專利名稱：通過使用小分子調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)復(fù)能基因而重編程細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實施方案涉及細胞生物學(xué)、干細胞、細胞分化、體細胞核轉(zhuǎn)移和基于細胞 的治療學(xué)的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明的實施方案涉及用于重編程細胞以及基于細胞的治療 法的方法、組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)學(xué)作為用于許多人類疾病的治療具有巨大的前景，但也帶來一些在現(xiàn)代科 學(xué)研究中面臨的最困難的技術(shù)挑戰(zhàn)。對再生醫(yī)學(xué)的技術(shù)挑戰(zhàn)包括低的克隆效率，潛在復(fù)能 組織的供應(yīng)不足，以及對于如何控制細胞分化和哪種類型的胚胎干細胞能被用于所選的治 療的知識的普遍缺乏。盡管ES細胞具有極大的可塑性，但是未分化的ES細胞能夠形成含 有組織類型的混合物的畸胎瘤(良性腫瘤)。此外，從一種來源向另一種來源移植ES細胞 將可能需要施用藥物來防止新細胞的排斥。已經(jīng)進行了嘗試來鑒定由非胎兒源的組織產(chǎn)生干細胞的新途徑。一種方法包括操 縱自體的成體干細胞。使用自體的成體干細胞用于再生醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢在于它們來源于且返回 至同一患者，并且因此不經(jīng)受免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的事實。主要的缺點是這些細胞缺少ES 細胞的可塑性和復(fù)能性，并因此它們的潛能是不確定的。另一種方法旨在將來自成體組織 的體細胞重編程以產(chǎn)生復(fù)能的ES樣細胞。然而，這種方法是困難的，因為多細胞生物體中 的每種細胞類型具有獨特的表觀遺傳學(xué)標記，認為在細胞分化后或從細胞周期中退出后該 標記便是固定的。細胞DNA—般以染色質(zhì)(一種包含核酸和蛋白質(zhì)的復(fù)合物)的形式存在。事實上， 大部分細胞RNA分子還以核蛋白復(fù)合物的形式存在。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，染色質(zhì)的 核蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)是廣泛研究的對象。一般而言，染色體DNA被包裝成核小體。核小體包含 核心和連接區(qū)。核小體核心包含核心組蛋白(H2A、H2B、H3和H4各二個)八聚體，約150個 堿基對的染色體DNA纏繞在該八聚體周圍。此外，約50個堿基對的連接區(qū)DNA區(qū)段與連接 區(qū)組蛋白Hl締合。核小體被組織成更高階的染色質(zhì)絲并且染色質(zhì)絲被組織成染色體。參 見，例如，Wolffe "chromatin Structure and Function(染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能)，，第 3 版， Academic Press, San Diego,1998。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)不是靜態(tài)的，而是易于被統(tǒng)稱為染色質(zhì)重建的過程修飾。染色質(zhì)重建可用于，例如從DNA區(qū)去除核小體；將核小體從一個DNA區(qū)移到另一個DNA區(qū)；改變核 小體之間的間距；或?qū)⒑诵◇w添加至染色體中的DNA區(qū)中。染色質(zhì)重建也能導(dǎo)致更高階結(jié) 構(gòu)的改變，從而影響轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)(開放染色質(zhì)或常染色質(zhì))和無轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì) (閉合的染色質(zhì)或異染色質(zhì))之間的平衡。染色體蛋白易受許多類型的化學(xué)修飾影響。這些核心組蛋白的翻譯后修飾的一種 機制是高度保守的堿性N-末端賴氨酸殘基的ε-氨基的可逆的乙酰化。組蛋白乙?；?穩(wěn)態(tài)通過競爭性的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙酰酶(本文稱為HDAC)之間的動態(tài)平衡 而建立。早已將組蛋白的乙?；兔撘阴；c轉(zhuǎn)錄的控制相聯(lián)系。組蛋白的可逆的乙?；?能導(dǎo)致染色質(zhì)重建并且如此可以充當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄的控制機制。總的來說，組蛋白的高度乙酰 化有利于基因的表達，然而組蛋白的脫乙?；c轉(zhuǎn)錄阻抑有關(guān)。據(jù)顯示組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶 充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的輔激活蛋白，然而發(fā)現(xiàn)脫乙酰酶屬于轉(zhuǎn)錄阻抑途徑。組蛋白乙?；徒M蛋白脫乙?；g的動態(tài)平衡對于正常的細胞生長是必不可 少的。組蛋白脫乙酰化的抑制導(dǎo)致細胞周期停滯、細胞分化、凋亡和轉(zhuǎn)化的表型的逆轉(zhuǎn)。牽涉在基因表達的調(diào)節(jié)中的另一組蛋白是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)，其負責(zé)引起轉(zhuǎn) 錄沉默的基因組的甲基化模式的產(chǎn)生。DNA甲基化對于許多哺乳動物的過程包括胚胎發(fā)育、 X-失活、基因組印記和基因表達的調(diào)節(jié)是核心性的。哺乳動物中DNA的甲基化通過甲基基 團從S-腺苷-甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的C5位置而實現(xiàn)。這個反應(yīng)由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化 并對于CpG 二核苷酸中的胞嘧啶是特異性的。在人基因組的CpG 二核苷酸中所有胞嘧啶的 百分之七十(70% )是甲基化的并易于脫氨基，導(dǎo)致胞嘧啶向胸腺嘧啶轉(zhuǎn)變。這個過程引起 鳥嘌呤和胞嘧啶的頻率全面下降至所有核苷酸的約40%，并引起CpG 二核苷酸的頻率進一 步下降至它們的預(yù)期頻率的約四分之一。在哺乳動物中已經(jīng)鑒定了四種活性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。它們被命名為DNMTl、DNMT2、 DNMT3A和DNFHB。