專利名稱：固定的產(chǎn)物耐受的微生物的制作方法
固定的產(chǎn)物耐受的微生物交叉引用本申請要求享有2008年4月9日提交的美國臨時專利申請第61/043，710號的權(quán) 益，通過引用將其整體并入本文。
背景技術(shù)：
在石油化學(xué)工業(yè)興起之前，工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵在歷史上是為溶劑和酸的生產(chǎn)而進行 的。對污染、氣候變化和產(chǎn)生的環(huán)境退化的關(guān)注已更新了興趣，特別是在低成本或低污染的 生物物質(zhì)(biomatter)可作為原料利用的領(lǐng)域。在經(jīng)濟上制約更為普及的采用的一個問題 是從通常見于發(fā)酵培養(yǎng)液的低濃度回收發(fā)酵產(chǎn)物所需的高能耗。由于這些化合物對培養(yǎng)的 微生物的毒性，提高發(fā)酵培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度的努力取得了有限的成功。制約基于生物產(chǎn)物 的發(fā)酵的經(jīng)濟可行性的另一個問題是發(fā)酵過程的生產(chǎn)率。生產(chǎn)率的提高導(dǎo)致設(shè)備資本的改 良利用。本發(fā)明詳述了出人意料的發(fā)現(xiàn)，即產(chǎn)生產(chǎn)物的微生物的菌株、環(huán)境分離株、或突變 體可以就其同時存在的在固體支持體上生長和耐受高濃度產(chǎn)物的能力而適應(yīng)或選擇，并且 如果產(chǎn)生產(chǎn)物的微生物的這些菌株、環(huán)境分離株或突變體被固定在固體支持體上而不是作 為懸浮培養(yǎng)物培養(yǎng)，那么它們在培養(yǎng)物中保留較高的產(chǎn)物耐受性。改進整體培養(yǎng)物生產(chǎn)率 并降低能量利用的較高產(chǎn)物濃度現(xiàn)在是可能的。增加的產(chǎn)物耐受可能依賴于已知抑制劑的 抑制作用降低，所述抑制劑例如HMF、糠醛(fufural)、乙酰丙酸(levulenic acid)、葡糖醛 酸或乙酸，它們可能是由生物體產(chǎn)生的或者存在于最初的進料中。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面包括一種方法，該方法包括在生產(chǎn)溶劑的發(fā)酵工藝中培養(yǎng)固定 在固體支持體上的微生物的步驟，其中所述微生物是突變體并且表現(xiàn)出相比于相應(yīng)的非突 變微生物的溶劑耐受性至少125%的對溶劑的耐受性。在該方法的一些實施方案中，突變微生物表現(xiàn)出至少150%的對溶劑的耐受性。在 該方法的一些實施方案中，突變微生物表現(xiàn)出至少200%的對溶劑的耐受性。在該方法的一 些實施方案中，突變微生物表現(xiàn)出至少250%的對溶劑的耐受性。在該方法的一些實施方案 中，突變微生物表現(xiàn)出至少500%的對溶劑的耐受性。在該方法的一些實施方案中，突變微 生物表現(xiàn)出至少1，000%的對溶劑的耐受性。在該方法的一些實施方案中，培養(yǎng)微生物的步驟是在包含容器、固體支持體和生 長培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中進行的。在該方法的一些實施方案中，微生物包括細(xì)菌或真菌。在 該方法的一些實施方案中，微生物包括單個物種。在該方法的一些實施方案中，微生物包括 來自同一物種的菌株的混合培養(yǎng)物。在該方法的一些實施方案中，微生物包括不同物種的 混合培養(yǎng)物。在該方法的一些實施方案中，微生物包括環(huán)境分離株。在該方法的一些實施方案中，微生物包括以下屬梭菌屬(Clostridium)、腸球菌 屬(Enterococcus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella) > ILff lifM (Lactobacillus)、或芽孢桿 菌屬(Bacilus)。在該方法的一些實施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)、紫色梭菌(Clostridiumpuniceum)、！!丁 酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、尿腸球菌(Enterococcus faecium)、享鳥雞腸球菌(Enterococcus gallinarium)、金黃丁 酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、^？破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetanomorphum)或熱角軍 H 梭菌 (Clostridium thermosaccharoIyticum)0在該方法的一些實施方案中，突變微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭 菌，并且表現(xiàn)出對至少2%丁醇的耐受性。在該方法的一些實施方案中，突變微生物是丙酮 丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表現(xiàn)出對至少2. 5%丁醇的耐受性。在該方法的一 些實施方案中，突變微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在該方法的一些實施 方案中，突變微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表現(xiàn)出對至少5%丁醇 的耐受性。在該方法的一些實施方案中，突變微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭 菌。在該方法的一些實施方案中，突變微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并 且表現(xiàn)出對至少10%丁醇的耐受性。在該方法的一些實施方案中，突變微生物是丙酮丁醇 梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表現(xiàn)出對至少12% 丁醇的耐受性。在該方法的一些實施 方案中，突變微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表現(xiàn)出對至少15%丁醇 的耐受性。在一些實施方案中，本方法包括通過使包含突變細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)基循環(huán)經(jīng)過生物 反應(yīng)器來將突變微生物固定在固體支持體上的步驟。在該方法的一些實施方案中，微生物 處于對數(shù)生長狀態(tài)。在該方法的一些實施方案中，根據(jù)在第一固體支持體上的溶劑耐受性對微生物進 行選擇，然后將微生物培養(yǎng)在固定的第二固體支持體上。在該方法的一些實施方案中，第一 固體支持體包括瓊脂。在該方法的一些實施方案中，在第一固體支持體上選擇之前將微生物培養(yǎng)在包含 誘變劑的液體培養(yǎng)基中。在該方法的一些實施方案中，固體支持體包括多孔材料。在該方 法的一些實施方案中，固體支持體包括選自由以下組成的組的材料骨炭、合成聚合物、天 然聚合物、無機材料或有機材料。在該方法的一些實施方案中，固體支持體包括所述組中的 兩種或多種材料的復(fù)合材料。在該方法的一些實施方案中，固體支持體包含有機材料，包括 原料。在該方法的一些實施方案中，原料包括玉米淀粉或纖維素生物質(zhì)。在該方法的一些 實施方案中，固體支持體包括細(xì)胞生物質(zhì)或細(xì)胞生物質(zhì)的團聚物。在該方法的一些實施方 案中，固體支持體包括在梅拉德反應(yīng)過程中形成的有機分子。在一些實施方案中，固體支持 體包括在培養(yǎng)基中形成的有機沉淀。在該方法的一些實施方案中，發(fā)酵工藝包括使用串聯(lián)或平行排列的至少兩個生物 反應(yīng)器。在一些實施方案中，本方法包括在至少兩個生物反應(yīng)器的至少一個中使用懸浮培 養(yǎng)。在該方法的一些實施方案中，至少兩個生物反應(yīng)器的至少一個的發(fā)酵工藝是連續(xù)培養(yǎng)。 在該方法的一些實施方案中，至少一種連續(xù)培養(yǎng)物接收來自另一種培養(yǎng)物的發(fā)酵流出液。 在該方法的一些實施方案中，至少一種連續(xù)培養(yǎng)物具有比產(chǎn)生發(fā)酵流出液的培養(yǎng)物高的溶 劑耐受性。在該方法的一些實施方案中，發(fā)酵工藝包括分批培養(yǎng)、補料-分批培養(yǎng)或連續(xù)培 養(yǎng)。在該方法的一些實施方案中，發(fā)酵工藝包括提取發(fā)酵，其中溶劑產(chǎn)物被連續(xù)提取。在該 方法的一些實施方案中，發(fā)酵工藝是需氧的、厭氧的或微需氧的。在該方法的一些實施方案中，連續(xù)培養(yǎng)包括連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基，并從培養(yǎng)物中8連續(xù)移除發(fā)酵流出液。在該方法的一些實施方案中，連續(xù)培養(yǎng)包括使突變微生物保持在對 數(shù)生長狀態(tài)中。在該方法的一些實施方案中，固定的突變微生物包括對至少2%丁醇耐受的 梭菌。在該方法的一些實施方案中，溶劑選自由醛、酮或醇組成的組。在該方法的一些實 施方案中，溶劑包括選自以下醛乙醛、丁醛或丙醛。在該方法的一些實施方案中，溶劑包括 選自以下酮丙酮或丁酮。在該方法的一些實施方案中，溶劑包括選自以下醇甲醇、乙醇、 丙醇、異丙醇、丁醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、2，3-丁二醇、2-甲 基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。本發(fā)明的一個方面包括包含生物反應(yīng)器的系統(tǒng)，所述生物反應(yīng)器包含與固體支持 體接觸的生長培養(yǎng)基和固定在該固體支持體上的微生物，其中所述微生物是突變微生物， 它們表現(xiàn)出與相應(yīng)的非突變微生物的溶劑耐受性相比至少125%的對溶劑的耐受性。