載體， 以及用包含編碼CBH2變體的核酸的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)宿主 細胞生產(chǎn)CBH2變體的方法，所述宿主細胞在適合生產(chǎn)CBH2變體的條件下在培養(yǎng)基中表達 CBH2變體。還提供了包含前述段落的纖維素酶變體的組合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，組 合物還包括至少一種其它的酶，所述酶選自枯草桿菌蛋白酶、中性金屬蛋白酶、脂肪酶、角 質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶和過 氧化物酶。本文提供了將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的方法，包括將所述生物質(zhì)與纖維素酶變體接觸。 還提供了生產(chǎn)燃料的方法，通過將生物質(zhì)組合物與包含纖維素酶變體的酶促組合物接觸來 生產(chǎn)糖溶液，和在足以生產(chǎn)燃料的條件下用發(fā)酵微生物培養(yǎng)。
還提供了包含纖維素酶變體的組合物，包括例如去垢劑組合物、飼料添加物；和清 潔或織物護理的方法，通過將包含織物的表面和/或物品與去垢劑組合物接觸。還提供了 織物護理處理的方法，包括脫毛和表面拋光(surface finish)，通過將包含織物的表面和/ 或物品與纖維素酶變體接觸。本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)點根據(jù)下文詳述的說明可以是顯而易見的。然而應(yīng) 該理解，當(dāng)表示本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案時，僅通過示例的方式給出詳細的說明和特定的 實施例，因為根據(jù)本詳細的說明書，在本發(fā)明的范圍和精神下，各種改變和修飾對本領(lǐng)域技 術(shù)人員是顯而易見的。VI.附圖簡介

圖1表示在存在增量的木質(zhì)素抑制劑的條件下，修飾的(方塊)和未修飾的(圓 圈)木霉屬物種纖維素酶制品對APB的糖化作用。圖IA和圖IB分別顯示了在M和48小 時孵育后的結(jié)果。圖2A表示比較修飾的纖維素酶的糖化作用，圖2B顯示了使用修飾的和未修飾的 纖維素酶的糖化作用的差異。圖3提供了成熟形態(tài)的各種纖維素酶的氨基酸序列的比對紅褐肉座菌(也稱為 里氏木霉)CBH2(SEQ ID NO :3)、康寧肉座菌 CBH2 (SEQ ID NO :4)、特異腐質(zhì)霉 CBH2 (SEQ ID NO 5)、解纖維素醋弧菌CBH2(SEQ ID NO 6)、二孢蘑菇CBH2 (SEQ ID NO 7)、尖鐮孢EG(SEQ ID NO :8)、黃孢原毛平革菌CBH2(SEQ ID NO :9)、埃默森籃狀菌CBH2 (SEQ ID NO :10)、褐色 嗜熱裂孢菌6B/E3 CBH2 (SEQ ID NO :11)、褐色嗜熱裂孢菌6A/E2 EG (SEQ ID NO 12)和糞 肥纖維單胞菌 CenA EG (SEQ ID NO: 13)。圖4提供了作為電荷改變產(chǎn)物的CBH2變體SEL的觀察到的預(yù)處理玉米秸稈(corn stover) (PCS)測定獲勝者對預(yù)期的獲勝者的相對頻率的圖。減少的CBH2電荷導(dǎo)致顯著更 高的PCS獲勝者頻率。圖5提供了 pTTTpyr-cbh2的質(zhì)粒圖。VII.各實施方案的詳述本發(fā)明涉及經(jīng)修飾降低了與非纖維素物質(zhì)結(jié)合的纖維素酶變體。通常，在存在非 纖維素物質(zhì)時，與野生型纖維素酶相比，纖維素酶變體具有增加的纖維素分解活性。在一些 實施方案中，與野生型纖維素酶相比，纖維素酶變體具有減少的凈電荷(即，更負)。在一些 實施方案中，纖維素酶變體具有比野生型纖維素酶更少的正電荷。在一些實施方案中，纖維 素酶經(jīng)修飾去除了一個或多個正電荷。在一些實施方案中，纖維素酶經(jīng)修飾添加了一個或 多個負電荷。在一些實施方案中，纖維素酶經(jīng)修飾去除了一個或多個正電荷且添加了一個 或多個負電荷。可以理解，前面的一般性描述和下文的詳細描述都只是示例性的和解釋性的，并 不限制本文描述的組合物和方法。除非在本文中另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù) 語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一個普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。在本申請中，單數(shù)的 使用包括了復(fù)數(shù)，除非另外特別陳述。除非另外陳述，“或”的使用意味著“和/或”。同樣 地，術(shù)語包含或包括的各個形態(tài)(“comprise”、“comprising”、“comprises”、“include，，、 “including”和“includes”)都并非意在限制。本文提及的所有專利和出版物，包括此類 專利和出版物中公開的所有氨基酸和核苷酸序列都通過引用明確的整合到本文中。本文提供的標(biāo)題不是對發(fā)明的各方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，可以通過整體參考說明書產(chǎn)生。因此，通 過整體參考說明書更全面的定義了本文中的術(shù)語。除非本文中另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 一個普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton，等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第 2版，John Wiley 和 Sons，New York (1994)；和Hale & Marham， THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)為技術(shù)人員 提供了本發(fā)明使用的許多術(shù)語的常規(guī)詞典。雖然在實踐或測試本發(fā)明時可以使用與本文描 述的相似或等價的任何方法和材料，但是，仍描述了優(yōu)選方法和材料。數(shù)值范圍包括了定義 范圍的數(shù)。除非另外指出，分別地，核酸按從左至右為5’至3’的方向書寫；氨基酸按從左 至右為氨基至羧基的方向書寫。關(guān)于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，實踐者可以特別指向Sambrook 等人，MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL (第 2 版)，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y. , 1989 ；禾口 Ausubel FM 等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,New York，N. Y.，1993?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述的特定方法、規(guī)程 和試劑，因為這些是可以改變的。I.定義通過整體參考說明書可以更全面的定義下列術(shù)語。如本文中使用的，術(shù)語“多肽”指由通過肽鍵連接的氨基酸殘基的單鏈組成的化合 物。如本文中使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”可以與術(shù)語“多肽”是同義的?！白凅w”意指源自前體蛋白質(zhì)(例如，天然蛋白質(zhì))的蛋白質(zhì)，這是通過在C-和/或 N-末端添加一個或多個氨基酸，取代氨基酸序列的一個或多個不同位點上的一個或多個氨 基酸，或者在蛋白質(zhì)的一個或兩個末端或氨基酸序列的一個或多個位點缺失一個或多個氨 基酸，或者通過改變電荷(即，通過去除正電荷、添加負電荷，或通過同時去除正電荷和添 加負電荷)來修飾一個或多個氨基酸。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來實施纖維素酶變 體的制備，所述方法包括氨基酸的化學(xué)修飾，這是通過修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列，將 修飾的DNA序列轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，并表達修飾的DNA序列形成變體酶。本發(fā)明的變體 纖維素酶包括這樣的肽，所述肽包含與前體酶的氨基酸序列相比改變的氨基酸序列，其中 變體纖維素酶保留了前體酶的特征性纖維素分解性質(zhì)，但可以具有在一些特定的方面改變 的性質(zhì)。例如，變體纖維素酶可以具有增加的PH優(yōu)化，或增加的溫度或氧化穩(wěn)定性，或與非 纖維素物質(zhì)降低的親和力或結(jié)合，但可以保留它的特征性纖維素分解活性。認為根據(jù)本發(fā) 明的變體可源自編碼纖維素酶變體的DNA片段，其中保留了所表達的纖維素酶變體的功能 活性。例如，編碼纖維素酶的DNA片段可以進一步包括這樣的DNA序列或其部分，所述DNA 序列或其部分編碼在5’或3’端與纖維素酶DNA序列連接的鉸鏈或接頭，其中保留了編碼 的纖維素酶結(jié)構(gòu)域的功能活性。