另外，DNMT3L是結(jié)構(gòu)上與DNMT3A和DNFHB緊密相關(guān)的蛋白，且對DNA 甲基化是至關(guān)重要的，但單獨的DNMT3L表現(xiàn)為是失活的。在含有CpG島的啟動子區(qū)中的胞 嘧啶的甲基化引起脊椎動物細胞中下游編碼序列的轉(zhuǎn)錄失活。稱為甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD 1至MBD 4)的蛋白家族被認為在甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 錄沉默中起重要作用。MeCP2是這個家族被鑒定的第一個成員且含有甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(MBD)和轉(zhuǎn)錄阻抑結(jié)構(gòu)域(TRD)，MeCP2有利于與甲基化的DNA的相互作用并將Sin3A/ HDAC復(fù)合物靶向甲基化的DNA。像MeCP2 —樣，MBD1、MBD2和MBD3已顯示是有效的轉(zhuǎn)錄阻 抑劑。MBD4是修復(fù)G:T錯配的DNA糖基化酶。除MBD3之外，該家族的每個成員在哺乳動物 細胞中與甲基化的DNA形成復(fù)合物，而且除MBDl和MBD4之外的所有成員都位于已知的染 色質(zhì)重建復(fù)合物中。Mi-2復(fù)合物結(jié)合DNA甲基化作用使染色質(zhì)重建和組蛋白脫乙酰。牽涉在表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)中的另一組蛋白是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)，組蛋白甲基 轉(zhuǎn)移酶是催化一個至三個甲基基團從輔因子S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至組蛋白的賴氨酸殘基 和精氨酸殘基的酶組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶。甲基化 的組蛋白與DNA更緊密地結(jié)合，這抑制轉(zhuǎn)錄。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)也能夠通過稱為染色質(zhì)重建復(fù)合物的高分子組件的活性而改變。 參見，例如，Cairns (1998) Trends Biochem. Sci. 23 :20 25 ；Workman 等.(1998) Ann. Rev. Biochem. 67 545 579 ；Kingston 等.(1999)Genes Devel. 13 :2339 2352 R Murchardt等· (1999) J. Mol. Biol. 293 185 197。染色質(zhì)重建復(fù)合物參與核小體陣列的斷裂或重新形 成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、DNA的復(fù)制和DNA的修復(fù)(Bochar等.(2000)PNAS USA 97(3) :1038 43)。雖然這些染色質(zhì)重建復(fù)合物中的許多具有不同的亞基組成，但都依賴于AIPase酶的 重建活性。體內(nèi)也有需要染色質(zhì)重建復(fù)合物的活性以活化基因的幾個實例。復(fù)能細胞或全能細胞發(fā)育為分化的、特化的表型由在發(fā)育期間表達的特定組的基 因決定?；虮磉_由能實現(xiàn)正調(diào)節(jié)或負調(diào)節(jié)的基因調(diào)節(jié)蛋白的序列特異性結(jié)合直接介導(dǎo)。 然而，這些調(diào)節(jié)蛋白的任一種直接介導(dǎo)基因表達的能力至少部分地取決于它們在細胞DNA 內(nèi)的結(jié)合位點的可接近性。如上文所討論的，細胞DNA中序列的可接近性通常取決于在其 中包裝細胞DNA的細胞染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，鑒定能夠誘導(dǎo)復(fù)能性所需要的基因的表達的方法、組合物和試劑盒，包括能 夠抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白的活性的方法、組合物和試劑盒是有用的。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于重編程細胞的方法、組合物和試劑盒。本發(fā)明的實施方案涉及包 括誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達的方法。在又一個實施方案中，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生重編 程的細胞。在還一個實施方案，本發(fā)明涉及包括抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白的活性的方法。在 又一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于重編程細胞的方法，包括改變調(diào)節(jié)蛋白的活性、表 達、或活性和表達二者。方法還包括誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達，及重編程細胞。本發(fā)明的實施方案還涉及重編程細胞的方法，包括將細胞、細胞群、細胞培養(yǎng)物、 來自細胞培養(yǎng)物的細胞亞群、同質(zhì)細胞的培養(yǎng)物或異質(zhì)細胞的培養(yǎng)物與抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄 的蛋白的活性、表達、或活性和表達二者的劑相接觸，誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達，以 及重編程細胞。方法還包括使重編程的細胞再分化。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細胞的方法，包括將細胞暴露于改 變調(diào)節(jié)蛋白的表達、活性、或表達和活性二者的小分子調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的 表達，以及篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。改變參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白或者調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達、或活性和表達二者的劑包 括但不限于小分子、小分子抑制劑和小分子活化劑。誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達的劑包括但不限于小分子、小分子抑制劑和小分 子抑制劑。參與阻抑轉(zhuǎn)錄的任何蛋白，包括但不限于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、甲基 結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、SWI/SNF復(fù)合物的組分、NuRD復(fù)合物的組分和IN080 復(fù)合物的組分，能夠被本發(fā)明的方法抑制。