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，突變微生物表現(xiàn)出至少150%的對溶劑的耐受性。在 該系統(tǒng)的一些實施方案中，突變微生物表現(xiàn)出至少200%的對溶劑的耐受性。在該系統(tǒng)的一 些實施方案中，突變微生物表現(xiàn)出至少250%的對溶劑的耐受性。在該方法的一些實施方案 中，突變的微生物表現(xiàn)出至少500%的對溶劑的耐受性。在該方法的一些實施方案中，突變 的微生物表現(xiàn)出至少1，000%的對溶劑的耐受性。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，生物反應(yīng)器還包括厭氧的或微需氧的環(huán)境。在一些 實施方案中，該系統(tǒng)包括至少一個其他的生物反應(yīng)器，其中這些生物反應(yīng)器被串聯(lián)或平行 排列。在一些實施方案中，該系統(tǒng)包括至少兩個生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器包含來自不同 物種的微生物或來自同一物種的不同菌株。在一些實施方案中，該系統(tǒng)包括包含懸浮的微 生物的至少一個生物反應(yīng)器和包含固定的微生物的至少一個生物反應(yīng)器。在一些實施方案 中，該系統(tǒng)包含串聯(lián)排列的兩個生物反應(yīng)器，其中來自串聯(lián)的第一生物反應(yīng)器的流出液構(gòu) 成第二生物反應(yīng)器的原料流。在一些實施方案中，該系統(tǒng)適合于分批培養(yǎng)、補料-分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)。在一些 實施方案中，該系統(tǒng)適合于提取發(fā)酵，其中溶劑產(chǎn)物被連續(xù)提取。在一些實施方案中，該系 統(tǒng)包括用于將微生物保持在連續(xù)培養(yǎng)物中的裝置。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，發(fā)酵工藝 是連續(xù)培養(yǎng)，還包括在溶劑純化過程中回收的發(fā)酵培養(yǎng)液的養(yǎng)分和礦物質(zhì)的再循環(huán)和再利用。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，根據(jù)在第一固體支持體上的溶劑耐受性對微生物進 行選擇，然后將微生物培養(yǎng)在固定的第二固體支持體上。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，第一 固體支持體包括瓊脂。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，在第一固體支持體上選擇之前將微生 物培養(yǎng)在包含誘變劑的液體培養(yǎng)基中。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，固體支持體包括多孔材料。在該系統(tǒng)的一些實施方 案中，固體支持體包括選自由以下組成的組的材料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、無機材 料或有機材料。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，固體支持體包含有機材料，包括原料。在該系 統(tǒng)的一些實施方案中，固體支持體包含原料，原料包括玉米淀粉或纖維素生物質(zhì)。在該系統(tǒng) 的一些實施方案中，固體支持體包括所述組中的兩種或多種材料的復(fù)合材料。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，微生物包括細(xì)菌和/或真菌。在該系統(tǒng)的一些實施 方案中，微生物包括單個物種。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，微生物包括來自同一物種的菌株的混合培養(yǎng)物。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，微生物包括不同物種的混合培養(yǎng)物。在該 系統(tǒng)的一些實施方案中，由微生物的一個物種或混合培養(yǎng)物種產(chǎn)生的發(fā)酵培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移至 包含不同物種或混合培養(yǎng)物種的另一發(fā)酵培養(yǎng)物中。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，微生物包括以下屬梭菌屬、腸球菌屬、克雷伯氏菌 屬、乳桿菌屬或芽孢桿菌屬。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏 梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、金黃丁酸梭菌、假破傷風(fēng)梭菌或熱解 糖梭菌。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，突變的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌。在該 系統(tǒng)的一些實施方案中，突變的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表現(xiàn)出對至少 2%丁醇的耐受性。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，突變的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭 菌，并且表現(xiàn)出對至少2. 5%丁醇的耐受性。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，突變的微生物是 丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表現(xiàn)出對至少5%丁醇的耐受性。在該系統(tǒng)的一些實施 方案中，突變的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表現(xiàn)出對至少10% 丁醇的耐受 性。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，突變的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表現(xiàn)出 對至少12%丁醇的耐受性。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，突變的微生物是丙酮丁醇梭菌或 糖丁酸梭菌，并且表現(xiàn)出對至少15% 丁醇的耐受性。在本發(fā)明的一個方面，提供了用于在生物反應(yīng)器中制備產(chǎn)物的方法，該方法包括 i)培養(yǎng)微生物，所述微生物被適應(yīng)或誘變使得表現(xiàn)出與相應(yīng)非適應(yīng)的或非誘變的微生物的 產(chǎn)物耐受性相比對產(chǎn)物至少150%的產(chǎn)物耐受性；和ii)收獲所述產(chǎn)物。在一些實施方案 中，適應(yīng)的微生物或突變的微生物表現(xiàn)出對產(chǎn)物至少200%的耐受性、對產(chǎn)物至少500%的 耐受性或?qū)Ξa(chǎn)物至少1000%的耐受性。在本發(fā)明的一些實施方案中，微生物包括細(xì)菌或真菌。在一些實施方案中，微生物 包括單個物種，而在其他實施方案中微生物包括來自同一物種或不同物種的菌株的混合培 養(yǎng)物。在一些實施方案中，微生物處于對數(shù)生長狀態(tài)。在一些實施方案中，微生物包括以下屬梭菌屬、腸球菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌 屬或芽孢桿菌屬。在其他實施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁 酸梭菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、金黃丁酸梭菌、假破傷風(fēng)梭菌或熱解糖梭菌。在一些實施方 案中，這些梭菌屬物種產(chǎn)生丁醇。在其他實施方案中，丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭 菌表現(xiàn)出對至少2%丁醇、至少2. 5%丁醇、至少5%丁醇、至少10%丁醇、至少12%丁醇或 至少15% 丁醇的耐受性。在一些實施方案中，微生物被固定在固體支持體上。在其他實施方案中，通過使包 含適應(yīng)的細(xì)胞或突變的細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)基循環(huán)經(jīng)過生物反應(yīng)器來完成固定。在一些實施方 案中，循環(huán)的發(fā)酵培養(yǎng)基包含固定在固體支持體上的適應(yīng)的微生物或突變的微生物。在一些實施方案中，根據(jù)在第一固體支持體上的產(chǎn)物耐受性對微生物進行選擇， 然后將微生物培養(yǎng)在固定的第二固體支持體上。在一些實施方案中，第一固體支持體包括 瓊脂。在一些實施方案中，與在液體培養(yǎng)基中表現(xiàn)出的產(chǎn)物耐受性相比，微生物在固體支持 體上表現(xiàn)出增強的產(chǎn)物耐受性。在其他實施方案中，固體支持體是半固體或固體。在其他實 施方案中，固體支持體包括多孔材料。仍在其他實施方案中，固體支持體包括選自由以下組 成的組的材料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、無機材料或有機材料。在一些實施方案中，固體支持體包括所述組中的兩種或多種材料的復(fù)合材料。