在本文中，術(shù)語變體和衍生物可以互換的使用。還可以通過在三級結(jié)構(gòu)水平確定與前體纖維素酶的同源性來定義“等價殘基”，所 述前體纖維素酶的三級結(jié)構(gòu)已通過χ-射線晶體學(xué)被確定。等價殘基定義為在比對后，纖維 素酶和紅褐肉座菌CBH2的特定氨基酸殘基的兩個或多個主鏈原子(N對N，CA對CA，C對C 以及0對0)的原子坐標(biāo)在0. 13nm以內(nèi)，優(yōu)選的在0. Inm內(nèi)。在關(guān)于紅褐肉座菌CBH2定向 并定位最佳模型，以產(chǎn)生纖維素酶的非氫蛋白質(zhì)原子的原子坐標(biāo)的最大重疊后實現(xiàn)比對。 最佳模型是使在最高分辨率的實驗衍射數(shù)據(jù)時可獲得最低R因子的晶體學(xué)模型，可見于例如 US 2006/0205042 O與紅褐肉座菌CBH2的特定殘基功能類似的等價殘基定義為纖維素酶的這樣的氨 基酸，所述氨基酸可以采用這樣的構(gòu)象，使得它們以定義的并歸因于紅褐肉座菌CBH2的特 定殘基的方式改變、修飾或促進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合或催化作用。此外，它們是纖維素酶 的這樣的殘基(已通過χ-射線晶體學(xué)獲得了所述纖維素酶的三級結(jié)構(gòu))，所述殘基以下述 程度占據(jù)了類似位置，即盡管給定殘基的主鏈原子可以沒有滿足基于占據(jù)同源位置的等價 規(guī)則，但是殘基的至少兩個側(cè)鏈原子的原子坐標(biāo)位于紅褐肉座菌CBH2的對應(yīng)側(cè)鏈原子的 0. 13nm以內(nèi)。Zou等人(1999)(參考文獻5，見上文)顯示了紅褐肉座菌CBH2的晶體結(jié)構(gòu)。術(shù)語“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。可以理解，由于遺傳密碼簡并性的 結(jié)果，可以產(chǎn)生編碼給定蛋白質(zhì)的多個核苷酸序列，例如CBH2和/或其變體。本發(fā)明考慮 了編碼變體纖維素酶(例如CBH2)的每種可能的變體核苷酸序列，考慮遺傳密碼的簡并性 所有這些都是可能的?！爱愒础焙怂針?gòu)建體或序列具有部分序列，所述部分對于表達它的細胞而言是非天 然的。在控制序列方面，異源指控制序列(即，啟動子或增強子)目前調(diào)控的基因表達實質(zhì) 上沒有作用于調(diào)控相同的基因。通常，異源核酸序列對于其存在的細胞或部分基因組不是 內(nèi)源的，已被通過感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等添加到細胞中?！爱愒吹摹焙怂針?gòu)建 體可以含有控制序列/DNA編碼序列的組合，與天然細胞中發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列 的組合相同或不同。如本文中使用的，術(shù)語“載體”指設(shè)計用于在不同的宿主細胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建 體?！氨磉_載體”指具有在外來細胞中摻入和表達異源DNA片段的能力的載體。許多原核和 真核表達載體是可商購的。合適的表達載體的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。因此，“表達盒”或“表達載體”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，具有一系列特殊 化的核酸元件，所述元件允許特定核酸在靶細胞中的轉(zhuǎn)錄。重組表達盒可以被摻入到質(zhì)粒、 染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列外，表達載體的重組 表達盒部分還包括待轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動子。如本文中使用的，術(shù)語“質(zhì)?！敝赣米骺寺≥d體的環(huán)狀雙鏈(ds)DNA構(gòu)建體，其在 許多細菌和一些真核生物中形成染色體外自我復(fù)制的遺傳元件。如本文中使用的，術(shù)語“編碼可選擇的標(biāo)志物的核苷酸序列”指這樣的核苷酸序 列，所述核苷酸序列能夠在細胞中表達，并且可選擇的標(biāo)志物的表達賦予含有表達基因的 細胞在存在對應(yīng)的選擇劑或?qū)?yīng)的選擇性生長條件下生長的能力。如本文中使用的，術(shù)語“啟動子”指發(fā)揮指導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄的功能的核酸序列。啟 動子通常對表達靶基因的宿主細胞是合適的。啟動子和其它轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列一起 (也稱為“控制序列”)，對表達給定基因是必需的。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列包括但不限 于啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列，以及增強子 或激活子序列。如本文中定義的，“嵌合基因”或“異源核酸構(gòu)建體”指由不同基因的部分組成的非 天然基因(即，已經(jīng)導(dǎo)入宿主中的基因)，所述部分包括調(diào)控元件。用于宿主細胞轉(zhuǎn)化的嵌 合基因構(gòu)建體通常包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(啟動子)，其與異源蛋白質(zhì)編碼序列有效連接，或者在 可選擇的標(biāo)志物嵌合基因中，與可選擇的標(biāo)志物基因有效連接，所述標(biāo)志物基因編碼賦予轉(zhuǎn)化細胞例如抗生素抗性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的用于轉(zhuǎn)化宿主細胞的典型的嵌合基因包括轉(zhuǎn) 錄調(diào)控區(qū)(組成型的或可誘導(dǎo)的)，蛋白質(zhì)編碼序列和終止子序列。如果需要分泌靶蛋白， 則嵌合基因構(gòu)建體還可以包括編碼信號肽的第二 DNA序列。當(dāng)核酸被放置于與另一種核酸序列功能性的關(guān)系中時，核酸是有效連接的。例如， 如果其表達為參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)，則編碼分泌前導(dǎo)子的DNA與多肽的DNA是有效連 接的；如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強子與編碼序列是有效連接的；或者如果其位 置有利于翻譯，則核糖體結(jié)合位點與編碼序列是有效連接的。通常，“有效連接”意指DNA序 列的連接是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)子的情況下，是連續(xù)的且符合讀框的。然而，增強子不 必是連續(xù)的。通過在常規(guī)的限制性位點連接來實現(xiàn)連接。如果不存在此類位點，則根據(jù)常 規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭(adaptor)、接頭或用于PCR的引物。如本文中使用的，術(shù)語“基因”意指在生產(chǎn)多肽鏈中涉及的DNA片段，可以或可以 不包括在編碼區(qū)前后的區(qū)域，例如5’非翻譯(5’ UTR)或“前導(dǎo)”序列，和3’ UTR或“非轉(zhuǎn)錄 尾區(qū)”序列，以及在單個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。通常，在中等至高嚴(yán)謹條件下，編碼變體纖維素酶(例如CBffi)的核酸分子可以與 如本文中提供的野生型序列雜交，如SEQ ID NO :1。然而，在一些情況下，使用具有基本不 同的密碼子選擇的CBH2-編碼核苷酸序列，而由CBH2-編碼核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)則與 天然蛋白質(zhì)具有相同或基本相同的氨基酸序列。例如，根據(jù)宿主使用的特定密碼子的頻率， 可以修飾編碼序列有利于CBH2在特定的原核或真核表達系統(tǒng)中更快的表達(IV ο等人， FEMS Microbiology Letters，190 :13_19，2000 ；例如，描述了用于在絲狀真菌中表達的基 因優(yōu)化)。如果在中等至高嚴(yán)謹?shù)碾s交和洗滌條件下，兩條序列特異性的彼此雜交，則認為 核酸序列與參照核酸序列是“可選擇性雜交的”。雜交條件基于核酸結(jié)合復(fù)合體或探針的解 鏈溫度(Tm)。例如，“最高嚴(yán)謹度”通常發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針的Tm 5°C )；“高嚴(yán)謹 度”發(fā)生在低于Tm約5-10°C ；“中等”或“中間嚴(yán)謹度”發(fā)生在低于探針的Tm約10_20°C ； 而“低嚴(yán)謹度”發(fā)生在低于Tm約20-25°C。