在一些實施方案中，至少一種小分子抑制劑能用于抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白 脫乙酰酶、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。在又一個實施方案中，多于一 種的小分子抑制劑能用于抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的多于一種蛋白的活性，所述蛋白包括但不限 于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括以下的方法將細胞與抑制至少一種 DNMT的活性的小分子抑制劑相接觸；將至少一個CpG 二核苷酸脫甲基；誘導(dǎo)促使細胞為復(fù) 能或多能的至少一種基因的表達，和重編程細胞。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括以下的方法將具有第一表型的細胞暴露于改變至少一種調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達、或活性和表達二者的小分子調(diào)節(jié)劑；將細胞的 第一表型與將細胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑之后獲得的表型相比較，以及篩選已被重編程的且 是復(fù)能或多能的細胞。在又一個實施方案中，方法包括將細胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑之前的 細胞基因型與用小分子調(diào)節(jié)劑處理之后獲得的細胞基因型相比較。在又一個實施方案中， 方法包括將細胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑之前的細胞的表型和基因型與細胞暴露于小分子調(diào) 節(jié)劑之后的細胞的表型和基因型相比較。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于重編程細胞的方法，包括將細胞暴露 于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達的小分子調(diào)節(jié)劑；以及篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù) 分化潛能。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細胞的方法，包括將細胞暴露于 改變調(diào)節(jié)蛋白的表達、活性、或表達和活性二者的小分子調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因 的表達；以及篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。在又一個實施方案中，方法包括將篩選的細胞培養(yǎng)或擴增成細胞群。在另一個實 施方案中，方法包括使用與復(fù)能基因或多能基因編碼的蛋白相結(jié)合的抗體或使用與多能標 記物或復(fù)能標記物相結(jié)合的抗體分離細胞，所述多能標記物或復(fù)能標記物包括但不限于 SSEA3、SSEA4、1Tra-1-60和 ει-1-81。在又一個實施方案中，本發(fā)明還包括將暴露于所述小 分子調(diào)節(jié)劑之前的復(fù)能基因或多能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與暴露于所述小分子調(diào)節(jié)劑之后獲 得的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較。使用有效的用于分離細胞的任何方法也可分離細胞，所述任何方 法包括但不限于熒光細胞激活分選儀、免疫組織化學(xué)和ELISA。在另一個實施方案中，方法 包括篩選具有比原始細胞低的分化狀態(tài)的細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細胞的方法，包括將具有第一轉(zhuǎn)錄 模式的細胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達的小分子調(diào)節(jié)劑；將細胞的第一轉(zhuǎn)錄模式 與暴露于所述調(diào)節(jié)劑之后獲得的轉(zhuǎn)錄模式相比較；以及篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù) 分化潛能。在另一個實施方案中，篩選細胞包括篩選具有比原始細胞低的分化狀態(tài)的細胞。在又一個實施方案中，篩選細胞包括鑒定具有轉(zhuǎn)錄模式至少5% -10%、 10 % -20 %,20 % -30 %,30 % -40 %,40 % -50 %,50 % -60 %,60 % -70 %,70 % -80 %, 80% -90%,90% _94%、95%或95% -99%類似于分析的胚胎干細胞的轉(zhuǎn)錄模式的細胞。 不需要比較胚胎干細胞的整個轉(zhuǎn)錄模式，盡管這是可以的。反而，可比較的胚胎基因的亞 組包括但不限于1-5 個、5-10 個、10-25 個、25-50 個、50-100 個、100-200 個、200-500 個、 500-1，000 個、1，000-2，000 個、2，000-2，500 個、2，500-5，000 個、5，000-10，000 個和多于 10，000個基因?？捎枚绞奖容^轉(zhuǎn)錄模式，即，可以進行比較來確定基因是轉(zhuǎn)錄的還是未 轉(zhuǎn)錄的。在另一個實施方案中，可以比較每個基因或基因亞組的轉(zhuǎn)錄速率和/或程度。能使 用本領(lǐng)域已知的任何方法來確定轉(zhuǎn)錄模式，所述任何方法包括但不限于RT-PCR、定量PCR、 微陣列、DNA印跡和雜交。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細胞的方法，包括將細胞暴露于干 擾第一調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達、或活性和表達二者的小分子調(diào)節(jié)劑；將所述細胞暴露于抑制 第二調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達、或表達和活性二者的第二劑，其中所述第二調(diào)節(jié)蛋白具有與第 一調(diào)節(jié)蛋白不同的功能；誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達；以及篩選細胞，其中所述細胞 已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。在另一個實施方案中，細胞或細胞群可同時或相繼地暴露于第一劑和 第二劑。