專利名稱：通過rna干擾引入復(fù)能基因而重編程細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞、細(xì)胞分化、體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移和基于細(xì)胞 的治療法的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于重編程細(xì)胞的方法、組合物和試劑 盒以及基于細(xì)胞的治療法。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)學(xué)作為許多人疾病的治療極具潛力，但是還伴隨著現(xiàn)代科學(xué)研究中遇到的 一些最困難的技術(shù)挑戰(zhàn)。再生醫(yī)學(xué)的技術(shù)挑戰(zhàn)包括低克隆效率、可能的復(fù)能(pluripotent) 組織供應(yīng)不足和對(duì)于如何控制細(xì)胞分化和哪種類型的胚胎干細(xì)胞可用于選擇的治療的知 識(shí)的普遍缺乏。盡管ES細(xì)胞具有極大的可塑性，但是未分化的ES細(xì)胞可以形成含有混合 組織類型的畸胎瘤(良性腫瘤)。此外，從一種來源向另一來源移植ES細(xì)胞將需要施用藥 物來防止新細(xì)胞的排斥。已經(jīng)進(jìn)行了嘗試來鑒定由非胎兒來源的組織產(chǎn)生干細(xì)胞的新途徑。一種方法包括 自體的成體干細(xì)胞的處理。使用自體的成體干細(xì)胞用于再生醫(yī)學(xué)的優(yōu)點(diǎn)在于以下事實(shí)它 們來源并返回同一患者，并且因此不會(huì)經(jīng)受免疫介導(dǎo)的排斥。缺點(diǎn)是這些細(xì)胞缺乏ES細(xì)胞 的可塑性和復(fù)能性并且因此它們的潛能是不確定的。另一方法著眼于將來自成體組織的體 細(xì)胞重編程以產(chǎn)生復(fù)能ES樣細(xì)胞。然而，這種方法是困難的，因?yàn)槎嗉?xì)胞生物體中的每種 細(xì)胞類型具有獨(dú)特的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，認(rèn)為該標(biāo)記在細(xì)胞分化之后或從細(xì)胞周期退出之后 是固定的。細(xì)胞DNA —般以染色質(zhì)的形式存在，染色質(zhì)是包含核酸和蛋白質(zhì)的復(fù)合體。事實(shí) 上，大部分的細(xì)胞RNA分子還以核蛋白復(fù)合體的形式存在。如本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知 的，染色質(zhì)的核蛋白結(jié)構(gòu)已成為廣泛的研究課題。一般而言，染色體DNA被包裝成核小體。 核小體包含核心和連接區(qū)。核小體核心包含核心組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3和H4各兩個(gè))， 約150個(gè)堿基對(duì)的染色體DNA纏繞在該八聚體周圍。此外，約50個(gè)堿基對(duì)的連接區(qū)DNA區(qū) 段與連接區(qū)組蛋白Hl締合。核小體被組織成更高階的染色質(zhì)纖維并且染色質(zhì)纖維被組織 成染色體。參見,例如,Wolffe" Chromatin Structure and Function(染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功 能)“3.sup. rd Ed. , Academic Press, San Diego,1998。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)不是靜止的，而是經(jīng)受著統(tǒng)稱為染色質(zhì)重建的過程的修飾。染色質(zhì) 重建可以用于例如，從DNA區(qū)清除核小體；將核小體從一個(gè)DNA區(qū)移到另一個(gè)DNA區(qū)；改變核小體之間的間距；或添加核小體到染色體中的DNA區(qū)。染色質(zhì)重建還可以導(dǎo)致更高階 結(jié)構(gòu)的改變，從而影響轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)(開放染色質(zhì)(open chromatin)或常染色質(zhì))與 無轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)(閉合染色質(zhì)(closed chromatin)或異染色質(zhì))之間的平衡。染色體蛋白經(jīng)受了大量類型的化學(xué)修飾。這些核心組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾的一種機(jī) 制是高度保守的堿性N-末端賴氨酸殘基的氨基的可逆乙酰化。組蛋白乙?；姆€(wěn)態(tài) 是由競爭性的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶與組蛋白脫乙酰酶之間的動(dòng)態(tài)平衡建立的，組蛋白脫乙 酰酶在本文稱為HDAC。早已將組蛋白乙?；c脫乙酰化與轉(zhuǎn)錄控制聯(lián)系起來?？赡娴慕M蛋 白乙?；梢詫?dǎo)致染色質(zhì)重建并且如此可以作為基因轉(zhuǎn)錄的控制機(jī)制起作用。一般而言， 組蛋白的高度乙酰化有利于基因表達(dá)，而組蛋白脫乙酰化則與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)聯(lián)。據(jù)顯示組 蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶充當(dāng)轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白，而脫乙酰酶則被發(fā)現(xiàn)是屬于轉(zhuǎn)錄抑制途徑的。組蛋白乙?；c脫乙?；g的動(dòng)態(tài)平衡是正常細(xì)胞生長所需的。組蛋白脫乙酰 化的抑制導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞分化、凋亡和轉(zhuǎn)化的表型逆轉(zhuǎn)。參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的另一組蛋白是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)，它們負(fù)責(zé)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄 沉默的基因組甲基化模式的產(chǎn)生。DNA甲基化對(duì)于許多哺乳動(dòng)物過程是重要的，所述過程包 括胚胎發(fā)育、X失活、基因組印跡以及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。哺乳動(dòng)物中的DNA甲基化是通過將 甲基從S-腺苷-甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的C5位置達(dá)成的。這個(gè)反應(yīng)是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 催化的并且是對(duì)CpG 二核苷酸中的胞嘧啶特異的。在人基因組中CpG 二核苷酸中的所有胞 嘧啶的百分之七十是甲基化的并且傾向于脫氨化，從而導(dǎo)致胞嘧啶向胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換。