在其他實施方案中，固體支持體 包含有機材料，包括原料。在其他實施方案中，原料包括玉米淀粉或纖維素生物質(zhì)。在其他 實施方案中，有機物包括細(xì)胞生物質(zhì)或細(xì)胞生物質(zhì)的團聚物。在另一實施方案中，有機物包 括在原料準(zhǔn)備過程中和/或在發(fā)酵過程中形成的沉淀。仍在其他實施方案中，固體支持體 包括在梅拉德反應(yīng)過程中形成的有機分子。在一些實施方案中，培養(yǎng)步驟包括使用串聯(lián)或平行排列的至少兩個生物反應(yīng)器。 在一些實施方案中，在所述至少兩個生物反應(yīng)器中包括至少一個懸浮培養(yǎng)。在其他實施方 案中，在至少兩個生物反應(yīng)器的至少兩個中使用固定的培養(yǎng)物。在其他實施方案中，至少兩 個生物反應(yīng)器中的至少一個是連續(xù)培養(yǎng)。在其他實施方案中，至少一種連續(xù)培養(yǎng)物接收來 自另一種培養(yǎng)物的發(fā)酵流出液。仍在其他實施方案中，至少一種連續(xù)培養(yǎng)物具有比產(chǎn)生發(fā) 酵流出液的培養(yǎng)物更高的產(chǎn)物耐受性。在一些實施方案中，培養(yǎng)步驟包括以分批培養(yǎng)、補料-分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)而培 養(yǎng)微生物。在其他實施方案中，培養(yǎng)步驟是在填充床生物反應(yīng)器或流化床生物反應(yīng)器中進 行的。仍在其他實施方案中，流化床生物反應(yīng)器是一種膨脹床生物反應(yīng)器。在一些實施方 案中，培養(yǎng)步驟是在適合于以填充床或流化床模式操縱的生物反應(yīng)器中進行的。在一些實施方案中，生物反應(yīng)器包括a)填充床區(qū)，所述填充床區(qū)適合于容納固 體支持體；b)床膨脹區(qū)，所述床膨脹區(qū)與所述填充床區(qū)接合，當(dāng)以膨脹床模式操縱所述 生物反應(yīng)器時，所述床膨脹區(qū)適合于容納所述固體支持體；和c)顆粒脫離區(qū)(particle disengagement zone)，所述顆粒脫離區(qū)與所述床膨脹區(qū)接合，所述顆粒脫離區(qū)適合于防止 所述固體支持體從所述生物反應(yīng)器中出去。在一些實施方案中，生物反應(yīng)器還包括與填充床區(qū)接合的入口分配區(qū)。在其他實 施方案中，柱還包括柱膨脹區(qū)。在其他實施方案中，生物反應(yīng)器在入口分配區(qū)具有的壓力降 不超過跨生物反應(yīng)器整個長度總壓力降的30%。在其他實施方案中，顆粒脫離區(qū)的直徑比 填充床區(qū)或膨脹床區(qū)的直徑大。在一些實施方案中，連續(xù)培養(yǎng)包括連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基并 從培養(yǎng)物中連續(xù)移除發(fā)酵流出液。在其他實施方案中，連續(xù)培養(yǎng)包括將適應(yīng)的微生物或突 變的微生物保持在對數(shù)生長狀態(tài)。在一些實施方案中，微生物包括對至少2%丁醇耐受的梭菌屬物種。在其他實施 方案中，培養(yǎng)步驟是在厭氧、微需氧或需氧條件下進行的。在一些實施方案中，產(chǎn)物選自由 有機酸、醛、酮或醇組成的組。在其他實施方案中，有機酸選自甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、 琥珀酸、己二酸或氨基酸。仍在其他實施方案中，醛選自乙醛、丁醛或丙醛。在其他實施方 案中，酮選自丙酮或丁酮。仍在其他實施方案中，醇選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、 1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、1，3-丙二醇、2，3_丙二醇、2，3_ 丁二醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲 基-1-丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。在其他實施方案中，產(chǎn)物是選自由以下組成的組的抑制 性產(chǎn)物5-羥甲基糠醛、糠醛、乙酸、葡糖醛酸(glucouronic acid)以及乙酰丙酸。在一些實施方案中，收獲步驟包括連續(xù)從培養(yǎng)物中提取產(chǎn)物。在其他實施方案中， 連續(xù)提取是使用汽提氣、溶劑、吸收材料、全蒸發(fā)膜或蒸餾進行的。在一些實施方案中，培養(yǎng)步驟包括在提供至少6g/L/小時、至少8g/L/小時或至少 10g/L/小時的丁醇生產(chǎn)率的條件下培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些實 施方案中，培養(yǎng)步驟包括在提供至少10g/L/小時或至少13g/L的總?cè)軇┥a(chǎn)率的條件下培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些實施方案中，每天生產(chǎn)至少1000升的丁 醇或者每天產(chǎn)生至少1500升的總?cè)軇?。在一些實施方案中，培養(yǎng)步驟包括培養(yǎng)至少7天或至少30天。在一些實施方案中，微生物包含異源基因。在其他實施方案中，異源基因編碼在產(chǎn) 物生物合成途徑中的酶。仍在其他實施方案中，酶選自由以下組成的組磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙 酸激酶、NAD依賴性β羥丁酰輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶、 乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶、NADH依賴性丁醇脫氫酶B、NADH依賴 性丁醇脫氫酶Α、醛-醇脫氫酶、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、醛脫氫酶、丁酸乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn) 移酶A亞基、丁酸乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶B亞基和乙酰乙酸脫羧酶。一方面，提供了用于制備產(chǎn)物的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器 包含a)與固體支持體接觸的生長培養(yǎng)基；b)固定在所述固體支持體上的微生物，其中微 生物被適應(yīng)或誘變以表現(xiàn)出與相應(yīng)的非適應(yīng)的或非誘變微生物的產(chǎn)物耐受性相比對產(chǎn)物 至少150 %的產(chǎn)物耐受性。在一些實施方案中，適應(yīng)的微生物或突變的微生物表現(xiàn)出對產(chǎn)物 至少200%的耐受性、至少500%的耐受性或至少1000%的耐受性。在一些實施方案中，微 生物包括以下屬梭菌屬、腸球菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬或芽孢桿菌屬。在其他實施方 案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、 金黃丁酸梭菌、假破傷風(fēng)梭菌或熱解糖梭菌。仍在其他實施方案中，適應(yīng)的微生物或突變的 微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些實施方案中，產(chǎn)物是丁醇。在其他 實施方案中，微生物是對至少2%丁醇、對至少2. 5%丁醇、對至少5% 丁醇或?qū)χ辽?0%丁 醇表現(xiàn)出耐受性的丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些實施方案中，微生物包含異源基因。在其他實施方案中，異源基因編碼在產(chǎn) 物生物合成途徑中的酶。仍在其他實施方案中，酶選自由以下組成的組磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙 酸激酶、NAD依賴性β羥丁酰輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶、 乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶、NADH依賴性丁醇脫氫酶B、NADH依賴 性丁醇脫氫酶Α、醛-醇脫氫酶、乙酰輔酶Α、乙酰轉(zhuǎn)移酶、醛脫氫酶、丁酸乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn) 移酶A亞基、丁酸乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶B亞基和乙酰乙酸脫羧酶。在一些實施方案中，該系統(tǒng)包括用于將微生物保持在連續(xù)培養(yǎng)物中的裝置。在一 些實施方案中，發(fā)酵工藝是連續(xù)培養(yǎng)，還包括在產(chǎn)物純化過程中回收的發(fā)酵培養(yǎng)液的養(yǎng)分 和礦物質(zhì)的再循環(huán)和再利用。在其他實施方案中，與在液體支持體中表現(xiàn)出的產(chǎn)物耐受性 相比，微生物在固體支持體上表現(xiàn)出增強的產(chǎn)物耐受性。在一些實施方案中，固體支持體包 括多孔材料。在其他實施方案中，固體支持體包括選自由以下組成的組的材料骨炭、合成 聚合物、天然聚合物、無機材料或有機材料。在其他實施方案中，固體支持體包含有機材料， 包括原料。在一些實施方案中，產(chǎn)物選自由有機酸、醛、酮或醇組成的組。在其他實施方案中， 有機酸選自甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、己二酸或氨基酸。在其他實施方案中，醛 選自乙醛、丁醛或丙醛。仍在其他實施方案中，酮選自丙酮或丁酮。