第二劑包括但不限于小分子、小分子抑制劑、小分子活化劑、核酸序列、和shRNA構(gòu)建體。本發(fā)明的實施方案也包括使用根據(jù)本文公開的方法產(chǎn)生的重編程的細胞來治療 多種疾病的方法。在又一個實施方案中，本發(fā)明也涉及重編程的細胞和已再分化的重編程 的細胞的治療用途。本發(fā)明的實施方案也涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重編程的細胞。重編程的細胞 能夠再分化成單一的譜系或多于一種譜系。重編程的細胞能夠是多能的或復(fù)能的。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)包括下列步驟的方法產(chǎn)生的富集的重編程 的細胞群將細胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因表達的小分子調(diào)節(jié)劑；以及篩選細胞， 其中多數(shù)細胞已恢復(fù)分化潛能，并培養(yǎng)所述篩選的細胞以產(chǎn)生細胞群。在又一個實施方 案中，重編程的細胞表達選自由以下組成的組的細胞表面標記物SSEA3、SSEA4、Tra-1-60 和Tra-1-81。在又一個實施方案中，重編程的細胞占富集的細胞群的至少5 % -10%, 10 % -20 %,20 % -30 %,30 % -40 %,40 % -50 %,50 % -60 %,60 % -70 %,70 % -80 %, 80% -90%,90% -95%,96% -98% ；或至少 99%。本發(fā)明的實施方案也涉及用于制備本發(fā)明的方法和組合物的試劑盒。試劑盒尤其 能夠用于重編程細胞和產(chǎn)生ES-樣細胞和干細胞樣細胞。附圖簡述

圖1是報道用DNMT抑制劑(500 μ M RG108)處理的原代人肺成纖維細胞中的 Oct-4和Nanog的上調(diào)的柱狀圖。MC是對照培養(yǎng)基。圖2是報道在VPA的存在下，在幾種細胞類型中的幾種復(fù)能基因的表達增加的柱 狀圖。HDi^a指的是成人皮膚成纖維細胞；HDFf指的是人胎兒皮膚成纖維細胞；HDi^n指的是 人新生兒皮膚成纖維細胞；且BJF指的是BJ成纖維細胞(包皮)。圖3是報道用在VPA處理的成人皮膚成纖維細胞和人胎兒皮膚成纖維細胞中對 HDACll和HDAC9表達的效應(yīng)的柱狀圖。圖4是報道用煙酰胺處理4天的成人皮膚成纖維細胞中的Oct-4的表達增加的柱 狀圖。圖5是報道用苯基丁酸鈉處理4天的成人皮膚成纖維細胞中的Oct-4的表達增加 的柱狀圖。圖6是報道用valproxam處理4天的成人皮膚成纖維細胞中的0ct_4的表達增加 的柱狀圖。圖7是報道用2-PCPA (組蛋白/賴氨酸1脫甲基酶抑制劑)處理8天的BJ成纖 維細胞中的Oct-4的表達增加的柱狀圖。圖8A是在成纖維細胞生長培養(yǎng)基中的成人皮膚成纖維細胞的照片。圖8B是在DMEM/F12培養(yǎng)基中的成人皮膚成纖維細胞的照片。圖8C是在基質(zhì)膠上的mTeSR hES細胞培養(yǎng)基中的VPA處理的(500 μ Μ)的成人皮 膚成纖維細胞的照片。圖8D是在基質(zhì)膠上的mTeSR hES細胞培養(yǎng)基中的VPA處理的(500 μ Μ)的成人皮 膚成纖維細胞的照片。優(yōu)選實施方案的詳述定義
除非另外指明，否則在本公開內(nèi)容中的數(shù)值范圍是近似的，并因此可包括該范圍 之外的值。數(shù)字范圍包括來自以一個單位遞增的下限值和上限值之間的所有值并且包括下 限值和上限值，前提條件是在任何下限值和任何上限值之間存在至少兩個單位的分隔。作 為實例，如果組分性質(zhì)、物理性質(zhì)或其它性質(zhì)諸如，例如分子量、熔化指數(shù)、溫度等是100至 1，000，則旨在清楚地列舉所有單個的值例如100、101、102等和子范圍例如100至144、155 至170、197至200等。對于含有少于1的值或含有大于1的分數(shù)數(shù)字(例如1. 1、1. 5等) 的范圍，一個單位視情況被認為是0. 0001,0. 001,0. 01或0. 1。對于含有少于10的單數(shù)字 的范圍(例如，1至5)，通常認為一個單位是0. 1。這些僅是具體旨指的范圍的實例，且認為 在列舉的最低值和最高值之間的數(shù)值的所有可能的組合在本公開內(nèi)容中清楚地陳述。在本 公開內(nèi)容中尤其提供的數(shù)字范圍是混合物中組分的相對量和方法中所引用的各種溫度以 及其他參數(shù)范圍。除非明確地限制為相反情況，否則“細胞”(“cell”或“cells”)包括任何體細胞、 胚胎干(EQ細胞、成體干細胞、器官特異性干細胞、核轉(zhuǎn)移(NT)單位和干樣細胞。細胞能 夠從任何器官或組織中獲得。細胞能夠是人或其它動物的。例如，細胞能夠是小鼠的、豚鼠 的、大鼠的、牛的、馬的、豬的、綿羊的、山羊的等。細胞也能夠來自非人靈長類。“培養(yǎng)基”或“生長培養(yǎng)基”指的是能夠支持細胞生長的合適的培養(yǎng)基?！胺只敝傅氖羌毎谂咛グl(fā)育期間變得結(jié)構(gòu)和功能特化的過程。"DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑”和“DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑”指的是能夠與DNA甲基轉(zhuǎn) 移酶相互作用且抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性的化合物?！耙种艱NA甲基轉(zhuǎn)移酶活性”指的是 降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化特定底物諸如CpG 二核苷酸序列的能力。在一些實施方案中， DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的這種降低是至少約25%至少約50%，在另外的實施方案中是至少約 75%，且在其它的實施方案中是至少約90%。在又一個實施方案中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性降 低至少95%且在另一個實施方案中降低至少99%?！氨碛^遺傳學(xué)”指的是關(guān)于功能上可遺傳的改變而無核苷酸序列改變的DNA狀態(tài)。 表觀遺傳學(xué)改變能夠由DNA的修飾諸如由甲基化或由脫甲基化引起，而無在DNA的核苷酸 序列上的任何改變。“組蛋白”指的是在染色體中發(fā)現(xiàn)的負責(zé)壓縮DNA足以使DNA適于在細胞核中的一 類蛋白分子。“敲低(Knock down) ”指的是以基因特異的方式阻抑基因的表達。具有一個或多 個被“敲低”的基因的細胞被稱為敲低的機體或僅僅為“敲低”?！皬?fù)能”指的是能夠分化成3種胚層細胞類型或基本組織類型?！皬?fù)能基因”指的是促使細胞為復(fù)能的細胞的基因。“復(fù)能細胞培養(yǎng)物”當(dāng)展現(xiàn)與胚胎來源或成體來源的分化細胞明顯區(qū)分它們的形 態(tài)時被稱為是“大體上未分化的”。