這個(gè) 過程導(dǎo)致鳥嘌呤和胞嘧啶的頻率總體降低至所有核苷酸的約40%，并且還將CpG 二核苷酸 的頻率降低至它們的期望頻率的約四分之一。已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中鑒定了四種活性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT2、MMT3A和 DNMT3B。此外，DNMT3L是結(jié)構(gòu)上與DNMT3A和DNMT3B極為相似的蛋白并且對(duì)于DNA甲基化 是關(guān)鍵的，但是其本身似乎是無活性的。在含有CpG島的啟動(dòng)子區(qū)中胞嘧啶的甲基化導(dǎo)致 脊椎動(dòng)物細(xì)胞中下游編碼序列的轉(zhuǎn)錄滅活。認(rèn)為稱為甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD1至4)的蛋白家族在甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默中 起重要作用。MeCP2是這種家族被鑒定的第一個(gè)成員并且其含有甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域MBD) 和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域(TRD)，它促進(jìn)與甲基化的DNA的相互作用并將Sin3A/HDAC復(fù)合體靶向 甲基化的DNA。與MeCP2類似，據(jù)顯示MBD1、MBD2和MBD3是有效的轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白。MBD4是 DNA糖基化酶，它修復(fù)G:T錯(cuò)配。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，除了 MBD3之外的這種家族的每一個(gè)成 員與甲基化的DNA形成復(fù)合體，并且除了 MBDl和MBD4之外全部都位于已知的染色質(zhì)重建 復(fù)合體中。幾種蛋白和蛋白復(fù)合體如Mi-2復(fù)合體將DNA甲基化與染色質(zhì)重建和組蛋白脫 乙?；悸?lián)起來。參與表觀遺傳性調(diào)節(jié)的另一組蛋白是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)，它們是催化將 一至三個(gè)甲基從輔因子S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基的酶，組蛋 白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白-精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶。甲基化的組蛋白更緊密地結(jié) 合DNA，這抑制了轉(zhuǎn)錄。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)還可以通過稱為染色質(zhì)重建復(fù)合體的大分子裝配體的活性來改變。 參見，例如 Cairns (1998) Trends Biochem. Sci. 23 20 25 ；Workman 等人(1998) Ann. Rev. Biochem. 67 545 579 ；Kingston 等人(1999) Genes Devel. 13 2339 2352 ；以及 Murchardt等人(1999)J. Mol. Biol. 293 :185 197。染色質(zhì)重建復(fù)合體參與了核小體陣列的破壞或再 形成，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、DNA復(fù)制和DNA修復(fù)(Bochar等人(2000)PNAS USA 97(3) 1038 43)。這些染色質(zhì)重建復(fù)合體的許多具有不同的亞基組成，但是重建活性全部都依賴 于ATP酶。還存在體內(nèi)基因激活需要染色質(zhì)重建復(fù)合體的活性的幾個(gè)實(shí)例。復(fù)能細(xì)胞或全能細(xì)胞向分化的、特化的表型的發(fā)育是由發(fā)育期間表達(dá)的特定組的 基因決定的。基因表達(dá)是直接由可以影響正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)的基因調(diào)節(jié)蛋白的序列特異性結(jié) 合介導(dǎo)的。然而，這些調(diào)節(jié)蛋白的任一種直接介導(dǎo)基因表達(dá)的能力至少部分取決于它們?cè)?細(xì)胞DNA內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)的可接近性。如上面所討論的，細(xì)胞DNA中序列的可接近性通常取 決于在其中包裝細(xì)胞DNA的細(xì)胞染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，鑒定可以誘導(dǎo)復(fù)能性所需的基因表達(dá)的方法、組合物和試劑盒將是有用的， 包括可以抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的基因的活性、表達(dá)或活性和表達(dá)二者的方法、組合物和試劑
品.ο發(fā)明簡述本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法、組合物和試劑盒。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包括誘 導(dǎo)復(fù)能基因或多能(multipotent)基因表達(dá)的方法。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及包 括制備重編程的細(xì)胞的方法。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括抑制編碼參與轉(zhuǎn)錄阻抑 的蛋白的至少一種基因表達(dá)的方法。該方法還包括誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)以及重 編程細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及重編程細(xì)胞的方法，所述方法包括使細(xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞 培養(yǎng)物、來自細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞亞群、同質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物或異質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物接觸阻礙編碼參 與轉(zhuǎn)錄阻抑的蛋白的基因表達(dá)的劑；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達(dá)；以及重編程細(xì)胞。所 述方法還包括使重編程的細(xì)胞再分化。阻礙編碼參與轉(zhuǎn)錄阻抑的蛋白的基因表達(dá)的劑包括但不限于shRNA分子、 shRNAmir分子、shRNA分子的組合、shRNAmir分子的組合以及shRNA和shRNAmir分子的組