在一些實施方案中，醇 選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、2， 3- 丁二醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。在該系統(tǒng)的一些實施方案中，在提供至少6g/L/小時、至少8g/L/小時或至少IOg/L/小時的丁醇生產(chǎn)率的條件下培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些實施方 案中，在提供至少10g/L或至少13g/L的總?cè)軇┑味鹊臈l件下培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭 菌或拜氏梭菌。在一些實施方案中，該系統(tǒng)每天生產(chǎn)至少1000升的丁醇或者每天產(chǎn)生至少 1500升的總?cè)軇??！矫?，提供了生物反?yīng)器，所述生物反應(yīng)器包括a)填充床區(qū)，所述填充床區(qū)適 合于容納固體支持體；b)床膨脹區(qū)，所述床膨脹區(qū)與所述填充床區(qū)接合，當(dāng)以膨脹床模式 操縱所述生物反應(yīng)器時，所述床膨脹區(qū)適合于容納所述固體支持體；和c)顆粒脫離區(qū)，所 述顆粒脫離區(qū)與所述床膨脹區(qū)接合，所述顆粒脫離區(qū)適合于防止所述固體支持體從所述生 物反應(yīng)器中出去。在一些實施方案中，所述填充床區(qū)和所述床膨脹區(qū)的結(jié)合高度(combined height) (H)與填充床區(qū)的高度(Hp)之比大于1. 01、1. 05、1. 10、1. 15或1. 20。在一些實施方案中，生物反應(yīng)器還包括適合于安放在床膨脹區(qū)和顆粒脫離區(qū)之間 的柱膨脹區(qū)，其中柱膨脹區(qū)的上游端與床膨脹區(qū)接合，并且柱膨脹區(qū)的下游端與顆粒脫離 區(qū)接合。在一些實施方案中，柱膨脹區(qū)包括距水平線向上傾斜至少10°或至少30°的傾斜 角度。在一些實施方案中，生物反應(yīng)器還包括與顆粒脫離區(qū)接合的氣體-液體分離區(qū)。在 一些實施方案中，生物反應(yīng)器被設(shè)置成以填充床模式或以膨脹床模式操縱。在其他實施方 案中，生物反應(yīng)器還被設(shè)置成在填充床模式和膨脹床模式的操作之間交替。在一些實施方 案中，生物反應(yīng)器能夠連續(xù)發(fā)酵至少100小時、至少500小時或至少1000小時。在一些實施方案中，固體支持體是半固體或固體。在其他實施方案中，固體支持體 包括多孔材料。在其他實施方案中，固體支持體包括至少50m2/g的表面積。仍在其他實施 方案中，固體支持體包括至少0. 3g/cm3的堆密度。在其他實施方案中，固體支持體包括至 少60的球盤硬度數(shù)。在其他實施方案中，固體支持體包括至少20MaP的屈服強度。在一些實施方案中，固體支持體包括選自由以下組成的組的材料骨炭、合成聚合 物、天然聚合物、無機材料或有機材料。在其他實施方案中，固體支持體包括所述組中的兩 種或多種材料的復(fù)合材料。在其他實施方案中，固體支持體包含有機材料，包括原料。仍在 其他實施方案中，原料包括玉米淀粉、纖維素生物質(zhì)、細(xì)胞生物質(zhì)、細(xì)胞生物質(zhì)的團聚物、在 原料準(zhǔn)備過程中和/或在發(fā)酵過程中形成的沉淀、或者在梅拉德反應(yīng)過程中形成的有機分 子。一方面，提供了用于在固體支持體上發(fā)酵生物學(xué)產(chǎn)物的生物反應(yīng)器，所述生物反 應(yīng)器包括a)填充床區(qū)，包括其中的固體支持體，所述固體支持體包括其上用于發(fā)酵所述 生物學(xué)產(chǎn)物的微生物；b)床膨脹區(qū)，所述床膨脹區(qū)與所述填充床區(qū)接合，當(dāng)以膨脹床模式 操縱所述生物反應(yīng)器時，所述床膨脹區(qū)適合于容納所述固體支持體；和c)顆粒脫離區(qū)，所 述顆粒脫離區(qū)與所述床膨脹區(qū)接合，所述顆粒脫離區(qū)適合于防止所述固體支持體從所述生 物反應(yīng)器中出去。在一些實施方案中，所述填充床區(qū)和所述床膨脹區(qū)的結(jié)合高度(H)與填 充床區(qū)的高度(Hp)之比大于1. 01,1. 05,1. 10,1. 15或1. 20。在一些實施方案中，生物反應(yīng)器還包括適合于安放在床膨脹區(qū)和顆粒脫離區(qū)之間 的柱膨脹區(qū)，其中柱膨脹區(qū)的上游端與床膨脹區(qū)接合，并且柱膨脹區(qū)的下游端與顆粒脫離 區(qū)接合。在一些實施方案中，柱膨脹區(qū)包括距水平線向上傾斜至少10°或至少30°的傾 斜角度。在一些實施方案中，生物反應(yīng)器還包括與顆粒脫離區(qū)接合的氣體-液體分離區(qū)。在13一些實施方案中，生物反應(yīng)器被設(shè)置成以填充床模式或以膨脹床模式操縱。在一些實施方 案中，生物反應(yīng)器還被設(shè)置成在填充床模式和膨脹床模式的操作之間交替。在一些實施方 案中，生物反應(yīng)器能夠連續(xù)發(fā)酵至少100小時、至少500小時或至少1000小時。在一些實施方案中，微生物包括以下屬梭菌屬、腸球菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌 屬或芽孢桿菌屬。在其他實施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁 酸梭菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、金黃丁酸梭菌、假破傷風(fēng)梭菌或熱解糖梭菌。在一些實施方案中，微生物生產(chǎn)丁醇。在其他實施方案中，丙酮丁醇梭菌、糖丁酸 梭菌或拜氏梭菌表現(xiàn)出對至少2%丁醇、至少2. 5%丁醇、至少5%丁醇或至少10%丁醇的 耐受性。在一些實施方案中，通過使包含微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基循環(huán)經(jīng)過生物反應(yīng)器來將微 生物固定在固體支持體上。在其他實施方案中，循環(huán)的發(fā)酵培養(yǎng)基包含固定在顆粒上的微 生物。在一些實施方案中，微生物處于對數(shù)生長狀態(tài)。在一些實施方案中，固體支持體是半固體或固體。在另外的實施方案中，固體支持 體包括多孔材料。仍在另外的實施方案中，固體支持體包括選自由以下組成的組的材料骨 炭、合成聚合物、天然聚合物、無機材料或有機材料。在一些實施方案中，固體支持體包括所 述組中的兩種或多種材料的復(fù)合材料。在其他實施方案中，固體支持體包含有機材料(包 括原料)、細(xì)胞生物質(zhì)、細(xì)胞生物質(zhì)的團聚物，有機物，包括在原料準(zhǔn)備過程中和/或在發(fā)酵 過程中形成的沉淀，或在梅拉德反應(yīng)過程中形成的有機分子。在另外的實施方案中，原料包 括玉米淀粉或纖維素生物質(zhì)。在本發(fā)明的一個方面，提供了用于制備生物學(xué)產(chǎn)物的方法，所述方法包括a)將 微生物培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中，所述生物反應(yīng)器包括i)填充床區(qū)，包括其中的固體支持體， 所述固體支持體包括其上用于發(fā)酵所述生物學(xué)產(chǎn)物的微生物；ii)床膨脹區(qū)，所述床膨脹 區(qū)與所述填充床區(qū)接合，當(dāng)以膨脹床模式操縱所述生物反應(yīng)器時，所述床膨脹區(qū)適合于容 納所述固體支持體；和iii)顆粒脫離區(qū)，所述顆粒脫離區(qū)與所述床膨脹區(qū)接合，所述顆粒 脫離區(qū)適合于防止所述固體支持體從所述生物反應(yīng)器中出去；以及b)收獲產(chǎn)物。附圖簡述

圖1是顯示雙盤誘變測定(double disc mutagenesis assay)的配置的圖片。圖2A顯示在各個時間點和丁醇濃度的0D_測量結(jié)果。圖2B顯示按1 20接種的起始培養(yǎng)物的0D_測量結(jié)果。圖3是顯示在每種丁醇濃度(0% -1. 6%丁醇)的液體培養(yǎng)基中Co-5673隨時間 生長的圖。圖4是顯示在每種丁醇濃度(0% -1. 6%丁醇)的液體培養(yǎng)基中Co-0124隨時間 生長的圖。圖5是顯示在每種丁醇濃度(0% -1. 6%丁醇)的液體培養(yǎng)基中Co-7449隨時間 生長的圖。圖6A是顯示分析三種菌株Co-5673、Co-7449和Co-OlM在固體培養(yǎng)基(P2+4% 木糖)上在M小時的丁醇耐受的表。觀察到的生長表明了丁醇耐受性。圖6B是在M小時的時間點，在液體培養(yǎng)基中和在固體培養(yǎng)基上生長的三種菌株 的丁醇耐受性的比較。