復(fù)能細胞通常具有高的核/質(zhì)比、突起的核仁、以及具有 難以辨認的細胞連接的致密的集落形成，且易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員識別。認識到未分化細 胞集落能被分化的鄰近細胞環(huán)繞。然而，當(dāng)在適當(dāng)?shù)那闆r下培養(yǎng)時，大體上未分化的細胞集 落將繼續(xù)存在，并且在分離培養(yǎng)的細胞后，未分化的細胞組成細胞的主要部分。在本公開內(nèi) 容中描述的有用的細胞群含有任何比例的具有這些標準的大體上未分化的復(fù)能細胞。大體 上未分化細胞培養(yǎng)物可含有約20^^40^^60%或甚至80%的未分化的復(fù)能細胞(以群中所有細胞的百分比計)?！罢{(diào)節(jié)蛋白”指的是調(diào)節(jié)生物學(xué)過程的任何蛋白，包括正向調(diào)節(jié)和負向調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié) 蛋白能夠?qū)ι飳W(xué)過程具有直接的或間接的影響，并能直接地發(fā)揮作用或者通過參與復(fù)合 物中發(fā)揮作用?！爸鼐幊獭敝傅氖且瞥酥械谋碛^遺傳學(xué)標記，然后建立不同組的表觀遺傳學(xué)標 記。在多細胞生物體的發(fā)育期間，不同的細胞和組織獲得不同的基因表達程序。這些不同 的基因表達模式表現(xiàn)為實質(zhì)上由諸如DNA甲基化、組蛋白修飾和其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白等表 觀遺傳學(xué)修飾調(diào)節(jié)。因此多細胞生物體中的每種細胞類型具有獨特的表觀遺傳標志，通常 認為該標志在細胞分化后或退出細胞周期后會變成“固定的”且不變的。但是，一些細胞在 正常發(fā)育或某些疾病期間，進行主要的表觀遺傳學(xué)的“重編程”?！靶》肿诱{(diào)節(jié)劑”指的是涵蓋為小分子抑制劑或小分子活化劑的化合物。小分子調(diào) 節(jié)劑可以在一些生理環(huán)境中起小分子抑制劑的作用且在另外的生理環(huán)境中起小分子活化 劑的作用。小分子調(diào)節(jié)劑對于一個靶點可起小分子抑制劑的作用且對于另一個靶點可起小 分子活化劑的作用。同一小分子調(diào)節(jié)劑可既起小分子活化劑的作用又起小分子抑制劑的作用?！叭堋敝傅氖悄軌虬l(fā)育成完整的胚胎或完整的器官。本發(fā)明的實施方案涉及包括誘導(dǎo)促使細胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達 的方法。在一些實施方案中，方法誘導(dǎo)促使細胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達；且產(chǎn) 生能夠定向分化為至少一種譜系的重編程的細胞。本發(fā)明的實施方案還涉及包括下列的方法修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，和重編程細胞為復(fù) 能或多能的。在又一個實施方案中，修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)包括使用小分子調(diào)節(jié)劑以改變參與調(diào) 節(jié)轉(zhuǎn)錄的至少一種調(diào)節(jié)蛋白的活性。在又一個實施方案中，修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)包括使用小分子抑制劑以抑制參與阻抑轉(zhuǎn) 錄的至少一種蛋白的活性。本發(fā)明的實施方案也涉及包括修飾促使細胞為復(fù)能或多能的基因的啟動子區(qū)域 或上游DNA序列的方法。在又一個實施方案中，修飾啟動子的結(jié)構(gòu)或上游DNA序列包括使 用小分子調(diào)節(jié)劑以改變參與轉(zhuǎn)錄的至少一種調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達、或活性和表達二者。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包括使用小分子調(diào)節(jié)劑以改變參與轉(zhuǎn)錄的至少 一種調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達、或活性和表達二者，并誘導(dǎo)促使細胞為復(fù)能或多能的至少一種 基因的表達的方法。在又一個實施方案中，方法包括抑制至少一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性 并產(chǎn)生重編程的細胞。在又一個實施方案中，方法包括使用小分子抑制劑以抑制至少一種DNA甲基轉(zhuǎn)移 酶的活性，將CpG 二核苷酸中的至少一種胞嘧啶脫甲基，并誘導(dǎo)促使細胞為復(fù)能或多能的 至少一種基因的表達。在另一個實施方案中，方法包括將細胞與小分子抑制劑相接觸；抑制參與阻抑轉(zhuǎn) 錄的至少一種蛋白的活性；以及誘導(dǎo)促使細胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達。在又 一個實施方案中，方法還包括產(chǎn)生重編程的細胞。該重編程的細胞能夠是復(fù)能或多能的。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細胞的方法，該方法包括將細胞暴 露于誘導(dǎo)復(fù)能基因或多能基因的表達的小分子調(diào)節(jié)劑；以及篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于重編程細胞的方法，該方法包括將 細胞暴露于改變至少一種調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達、或活性和表達二者的小分子調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo) 復(fù)能基因或多能基因的表達，以及篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。復(fù)能或多能 基因可被誘導(dǎo)以任何倍數(shù)增加表達，包括但不限于0. 25-0. 5,0. 5-1,1. 0-2. 5,2. 5_5、5_10、 10-15、15-20、20-40、40-50、50-100、100-200、200-500 和大于 500。在另一個實施方案中， 方法包括鋪板分化的細胞，將所述分化的細胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)所述細胞，及鑒定 已經(jīng)被重編程的細胞。在另一個實施方案中，改變調(diào)節(jié)蛋白的活性、表達、或表達和活性二者能夠引起 調(diào)節(jié)蛋白活性的增加，調(diào)節(jié)蛋白表達的增加，調(diào)節(jié)蛋白活性的降低或調(diào)節(jié)蛋白表達的降 低。