口 O可以通過本發(fā)明的方法抑制編碼參與轉(zhuǎn)錄阻抑的蛋白的任何基因，包括但不限于 編碼下列蛋白的基因DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶、賴氨酸甲 基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫甲基酶、賴氨酸脫甲基酶、sirtuirusirtuin激活蛋白、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域 蛋白、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、SWI/SNF復(fù)合體的組分、NuRD復(fù)合體的組分以及IN080復(fù)合體的 組分?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法抑制單個(gè)基因或多于一種的基因，包括但不限于2種、3種、4 種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11-20種、21-30種、31-40種、41-50種和大于50種基 因。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程的方法，該方法包括將細(xì)胞暴露于干擾編 碼調(diào)節(jié)蛋白的基因表達(dá)的shRNA構(gòu)建體；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)；以及選擇細(xì)胞， 其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括下列的方法將具有第一表型的細(xì)胞暴露于 干擾編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因表達(dá)的shRNA構(gòu)建體；比較細(xì)胞的所述第一表型與將所述細(xì)胞暴 露于所述shRNA構(gòu)建體后所獲得的表型；以及選擇被重編程的細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，方 法包括比較在將細(xì)胞暴露于所述shRNA構(gòu)建體之前的細(xì)胞基因型與將所述細(xì)胞暴露于所述shRNA構(gòu)建體之后所獲得的細(xì)胞基因型。在再一實(shí)施方案中，方法包括比較在將細(xì)胞暴 露于shRNA構(gòu)建體之前的細(xì)胞表型和基因型與將所述細(xì)胞暴露于所述shRNA構(gòu)建體之后的 細(xì)胞表型和基因型。在又一實(shí)施方案中，方法包括將選擇的細(xì)胞培養(yǎng)或擴(kuò)增為細(xì)胞群。在又一實(shí)施 方案中，方法包括使用與由復(fù)能基因或多能基因所編碼的蛋白結(jié)合的抗體或使用與多能 標(biāo)記物或復(fù)能標(biāo)記物結(jié)合的抗體分離細(xì)胞，所述多能標(biāo)記物或復(fù)能標(biāo)記物包括但不限于 SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。還可以使用有效分離細(xì)胞的任何方法分離細(xì)胞，包括 但不限于熒光細(xì)胞激活的分選儀、免疫組織化學(xué)和ELISA。在另一實(shí)施方案中，方法包括選 擇與原始細(xì)胞相比具有較低分化狀態(tài)的細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括比較暴露于所述shRNA構(gòu)建體之前的復(fù)能基因 或多能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與暴露于所述劑之后所獲得的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將具有第一轉(zhuǎn)錄 模式的細(xì)胞暴露于shRNA構(gòu)建體；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)；比較細(xì)胞的所述第一 轉(zhuǎn)錄模式與暴露于所述shRNA構(gòu)建體之后所獲得的轉(zhuǎn)錄模式；以及選擇細(xì)胞，其中所述細(xì) 胞已恢復(fù)分化潛能。在又一實(shí)施方案中，選擇細(xì)胞包括鑒定轉(zhuǎn)錄模式至少5-10%、10-20%、20_30%、 30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-94%、95%或 95-99%類似于分 析的胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式的細(xì)胞。不需要比較胚胎干細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄模式，盡管這是可 以的。然而，可以比較的胚胎基因的亞組包括但不限于1_5個(gè)、5-10個(gè)、10-25個(gè)、25-50 個(gè)、50-100 個(gè)、100-200 個(gè)、200-500 個(gè)、500-1，000 個(gè)、1，000-2，000 個(gè)、2，000-2，500 個(gè)、 2，500-5, 000個(gè)、5，000-10, 000個(gè)和多于10，000個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄模式可以以二元形式比較， 即，可以進(jìn)行比較來確定基因是轉(zhuǎn)錄的還是未轉(zhuǎn)錄的。在另一實(shí)施方案中，可以比較每種基 因或基因亞組的轉(zhuǎn)錄速率和/或程度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法來確定轉(zhuǎn)錄模 式，包括但不限于RT-PCR、定量PCR、微陣列、DNA印跡和雜交。在又一實(shí)施方案中，可以使用至少一種shRNA或shRNAmir序列來抑制DNA甲基轉(zhuǎn) 移酶、組蛋白脫乙酰酶、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。在再一實(shí)施方案 中，可以使用多于一種的shRNA或shRNAmir來抑制參與轉(zhuǎn)錄阻抑的多于一種蛋白的表達(dá)， 所述蛋白包括但不限于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白或組蛋白 甲基轉(zhuǎn)移酶。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞暴露于干 擾編碼第一調(diào)節(jié)蛋白的基因表達(dá)的shRNA構(gòu)建體；將所述細(xì)胞暴露于抑制第二調(diào)節(jié)蛋白的 活性、表達(dá)或表達(dá)和活性的第二劑，其中所述第二調(diào)節(jié)蛋白具有與所述第一調(diào)節(jié)蛋白不同 的功能；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)；以及選擇細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。 在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞群可以同時(shí)或順序地暴露于第一劑和第二劑。所述第二劑 包括但不限于小分子、小分子抑制劑、小分子激活劑、核酸序列和shRNA構(gòu)建體。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括使用根據(jù)本文所公開的方法制備的重編程的細(xì)胞治療 多種疾病的方法。