功能上，最高嚴(yán)謹度條件可用于鑒別與雜交探針 具有嚴(yán)格同一性或近似嚴(yán)格同一性的序列，而高嚴(yán)謹度條件可用于鑒別與探針具有約80% 或更高序列同一性的序列。中等或高嚴(yán)謹度雜交條件是本領(lǐng)域普遍已知的(參見例如，Sambrook等人，1989， 第9和11章；以及Ausubel，F(xiàn).M.等人，1993 ；通過引用明確的整合到本文中)。高嚴(yán)謹 度條件的實例包括在約42°C下，在50%甲酰胺、5xSSC、5倍Denhardt' s液、0. 5% SDS和 100 μ g/ml變性載體DNA中雜交，然后在室溫下，在2倍SSC和0. 5% SDS中洗滌2次，和在 42°C下，在0. 1 χ SSC和0. 5% SDS中再洗滌2次。當(dāng)對于例如細胞或核酸、蛋白質(zhì)或者載體使用時，術(shù)語“重組”表示通過導(dǎo)入異源 的核酸或蛋白質(zhì)，或者改變天然的核酸或蛋白質(zhì)，來修飾細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體，或者所 述細胞是源自如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非重組)形式的細胞中 不可見的基因，或者表達另外異常表達的、低表達的或完全不表達的天然基因。如本文中使用的，涉及細胞的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)基因的”意指細 胞具有整合到其基因組或作為在多個世代中維持的附加型質(zhì)粒的非天然(異源的)核酸序 列。
如本文中使用的，術(shù)語“表達”指基于基因的核酸序列生產(chǎn)多肽的過程。過程包括 轉(zhuǎn)錄和翻譯。在涉及向細胞中插入核酸序列時，術(shù)語“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”， 并包括指代核酸序列摻入到真核或原核細胞中，其中核酸序列可以被摻入到細胞的基因組 中(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子或被瞬時表達(例如，轉(zhuǎn)染 的 mRNA)。因而術(shù)語“CBH2表達”指cbh2基因或其變體的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)物包括前體RNA、 mRNA、多肽、翻譯后加工的多肽及其衍生物，包括來自相關(guān)物種的CBH2，所述物種例如康 寧木霉(Trichoderma koningii)、紅褐肉座菌(也稱為長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉 (Trichoderma viride))和 Hypocrea schweinitzii。通過示例，CBH2 表達的測定包括用 于CBH2蛋白的Wfestern印跡、用于cbh2 mRNA的Northern印跡分析和反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈 式反應(yīng)(RT-PCR)測定，以及磷酸膨脹纖維素(Phosphoric Acid Swollen Cellulose,PASC) 和對-羥基苯甲酰胼(PAHBAH)測定，如下列中所述(a) PASC (Kar Is son, J.等人，Q001)， Eur. J. Biochem, 268,6498-6507 ；Wood, Τ. (1988) ^t Methods in Enzymology,第 160 Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose (Wood, W. & Kellog,S.編著)中，第 19-25 頁，Academic Press,San Diego,Calif. ,USA)和(b)PAHBAH : (Lever，Μ· (1972)Analytical Biochemistry, 47, 273 ；Blakeney,A. B. & Mutton, L.L. (1980)Journal of Science of Food and Agriculture, 31,889 ；Henry,R. J. (1984)Journal of the Institute of Brewing,90, 37)。術(shù)語“可變剪接”指從單個基因產(chǎn)生多個多肽同種型的過程，涉及在一部分而并非 全部基因轉(zhuǎn)錄物的加工過程中，將不連續(xù)的外顯子剪接到一起。因此，特定的外顯子可以 與一些選擇性外顯子的任一個連接，形成信使RNA?？勺兗艚拥膍RNA產(chǎn)生多肽(“剪接變 體”)，其中一些部分是相同的，而其它部分是不同的。術(shù)語“信號序列”指在蛋白質(zhì)N末端部分的氨基酸序列，其有利于成熟形態(tài)的蛋白 質(zhì)分泌到細胞外。成熟形態(tài)的胞外蛋白質(zhì)缺少在分泌過程中切割掉的信號序列。術(shù)語“宿主細胞”意指含有載體，并支持表達構(gòu)建體的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻 譯(表達)的細胞。用于本發(fā)明的宿主細胞可以是原核細胞，例如大腸桿菌，或真核細胞， 例如酵母、植物、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞。通常，宿主細胞是絲狀真菌。術(shù)語“絲狀真菌”意指本領(lǐng)域技術(shù)人員認識的任何和所有的絲狀真菌。優(yōu)選的真 菌選自曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬、鐮孢屬(Fusarium)、金小孢子屬(Chrysosporium)、 青霉屬(Penicillium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、脈孢菌屬(Neurospora)、或其可選的有性型 如裸孢殼屬(Emericella)、肉座菌屬(Hypocrea)。已證明無性的工業(yè)真菌里氏木霉是子 囊菌綱(ascomycete)紅褐肉座菌的克隆衍生物(參見，Kuhls等人，PNAS，93 :7755-7760, 1996)。術(shù)語“纖維寡糖”指含有2-8個葡萄糖單元并具有β -1，4連接的寡糖基，例如纖維二糖。術(shù)語“纖維素酶”、“纖維素分解酶”或“纖維素酶”指能夠水解纖維素多聚物為較 短的纖維寡糖寡聚物、纖維二糖和/或葡萄糖的一類酶。已從纖維分解生物中，特別包括 真菌、植物和細菌中，獲得了纖維素酶的多個實例，例如外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡糖苷酶。這類微生物制造的酶是這樣的蛋白質(zhì)的混合物，所述蛋白 質(zhì)具有在將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖中有效的三類作用內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、纖維二糖水解酶 (CBH)和β-葡糖苷酶(BGL或Bglu)。這三類不同的纖維素酶協(xié)同作用，將纖維素及其衍 生物轉(zhuǎn)化為葡萄糖。許多微生物制造水解纖維素的酶，包括木腐真菌木霉屬、堆肥細菌高溫單孢菌屬 (Thermomonospora)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和纖維單胞菌屬(Cellulomonas)；鏈霉菌屬 (Streptomyces)；以及真菌腐質(zhì)霉屬、曲霉屬和鐮孢屬。來自紅褐肉座菌的CBH2是糖基水解酶家族6 (因而，Cel6)的成員，特別的是在紅 褐肉座菌中鑒別的該家族的第一個成員(因而，Cel6)。糖基水解酶家族6既含有內(nèi)切葡聚 糖酶，也含有纖維二糖水解酶/外切葡聚糖酶，CBH2是后者。因此，詞組CBH2、CBH2型蛋白 和Cel6纖維二糖水解酶在本文中可互換的使用。如本文中使用的，術(shù)語“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指在纖維素酶或其衍生物的纖維素結(jié) 合活性中涉及的纖維素酶的部分氨基酸序列或酶的區(qū)域。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常通過將纖 維素酶與纖維素、纖維素衍生物或其其它的多糖等價物非共價結(jié)合來發(fā)揮作用。纖維素結(jié) 合結(jié)構(gòu)域通過結(jié)構(gòu)迥異的催化核心區(qū)允許或有利于纖維素纖維的水解，而且通常獨立于催 化核心發(fā)揮作用。因此，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以不具有歸因于催化核心的顯著的水解活性。 換言之，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是纖維素酶蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)元件，其不同于具有催化活 性的結(jié)構(gòu)元件。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合組件在本文中可互換的使用。