圖7A是顯示分析三種菌株Co-5673、Co-7449和Co-OlM在固體培養(yǎng)基(P2+4% 木糖)上在96小時的丁醇耐受性的表。觀察到的生長表明了丁醇耐受。圖7B是在96小時的時間點，在液體培養(yǎng)基中和在固體培養(yǎng)基上生長的三種菌株 的丁醇耐受性的比較。圖8用圖說明包括串聯(lián)排列的具有懸浮的細(xì)胞的生物反應(yīng)器和具有固定的細(xì)胞 生物反應(yīng)器的系統(tǒng)。將培養(yǎng)基引入到懸浮的細(xì)胞的生物反應(yīng)器中，將發(fā)酵流出液移出并連 同另外的培養(yǎng)基一起引入到固定細(xì)胞生物反應(yīng)器中。固定細(xì)胞生物反應(yīng)器包含具有丁醇耐 受性、表現(xiàn)出提高的產(chǎn)物耐受性的分離的、適應(yīng)的菌株或突變體，它們能夠利用培養(yǎng)基中的 殘余基質(zhì)，產(chǎn)生高濃度的產(chǎn)物。然后將發(fā)酵流出液移出并送往分離和回收。圖9A是包括具有不同大小的目、沉降速度(cm/s)以及等效直徑(μ m)的骨炭顆 粒的三個實例的表。圖9B是使用終端沉降速度，5X8型骨炭在4%葡萄糖溶液中的等效直徑的圖示。圖IOA是顯示以5X8型骨炭在4%葡萄糖溶液中的不同等效直徑，經(jīng)一定范圍的 空隙率計算出的最小流化速度(Umf)的表。圖IOB是顯示對5X8型骨炭的不同等效直徑，經(jīng)一定范圍的空隙率計算出的最小 流化速度(Umf)的圖示。圖IlA是顯示以IOX^型骨炭在4%葡萄糖溶液中的不同等效直徑，經(jīng)一定范圍 的空隙率計算出的最小流化速度(Umf)的表。圖IlB是顯示對10父觀型骨炭的不同等效直徑，經(jīng)一定范圍的空隙率計算出的最 小流化速度(Umf)的圖示。圖12A是顯示以20X60型骨炭在4%葡萄糖溶液中的不同等效直徑，經(jīng)一定范圍 的空隙率計算出的最小流化速度(Umf)的表。圖12B是顯示對20X60型骨炭的不同等效直徑，經(jīng)一定范圍的空隙率計算出的最 小流化速度(Umf)的圖示。圖13A顯示了用于計算5X8型骨炭的床膨脹水平的參數(shù)。結(jié)果是膨脹床高度比 填充床高度的比率形式(H/Ht_)。圖1 是5X8型骨炭的床膨脹的圖示。圖14A顯示了用于計算IOX^型骨炭的床膨脹水平的參數(shù)。結(jié)果是膨脹床高度 比填充床高度的比率形式(H/Ht_)。圖14B是IOX^型骨炭的床膨脹的圖示。圖15A用圖說明了用于計算20X60型骨炭的床膨脹水平的參數(shù)。結(jié)果是膨脹床 高度比填充床高度的比率形式(H/Ht_)。圖15B是20X60型骨炭的床膨脹的圖示。圖16用圖說明了確定填充區(qū)的高度、床膨脹區(qū)的高度和實現(xiàn)5X8型骨炭流化的 液體流動速率的設(shè)計計算。圖17用圖說明了確定填充區(qū)的高度、床膨脹區(qū)的高度和實現(xiàn)IOX^型骨炭流化 的液體流動速率的設(shè)計計算。圖18用圖說明了確定填充區(qū)的高度、床膨脹區(qū)的高度和實現(xiàn)20X60型骨炭流化 的液體流動速率的設(shè)計計算。
圖19用圖說明了樣品反應(yīng)器概念。圖20是顯示被收集以支持生物反應(yīng)器的設(shè)計和建模的實驗數(shù)據(jù)的表。圖21是固定細(xì)胞生物反應(yīng)器的配置和控制的方案。圖22顯示Co-7449在IOOmL固定細(xì)胞生物反應(yīng)器中連續(xù)發(fā)酵的過程中所獲得的 數(shù)據(jù)的實驗蹤跡。圖23顯示Co-7449在IOOOmL固定細(xì)胞生物反應(yīng)器中連續(xù)發(fā)酵的過程中所獲得的 數(shù)據(jù)的實驗蹤跡。圖M顯示Co-5673在IOOOmL固定細(xì)胞生物反應(yīng)器中連續(xù)發(fā)酵的過程中所獲得的 數(shù)據(jù)的實驗蹤跡。圖25顯示Co-7449在IOOOmL固定細(xì)胞生物反應(yīng)器中連續(xù)發(fā)酵的過程中所獲得的 數(shù)據(jù)的實驗蹤跡。圖沈顯示Co-5673在IOOOmL固定細(xì)胞生物反應(yīng)器中連續(xù)發(fā)酵的過程中所獲得的 數(shù)據(jù)的實驗蹤跡。圖27是概括在固定細(xì)胞生物反應(yīng)器中連續(xù)產(chǎn)生丁醇的過程中獲得的實驗數(shù)據(jù)的 圖表。圖觀是小試規(guī)模固定細(xì)胞的填充床生物反應(yīng)器工藝設(shè)計/控制的方案(具有生 物反應(yīng)器溫度指示器控制)。圖四是小型規(guī)模(mini-pilot)工藝流-上游加工的方案(沒有收獲罐的固定細(xì) 胞的填充床生物反應(yīng)器)。MF代表微量過濾，例如切向流過濾。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于提高從微生物的培養(yǎng)物中生產(chǎn)產(chǎn)物的總產(chǎn)率的方法和材料。所 述方法是通過在半固體或固體支持體上適應(yīng)或選擇微生物實現(xiàn)的，所述微生物顯示出對產(chǎn) 物的高耐受性，所述產(chǎn)物包括有機酸，像乙酸和丁酸，以及溶劑，例如醇、醛和酮。然后在產(chǎn) 生產(chǎn)物的條件下將微生物培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中的半固體或固體支持體上，在其中所選擇的 微生物出人意料地保持其對產(chǎn)物的耐受性，并且表現(xiàn)出與起始的一種或多種微生物母體原 料相比至少大125%的對具體產(chǎn)物的耐受性。本發(fā)明的微生物包括細(xì)菌和真菌。本發(fā)明的 微生物可以來源于最近從環(huán)境分離的微生物、來源于已知培養(yǎng)物、突變體或來源于被遺傳 修飾的培養(yǎng)物。在一些實施方案中，使用來自同一物種的不同菌株的混合培養(yǎng)物或不同物 種的混合培養(yǎng)物。本發(fā)明考慮使用這些方法來生產(chǎn)沿著生物化學(xué)途徑、代謝途徑、合成途徑或發(fā)酵 途徑所產(chǎn)生的產(chǎn)物。本發(fā)明適用于任何生產(chǎn)產(chǎn)物的途徑，不論是天然存在的、部分遺傳工程 的或完全遺傳工程的途徑。本發(fā)明還包括微生物，其中在將中間產(chǎn)物從生產(chǎn)產(chǎn)物的途徑中 占用的競爭途徑中一種或多種基因的表達(dá)被敲除或工程化以具有減少的表達(dá)。天然存在的 生產(chǎn)有機酸的發(fā)酵途徑的一個實例是乳桿菌屬物種的同型乳酸發(fā)酵途徑。天然存在生產(chǎn)溶 劑的發(fā)酵途徑的實例是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙醇途徑。溶劑途徑的 另一實例是丙酮丁醇梭菌的丁醇途徑。部分遺傳工程發(fā)酵途徑的實例是工程化到大腸桿菌 中的乙醇途徑。部分遺傳工程合成途徑的實例是工程化到大腸桿菌中的四碳醇途徑。M本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)有機酸。這些有機酸包括，例如甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸和其他二羧酸、己二酸以及氨基酸。通過微生物生產(chǎn)可用作食品或藥品添加 劑、或工業(yè)化學(xué)品的有機酸是特別令人感興趣的。mM本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)工業(yè)溶劑。這些工業(yè)溶劑包括，例如醇(乙醇、丁醇、丙 醇、異丙醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、1，2-丁二醇、2，3-丁二醇、1，2，4-丁三 醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇、丙三醇、正戊醇及其異構(gòu)體、正己醇及其異構(gòu)體、正庚醇及其 異構(gòu)體、正辛醇及其異構(gòu)體)，醛(乙醛、丁醛)以及酮(丙酮、丁酮)。通過微生物生產(chǎn)可 用作燃料和工業(yè)化學(xué)品的溶劑是特別令人感興趣的。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可 用于通過丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌或糖丁酸梭菌增加高價值的生物燃料丁醇的 生產(chǎn)。其他適應(yīng)或詵擇的耐警件本文的方法也可以用于分離適應(yīng)的微生物或選擇的微生物，所述微生物具有對發(fā) 酵途徑、代謝途徑、呼吸途徑或合成途徑中生產(chǎn)的中間物質(zhì)的提高的耐受性。另外，提高的 產(chǎn)物耐受性可以是間接的并且可以依賴抑制劑的降低的抑制作用，所述抑制劑包括但不限 于HMF、糠醛、乙酰丙酸、葡糖醛酸、自溶素或乙酸。抑制劑可以由生物體產(chǎn)生，或者可以存 在于最初的進料中。抑制劑或抑制性物質(zhì)可以沿著發(fā)酵途徑、代謝途徑、呼吸途徑或合成途 徑形成。對抑制劑提高的耐受性可以提高期望產(chǎn)物例如乙醇、丁醇等等的生產(chǎn)率。在一個 實施方案中，與未適應(yīng)的微生物或未誘變的微生物以及選擇的微生物相比實現(xiàn)對抑制劑提 高的耐受性，所述抑制劑選自由HMF、糠醛、乙酰丙酸、葡糖醛酸和乙酸組成的組。發(fā)酵途徑發(fā)酵途徑是厭氧進行的代謝途徑，其中有機分子而非氧作為末端電子接受體起作 用，如在需氧條件下氧化磷酸化所發(fā)生的那樣。糖酵解是在細(xì)菌(丙酮丁醇梭菌和大腸桿 菌)和酵母中的廣泛的發(fā)酵途徑的實例。在糖酵解過程中，細(xì)胞將單糖例如葡萄糖轉(zhuǎn)化成 丙酮酸，同時凈產(chǎn)生ATP和NADH。在再生NAD+的短途徑中消耗至少95%丙酮酸，NAD+是用 于持續(xù)的糖酵解和ATP生產(chǎn)的專性需求物。這些NAD+再生系統(tǒng)的廢物或終產(chǎn)物被稱為發(fā) 酵產(chǎn)物。取決于生物和培養(yǎng)條件，丙酮酸最終被轉(zhuǎn)化成諸如有機酸(甲酸、乙酸、乳酸、丙酮 酸、丁酸、琥珀酸和其他二羧酸)和中性溶劑(乙醇、丁醇、丙酮、1，3_丙二醇、2，3_丙二醇、 乙醛、丁醛、2，3-丁二醇)等終產(chǎn)物?；谝韵掳l(fā)酵終產(chǎn)物，TIGR的綜合微生物資源(CMR)在其圖冊集列出九種類型發(fā) 酵途徑同型乳酸(乳酸)；異型乳酸(乳酸)、乙醇(ethanolic)、丙酸、混合酸(甲酸和乙 酸)、丁二醇、丁酸、氨基酸和產(chǎn)甲烷作用。本發(fā)明的方法可以用在任何發(fā)酵途徑中，其中在 所述途徑的任何階段產(chǎn)生酸或溶劑。本發(fā)明中描述的發(fā)酵途徑可以是天然存在的、通過化 學(xué)誘變改變的、半遺傳工程化或完全遺傳工程化的發(fā)酵途徑。生產(chǎn)溶劑的發(fā)酵途徑天然的通過公知的糖酵解途徑，酵母將一個己糖分子轉(zhuǎn)化成兩個乙醇分子和兩個二氧化 碳分子。許多梭菌屬物種通過發(fā)酵生產(chǎn)溶劑。在丙酮丁醇梭菌中，以按重量大致3 :6:1 的比率產(chǎn)生溶劑丙酮、丁醇和乙醇(ABE)。其他作為中間產(chǎn)物產(chǎn)生的溶劑包括乙醛和丁醛。