調(diào)節(jié)蛋白的活性或表達能夠增加或降低任何的量，包括但不限于-5%,5% -10%, 10 % -20 %,20 % -30 %,30 % -40 %,40 % -50 %,50 % -60 %,60 % -70 %,70 % -80 %, 80 % -90 %,90 % -95 %、及 95 % -99 %,99 % -200 %,200 % -300 %,300 % -400 400% -500%和大于 500% ο在又一個實施方案中，方法還包括使用針對由復(fù)能基因或多能基因編碼的蛋白或 蛋白片段的抗體或針對復(fù)能標記物或多能標記物的抗體來篩選細胞。能夠使用任何類型的 抗體，包括但不限于單克隆、多克隆、抗體片段、模擬肽、活性區(qū)的抗體、及蛋白的保守區(qū)的 抗體。在又一個實施方案中，方法包括篩選細胞及擴增或培養(yǎng)所述細胞為復(fù)能細胞培養(yǎng)物。在又一個實施方案中，方法還包括使用由復(fù)能基因或多能基因驅(qū)動的報道分子或 復(fù)能表面標記物或多能表面標記物來篩選細胞。能夠使用任何類型的報道分子，包括但不 限于熒光蛋白、綠色熒光蛋白、青色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、細菌螢光素酶、 水母發(fā)光蛋白、增強型綠色熒光蛋白、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、dsRED、半乳糖苷酶和 堿性磷酸酶。在又一個實施方案中，方法還包括使用下列的抗性作為選擇標記物來篩選細胞， 包括但不限于抗生素抗性、殺真菌劑抗性、嘌呤霉素抗性、潮霉素抗性、二氫葉酸還原酶抗 性、胸苷激酶抗性、新霉素抗性(neo)、G418抗性、霉酚酸抗性(gpt)、博來霉素(zeocin)抗 性蛋白和鏈霉素抗性。在又一個實施方案中，方法還包括將暴露于小分子調(diào)節(jié)劑之前存在的細胞的復(fù)能 基因或多能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與用小分子調(diào)節(jié)劑處理之后獲得的復(fù)能基因或多能基因的 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較。能夠比較染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何方面，包括但不限于常染色質(zhì)、異染色 質(zhì)、組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、組蛋白或組蛋白組分的存在和不存在、組蛋白的位置、組 蛋白的排列、及與染色質(zhì)締合的調(diào)節(jié)蛋白的存在或不存在?？杀容^基因的任何區(qū)域的染色 質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括但不限于增強子元件、激活子元件、啟動子、TATA盒、轉(zhuǎn)錄起始位點的上游區(qū) 域、轉(zhuǎn)錄起始位點的下游區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子。小分子抑制劑或“小分子化合物”指的是在本發(fā)明的方法、組合物、和試劑盒中有 用的具有可測量的活性或抑制活性的化合物。在一些實施方案中，小分子抑制劑具有不多 于1000D的相對分子量，且在還一個方案中不多于500D。小分子抑制劑能夠是有機性質(zhì)的 或無機性質(zhì)的。除小有機化合物和小無機化合物外，預(yù)期肽、抗體、環(huán)肽和模擬肽也可用于 本公開的方法中。小分子調(diào)節(jié)劑可以是包含在小分子文庫中的任何化合物或衍生于包含在小分子文庫中的化合物的修飾的化合物。幾種小分子文庫可從包括但不限于BIOMOL INTERNATIONAL (現(xiàn)稱Enzo Life Sciences)的商業(yè)來源供應(yīng)，并包括但不限于生物活性 脂質(zhì)文庫、內(nèi)源性大麻素文庫、脂肪酸文庫、ICCB已知的生物活性體文庫、離子通道配體文 庫、激酶抑制劑文庫、激酶/磷酸酶抑制劑文庫、神經(jīng)遞質(zhì)文庫、天然產(chǎn)物文庫、核受體文 庫、孤兒配體文庫、蛋白酶抑制劑文庫、磷酸酶抑制劑文庫、和稀有天然產(chǎn)物文庫。小分子抑制劑能夠用于抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的任何蛋白，包括但不限于組蛋白脫 乙酰酶(HDAC)、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白(MBD)、甲基腺苷基轉(zhuǎn)移酶(MAT)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNMT)、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基循環(huán)酶。優(yōu)選地，這樣的抑制是特異性的，即，對于DNMT小分子抑制劑，DNMT抑制劑以比產(chǎn) 生另一種不相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)所需要的抑制劑濃度低的濃度來降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶甲基 化特定底物的能力或降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與甲基化需要的另一種組分相互作用的能力。優(yōu) 選地，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制活性需要的抑制劑的濃度比產(chǎn)生不相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)需要的 濃度低至少2倍、更優(yōu)選地低至少5倍、甚至更優(yōu)選地低至少10倍、且最優(yōu)選地低至少20 倍。任何數(shù)量、任何組合和任何濃度的小分子調(diào)節(jié)劑能夠用于改變參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的一 種蛋白或多于一種蛋白的活性、表達、或活性和表達二者，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11-15、16-20、21-25、25-50、50-100、100-250 和多于 250 種蛋白。小分子調(diào)節(jié)劑能
夠針對一種特定的蛋白或多于一種蛋白、一類具體的蛋白或多于一類蛋白、一個具體的蛋 白家族或多于一個蛋白家族或通用轉(zhuǎn)錄組分。小分子調(diào)節(jié)劑可具有不可逆的作用機制或可逆的作用機制。小分子調(diào)節(jié)劑能具 有任何的結(jié)合親和力，包括但不限于毫摩(mM)、微摩(μΜ)、納摩(ηΜ)、皮摩(ρΜ)和分摩 (fM)。小分子調(diào)節(jié)劑能夠與蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)或催化區(qū)結(jié)合。表I中提供了可被本發(fā)明的方法抑制的蛋白的代表性列表。表I.參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白的代表性列表