如本文中使用的，術(shù)語“表面活性劑”指本領(lǐng)域常規(guī)已知的具有表面活性性質(zhì)的任 何化合物。因此例如，表面活性劑包括陰離子、陽離子和非離子型表面活性劑，例如常見于 去垢劑中的那些。陰離子表面活性劑包括線性的或分支的烷基苯磺酸鹽；具有線性的或分 支的烷基或烯基的烷基醚硫酸鹽或烯基醚硫酸鹽；烷基或烯基硫酸鹽；烯屬磺酸酯；和烷 基磺酸鹽。兩性表面活性劑包括季銨鹽磺酸鹽和甜菜堿型兩性表面活性劑。此類兩性表面 活性劑在同一個分子中同時具有正和負電荷基團。非離子表面活性劑可以包括聚氧化烯醚 以及較高脂肪酸的鏈烷醇酰胺或其烯化氧的加合物、脂肪酸甘油單酯等。如本文中使用的，術(shù)語“含纖維素的織物”指由含棉或非棉的纖維素或含棉或非棉 的纖維素混合物制成的任何縫制的或非縫制合的織物、紗或纖維，包括天然纖維素制品和 人造纖維素制品(例如黃麻、亞麻、苧麻、人造絲和lyocell)。如本文中使用的，術(shù)語“含棉的織物”指由純棉或棉混合物制成的縫制的或非縫制 的植物、紗或纖維，包括棉機織織物、棉編織物、棉勞動布、棉紗、原棉等。如本文中使用的，術(shù)語“石洗(stonewashing)組合物”指用于含石洗纖維素的織 物的制劑。石洗組合物用于在銷售前修飾含纖維素的織物，例如在生產(chǎn)過程中。相反，去垢 劑組合物意在用于清潔污損的衣物，不在生產(chǎn)過程中使用。如本文中使用的，術(shù)語“去垢劑組合物”指意圖在用于清洗污損的含纖維素織物的 洗滌基質(zhì)中使用的混合物。在本發(fā)明的上下文中，此類組合物除纖維素酶和表面活性劑以 外，可以包括其它的水解酶、增效劑、漂白劑、漂白活化劑、上藍劑和熒光染料、抗結(jié)塊劑、掩 蔽劑、纖維素酶激活劑、抗氧化劑和加溶劑。如本文中使用的，術(shù)語“降低或消除cbh2基因的表達”意指已從基因組中缺失了 cbh2基因從而重組宿主微生物不能表達cbh2基因；或者cbh2基因或轉(zhuǎn)錄物已經(jīng)被修飾使宿主微生物不生產(chǎn)功能性CBH2酶或以顯著低于未修飾的cbh2基因或轉(zhuǎn)錄物的水平生產(chǎn)。術(shù)語“變體cbh2基因”意指通過去除、添加和/或操縱編碼序列，改變了來自紅褐 肉座菌的cbh2基因的核酸序列。如本文中使用的，術(shù)語“純化”通常指將含轉(zhuǎn)基因核酸或蛋白質(zhì)的細胞進行生物化 學(xué)純化和/或柱層析。如本文中使用的，術(shù)語“活性”和“生物學(xué)活性”指與特定蛋白質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)活 性，在本文中可互換的使用。例如，與蛋白酶相關(guān)的酶活性是蛋白酶解，因而有活性的蛋白 酶具有蛋白水解活性。因而，給定蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性指本領(lǐng)域技術(shù)人員通常歸因于蛋白 質(zhì)的任何生物學(xué)活性。如本文中使用的，術(shù)語“富集的”意指相對于在野生型或天然存在的真菌纖維素酶 組合物中發(fā)現(xiàn)的CBH2濃度，發(fā)現(xiàn)纖維素酶(例如CBH2)的濃度更大。術(shù)語富集的、升高的 和增強的在本文中可互換的使用。野生型真菌纖維素酶組合物是由天然存在的真菌來源生產(chǎn)的組合物，包括一種或 多種BGL、CBH和EG組分，其中發(fā)現(xiàn)每種組分都是真菌來源生產(chǎn)的比例。因此，富集的CBH 組合物可以具有改變比例的CBH，其中CBH與其它纖維素酶組分(例如，EG、β -葡糖苷酶 和其它內(nèi)切葡聚糖酶)的比例是升高的。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法增加CBH或降低 (或消除)至少一種其它組分，來增加該比例。如本文中使用的，術(shù)語“分離的”或“純化的”指核酸或氨基酸是從其天然相關(guān)的 至少一種組分中移出的。因此，作為示例，通過文獻中已充分公開的已知分離技術(shù)，可以將天然存在的纖維 素酶系統(tǒng)純化為基本純的組分，所述技術(shù)包括在合適PH下的離子交換層析、親和層析、大 小排阻等。例如，在離子交換層析(通常是陰離子交換層析)中，能夠通過用PH梯度或鹽 梯度或PH與鹽梯度洗脫，分離纖維素酶組分。然后，可以將純化的CBH添加到酶溶液中，獲 得富集的CBH溶液。還可以使用分子遺傳學(xué)方法過表達編碼CBH的基因(可能組合缺失一 個或多個編碼其它纖維素酶的基因)，來提高微生物生產(chǎn)的CBH的量。真菌纖維素酶可以含有一種以上的CBH組分。不同的組分通常具有不同的等電 點，使得可以通過離子交換層析等將它們分離。在酶溶液中可以使用單個CBH組分，或CBH 組分的組合。當(dāng)在酶溶液中使用時，同源物或變體CBH2組分添加的量通常足以允許從生物質(zhì) 最高速率的釋放可溶性糖。添加的同源物或變體CBH2組分的量依賴于待糖化的生物質(zhì)的 類型，使用時所述量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便的確定，纖維素酶組合物中存在的同源物 或變體CBH2組分的重量百分比優(yōu)選的在1和100之間，示例性實例是約1，優(yōu)選的約5，優(yōu) 選的約10，優(yōu)選的約15，或優(yōu)選的約20重量百分比至優(yōu)選的約25，優(yōu)選的約30，優(yōu)選的約 35，優(yōu)選的約40，優(yōu)選的約45，或優(yōu)選的約50重量百分比。此外，優(yōu)選的范圍可以是約0. 5 至約15重量百分比，約0. 5至約20重量百分比，約1至約10重量百分比，約1至約15重 量百分比，約1至約20重量百分比，約1至約25重量百分比，約5至約20重量百分比，約5 至約25重量百分比，約5至約30重量百分比，約5至約35重量百分比，約5至約40重量 百分比，約5至約45重量百分比，約5至約50重量百分比，約10至約20重量百分比，約10 至約25重量百分比，約10至約30重量百分比，約10至約35重量百分比，約10至約40重量百分比，約10至約45重量百分比，約10至約50重量百分比，約15至約60重量百分比， 約15至約65重量百分比，約15至約70重量百分比，約15至約75重量百分比，約15至約 80重量百分比，約15至約85重量百分比，約15至約95重量百分比。然而，當(dāng)使用時，相對 于纖維素酶組合物中存在的任何EG型組分，同源物或變體CBH2組分的重量百分比優(yōu)選的 是從約1，優(yōu)選的約5，優(yōu)選的約10，優(yōu)選的約15，或優(yōu)選的約20重量百分比至優(yōu)選的約25， 優(yōu)選的約30，優(yōu)選的約35，優(yōu)選的約40，優(yōu)選的約45，或優(yōu)選的約50重量百分比。此外，優(yōu) 選的范圍可以是約0. 5至約15重量百分比，約0. 5至約20重量百分比，約1至約10重量 百分比，約1至約15重量百分比，約1至約20重量百分比，約1至約25重量百分比，約5 至約20重量百分比，約5至約25重量百分比，約5至約30重量百分比，約5至約35重量 百分比，約5至約40重量百分比，約5至約45重量百分比，約5至約50重量百分比，約10 至約20重量百分比，約10至約25重量百分比，約10至約30重量百分比，約10至約35重 量百分比，約10至約40重量百分比，約10至約45重量百分比，約10至約50重量百分比， 約15至約20重量百分比，約15至約25重量百分比，約15至約30重量百分比，約15至約 35重量百分比，約15至約30重量百分比，約15至約45重量百分比，約15至約50重量百 分比。II.纖維素酶纖維素酶是本領(lǐng)域已知的水解纖維素(β-1，4-葡聚糖或β-D-糖苷鍵)導(dǎo)致形 成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖等的酶。如上文所述，纖維素酶傳統(tǒng)上分為三大類內(nèi)切葡聚 糖酶(EC 3. 2. 1. 4) ( “EG”)、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC 3. 2. 1. 91) ( “CBH”)和 β-葡糖苷酶(EC 3. 2. 1.21) ( “BG”)。一些真菌產(chǎn)生完整的纖維素酶系統(tǒng)，包括外切纖維二糖水解酶或CBH型纖維素 酶、內(nèi)切葡聚糖酶或EG型纖維素酶，以及β-葡糖苷酶或BG-型纖維素酶。然而，有時這些 系統(tǒng)缺少CBH型纖維素酶和細菌纖維素酶，還通常包括極少或不含CBH型纖維素酶。此外， 已顯示EG組分和CBH組分協(xié)同的相互作用，更有效的降解纖維素。在多組分或完整的纖維 素酶系統(tǒng)中的不同組分，即各種內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維二糖水解酶，通常具有不同的性 質(zhì)，例如等電點、分子量、糖基化程度、底物特異性和酶作用模式。認為內(nèi)切葡聚糖酶類型的纖維素酶水解纖維素的低結(jié)晶度(crystallinity)區(qū) 域內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵，而外切纖維二糖水解酶型纖維素酶從纖維素的還原端或非還原 端水解纖維二糖。因而，通過創(chuàng)造外切纖維二糖水解酶組分識別的新的鏈末端，內(nèi)切葡聚糖 酶組分的作用可以極大的有利于外切纖維二糖水解酶的作用。