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及重編程的細(xì)胞和再分化的重編程的細(xì) 胞的治療用途。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及包括篩選參與重編程細(xì)胞的基因的方法。在又一實(shí)施方案中，方法還包括篩選編碼抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白的基因。在再一實(shí)施方案中，方法包括篩選促使 細(xì)胞為復(fù)能或多能的基因。篩選可以使用適當(dāng)?shù)暮Y選試劑進(jìn)行，所述篩選試劑包括但不限 于shRNA文庫或shRNAmir文庫。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及由本發(fā)明的方法制備的重編程的細(xì)胞。重編程的細(xì)胞可 以再分化為單個(gè)譜系或多于一種譜系。重編程的細(xì)胞可以是多能的或復(fù)能的。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)包括下列步驟的方法制備的富集的重編程 的細(xì)胞群將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達(dá)的shRNA構(gòu)建體；和選擇細(xì)胞，其 中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能；以及培養(yǎng)所述選擇的細(xì)胞以制備細(xì)胞群。在又一實(shí)施方案 中，重編程的細(xì)胞表達(dá)選自由下列組成的組的細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA3、SSEA4、Tra-1-60 和Tra-1-81。在又一實(shí)施方案中，重編程的細(xì)胞可以通過復(fù)能基因或多能基因的蛋白表 達(dá)來選擇，所述復(fù)能基因或多能基因包括但不限于Oct-3/4、Sox-2、Nanog和Klf4。在又 一實(shí)施方案中，重編程的細(xì)胞占富集的細(xì)胞群的至少5-10%、10-20%、20-30%、30-40%、 40-50%,50-60%,60-70%,70-80%,80-90%,90-95%,96-98% ；或至少 99%。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及用于制備本發(fā)明的方法和組合物的試劑盒。該試劑盒尤 其可用于重編程細(xì)胞和產(chǎn)生ES樣細(xì)胞和干細(xì)胞樣細(xì)胞。附圖
簡述圖IA是報(bào)道在用DWTl shRNA感染的細(xì)胞中0ct_4的表達(dá)增加和DWTl的表達(dá) 降低的圖。圖IB是報(bào)道在用DNMTl shRNA感染并在hES培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中0ct_4的表 達(dá)增加和DNMTl的表達(dá)降低的圖。圖2A是在DNMTl的shRNA敲低之后形成的胚胎樣體的照片。圖2B是展示圖2A中所顯示的胚胎樣體內(nèi)存在的細(xì)胞中的GFP定位的照片，它證 實(shí)了慢病毒感染。圖2C是在DNMTl的shRNA敲低之后形成的胚胎樣體的照片。圖2D是展示在圖2C所顯示的胚胎樣體中DNMTl的shRNA敲低所誘導(dǎo)的Sox2蛋 白表達(dá)的照片。圖2E是在DNMTl的shRNA敲低之后形成的胚胎樣體的照片。圖2F是展示在圖2E所顯示的胚胎樣體中DNMTl的shRNA敲低所誘導(dǎo)的0ct4蛋 白表達(dá)的照片。圖2G是在培養(yǎng)物中生長的成纖維細(xì)胞的照片。圖2H是展示在圖2G所顯示的胚胎樣體中DNMTl的shRNA敲低所誘導(dǎo)的SSEA4蛋 白表達(dá)的照片。圖3A是報(bào)道在用DNMTl shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中0ct_4的表達(dá)增 加和DNMTl的表達(dá)降低的圖。圖3B是報(bào)道在用DNMTl shRNA感染并且在存在嘌呤霉素的條件下培養(yǎng)的人胎兒 皮膚成纖維細(xì)胞中Oct-4的表達(dá)增加和DNMTl的表達(dá)降低的圖。圖3C是報(bào)道在用DNMTl shRNA感染并且在存在嘌呤霉素和hES培養(yǎng)物的條件下 培養(yǎng)的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中Oct-4的表達(dá)增加和DNMTl的表達(dá)降低的圖。圖4A是報(bào)道在用DNMTl shRNA感染的人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞中0ct_4的表達(dá)增加和DNMTl的表達(dá)降低的圖。圖4B是報(bào)道在用DNMTl shRNA感染并且在存在嘌呤霉素的條件下培養(yǎng)的人新生 兒皮膚成纖維細(xì)胞中Oct-4的表達(dá)增加和DNMTl的表達(dá)降低的圖。圖4C是報(bào)道在用DNMTl shRNA感染并且在存在嘌呤霉素和hES培養(yǎng)物的條件下 培養(yǎng)的人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞中Oct-4的表達(dá)增加和DNMTl的表達(dá)降低的圖。圖5A是報(bào)道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下成人皮膚成纖維細(xì)胞中 0ct-4mRNA的表達(dá)增加的圖。圖5B是報(bào)道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞 中0ct-4mRNA的表達(dá)增加的圖。圖5C是報(bào)道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中 0ct-4mRNA的表達(dá)增加的圖。圖6A是報(bào)道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下成人皮膚成纖維細(xì)胞中 Nanog mRNA的表達(dá)增加的圖。圖6B是報(bào)道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下人新生兒皮膚成纖維細(xì)胞 中Nanog mRNA的表達(dá)增加的圖。圖6C是報(bào)道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中 Nanog mRNA的表達(dá)增加的圖。圖7A是人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖7B是用DNMTl shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖7C是用HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖7D是用DNMTl和HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖7E是用DNMTl和HDACll shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖7F是用HDACl 1和HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖7G是人胚胎干細(xì)胞的照片。