遺傳工稈化大腸桿菌ZM細(xì)菌大腸桿菌當(dāng)厭氧生長時由于其缺乏酶丙酮酸脫羧酶而產(chǎn)生最少水平的乙 醇。通過表達(dá)從運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)中克隆的醇脫氫酶II(adhB)和丙酮酸脫 羧酶(pdc)可以在大腸桿菌中產(chǎn)生半遺傳工程發(fā)酵的乙醇途徑(Conway等人.(1987a) J.Bacterid 169 :2591-2597 ;Neale 等人.(1987)Nucleic Acids Res.15 :1752-1761 ； Ingram 和 Conway [1988] Appl. Environ. Microbiol. 54 :397-404 ；Ingram 等人· (1987) App 1. Environ. Microbiol. 53 :2420-2425)。乙醇生產(chǎn)率直接與運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基 因的表達(dá)水平相對應(yīng)。該方法的通用性后來在兩種其他腸道細(xì)菌菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)和植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)中證明。(Tolan 和 Finn. Appl. Environ. Microbiol. 53 :2033-2038, 2039-2044，1987 ；Beall 等人·，1993 ；Ingram 和 Conway,1988 ；Wood 禾口 Ingram，1992.)4碳醇和高級醇通過利用細(xì)菌的氨基酸生物合成途徑，可以將包括異丁醇、1- 丁醇、2-甲基-1- 丁 醇、3-甲基-1- 丁醇和2-苯基乙醇在內(nèi)的高級醇表達(dá)在大腸桿菌中。通過將見于艾利希途 徑最后兩步中的兩種異源酶2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達(dá)遺傳工程化，可以將該途徑 中產(chǎn)生的2-酮酸中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)換成醇產(chǎn)品。(Shota A.，等人.Non-fermentative pathways for synthesis of branched—chain higher alcohols as biofuels(用于合成作為生物燃 料的支鏈高級醇的非發(fā)酵途徑).Nature，第451/3卷2008年1月.)微生物本發(fā)明提供了與對應(yīng)的非突變微生物的產(chǎn)物耐受性相比具有提高的產(chǎn)物耐受性 的菌株、環(huán)境分離株和突變微生物的適應(yīng)或選擇。所公開的方法學(xué)適用于廣泛范圍的微 生物，包括細(xì)菌和真菌。本文的方法也可以用于適應(yīng)或選擇微生物的粘附或生長于且附 于所選擇的固體支持體的能力。微生物被接種或放置在具有基質(zhì)的固體支持體上并且被 培養(yǎng)。使培養(yǎng)物經(jīng)歷一個或多個循環(huán)，在循環(huán)中漂洗固體支持體以除去未粘附或粘附弱 的微生物，接著加入更多培養(yǎng)基以允許剩余微生物增加其數(shù)目。那些表現(xiàn)出在固體支持 體上增強或快速生長的微生物被選擇并儲存供后面使用?？梢酝ㄟ^對于提高產(chǎn)物耐受性 進行的適應(yīng)或誘變和選擇來進一步改良挑出的分離株。還可以轉(zhuǎn)化挑出的分離株以表 達(dá)賦予提高的產(chǎn)物耐受性或提高產(chǎn)物生產(chǎn)的異源基因。在一些實施方案中，微生物是真 菌并且真菌是酵母。酵母的實例包括但不限于釀酒酵母、貝酵母(S.bayanus)、卡氏酵母 (S. carlsbergensis)、摩納酵母(S. Monacensis)、巴氏酵母(S. Pastorianus)、葡萄汁酵母 (S. uvarum)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces)物種。厭氧或耐氧真菌的其他實例包括但不 限于屬Neocallimastix、Caecomyces、Piromyces禾口其他瘤胃來源的厭氧真菌。在一些實施方案中，微生物是細(xì)菌。本發(fā)明涵蓋的細(xì)菌包括革蘭氏陰性細(xì)菌 和革蘭氏陽性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌的非限制性實例包括見于以下屬的細(xì)菌葡萄球 菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、分枝桿 菌屬(Mycobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus) > If lif M (Lactobacillus)、明串珠 菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)禾口丙酸桿菌屬(Propionibacterium)0 具體的種的實例包括屎腸球菌(Enterococcus faecium)、鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarium)。革蘭氏陰性細(xì)菌的非限制實例包括見于以下屬的細(xì)菌假單胞菌屬 (Pseudomonas)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、螺旋體屬(Spirochaeta)、甲基彎曲 菌屬(Methylosinus)、泛菌屬(Pantoea)、醋桿菌屬(Acetobacter)、葡糖桿菌屬 (Gluconobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)禾口歐文菌屬(Erwinia)0在一些實施方案中，細(xì)菌是嚴(yán)格的厭氧菌或?qū)Ｐ缘膮捬蹙T如丙酮丁醇梭菌。 考慮用于本發(fā)明的丙酮丁醇梭菌的菌株包括來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的野 生型菌株諸如ATCC 43084和ATCC 824，以及來自德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany)的 DSM 792 禾口 DSM 1731?？紤]用于本發(fā)明的丁醇高產(chǎn)菌株丙酮丁醇梭菌包括來自ATCC的菌株諸如ATCC 55025和ATCC 39058。另一種考慮用于本發(fā)明的高產(chǎn)菌株是B643。(Contag，P. R.，等人， Cloning of a lactate dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum B643 and expression in Escherichia coli (從丙酮丁醇梭菌B643克隆乳酸脫氫酶基因和在大 腸桿菌中表達(dá))· Appl. Environ. Microbiol. 56 :3760-3765,1990.)盡管最初被鑒定為丙酮 丁醇梭菌，B643現(xiàn)在被分類為糖丁酸梭菌?？紤]用于本發(fā)明的另一高產(chǎn)菌株是來源于B643 的B18(Rogers,P.禾口Palorsaari,N. Clostridium acetobutylicum mutants that produce butyraldehyde and altered quantities of solvents (產(chǎn)生丁酸禾口改變的量的溶齊[J的丙 酮丁醇梭菌突變體).Appl. Environ. Microbiol. 53 :2761-2766,1987)。考慮用于本發(fā)明的梭菌屬的其他實例包括拜氏梭菌(例如ATCC25752、ATCC51743 ^P BAlOU ATCC PTA 1550 (U. S 6，358，717 和美國申請第 10/945，551 號))、紫色梭菌(例 如 ATCC 43978)或糖丁酸梭菌(例如 ATCC BAA-117 或 Co-7449)?？紤]用于本發(fā)明的梭菌屬物種的其他實例可以選自金黃丁酸梭菌 (C. aurantibutyricum) > T Sl It ^ (C. butyricum) ,M^f M^M (C. eel lulolyticum)、 土壤棲梭菌(C. phytofermentans)、解糖梭菌(C. saccharolyticum)、糖乙酸多丁 酉享 菌(C. saccharoperbutylacetonicum)、{[Μ 破傷風(fēng) 菌(C. tetanomorphum)、丁酸梭菌(C. thermobutyricum)、熱纖梭菌(C. thermocellum)、糖乙酸多丁醇梭菌 (C. saccharoperbuty lacetoni cum) 5 ! 11 (C. thermo saccharo Iyti cum)?？紤]用于本發(fā)明的其他細(xì)菌包括棒狀桿菌屬(Corynekicteria)，諸如白喉 棒狀桿菌(C. diphtheriae)；月市炎球菌(Pneumococci),諸如月市炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)；鏈球菌屬(Mr印tococci)，諸如釀膿鏈球菌(S. pyogenes)和唾液鏈球菌 (S. salivarus)；葡萄球菌屬Staphylococci)，諸如金黃色葡萄球菌(S. aureus)和白色 葡萄球菌(S. albus)；肌病毒科(Myoviridae)；長尾噬菌體科(Siphoviridae)；需氧的 芽孢形成桿菌，芽孢桿菌屬(Bacilli)，諸如炭疽芽胞桿菌(B.anthracis)、枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)；溶纖維丁酸 弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；厭氧的芽孢形成桿菌，分枝桿菌(Mycobacteria), 諸如人結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis hominis)、牛分支桿菌(M. bovis)、鳥分枝 桿菌(M. avium)、畐Ij 結(jié)核分枝桿菌(M. paratuberculosis)；方文線菌(Actinomycetes) (真菌樣細(xì)菌)，諸如衣氏放線菌(A. israelii)、牛型放線菌(A. bovis)、內(nèi)氏放線 