此外，β -葡糖苷酶類型的纖 維素酶已顯示催化烷基和/或芳香基β -D-葡糖苷的水解，例如甲基β -D-葡糖苷和ρ-硝 基苯葡糖苷，以及僅含碳水化合物殘基的糖苷，例如纖維二糖。這產(chǎn)生葡萄糖作為微生物的 單一產(chǎn)物，并降低或消除抑制纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶的纖維二糖。纖維素酶還在去垢劑組合物中有多種應(yīng)用，包括增強清潔能力、作為軟化劑和改 善棉織物的觸感(Hemmpel, ITB Dyeing/Printing/Finishing 3 :5-14,1991 ；Tyndall, Textile Chemist and Colorist 24 :23-26,1992 ；禾口 Kumar 等人，Textile Chemist and Colorist,29 :37_42，1997)。雖然機制不是本發(fā)明的一部分，但纖維素酶的軟化和色彩修 復(fù)性質(zhì)已歸因于纖維素酶組合物中的堿性內(nèi)切葡聚糖酶組分，如美國專利號5，648，263, 5，691，178和5，776，757中示例的，其中公開了含富集了特定堿性內(nèi)切葡聚糖酶組分的纖維素酶組合物的去垢劑組合物賦予所處理的衣物色彩修復(fù)和改善的軟化，這是與未富集此 類組分的纖維素酶組合物相比。此外，去垢劑組合物中的此類堿性內(nèi)切葡聚糖酶組分的應(yīng) 用已顯示補償了去垢劑組合物的PH要求(例如，通過在7. 5-10的堿性pH下表現(xiàn)出最大活 性，如美國專利號5，648，263,5, 691，178和5，776，757中所述)。纖維素酶組合物也顯示出降解含棉織物、導(dǎo)致織物降低的力量損失(strength loss)(美國專利號4，822，516)，引起在商業(yè)去垢劑應(yīng)用中使用纖維素酶組合物的阻礙。已 提示，與包含完整纖維素酶系統(tǒng)的組合物相比，包含內(nèi)切葡聚糖酶組分的纖維素酶組合物 表現(xiàn)出含棉織物降低的力量損失。纖維素酶還表現(xiàn)出可用于降解纖維素酶生物質(zhì)為乙醇(其中，纖維素酶降解纖維 素為葡萄糖，而酵母或其他微生物進一步發(fā)酵葡萄糖為乙醇)，這是在機械紙漿處理(Pere 等人，In Proc. Tappi Pulping Conf.，Nashville，Tenn.，27-31，第 693-696 頁，1996)中， 用作飼料添加物(W0 91/04673)以及在谷粒濕磨中。大部分CBH和EG具有多結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，包括通過接頭肽與纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (CBD)分隔的核心結(jié)構(gòu)域(Suurnakki等人，2000)。核心結(jié)構(gòu)域含有活性位點，而CBD通過 將酶與纖維素結(jié)合而與纖維素相互作用(van Tilbeurgh等人，F(xiàn)EBS Lett. 204 =223-227, 1986 ；Tomme 等人，Eur. J. Biochem. 170 =575-581,1988)。在結(jié)晶纖維素的水解中，CBD 是 特別重要的。已顯示，當(dāng)缺失CBD時，纖維二糖水解酶降解結(jié)晶纖維素的能力明顯降低 (Linder和Teeri, J. Biotechnol. 57 15-28，1997)。然而，CBD的精確作用和作用機制仍然 是思考的話題。已提示CBD僅通過增加纖維素表面的有效酶濃度(Mahlberg等人，Bio/ Technol. 9 =286-290,1991)，和/或通過從纖維素表面松弛單條纖維素鏈(Tormo等人， EMBO J.，第15卷，第21期，第5739-5751頁，1996)來增加酶活性。已經(jīng)用纖維二糖水解 酶的核心蛋白進行了大部分關(guān)注纖維素酶結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌孜锏挠绊懙难芯?，因為所述酶?核心蛋白可以方便的通過木瓜蛋白酶限制性蛋白酶解來生產(chǎn)(Tomme等人，1988)?？茖W(xué)文 獻中已經(jīng)描述了多種纖維素酶，其實例包括來自里氏木霉的Shoemaker，S.等人，Bio/ Technology, 1 :691-696,1983，其公開了 CBHl ；Teeri, T.等人，Gene, 51 :43-52,1987，其公 開了 CBH2。還描述了來自木霉屬以外的物種的纖維素酶，例如Ooi等人，Nucleic Acids Research，第 18 卷，第 19 期，1990，其公開了編碼由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus) 生產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶 Fl-CMC 的 cDNA 序列；Kawaguchi T 等人，Gene 173(2) =287-8,1996, 其公開了編碼來自棘孢曲霉的β -葡糖苷酶1的cDNA的克隆和測序；Sakamoto等人， Curr. Genet. 27 :435_439，1995，其公開了編碼來自白曲霉(Aspergillus kawachii)IF0 4308的內(nèi)切葡聚糖酶CMC酶-1的cDNA序列；&iarilahti等人，Gene 90 :9_14，1990，其 公開了來自胡蘿卜歐文氏菌(Erwinia carotovara)的內(nèi)切葡聚糖酶；Spilliaert R等 人，Eur J Biochem. 224(3) :923_30，1994，其公開了編碼來自 Rhodothermus marinus 的熱 穩(wěn)定β -葡聚糖酶的bglA的克隆和測序；以及Halldorsdottir S等人，Appl Microbiol Biotechnol.49(3) :277_84，1998，其公開了編碼糖基水解酶家族12的熱穩(wěn)定的纖維素酶 Wmiodothermus marinus基因的克隆、測序和過表達。然而，仍然需要鑒別和表征具有改 良性質(zhì)的新的纖維素酶，例如在熱脅迫的條件下或者在存在表面活性劑的條件下改良的性 能、增加的比活、改變的底物切割模式，和/或高水平的體外表達。包含改變量的CBH型、EG型和BG型纖維素酶的、新的和改良的纖維素酶組合物的開發(fā)旨在用于例如(1)將木漿或其他生物質(zhì)降解為糖的組合物(例如，用于生物化學(xué)品生 產(chǎn)，例如生物燃料)；(2)表現(xiàn)出增強的清潔能力的去垢劑組合物；(3)作為柔軟劑發(fā)揮作用 和/或改善棉織物的觸感(例如，“石洗”或“生物拋光(biopolishing)")；和/或(4)飼 料組合物。本文還提供了包含纖維素酶變體的全纖維素酶制品。如此處所用的短語“全纖維 素酶制品”是指天然存在和非天然存在的含有纖維素酶的組合物。“天然存在”的組合物是 通過天然存在的來源生產(chǎn)的組合物，該組合物含有一種或多種纖維二糖水解酶類型、一種 或多種內(nèi)切葡聚糖酶類型和一種或多種β -葡糖苷酶組分，其中這些組分的每一種都以來 源生產(chǎn)的比例得到。天然存在的組合物是這樣一種組合物，其產(chǎn)生于纖維素分解酶方面未 經(jīng)修飾的生物，從而組分酶的比例并未從天然生物產(chǎn)生的比例發(fā)生改變。“非天然存在”的 組合物包含那些組合物，其產(chǎn)生是通過(1)以天然存在的比例或非天然存在(也就是改變 了的)比例來組合組分纖維素分解酶，或( 修飾生物以過量表達或不足表達一種或多種 纖維素分解酶，或C3)修飾生物以致至少一種纖維素分解酶被缺失。相應(yīng)地，在一些實施方 案中，全纖維素酶制品可缺失多種EG和/或CBH中的一種或多種、和/或β-葡糖苷酶。例 如，EGl可單獨缺失或與其他EG和/或CBH組合被缺失。一般來說，全纖維素酶制品包括酶，該酶包括并不限于(i)內(nèi)切葡聚糖酶(EG) 或l，4-i3-d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，其包括1， 4-β -d-葡聚糖葡聚糖水解酶(又已知為纖維糊精酶(eellodextrinases)) (EC 3. 2. 1. 74) 和1，4-β -d-葡聚糖纖維二糖水解酶(外切纖維二糖水解酶，CBH) (EC 3. 2. 1. 91)和(iii) β -葡糖苷酶(BG)或β -葡萄糖苷葡糖水解酶(EC 3. 2. 1. 21)。在本公開內(nèi)容中，全纖維素酶制品可來自任何可用于纖維素物質(zhì)水解的微生物。 在一些實施方案中，全纖維素酶制品是絲狀真菌全纖維素酶?！敖z狀真菌”包括亞門真菌 (Eumycota)和藻屬(Oomycota)的所有絲狀形式。在一些實施方案中，全纖維素酶制品是 支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、裸孢殼屬(Emericella)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、 毛霉菌屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬(Neurospora)、柱霉屬 (Scytalidium)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬物種的全纖 維素酶。