圖8A是人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8B是用DNMTl shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8C是用DNMTl和HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8D是用DNMTl和HDACll shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8E是用HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8F是用HDACll和HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的照片。圖8G是人胚胎干細(xì)胞的照片。優(yōu)選實(shí)施方案詳述定義除非另外指明，否則本公開內(nèi)容中的數(shù)字范圍是近似的，并且因此可以包括該范 圍之外的值。數(shù)字范圍包括來自以一個(gè)單位遞增中的下限值和上限值之間的所有值并且 包括下限值和上限值，前提條件是在任何下限值和任何上限值之間存在至少兩個(gè)單位的分 隔。作為實(shí)例，如果成分特征、物理特征或其他特征諸如分子量、粘度等是100至1，000，則 旨在清楚地列舉所有單個(gè)的值例如100、101、102等，和子范圍例如100至144、155至170、 197至200等。對(duì)于含有小于1的值或含有大于1的分?jǐn)?shù)數(shù)字(例如，1. 1、1. 5等)的范圍，一個(gè)單位視情況被認(rèn)為是0. 0001,0. 001,0. 01或0. 1。對(duì)于含有小于10的單數(shù)字的范圍 (例如，1至5)，通常認(rèn)為一個(gè)單位是0. 1。這些僅是具體意指的實(shí)例，認(rèn)為在所列舉的最低 值和最高值之間的所有可能的數(shù)值組合均清楚地在本公開內(nèi)容中陳述。在本公開內(nèi)容中尤 其提供的數(shù)字范圍是混合物中組分的相對(duì)量以及方法中所引用的各種溫度和其他參數(shù)范 圍。除非明確限制為相反的情況，否則細(xì)胞(“cell”或“cells”)包括任何體細(xì) 胞、胚胎干(ES)細(xì)胞、成體干細(xì)胞、器官特異性干細(xì)胞、核轉(zhuǎn)移(NT)單位以及干樣細(xì)胞 (stem-like cell)。細(xì)胞可以由任何器官或組織獲得。細(xì)胞可以是人或其他動(dòng)物的。例如， 細(xì)胞可以是小鼠的、豚鼠的、大鼠的、牛的、馬的、豬的、綿羊的、山羊的等。細(xì)胞還可以來自 非人的靈長類。“培養(yǎng)基”或“生長培養(yǎng)基”意指能夠支持細(xì)胞生長的合適的培養(yǎng)基?！胺只币庵冈谂咛グl(fā)育期間細(xì)胞變得在結(jié)構(gòu)和功能上特化的過程。"DNA甲基化”意指甲基(一CH3基團(tuán))連接到胞嘧啶上。這是作為保護(hù)自身DNA 免受為破壞外來DNA所產(chǎn)生的酶和化學(xué)物的破壞的方式和作為調(diào)節(jié)DNA中的基因轉(zhuǎn)錄的方 式常規(guī)進(jìn)行的?！氨碛^遺傳學(xué)”意指關(guān)于在不改變核苷酸序列的條件下功能上的可遺傳改變的DNA 狀態(tài)。表觀遺傳學(xué)改變可以是由諸如甲基化和脫甲基化等DNA修飾引起的，而沒有任何DNA 核苷酸序列的改變?！敖M蛋白”意指存在于染色體中的一類蛋白質(zhì)分子，它負(fù)責(zé)將DNA壓縮得足以使 DNA適于在核內(nèi)?！耙种苹蚋蓴_基因的表達(dá)”意指降低基因的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，這種基因表 達(dá)的降低是至少約5-25%，更優(yōu)選至少約50%，仍然更優(yōu)選至少約75%，并且仍然更優(yōu)選 至少約90 %。在其他實(shí)施方案中，基因表達(dá)降低了至少95 %，并且在又一實(shí)施方案中，基因 表達(dá)降低了至少99%?！扒玫汀币庵敢曰蛱禺愋苑绞阶枰只虻谋磉_(dá)。具有一種或多種基因被“敲低” 的細(xì)胞被稱為敲低生物體或簡單稱為“敲低”?！皬?fù)能”意指能夠分化成3胚層細(xì)胞類型或基本組織類型?！皬?fù)能基因”意指促使細(xì)胞為復(fù)能的基因?！皬?fù)能細(xì)胞培養(yǎng)物”在表現(xiàn)出將它們與胚胎或成體來源的分化的細(xì)胞明顯區(qū)別開 的形態(tài)時(shí)被說成是“基本上未分化的”。復(fù)能細(xì)胞通常具有高的核/胞質(zhì)比、突出的核仁以 及具有差的辨識(shí)度的細(xì)胞連接的緊密集落形成，并且容易被本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員識(shí)別。 認(rèn)識(shí)到未分化的細(xì)胞集落可以被分化的鄰近細(xì)胞環(huán)繞。然而，當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)時(shí)， 基本上未分化的集落繼續(xù)存在，并且在分離培養(yǎng)的細(xì)胞后未分化的細(xì)胞構(gòu)成了大部分的細(xì) 胞。本公開內(nèi)容中描述的可用的細(xì)胞群含有任何比例的具有這些標(biāo)準(zhǔn)的基本上未分化的復(fù) 能細(xì)胞。基本上未分化的細(xì)胞培養(yǎng)物可以含有至少約20%、40%、60%或甚至80%未分化 的復(fù)能細(xì)胞(以群中總細(xì)胞的百分比計(jì))?！罢{(diào)節(jié)蛋白”意指調(diào)節(jié)生物過程的任何蛋白，包括正向和負(fù)向的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)蛋白可 以對(duì)生物過程具有直接或間接的作用，并且可以直接施加影響或通過參與到復(fù)合體中來施 加影響。
“重編程”意指移除核中的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，然后建立不同組的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記。 在多細(xì)胞生物體的發(fā)育期間，不同的細(xì)胞和組織獲得不同的基因表達(dá)程序。這些不同的基 因表達(dá)模式表現(xiàn)為實(shí)際上由諸如DNA甲基化、組蛋白修飾和其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白的表觀遺 傳學(xué)修飾調(diào)節(jié)。因此多細(xì)胞生物體中的每種細(xì)胞類型具有獨(dú)特的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，常規(guī)上 認(rèn)為該標(biāo)志在細(xì)胞分化后或退出細(xì)胞周期之后變成“固定的”和不變的。然而，一些細(xì)胞在 正常發(fā)育或某些疾病期間會(huì)進(jìn)行主要的表觀遺傳學(xué)“重編程”。“全能”意指能夠發(fā)育成整個(gè)胚胎或器官。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)的 方法。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為多能的至少一種基因表達(dá)的方法。 