組蛋白脫乙酰 酵甲基結(jié)合 結(jié)構(gòu)域蛋 白曱基腺苷 基轉(zhuǎn)移酶DNA曱基 轉(zhuǎn)移酶組蛋白曱基 轉(zhuǎn)移酶甲基循 環(huán)酶I類(HDAC 1-3、8、11)MBDlMAT2ADNMTlEHMTlMTHFRII 類(HDAC 4-7、9、10)MBD2MATlADNMT2HDMG9ACBSIII 類(SIRTI 1-7)MBD3MAT2BDNMT3ASUV39H1IV 類(HDAC 11)MBD4DNMT3BSETDBlMeCP2DNMT3L 例如，甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白，例如MeCP2，與甲基化的胞嘧啶結(jié)合并募集組蛋白脫 乙酰酶，之后將組蛋白脫乙?；?，導(dǎo)致凝聚的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而凝聚的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)抑制轉(zhuǎn)錄。 本發(fā)明的方法能夠抑制參與阻抑轉(zhuǎn)錄的蛋白并藉此誘導(dǎo)復(fù)能基因的轉(zhuǎn)錄。
因此，基于阻抑復(fù)合物的以上代表性描述，小分子抑制劑能夠用于抑制MeCP2的 活性，藉此顯著性降低HDAC募集到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。這能引起對于細胞為復(fù)能或多能的至關(guān) 重要的基因的上調(diào)，并因此增加體細胞中的分化能力。同樣地，小分子抑制劑能用于抑制 DNMT，這將同樣地引起促使細胞為復(fù)能或多能的基因的上調(diào)。而且，針對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的 小分子抑制劑和針對甲基結(jié)合蛋白的小分子抑制劑能同時或相繼地用于降低包含在阻抑 復(fù)合物中的至少一種蛋白的活性，這可引起復(fù)能基因的誘導(dǎo)，并因此引起細胞的重編程。以 上討論僅是說明性的目的且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。0匪1"小分子抑制劑可與包括但不限于1)匪11、0匪12、0匪134、和1)匪138、及1)匪丁31^ 的任何DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用并抑制它們。DNMTl可能是哺乳動物細胞中最豐富的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，并被認為參與維持哺乳動物中的甲基轉(zhuǎn)移酶。DNMTl主要甲基化哺乳動物基因 組中半甲基化的CpG 二核苷酸。與體外未甲基化的底物相比，DNMTl酶對半甲基化DNA的 活性高7-20倍，然而它對從頭甲基化比其他DNMT活性還高。DNMTl酶長約1620個氨基酸。 前1100個氨基酸構(gòu)成DNMTl酶的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，且剩余的殘基構(gòu)成催化結(jié)構(gòu)域。調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域 和催化結(jié)構(gòu)域由谷氨酸-賴氨酸重復(fù)單位連接。DNMTl的催化功能需要這二個結(jié)構(gòu)域。DNMT2具有與原核細胞和真核細胞二者的5_甲基胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶強的序列相 似性。DNMT2也已顯示將天冬氨酸轉(zhuǎn)運RNA中的第38位點甲基化。DNMT3是能夠以相同的速度將半甲基化的CpG 二核苷酸和未甲基化的CpG 二核苷 酸甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族。DNMT3酶的結(jié)構(gòu)類似于DNMTl，具有與催化結(jié)構(gòu)域相連的 調(diào)節(jié)區(qū)。DNMT3A和DNFHB負責(zé)在發(fā)育期間建立DNA的甲基化模式。DNMT3A蛋白和DNFHB 蛋白在胚胎形成的不同階段表達。DNFHB表現(xiàn)為在諸如內(nèi)層細胞群、外胚層細胞和胚胎外 胚層細胞等多能胚胎細胞中表達，而DNMT3A表現(xiàn)為在胚胎10. 5天(E10. 5)之后同時普遍 地表達。DNMT3L含有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基序并參與建立母體的基因組印跡。DNMT3L也被認 為在轉(zhuǎn)錄阻抑中發(fā)揮作用。在本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒中使用的DNMT小分子抑制劑可與DNMT1、 DNMT2、DNMT3A、DNMT3B或DNMT3L相互作用。DNMT抑制劑可與DNMT的一種類型、DNMT的 所有類型、或DNMT的多個類型相互作用，包括但不限于包括DNMT1和DNMT2 ；DNMTl和 DNMT3A ；DNMTl 禾口 DNMT3B ；DNMTl 禾口 DNMT3L ；DNMT2 禾口 DNMT3A ；DNMT2 禾口 DNMT3B ；DNMT2 和 DNMT3L ；DWT3A 禾口 DNMT3B ；DWT3A 禾口 DNMT3L ；DWT3B 禾口 DNMT3L ；DNMTU DNMT2、DNMT3A ； D匪Tl、D匪T2 和 DNMT3B ；D匪Tl、D匪T2 和 DNMT3L ；DWT2、D匪T3A 和 DNMT3B ；DNMT2、DNMT3A 和 DNMT3L ；DNMT2.DNMT3B 和 DNMT3L 以及 DWT1、DWT2、DWT3A 和 DNFHB。本發(fā)明的 DWT 抑制劑也可與不落在已知類型之一的DNMT或是仍未歸類的DNMT相互作用。在另一個實施方案中，DNMT抑制劑可通過與DNMT的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域或催化結(jié)構(gòu)域相 結(jié)合而發(fā)揮作用。在另一個實施方案中，DNMT抑制劑可是核苷類似物(摻入DNA或RNA中) 或非核苷類似物。在另一個實施方案中，DNMT抑制劑可以是DNMT(包括但不限于DNMTl、 DNMT2、DNMT3A、DNMT;3B或DNMT3L)的反義寡核苷酸。在又一個實施方案中，DNMT抑制劑也 可通過阻斷蛋白與蛋白的相互作用而發(fā)揮作用。在另一個實施方案中，為抑制Dnmt的活性和胞嘧啶的甲基化，細胞可在下列培養(yǎng) 基中生長