在一些實施方案中，全纖維素酶制品是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛 曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉或米曲霉的全纖維素酶。在另一 方面，全纖維素酶制品是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、 Fusarium crookwellense、大刀鍵抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗鍵抱(Fusarium graminearum)、禾赤鍵抱(Fusarium graminum)、異抱鍵抱(Fusarium heterosporum)、 Fusarium negundi、尖鍵抱(Fusarium oxysporum)、多枝鍵抱(Fusarium reticulatum)、 粉紅鍵抱(Fusarium roseum)、接骨木鍵抱(Fusarium sambucinum)、膚色鍵抱(Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱鍵抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色鍵刀菌(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides 或 Fusarium venenatum 的全纖維素酶。在另一方面，全纖維素酶制品是特異腐質(zhì)酶(Humicola insolens), Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糖 脈抱菌(Neurospora crassa)、Scytalidium thermophilum 或太瑞斯梭抱殼(Thielaviaterrestris)的全纖維素酶。在另一方面,全纖維素酶制品是iTrichoderma harzianum、康 tJ27^ (Trichoderma koningii)、長枝7^ (Trichoderma longibrachiatum)、Jl 1 * (Trichoderma reesei),如 RL-P37(Sheir-Neiss 等人’ Appl. Microbiol. Biotechnology, 20(1984)第 46-53 頁；Montenecourt B. S.，Can.，1-20,1987)、QM9414(ATCC No. 26921)、 NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56466、56767 或綠色木霉(Trichoderma viride)如 ATCC 32098和32086的全纖維素酶。在一些實施方案中，全纖維素酶制品是里氏木霉RutC30的 全纖維素酶，其可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)如里 氏木霉ATCC 56765中得到。適合用于本發(fā)明的可商購的纖維素酶制品的實例包括例如CELLUCLAST (可從 Novozymes A/S 獲得)和 LAMINEX 、IndiAge 和 Primafast LAMINEX BG酶、ACCELLERASE 100 和 ACCELLERASE 1500 (可從 Genencor Division, Danisco US. Inc.獲得)。在本公開內(nèi)容中，全纖維素酶制品可來自本領(lǐng)域已知的任意微生物培養(yǎng)方法，導(dǎo) 致能夠水解纖維素物質(zhì)的酶的表達。發(fā)酵可包括在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的搖瓶培養(yǎng)、小 或大規(guī)模發(fā)酵，如連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵，其在允許纖維素酶表達或分離的條件 下、于合適的培養(yǎng)基中進行。通常，微生物在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基適合用于產(chǎn)生能夠水解纖維素物質(zhì) 的酶。培養(yǎng)運用本領(lǐng)域已知方法，在含有碳源、氮源和無機鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生。 本領(lǐng)域已知適合生長和纖維素酶生產(chǎn)的合適的培養(yǎng)基、溫度范圍和其他條件。作為非限制 性的例子，通過里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的正常溫度范圍是對！到觀！。通常，全纖維素酶制品以發(fā)酵生產(chǎn)的樣子使用，不進行或極少進行回收和/或純 化。例如，一旦纖維素酶由細胞分泌到細胞培養(yǎng)基中，就可以使用含有纖維素酶的細胞培養(yǎng) 基。在一些實施方案中，全纖維素酶制品含有發(fā)酵物質(zhì)的未分級分離的成分，包括細胞培養(yǎng) 基、細胞外酶和細胞?？蛇x地，全纖維素酶制品可用任何方便的方法加工，如，通過沉淀、離 心、親和、過濾或本領(lǐng)域已知的任何其他方法。在一些實施方案中，全纖維素酶制品例如可 以被濃縮，然后不經(jīng)進一步純化而被使用。在一些實施方案中，全纖維素酶制品含有降低細 胞活力或殺死細胞的化學(xué)劑。在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知方法裂解或透化處理細 胞。III.分子生物學(xué)在一個實施方案中，本發(fā)明提供了變體cbh2基因在絲狀真菌中功能性的啟動子 的控制下表達。因此，本發(fā)明依賴于重組遺傳性領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)(參見例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，1989 ；Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual，1990 ；禾口 Ausubel 等人編著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York，1994)。突變cbh2核酸序列的方法本發(fā)明考慮了任何本領(lǐng)域已知可導(dǎo)入突變的方法。本發(fā)明涉及變體CBH2的表達、純化和/或分離，以及用途。這些酶優(yōu)選的通過重組 方法制備，使用來自紅褐肉座菌的cbh2基因?？梢允褂眠M行或不進行純化的發(fā)酵培養(yǎng)基。在從紅褐肉座菌中分離和克隆cbh2基因后，使用本領(lǐng)域已知的其它方法，例如定 點誘變，產(chǎn)生與表達的CBH2變體中取代氨基酸對應(yīng)的取代、添加或缺失。同樣，定點誘變和在DNA水平向表達蛋白質(zhì)中摻入氨基酸改變的其它方法是本領(lǐng)域已知的(Sambrook等人， 見上文；和Ausubel等人，見上文)。通過多種本領(lǐng)域已知的方法制備編碼紅褐肉座菌CBH2的氨基酸序列變體的DNA。 這類方法包括但不限于通過對較早制備的編碼紅褐肉座菌CBH2的DNA進行定點(或寡核 苷酸-介導(dǎo)的)誘變、PCR誘變和盒誘變來制備。定點誘變是制備取代變體的優(yōu)選方法。該技術(shù)是本領(lǐng)域普遍已知的(參見例如， Carter 等人，Nucleic Acids Res. 13 :4431-4443 (1985)和 Kunkel 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488(1987))。簡而言之，在進行DNA的定點誘變中，通過首先將編碼目的突變 的寡核苷酸與此類起始DNA的單鏈雜交，來改變起始DNA。在雜交后，使用DNA聚合酶合成 完整的第二鏈，使用雜交的寡核苷酸作為引物，并使用起始DNA的單鏈作為模板。因此，將 編碼目的突變的寡核苷酸摻入到所獲得的雙鏈DNA中。PCR誘變也適合制造起始多肽(S卩，紅褐肉座菌CBH2)的氨基酸序列變體。參 見 Higuchi,在 PCR Protocols,第 177-183 頁(Academic Press,1990)；和 Vallette 等 人，Nuc.Acids Res. 17 :723-733(1989)。還參見例如 Cadwell 等人，PCR Methods and Applications，第2卷，28-33 (1992)。簡而言之，當(dāng)使用少量模板DNA作為PCR的起始材料 時，可以使用與模板DNA的對應(yīng)區(qū)域的序列輕微差異的引物來產(chǎn)生相對大量的特定DNA片 段，所述片段僅在引物不同于模板的位置與模板序列不同。制備變體的另一種方法，盒誘變，是基于Wfells等人，Gene 34 :315-323(1985)描 述的技術(shù)。起始材料是包含待突變的起始多肽DNA的質(zhì)粒(或其它載體)。鑒別了起始DNA 中待突變的密碼子。在鑒別的突變位點的每一側(cè)必須有獨特的限制性內(nèi)切核酸酶位點。如 果不存在此類限制性位點，可以使用上述寡核苷酸-介導(dǎo)的誘變方法，在起始多肽DNA的合 適位置導(dǎo)入它們來產(chǎn)生它們。在這些位點切割質(zhì)粒DNA來將其線性化。