在一些實(shí)施方案中，方法包括誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)，和制備是 復(fù)能或多能的并且能夠定向分化成多個(gè)譜系的重編程的細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及包括下列的方法修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和將細(xì)胞重編程為復(fù) 能或多能的。在又一實(shí)施方案中，修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)包括抑制編碼參與阻抑復(fù)合體的蛋白的 至少一種基因表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，方法包括抑制編碼參與轉(zhuǎn)錄阻抑的蛋白的至少一種基因表 達(dá)，以及誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，方法包括 抑制編碼參與轉(zhuǎn)錄阻抑的蛋白的至少一種基因表達(dá)以及制備重編程的細(xì)胞。本發(fā)明的方法 可以抑制編碼參與任何類型的阻抑的蛋白的基因表達(dá)，所述蛋白包括但不限于活性阻抑 蛋白、修飾基本轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的阻抑蛋白、修飾募集阻抑蛋白的結(jié)構(gòu)的蛋白、募集阻抑蛋白的蛋 白、修飾核小體或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白、修飾組蛋白的蛋白、修飾DNA的蛋白、以及參與染色 質(zhì)重建復(fù)合體的蛋白。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞暴露于 干擾編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因表達(dá)的shRNA構(gòu)建體；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達(dá)；以及選 擇細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。復(fù)能基因或多能基因可以被誘導(dǎo)為表達(dá)增加任何 倍數(shù)，包括但不限于 0. 25-0. 5,0. 5-1,1. 0-2. 5,2. 5_5、5_10、10-15、15-20、20-40、40_50、 50-100、100-200、200-500和大于500。在另一實(shí)施方案中，方法包括鋪板分化的細(xì)胞；將 所述分化的細(xì)胞暴露于干擾編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因表達(dá)的shRNA構(gòu)建體；培養(yǎng)所述細(xì)胞；以 及鑒定已被重編程的細(xì)胞。shRNA構(gòu)建體可以任何量干擾調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，包括但不限于 1-5%,5-10%, 10-20 %、20-30 %、30-40 %、40-50 %、50-60 %、60-70 %、70-80 %、80-90 %、 90-95%和 95-9999-200200-300300-400400-500% 以及大于 500%。在又一實(shí)施方案中，方法還包括使用針對(duì)由復(fù)能基因或多能基因編碼的蛋白或蛋 白片段的抗體或針對(duì)復(fù)能或多能表面標(biāo)記物的抗體選擇細(xì)胞?？梢允褂萌魏晤愋偷目贵w， 包括但不限于單克隆的、多克隆的、抗體片段、肽模擬物、活性區(qū)域的抗體以及蛋白保守區(qū) 域的抗體。在又一實(shí)施方案中，方法包括選擇細(xì)胞，以及將所述細(xì)胞擴(kuò)增或培養(yǎng)為復(fù)能細(xì)胞 培養(yǎng)物或多能細(xì)胞培養(yǎng)物。在又一實(shí)施方案中，方法還包括使用由復(fù)能基因或多能基因驅(qū)動(dòng)的報(bào)道分子或復(fù) 能或多能表面標(biāo)記物選擇細(xì)胞。可以使用任何類型的報(bào)道分子，包括但不限于熒光蛋白、 綠色熒光蛋白、青色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、細(xì)菌螢光素酶、水母發(fā)光蛋白、 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、turbo GFP、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、dsRED、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。在又一實(shí)施方案中，方法還包括使用抗性作為選擇標(biāo)記物來選擇細(xì)胞，所述抗性 包括但不限于抗生素抗性、殺真菌劑抗性、嘌呤霉素抗性、潮霉素抗性、二氫葉酸還原酶抗 性、胸苷激酶抗性、新霉素抗性(neo)、G418抗性、麥考酚酸抗性(gpt)、博來霉素(zeocin) 抗性蛋白和鏈霉素抗性。在又一實(shí)施方案中，方法還包括比較在將細(xì)胞暴露于shRNA構(gòu)建體之前細(xì)胞的復(fù) 能基因或多能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與用所述shRNA構(gòu)建體處理之后所獲得的復(fù)能基因或多 能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)?？梢员容^染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何方面，包括但不限于常染色質(zhì)、異染色 質(zhì)、組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化、組蛋白或組蛋白組分的存在和不存在、組蛋白的定位、組 蛋白的排列以及與染色質(zhì)締合的調(diào)節(jié)蛋白的存在或不存在。可以比較基因任一區(qū)域的染色 質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括但不限于增強(qiáng)子元件、激活子元件、啟動(dòng)子、TATA框、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游區(qū) 域、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子。抑制編碼參與轉(zhuǎn)錄阻抑的蛋白的基因表達(dá)可以通過任何合適的機(jī)制來完成，所述 機(jī)制包括但不限于RNA干擾(RNAi)。RNAi經(jīng)由通過以序列特異性方式降解靶mRNA的普遍 機(jī)制來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。小干擾RNA鏈(siRNA)是RNAi過程的關(guān)鍵，并且具有靶RNA鏈的互 補(bǔ)核苷酸序列。特定的RNAi途徑蛋白通過siRNA被導(dǎo)向靶向的信使RNA(mRNA)，它們?cè)诖?處將靶“裂解”，將靶降解為不能再被翻譯成蛋白的較小的部分。在另一實(shí)施方案中，方法包括使細(xì)胞接觸短發(fā)夾RNA(shRNA)，以及抑制編碼參與 轉(zhuǎn)錄阻抑的蛋白的至少一種基因表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，方法還包括制備重編程的細(xì)胞。 