菌(A. naeslundii)、星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides)、巴西諾卡氏菌(Nocardia19brasiliensis)；螺旋體(Spirochetes)，蒼白密螺旋體(Treponema pallidium)、極細(xì)密 螺旋體(Treponema pertenue)、斑點病密螺旋體(Treponema carateum)、回歸熱疏螺旋 體(Borrelia recurrentis)、出血黃||[鉤端 累旋體(Leptospira icterohemorrhagiae) > 犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、小螺菌(Spirillum minus)、念珠狀鏈桿菌 (Streptobaci 1 Ius moniliformis)；維蟲屬(Trypanosomas)；支原體屬(Mycoplasmas)，月市 炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)；單核增生性李其jf特氏菌(Listeria monocytogenes)； 豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；念珠狀鏈桿菌(Sti^ptobacillus monilformis) ；1 (Donvania granulomatis) ；If^Ei/Kffl 1 ^ (Bartonellabacilliformis)；立克次氏體屬(Rickettsiae)，普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii)、禾裹氏立克次氏體(Rickettsia mooseri)、立氏立克次氏體(Rickettsia rickettsiae)和康氏立克次氏體(Rickettsia conori)。使用的其他細(xì)菌包括大腸桿菌、 運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、菊歐文氏菌和植生克雷伯氏菌。在本發(fā)明的一些實施方案中，微生物是專性厭氧微生物。專性厭氧微生物 的非限制實例包括溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrosolvens)和梭菌屬物種諸 如巴氏梭菌(C. pasterianum)。在本發(fā)明的其他實施方案中，微生物是微需氧耐受的 (microaerotolerant)，并且能夠在小濃度氧的存在下存活。在一些實施方案中，微需氧條 件包括但不限于通過用以下量氣體充入液體培養(yǎng)基所產(chǎn)生的發(fā)酵條件至少0. 01 %到至 少 5%或更多 02(例如 0. 01%,0. 05%,0. 10%,0. 50%,0. 60%,0. 70%,0. 80%U. 00%, 1. 20%Λ. 50%U. 75%、2. 0%、3%、4%、5%或更多02)。另一方面，微需氧條件包括但不 限于具有至少約0. 05ppm溶氧或更多溶氧(例如0. 05ppm、0. 075ppm、0. lppm、0. 15ppm、 0. 2ppm、0. 3ppm、0. 4ppm、0. 5ppm、0. 6ppm、0. 8ppm> 1. 0ppm、2. 0ppm、3. 0ppm、4. 0ppm、5. Oppm、 8. Oppm、10. Oppm或更多)的培養(yǎng)條件。用于開發(fā)更高產(chǎn)物耐受性突變體的細(xì)菌和真菌的親本菌株來源包括已建立的培 養(yǎng)物保藏中心和大學(xué)中的研究者、政府機構(gòu)或公司?？蛇x地，親本菌株可以從環(huán)境樣品中分 離，諸如來自廢水處理設(shè)施的廢水污泥，所述廢水處理設(shè)施包括市政設(shè)施和那些在化工廠 或石油化工廠的設(shè)施。當(dāng)能夠預(yù)期分離的微生物經(jīng)許多代的過程在高產(chǎn)物濃度的存在下進 化并由此已達(dá)到可以被進一步改善的期望的產(chǎn)物耐受性水平時，后一種來源特別具有吸引 力。個別物種和多個物種的混合群可以從環(huán)境樣品中分離。當(dāng)期望具體種或?qū)俚幕旌先簳r，可以使用不期望物種或?qū)俚倪x擇性生長抑制劑來 阻止或抑制這些不期望微生物的生長。在一些實施方案中，利用了共培養(yǎng)物。通常，一種微生物將酶分泌到培養(yǎng)基 中，所述酶將原料降解成可以被另一種微生物利用的組成化合物。使用微生物的共培 養(yǎng)物生產(chǎn)溶劑的實例包括用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)與肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) W^Jtlf^^r'T—Il (Yu等人.,Applied and Environmental Microbiology(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué))(1985)50(4) :924-929)和從熱纖維梭菌與熱硫 化氫梭菌(C. thermohydrosulfuricum)的共培養(yǎng)物生產(chǎn)乙醇(Eng等人.，Applied and Environmental Microbiology (應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué))(1981) 41 (6) :1337-1343) 在其他實施方案中，使用環(huán)境分離株和/或微生物聚生體來產(chǎn)生具有提高的產(chǎn)物 耐受性的微生物聚生體?？梢詮谋姸嗟沫h(huán)境小生境中收集包括微生物聚生體在內(nèi)的分離株，包括土壤、河流、湖泊、沉積物、河口、沼澤、工業(yè)設(shè)施等等。在一些實施方案中，微生物聚 生體是嚴(yán)格厭氧微生物。在其他實施方案中，微生物聚生體是專性厭氧微生物。在一些實 施方案中，微生物聚生體是兼性厭氧微生物。仍在其他實施方案中，微生物聚生體不包括腸 球菌屬或乳桿菌屬的物種。在一些實施方案中，微生物包含一個或多個異源基因，異源基因的表達(dá)提高微生 物的產(chǎn)物耐受性。在一些實施方案中，在固體支持體上適應(yīng)或選擇產(chǎn)物耐受性之前將所述 一個或多個異源基因引入微生物中，而在其他實施方案中，在適應(yīng)或選擇產(chǎn)物耐受性之后 將所述一個或多個異源基因弓I入微生物中。在一些實施方案中，微生物被工程化以過表達(dá)提高微生物產(chǎn)物耐受性的內(nèi)源基 因。在一些實施方案中，微生物包含提高對產(chǎn)物的耐受性的另外拷貝數(shù)的內(nèi)源基因。在某 些實施方案中，產(chǎn)物耐受的微生物不是大腸桿菌，并且異源基因或過表達(dá)基因不是yfdE、 yhhL、yhhM和csrC。在其他實施方案中，微生物不是具有熱激蛋白的提高表達(dá)的重組微生 物。仍在其他實施方案中，微生物不是包含如下異源基因的重組微生物所述異源基因編碼 將丁醇輸出到微生物外的多肽。適應(yīng)過稈可以適應(yīng)或選擇微生物以在存在微生物正常產(chǎn)生的產(chǎn)物的情況下生長并附于固 體支持體，或者適應(yīng)和選擇二者兼有。在一些實施方案中，通常，微生物群被接種或以其他 方式被分散在包含可用養(yǎng)分的固體支持體上。養(yǎng)分可以自由利用，諸如在固體支持體是包 含營養(yǎng)介質(zhì)的瓊脂的情況下。可選地，在其他實施方案中，固體支持體可以是微生物能夠聚 居形成生物膜的表面，諸如骨炭，但是在骨炭中養(yǎng)分是由灌注固體支持體的液體培養(yǎng)基提 供。可以挑出并培養(yǎng)在期望的固體支持體上快速生長的微生物的菌落，或者將其儲存供后 面應(yīng)用。在另一實施方案中，固體支持體可以包含通過酶分解釋放可利用的養(yǎng)分的原料， 如發(fā)生在包含淀粉或纖維素的原料被分解成能夠被微生物同化的葡萄糖和其他更簡單組 分時?？梢詮墓腆w支持體中挑出并培養(yǎng)快速生長的微生物的菌落，或?qū)⑵鋬Υ婀┖竺鎽?yīng)用。仍在另一實施方案中，可以將已知在選擇的固體支持體上生長良好的微生物暴露 于不同濃度的其正常情況下產(chǎn)生的產(chǎn)物中，以便選擇能夠在更高濃度下生長的微生物。暴 露可以是連續(xù)的，諸如用產(chǎn)物的低濃度開始。然后挑出具有良好生長特性的菌落，并將其轉(zhuǎn) 移或接種在相同固體表面，其中微生物被暴露于更高濃度的產(chǎn)物。挑出具有良好生長特性 的菌落并且該過程根據(jù)所需繼續(xù)用較高濃度按順序進行以產(chǎn)生用于預(yù)期用途的適應(yīng)的微 生物。使微生物適應(yīng)于產(chǎn)物濃度的替代方式是將連續(xù)的培養(yǎng)物保持在固體基質(zhì)上的微 生物上?？梢詫a(chǎn)物的濃度保持在相同濃度或者它可以隨時間改變，通常是以濃度遞增的 方式。隨著細(xì)胞生長，過量細(xì)胞一般被移除，并且經(jīng)過多代，產(chǎn)生了適應(yīng)于產(chǎn)物濃度的更多 產(chǎn)物耐受微生物。對于產(chǎn)生丁醇的梭菌，包括但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于適應(yīng)的有 用的乙酸或丁酸濃度包括約0.2%到約10%。在一些實施方案中，可以使丙酮丁醇梭菌或 糖丁酸梭菌適應(yīng)以表現(xiàn)出對至少 0. 2%,0. 40%,0. 60%,0. 80%U. 00%,1. 20%Λ. 40%, 1.60 %U. 80 %,2. 00 %,2. 20. 0 %,2. 40 %,2. 60 %,2. 80 %,3. 00 %,3. 5 %A. 005. 00%、6. 00%、7. 00%或8. 00%的乙酸或丁酸的耐受性。對于產(chǎn)生丁醇的梭菌，例如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于適應(yīng)的有 用的丁醇濃度包括約1. 0% w/v到約25% w/v、l. 5% w/v到約22. 