使用標(biāo)準(zhǔn)程序合成 雙鏈寡核苷酸，所述雙鏈寡核苷酸編碼在限制性位點之間含有目的突變的DNA序列，其中 兩條寡核苷酸鏈?zhǔn)欠謩e合成的，然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將所述鏈雜交在一起。該雙鏈寡核苷酸 被稱為盒。該盒被設(shè)計為具有與線性化質(zhì)粒的末端相容的5’和3’末端，使其可以直接連 接到質(zhì)粒中?，F(xiàn)在，所述質(zhì)粒含有突變DNA序列?？蛇x的或另外的，可以確定編碼變體CBH2的目的氨基酸序列，并可以合成產(chǎn)生編 碼此類氨基酸序列變體的核酸序列。如此制備的變體CBH2可以進行進一步修飾，通常依賴于纖維素酶的預(yù)期用途。此 類修飾可以涉及氨基酸序列的進一步改變，與異源多肽融合和/或共價修飾。IV. cbh2 核酸和 CBH2 多肽A.變體cbh2-型核酸SEQ ID N0:1顯示了野生型cbh2的核酸序列。本發(fā)明涵蓋了編碼本文所述的變 體纖維素酶的核酸分子。核酸可以是DNA分子。在將編碼CBH2變體的DNA序列克隆到DNA構(gòu)建體中后，使用DNA轉(zhuǎn)化微生物。用 于表達根據(jù)本發(fā)明的變體CBH2目的的待轉(zhuǎn)化微生物可以有利的包括源自木霉屬物種的菌 株。因此，用于制備根據(jù)本發(fā)明的變體CBH2纖維素酶的優(yōu)選模式包括用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化木 霉屬物種宿主細胞，所述構(gòu)建體至少包含編碼一部分或全部變體CBH2的DNA片段。DNA構(gòu) 建體通常可以與啟動子功能性連接。然后，轉(zhuǎn)化的宿主細胞生長在表達目的蛋白質(zhì)的條件下。然后，可以將目的的蛋白質(zhì)產(chǎn)物純化至基本同質(zhì)。然而，實際上，編碼變體CBH2的給定DNA的最佳表達載體可以不同于紅褐肉座菌。 因此，在與變體CBH2的來源生物具有系統(tǒng)發(fā)生相似性的轉(zhuǎn)化宿主中表達蛋白質(zhì)可以是最 有利的。在可選的實施方案中，可以使用黑曲霉(Aspergillus niger)作為表達載體。關(guān) 于使用黑曲霉的轉(zhuǎn)化技術(shù)的描述，參見WO 98/31821，其公開文本通過引用全文整合到本文 中。因此，僅出于示例的目的提供曲霉屬物種表達系統(tǒng)的本說明，它們作為表達本發(fā) 明的變體CBH2的一個選擇。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以傾向于根據(jù)需要在不同宿主細胞中 表達編碼變體CBH2的DNA，應(yīng)該理解，在確定最佳表達宿主時應(yīng)該考慮變體CBH2的來源。 此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用本領(lǐng)域可獲得的工具，通過常規(guī)技術(shù)選擇特定基因的最佳 表達系統(tǒng)。B.變體CBH2多肽本發(fā)明的變體CBH2具有源自前體CBH2的氨基酸序列的氨基酸序列。通過取代、缺 失或插入前體氨基酸序列一個或多個氨基酸，CBH2變體的氨基酸序列不同于前體CBH2氨 基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，前體CBH2是紅褐肉座菌CBH2。SEQ ID NO :3顯示了紅褐 肉座菌CBH2的成熟氨基酸序列。因此，本發(fā)明涉及這樣的CBH2變體，所述變體含有等價于 紅褐肉座菌CBH2的特定鑒別殘基的位置上的氨基酸殘基。如果與紅褐肉座菌CBH2中的該 殘基的特定殘基或部分同源(即，在初級或三級結(jié)構(gòu)中位置對應(yīng))或功能類似，則CBH2同 源物的殘基(氨基酸)與紅褐肉座菌CBH2的殘基是等價的(即，具有相同或相似的功能性 能力而化學(xué)的或結(jié)構(gòu)性的結(jié)合、反應(yīng)或相互作用)。如本文中使用的，編號意在與成熟CBH2 氨基酸序列(SEQ ID NO 3)的編號的相對應(yīng)。比對氨基酸序列來確定同源性優(yōu)選的使用“序列比較算法”來確定?？梢酝ㄟ^ 例如 Smith & Waterman，Adv. App 1. Math. 2 :482 (1981)的局部同源性算法；Needleman & ffunsch, J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同源性比對算法；Pearson & Lipman, Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 85 :2444 (1988)的搜索相似性方法，通過這些算法的計算機 化運用(GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA，在 Wisconsin Genetics Software Package 中，Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wis.)或者通過視覺觀察 (visual inspection)，來執(zhí)行用于比較的優(yōu)化的序列比對，視覺觀察可以使用繪圖包，例 如 Chemical Computing Group, Montreal Canada 的 MOE0適合確定序列相似性的算法的實例是BLAST算法，描述在Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 =403-410(1990)中。用于實施BLAST分析的軟件可通過國立生物技術(shù)信息中心 (www. ncbi. nlm. nih. gov)公開獲得。該算法涉及首先鑒別高分序列對(HSP)，這是通過在 查詢序列中鑒別短的字節(jié)長度W，當(dāng)所述字節(jié)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字節(jié)比對時，匹 配或者滿足一定的正閾值分數(shù)T。這些初始的相鄰字節(jié)命中作為尋找含有它們的較長HSP 的起始點發(fā)揮作用。沿著比較的兩條序列中任一向兩個方向擴展字節(jié)命中，只要可以增加 累積比對分數(shù)。當(dāng)累積比對分數(shù)從達到的最大值下降量X ；累積分數(shù)達到O或更低；或者 達到任一條序列的末端時，停止字節(jié)命中的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對的靈 敏度和速度。BLAST程序使用的缺省值為字節(jié)長度(W)為11，BL0SUM62打分矩陣(參見 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915(1989))比對(B)為 50，期望值(E)為10，M，5，N，4，以及比較兩條鏈。然后，BLAST算法實施兩條序列之間的相似性統(tǒng)計學(xué)分析(參見例如，Karlin & Altschul, Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993))。BLAST 算法提供的一種相 似性測量是最小總概率(P(N))，其提供了在兩條核苷酸或氨基酸序列之間的匹配可以偶然 發(fā)生的概率的指示。例如，如果在測試氨基酸序列與蛋白酶氨基酸序列的比較中，最小總概 率低于約0. 1，更優(yōu)選的低于約0. 01，最優(yōu)選的低于約0. 001，則認為氨基酸序列與蛋白酶 是相似的。出于本發(fā)明的目的，可以通過本領(lǐng)域已知的計算機程序適當(dāng)?shù)拇_定同一性的程 度，例如在GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，第8版，1994年8月， Genetics Computer Group,575 Science Drive, Madison, Wis. , USA 53711)(Needleman, S. B.和 Wunsch，C.D.，(1970), Journal of Molecular Biology, 48,443-45)中提供的 GAP, 使用具有下列設(shè)定的GAP用于多核苷酸序列比較GAP生成罰分為5. 0，GAP延伸罰分為 0. 3?？梢允褂美锸夏久笴BH2和其他纖維素酶之間的結(jié)構(gòu)比對來鑒別在具有中等至 高度同源性的其他纖維素酶中的等價/對應(yīng)位置，所述同源性例如與里氏木霉CBH2(SEQ ID NO 3)約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者甚至 99% 的同 源性。獲得所述結(jié)構(gòu)比對的一種方法是使用來自GCG包的Pile Up程序，使用空位罰分的 缺省值，即空位生成罰分為3. 0，空位延伸罰分為0. 1。其他結(jié)構(gòu)比對方法包括疏水簇分析 (Gaboriaud 等人，F(xiàn)EBS Letters，224 :149_155，1987)和反向聯(lián)系(reverse threading) (Huber 禾口 Torda，Protein Science, 7 :142-149,1998) 如圖3提供了成熟形態(tài)的各種參照纖維素酶的示例性比對。參照纖維素酶包括 紅褐肉座菌(也稱為里氏木霉)CBH2 (SEQ ID NO :3)、康寧肉座菌CBH2 (SEQ ID NO :4)、特 異腐質(zhì)霉CBH2(SEQ ID NO :5)、解纖維素醋弧菌CBH2 (SEQ ID NO :6)、二孢蘑菇CBH2 (SEQ ID NO 7)、尖鐮孢EG (SEQ ID NO :8)、黃孢原毛平革菌CBH2 (SEQ ID NO :9)、埃默森籃狀菌 CBH2 (SEQ ID NO :10)、褐色嗜熱裂孢菌 6B/E3 CBH2 (SEQ ID NO :11)、褐色嗜熱裂孢菌 6A/E2 EG (SEQ ID N0:12)和糞肥纖維單胞菌 CenA EG (SEQ ID N0:13)。使用 ClustalW 和 MUSCLE 多序列比對算法比對序列。表1提供了矩陣，其顯示圖3的序列比對的纖維素酶百分比同 一性。表1.纖維素酶百分比同一性矩陣*