重編程的細(xì)胞可以是復(fù)能或多能的。ShRNA是產(chǎn)生可用于沉默基因表達(dá)的緊密發(fā)夾彎(hairpin turn)的RNA序列； shRNA的使用是實(shí)現(xiàn)RNA干擾的一種方法。在一些實(shí)施方案中，可以將shRNA摻入到具有啟 動(dòng)子的載體中以確保shRNA被表達(dá)，所述啟動(dòng)子包括但不限于U6啟動(dòng)子。載體通常被傳到 子代細(xì)胞，從而容許基因沉默被遺傳。shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)被細(xì)胞機(jī)構(gòu)裂解為短的干擾RNA，所 述短的干擾RNA然后結(jié)合至RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。這種復(fù)合體結(jié)合并裂解與其所 結(jié)合的siRNA匹配的mRNA?？梢詫hRNA整合到慢病毒構(gòu)建體中。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一類緩慢的病 毒，它由長孵育期間表征。慢病毒可以遞送大量遺傳信息給宿主細(xì)胞DNA，并且因此是基因 遞送載體的有效方法。在另一實(shí)施方案中，shRNA文庫可用于本發(fā)明的方法以鑒定參與轉(zhuǎn)錄阻抑的因子、 參與染色質(zhì)重建的因子以及促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的因子。在又一實(shí)施方案中，shRNA文 庫可以來自RNAi聯(lián)盟(TRC)，RNAi聯(lián)盟是11個(gè)世界上有名的學(xué)院和公司的生命科學(xué)研究 組的協(xié)會(huì)團(tuán)體，他們的任務(wù)是制造用于功能基因組研究的全面工具并使它們廣泛可用于全 世界科學(xué)家。在麻省理工和哈佛的Broad學(xué)院發(fā)展的TRC集團(tuán)目前包括靶向16，000種注 釋的人基因的159，000種預(yù)克隆的shRNA構(gòu)建體。shRNA構(gòu)建體、文庫和載體可以常規(guī)制備或可以購自商業(yè)來源，包括但不限于從 Dharmacon RNAi technologies (Thermo Scientific，Lafayette，CO)獲得的 SMART 載體 shRNA 慢病毒技術(shù)；從 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)獲得的 MISSION TRC shRNA;從 Open Biosystems (Huntsville, AL)獲得的TRC慢病毒shRNA文庫；具有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、不同的選擇標(biāo)記物和病毒遞送選擇的BLOCK-iT RNAi載體，其用慢病毒載體和腺病毒載體 (Invitrogen, Carlsbad, CA)可獲得。此外，針對(duì)于特定靶的shRNA分子還可以從諸如OriGene (Rockvi 1 Ie，MD)和Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California)的商業(yè)來源獲得。誘導(dǎo)型 shRNA 也可從 Clonetech(Mountainview,CA)獲得。敲除誘導(dǎo)型RNAi系統(tǒng)緊密地調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有 功能的短發(fā)夾RNA(shRNA)的表達(dá)以便沉默靶基因。敲除誘導(dǎo)型RNAi系統(tǒng)在基因的阻抑是 致死的從而阻止其分析的情況下是可用的。有幾種可用的形式敲除單載體誘導(dǎo)型RNAi系 統(tǒng)和敲除Tet RNAi系統(tǒng)H和P。在另一實(shí)施方案中，方法包括使細(xì)胞接觸shRNAmir以及抑制參與轉(zhuǎn)錄阻抑的至 少一種基因表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，方法還包括制備重編程的細(xì)胞。重編程的細(xì)胞可以 是復(fù)能或多能的。微RNA(miRNA)是長度為約21_23個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，它調(diào)節(jié)基因表達(dá)。 miRNA由DNA轉(zhuǎn)錄而來的基因編碼但是不翻譯成蛋白(非編碼RNA)；而是他們由被稱 為pri-miRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工為被稱為pre-miRNA的短的莖環(huán)結(jié)構(gòu)并最終加工為功能 miRNA。成熟miRNA分子與一種或多種信使RNA(mRNA)分子部分互補(bǔ)，并且它們的主要功能 是下調(diào)基因表達(dá)。哺乳動(dòng)物RNAi的shRNAmir觸發(fā)子是基于對(duì)內(nèi)源微RNA生物發(fā)生途徑的現(xiàn)有知 識(shí)。shRNAmir構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為模擬天然的微RNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，從而使得能夠被內(nèi)源RNAi途 徑特異性加工并產(chǎn)生有效的基因敲低?；蚪M范圍的shRNAmir文庫以增加基因敲低的效 力和特異性為目標(biāo)整合了幾種特征，從而提供了多種RNAi應(yīng)用的方法。shRNAmir文庫可用于本發(fā)明的方法。在又一實(shí)施方案中，shRNAmir文庫可以來自 RNAi 聯(lián)盟(TRC)。shRNAmir和shRNAmir文庫可以常規(guī)制備或購自商業(yè)來源。例如，Expression Arrest 微RNA改造的shRNA (shRNAmir文庫)、逆轉(zhuǎn)錄病毒shRNAmir文庫、慢病毒shRNAmir 文庫、TRIPz慢病毒誘導(dǎo)型shRNAmir文庫、pSM2逆轉(zhuǎn)錄病毒shRNAmir文庫全部從Open Biosystems (Huntsville, AL)可獲得。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括使細(xì)胞接觸shRNA、shRNA文庫、 shRNAmir、shRNAmir文庫或shRNA構(gòu)建體的組合，抑制參與轉(zhuǎn)錄阻抑的至少一種基因的表 達(dá)或活性，以及鑒定已被抑制的所述基因?？梢允褂脝蝹€(gè)ShRNA或shRNAmir來靶向單個(gè)基因的抑制，或者使用多于一種的 shRNA或shRNAmir來靶向單個(gè)基因的抑制。在又一實(shí)施方案中，單個(gè)shRNA或shRNAmir 可用于靶向多于一種基因的抑制。在再一實(shí)施方案中，可以使用多于一種的shRNA或多于 一種的shRNAmir來靶向多于一種基因的抑制?？梢允褂胹hRNA構(gòu)建體和shRNAmir構(gòu)建體 的混合物?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法抑制單個(gè)基因或多于一種的基因，包括但不限于2種、3 種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11-20種、21-30種、31-40種、41-50種和大于50 種基因?