(a)用 Dnmtl、Dnmt2、Dnmt3a 禾口 / 或 3b siRNA (Dharmacon, Inc.)處理的培養(yǎng)基；(b)用RG108(分析系統(tǒng)實驗室，路易斯安那州獸醫(yī)學(xué)校)處理的培養(yǎng)基；(c)用 5-AzadCyd(Sigma)處理的培養(yǎng)基。表II提供能夠抑制DNMT的小分子抑制劑的代表性列表。在本發(fā)明的方法、組合 物和試劑盒中使用的DNMT抑制劑包括本文提及的DNMT抑制劑的衍生物和類似物。表II.作為DNMT抑制劑的核苷類似物和非核苷類似物的代表性實例
權(quán)利要求
1.一種用于重編程細胞的方法，所述方法包括將細胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因表達的小 分子調(diào)節(jié)劑；并且篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù)分化潛能。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中篩選所述細胞包括將所述細胞暴露于所述小分子 調(diào)節(jié)劑之前和之后的表型相比較，并鑒定具有與恢復(fù)的分化潛能一致的表型的細胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將所述篩選的細胞擴增為細胞群。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述小分子調(diào)節(jié)劑選自由以下組成的組組蛋白脫 乙酰酶抑制劑、甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白抑制劑、甲基腺苷基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑 制劑、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、組蛋白脫甲基酶抑制劑和甲基 循環(huán)酶抑制劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述小分子調(diào)節(jié)劑是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑是RG108。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中篩選所述細胞包括使用針對由復(fù)能基因表達的蛋 白的抗體或使用針對復(fù)能標記物的抗體來分離細胞。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中篩選所述細胞包括使用由復(fù)能基因驅(qū)動的報道分 子或?qū)x擇標記物的抗性來分離細胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述復(fù)能基因選自由0ct-4、SoX-2和Nanog組成的組。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將所述細胞暴露于所述小分子調(diào)節(jié)劑 之前復(fù)能基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與暴露于所述小分子調(diào)節(jié)劑之后獲得的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較。
11.一種用于重編程細胞的方法，所述方法包括將具有第一轉(zhuǎn)錄模式的細胞暴露于 小分子調(diào)節(jié)劑，其中所述調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)復(fù)能基因的表達；將所述細胞的所述第一轉(zhuǎn)錄模式與 暴露于所述調(diào)節(jié)劑之后獲得的轉(zhuǎn)錄模式相比較；并且篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù)分 化潛能。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中暴露于所述調(diào)節(jié)劑之后的所述轉(zhuǎn)錄模式至少50% 類似于胚胎干細胞的轉(zhuǎn)錄模式。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中比較所述轉(zhuǎn)錄模式之前，將所述細胞暴露于所述 小分子調(diào)節(jié)劑之前和之后的表型相比較。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，所述方法還包括將所述篩選的細胞擴增為細胞群。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中篩選所述細胞包括使用針對由復(fù)能基因表達的 蛋白的抗體或使用針對復(fù)能標記物的抗體來分離細胞。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述復(fù)能基因選自由0ct-4、SOX-2和Nanog組成 的組。
17.一種富集的重編程的細胞群，所述重編程的細胞群根據(jù)包括以下步驟的方法產(chǎn)生 將細胞暴露于誘導(dǎo)復(fù)能基因表達的小分子調(diào)節(jié)劑；并且篩選細胞，其中所述細胞已經(jīng)恢復(fù) 分化潛能；并培養(yǎng)所述篩選的細胞至產(chǎn)生細胞群。
18.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細胞群，其中所述重編程的細胞表達選自由 以下組成的組的細胞表面標記物SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。
19.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細胞群，其中所述復(fù)能基因選自由0ct-4、 Sox-2和Nanog組成的組。
20.如權(quán)利要求17所述的富集的重編程的細胞群，其中所述重編程的細胞占所述群的 至少60%。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于重編程細胞的方法、組合物和試劑盒。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包括誘導(dǎo)促使細胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達的方法。在又一個實施方案中，方法包括將細胞暴露于誘導(dǎo)促使細胞為復(fù)能或多能的至少一種基因的表達的小分子調(diào)節(jié)劑。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及能夠具有ES樣細胞的特征，能夠再分化或轉(zhuǎn)分化為各種分化的細胞類型的重編程的細胞以及富集的重編程的細胞群。
文檔編號C12N15/113GK102083968SQ200980121405
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者K·J·埃勒特森, 瑞秋·A·帕沃爾 申請人:紐珀滕索有限公司