權(quán)利要求
1.分離的纖維素酶變體，其中所述變體是具有纖維素酶活性的成熟形態(tài)，并包含在一 個或多個選自以下位置的取代63、77、129、147、153、157、161、194、197、203、237、239、247、 254、281、285、288、289、294、327、339、344、356、378 和 382，其中位置是通過與 SEQ ID NO 3所述的參照纖維二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列對應(yīng)而編號的，且其中在一個或多個 位置的取代導(dǎo)致纖維素酶變體與參照CBH2相比具有更負的凈電荷。
2.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中在一個或多個位置的取代包括去除一個或 多個正電荷。
3.權(quán)利要求2的分離的纖維素酶變體，其中去除一個或多個正電荷包括用中性氨基酸 替換賴氨酸或精氨酸。
4.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中在一個或多個位置的取代包括添加一個或 多個負電荷。
5.權(quán)利要求4的分離的纖維素酶變體，其中添加一個或多個負電荷包括用帶負電荷的 氨基酸替換中性氨基酸。
6.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中在一個或多個位置的取代包括去除一個或 多個正電荷并添加一個或多個負電荷。
7.權(quán)利要求6的分離的纖維素酶變體，其中去除一個或多個正電荷并添加一個或多個 負電荷包括用帶負電荷的氨基酸替換賴氨酸或精氨酸。
8.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中在一個或多個位置的取代包括一個或多 個的 K129E、K157E、K194E、K288E、K327E、K356E、R63Q、R77Q、R153Q、R203Q、R294Q、R378Q、 N161D、N197D、N237D、N247D、N254D、N285D、N289D、N339D、N344D、N382D、Q147E、Q204E、Q239E 和Q281E，其中位置是通過與SEQ ID NO :3所述的參照纖維二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸 序列對應(yīng)而編號的。
9.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中變體包括在一個或多個選自146、151、189、 208、211、M4、277和405的其它位置的其它取代，其中其它位置是通過與SEQ ID NO :3所 述的參照纖維二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列對應(yīng)而編號的。
10.權(quán)利要求9的分離的纖維素酶變體，其中在一個或多個其它位置的其它取代包括 用中性氨基酸替換天冬氨酸或谷氨酸。
11.權(quán)利要求9的分離的纖維素酶變體，其中在一個或多個其它位置的其它取代包括 一個或多個的 D151N、D189N、D21 IN、D277N、D405N、E146Q、E208Q 和 E244Q，其中位置是通過 與SEQ ID NO :3所述的參照纖維二糖水解酶II (CBH2)的氨基酸序列對應(yīng)而編號的。
12.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中在一個或多個位置的取代選自1、2、3、4、 5、6、7、8、9和10個位置。
13.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中纖維素酶變體源自親本纖維素酶，所 述親本纖維素酶選自紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)CBH2、康寧肉座菌(Hypocrea koningii)CBH2、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)CBH2、解纖維素醋弧菌(Acremonium cellulolyticus)CBH2、 二 孢蘑菇(Agaricus bisporus)CBH2、尖鐮孢(Fusarium osysporum) EG、黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) CBH2、埃默森籃狀菌 (Talaromyces emersonii)CBH2、褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida. fusca)6B/E3 CBH2、褐色 嗜熱裂孢菌(Thermobifida. fusca)6A/E2 EG和糞肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)CenAEG。
14.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中纖維素酶變體源自親本纖維素酶，所述親 本纖維素酶的氨基酸序列與 SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12 禾口 SEQ ID NO 13至少75%相同。
15.權(quán)利要求1的分離的纖維素酶變體，其中與參照CBH2相比，更負的凈電荷是-1 或-2。
16.將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的方法，包括將所述生物質(zhì)與權(quán)利要求1的纖維素酶變體接觸。
17.生產(chǎn)燃料的方法，包括將生物質(zhì)組合物與包含權(quán)利要求1的纖維素酶變體的酶組合物接觸來產(chǎn)生糖溶液；和在足以生產(chǎn)燃料的條件下用發(fā)酵微生物培養(yǎng)糖溶液。
18.纖維素酶變體，其中所述變體是具有纖維素酶活性的成熟形態(tài)，并包含賴氨酸殘基 的化學(xué)修飾以去除賴氨酸殘基的正電荷。
19.權(quán)利要求18的纖維素酶變體，其中化學(xué)修飾包括用以下化合物來處理，所述化 合物選自琥珀酐、乙酰氧基丁二酸酐、馬來酸酐、酒石酸酐、鄰苯二甲酸酐、trimetallitic anhydride、順烏頭酸酐、t-硝基鄰苯二甲酸酐、乙酸酐、丁酸酐、異丁酸酐、己酸酐、戊酸酐、 異戊酸酐和新戊酸酐。
20.權(quán)利要求18的纖維素酶變體，其中纖維素酶變體源自親本纖維素酶，所述親本纖 維素酶選自紅褐肉座菌纖維二糖水解酶I、紅褐肉座菌纖維二糖水解酶II、紅褐肉座菌內(nèi) 切葡聚糖酶I、紅褐肉座菌內(nèi)切葡聚糖酶II和紅褐肉座菌β -葡糖苷酶。
21.權(quán)利要求18的纖維素酶變體，其中纖維素酶變體源自親本纖維素酶，所述親本纖 維素酶選自紅褐肉座菌CBH2、康寧肉座菌CBH2、特異腐質(zhì)霉CBH2、解纖維素醋弧菌CBH2、二 孢蘑菇CBH2、尖鐮孢EG、黃孢原毛平革菌CBH2、埃默森籃狀菌CBH2、褐色嗜熱裂孢菌6B/E3 CBH2、褐色嗜熱裂孢菌6A/E2 EG和糞肥纖維單胞菌CenA EG。
22.權(quán)利要求18的分離的纖維素酶變體，其中纖維素酶變體源自這樣的親本纖維素 酶，所述親本纖維素酶的氨基酸序列與SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 13 至少 75%相同。
23.權(quán)利要求18的分離的纖維素酶變體，其中纖維素酶變體包括在選自63、77、129、 147、153、157、161、194、197、203、237、239、247、254、281、285、288、289、294、327、339、344、 356,378和382的一個或多個位置上的取代，其中所述位置是通過與SEQ ID NO 3所述的 參照纖維二糖水解酶II(CBH2)的氨基酸序列對應(yīng)來編號的。
全文摘要
本發(fā)明涉及纖維素酶變體。特別是本發(fā)明涉及具有與非纖維素物質(zhì)降低的結(jié)合的纖維素酶變體。還描述了編碼纖維素酶的核酸，包含所述纖維素酶的組合物，鑒別纖維素酶變體的方法和使用組合物的方法。
文檔編號C12N9/42GK102057041SQ200980121072
公開日2011年5月11日 申請日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者A·劉, B·R·凱萊門, L·G·卡斯康-佩雷拉, T·卡佩爾 申請人:丹尼斯科美國公司