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法抑制編碼參與基因表達(dá)阻抑的蛋白的任何基因，所述蛋白 包括但不限于組蛋白脫乙酰酶、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白、甲基腺苷轉(zhuǎn)移酶、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基循環(huán)酶、核受體、孤兒核受體、Esrr β和EssRy。可以通過本發(fā)明的方法抑制的基因的代表性列表提供于表I中。例如，甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白如MeCP2結(jié)合甲基化的胞嘧啶并募集組蛋白脫乙酰 酶，然后組蛋白脫乙酰酶將組蛋白脫乙?；?，從而導(dǎo)致凝聚的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)抑制轉(zhuǎn) 錄。本發(fā)明的方法可以抑制編碼阻抑復(fù)合體中的蛋白的基因表達(dá)，并從而誘導(dǎo)復(fù)能基因的 轉(zhuǎn)錄。表I.參與阻抑和阻抑復(fù)合體的基因的代表性列表
權(quán)利要求
1.一種重編程細(xì)胞的方法，所述方法包括將細(xì)胞暴露于干擾編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因表 達(dá)的shRNA構(gòu)建體；誘導(dǎo)復(fù)能基因的表達(dá)；以及選擇細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇所述細(xì)胞包括比較所述細(xì)胞暴露于所述 shRNA構(gòu)建體之前和之后的表型，以及鑒定具有與恢復(fù)的分化潛能一致的表型的細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將選擇的細(xì)胞擴(kuò)增為細(xì)胞群。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇細(xì)胞包括使用針對(duì)于由復(fù)能基因編碼的 蛋白的抗體或針對(duì)于細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體分離細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細(xì)胞表面標(biāo)記物選自由下列組成的組SSEA3、 SSEA4、Tra-1-60 和 Tra-1-81。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括在選擇所述細(xì)胞之前，比較暴露于所述 shRNA構(gòu)建體之前所述復(fù)能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與暴露于shRNA構(gòu)建體之后所獲得的染色質(zhì) 結(jié)構(gòu)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因編碼選自由下列組成的組的調(diào)節(jié)蛋白 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫甲基酶、賴氨酸脫甲基酶、 sirtuin,甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述復(fù)能基因選自由下列組成的組0ct-4、SOX-2和Nanog0
9.一種重編程細(xì)胞的方法，所述方法包括將具有第一轉(zhuǎn)錄模式的細(xì)胞暴露于小分子 抑制劑；誘導(dǎo)復(fù)能基因的表達(dá)；比較細(xì)胞的所述第一轉(zhuǎn)錄模式與暴露于所述抑制劑之后所 獲得的轉(zhuǎn)錄模式；以及選擇細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中暴露于所述抑制劑之后的所述轉(zhuǎn)錄模式與從胚胎 干細(xì)胞分析的基因的轉(zhuǎn)錄模式至少50%相似。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中在比較轉(zhuǎn)錄模式之前，比較所述細(xì)胞暴露于所述 shRNA構(gòu)建體之前和之后的表型。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，所述方法還包括將選擇的細(xì)胞擴(kuò)增為細(xì)胞群。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中選擇所述細(xì)胞包括使用針對(duì)于由復(fù)能基因編碼的 蛋白的抗體或針對(duì)于復(fù)能標(biāo)記物的抗體分離細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中選擇所述細(xì)胞包括使用報(bào)道分子或?qū)x擇標(biāo)記物 的抗性分離細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述復(fù)能基因選自由下列組成的組0ct-4、Sox-2 禾口 Nanog0
16.一種富集的重編程的細(xì)胞群，所述重編程的細(xì)胞群根據(jù)包括下列步驟的方法制備 將細(xì)胞暴露于干擾編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因表達(dá)的shRNA構(gòu)建體；誘導(dǎo)復(fù)能基因的表達(dá)；以及 選擇細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已恢復(fù)分化潛能。
17.如權(quán)利要求16所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述重編程的細(xì)胞表達(dá)選自由 下列組成的組的細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。
18.如權(quán)利要求16所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述復(fù)能基因選自由下列組成 的組0ct-4、Nanog 和 Sox_2。
19.如權(quán)利要求16所述的富集的重編程的細(xì)胞群，其中所述重編程的細(xì)胞占所述群的至少60%。
全文摘要
本發(fā)明涉及重編程細(xì)胞的方法、組合物和試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)促使細(xì)胞為復(fù)能或多能的至少一種基因表達(dá)的方法。在又一實(shí)施方案中，方法包括抑制編碼參與轉(zhuǎn)錄阻抑的蛋白的基因表達(dá)。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重編程的細(xì)胞或富集的重編程的細(xì)胞群，該重編程的細(xì)胞或富集的重編程的細(xì)胞群可以具有ES樣細(xì)胞的特征，它可以再分化或轉(zhuǎn)分化為分化的細(xì)胞類型。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102083982SQ200980121404
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者K·J·埃勒特森, 瓊·S·瑞姆, 瑞秋·A·帕沃爾 申請(qǐng)人:紐珀滕索有限公司