5% w/v、2. 0% w/v到約 20. 0% w/v、2%到約 18% w/v、2. 0% w/v 到約 16. 0% w/v、2%到約 15% w/v、2. 0% w/v 到 約 12. 0% w/v、2%到約 10% w/v、2. 0% w/v 到約 9. 0% w/v、2%到約 8% w/v、2. 0% w/v 到 約 7. 0% w/v、2% 到約 6% w/v,2. 0% w/v 到約 5. 0 % w/v、2% 到約 4% w/v,2. 0% w/v 到 約3. 0 % w/v和2 %到約2. 5 % w/v ο其他有用的丁醇濃度包括至少1. 0 %、1. 5 %、1. 8 %、 2. 0%,2. 2%,2. 4%,2. 6%,2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3. 6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%U0%, 12%或15%。丁醇適應(yīng)濃度包括那些唯一由1-丁醇組成的濃度和那些由丁醇異構(gòu)體的混 合物構(gòu)成的濃度。還可以使丙酮丁醇梭菌適應(yīng)于包含ABE溶劑混合物的溶液。有用的ABE總 溶劑濃度范圍包括以下濃度約1. 0% w/v到約25% w/v、1. 5% w/v到約22. 5% w/v,2. 0% w/v 到約 20. 0% w/v、2%到約 18% w/v,2. 0% w/v 到約 16. 0% w/v、2%到約 15% w/v,2. 0% w/v 到約 12. 0% w/v、2%到約 10% w/v、2. 0% w/v 到約 9. 0% w/v、2%到約 8% w/v、2. 0% w/v 到約 7. 0 % w/v、2 % 到約 6 % w/v、2. 0 % w/v 到約 5. 0 % w/v、2 % 到約 4% w/v、2. 0 % w/v 到約3.0% w/v和2%到約2.5% w/v。其他有用的總ABE濃度包括至少1.0%、1.5%、1.8%、 2. 0%,2. 2%,2. 4%,2. 6%,2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3. 6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%U0%, 12% 或 15%。在一些實施方案中，可以在固體支持體上使微生物適應(yīng)，以耐受比對應(yīng)的非適應(yīng) 親本微生物可耐受的水平大至少125%的有機酸水平。在其他實施方案中，適應(yīng)的微生 物相比于對應(yīng)的非適應(yīng)親本微生物的酸耐受性表現(xiàn)出至少150 %,200 250%,300%, 400 %,500 %,600 %,700 800%,900%, 1，000 %、2，000 %、3，000 %A, 000 000%, 6，000%,7, 000%,8, 000%,9, 000%,10, 000%、11，000%,12, 000%,13, 000%,14, 000% 或15，000%的酸耐受性。如果親本微生物是不能利用的，那么可以使用標(biāo)準(zhǔn)種或標(biāo)準(zhǔn)菌株 進行比較。例如，對于丙酮丁醇梭菌，標(biāo)準(zhǔn)菌株是ATCC 824。在一些實施方案中，酸耐受性是通過測量適應(yīng)的微生物在包含指定濃度酸的半固 體或固體支持體上的生長能力而確定的絕對值。例如，使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的糖丁酸梭 菌的適應(yīng)菌株可能具有對至少5%的乙酸或丁酸的絕對耐受性。在一些實施方案中，梭菌屬 的適應(yīng)菌株表現(xiàn)出對至少 2. 0%、2. 5%,3. 0%,3. 5%,4. 0%,5. 0%,6. 0%,7. 0%,8. 0%, 9. 0%U0. 0%Λ2. 5%Λ5. 0%、20%或25%的乙酸或丁酸的耐受性。選擇過程許多方法已知在本領(lǐng)域中用于誘發(fā)突變到微生物中并用于選擇期望的表型。通 常，將微生物懸浮在包含特定濃度誘變劑的液體培養(yǎng)基中。在孵育給定量的時間后，將懸浮 液離心并且將得到的液體潷出，留下微生物沉淀。將沉淀重懸在培養(yǎng)基中。如果必要的話 可以重復(fù)該洗滌步驟。除去誘變劑后，通常將微生物培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中以便在稀釋之前 從誘變步驟中恢復(fù)，然后將其展開在固體營養(yǎng)培養(yǎng)基(像瓊脂)上，所述固體培養(yǎng)基包含對 接種的微生物施加選擇壓的劑。如果具有提高的產(chǎn)物耐受性的突變體是期望的，那么使用標(biāo)出產(chǎn)物濃度范圍的平 板的集合。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)期后，可以從固體營養(yǎng)培養(yǎng)基中選擇產(chǎn)物耐受微生物的菌落。通 過改變誘變時間和誘變劑濃度，可以修改微生物的突變率和死亡率以找到有利條件。22
在美國專利第4，757，010號中描述了用于正丁醇耐受的丙酮丁醇梭菌的替代的 誘變和選擇過程。在該過程中，在固體培養(yǎng)基上一步進行誘變。獲得了處于生長狀態(tài)的丙酮 丁醇梭菌的液體培養(yǎng)物。將該液體培養(yǎng)物以不同稀釋度接種在固體營養(yǎng)培養(yǎng)基的平板上， 每個平板包含特定濃度的正丁醇，平板的集合標(biāo)出正丁醇濃度的范圍。另外，每個平板具有 誘變劑的濃度梯度。通常，誘變劑被安放在一點，例如，在每個皿的中心，從中心誘變劑擴散 產(chǎn)生濃度梯度。在培養(yǎng)適量時間后分離耐正丁醇的菌落。另一誘變和選擇的方法是使用雙紙片擴散法(double disc method)，其中在培養(yǎng) 物被接種到包含半固體或固體支持體的一個或多個容器上后，兩個紙片或紙條被放在每個 容器中支持體的頂部。用誘變劑的溶液浸漬一個紙片或紙條。另一個紙片或紙條包含施加 選擇性壓力的劑。通常，紙條被彼此垂直地使用和放置以產(chǎn)生誘變劑和選擇性劑的重疊梯 度。參見圖1。在兩個紙條附近存在一個沒有細(xì)胞能夠生長的空白區(qū)域。通常，遠(yuǎn)離紙條 處，在較低重疊濃度，可以發(fā)現(xiàn)和分離突變體的菌落。在本發(fā)明中有用的誘變劑包括烷化劑，諸如甲基磺酸乙酯(EMQ、N_甲基N'-硝 基N-亞硝基胍(MNNG或NG)、ICR 191、亞硝酸、硝基喹啉-N-氧化物、N-乙基-N-亞硝基脲 (ENU)和三乙烯三聚氰胺。其他有用的化學(xué)誘變劑包括羥胺、核苷堿類似物(例如BrdU)、 DNA嵌入劑(例如溴化乙錠)和DNA交聯(lián)劑(順鉬)。有用的物理誘變劑包括電離輻射(例 如，χ射線、α粒子和β粒子)和非電離輻射(例如，紫外線輻射)。對于產(chǎn)生丁醇的梭菌，例如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于選擇的有 用的丁醇濃度包括約1. 0% w/v到約25% w/v、l. 5% w/v到約22. 5% w/v、2. 0% w/v到約 20. 0% w/v、2%到約 18% w/v、2. 0% w/v 到約 16. 0% w/v、2%到約 15% w/v、2. 0% w/v 到 約 12. 0% w/v、2%到約 10% w/v,2. 0% w/v 到約 9. 0% w/v、2%到約 8% w/v,2. 0% w/v 到 約 7. 0% w/v、2% 到約 6% w/v,2. 0% w/v 到約 5. 0% w/v、2% 到約 4% w/v,2. 0% w/v 到 約3. 0 % w/v和2 %到約2. 5 % w/v ο其他有用的丁醇濃度包括至少1. 0 %、1. 5 %、1. 8 %、 2. 0%,2. 2%,2. 4%,2. 6%,2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3. 6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%U0%, 12%或15%。丁醇選擇濃度包括那些唯一由1-丁醇組成的濃度和那些由丁醇異構(gòu)體的混 合物構(gòu)成的濃度。產(chǎn)溶劑的梭菌諸如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌也可以用包含 ABE溶劑混合物的溶液來選擇。有用的ABE總?cè)軇舛确秶ㄒ韵聺舛燃s1. 0% w/v 到約 25% w/vU. 5% w/v 到約 22. 5% w/v、2. 0% w/v 到約 20. 0% w/v、2%到約 18% w/v、 2. 0% w/v 到約 16. 0% w/v、2%到約 15% w/v、2. 0% w/v 到約 12. 0% w/v、2%到約 10% w/ ν,2. 0% w/v 到約 9. 0% w/v、2%到約 8% w/v、2. 0% w/v 到約 7. 0% w/v、2%到約 6% w/v、 2. 0% w/v 到約 5. 0% w/v、2%到約 4% w/v、2. 0% w/v 到約 3. 0% w/v 和 2%到約 2. 5% w/ ν。其他有用的ABE總?cè)軇舛劝ㄖ辽?.0%U.5%U.8%,2.0%,2. 2% ,2. 4% ,2. 6%, 2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3. 6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%、10%、12%或 15%。在一些實施方案中，可以對最初選擇的微生物使用多輪的選擇或誘變和選擇。每 輪可以是逐步增高的產(chǎn)物濃度。可選地，誘變劑和/或產(chǎn)物可以在多輪選擇之間改變。酸耐受性在一些實施方案中，對酸耐受的微生物在固體支持體上的提高的酸耐受性進行誘 變和選擇。在一些實施方案中，酸耐受的突變體可以用于溶劑或有機酸的生產(chǎn)。例如，可以 將產(chǎn)溶劑的梭菌(諸如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌)的酸耐受突變體培養(yǎng)在有助于乙酸和丁酸產(chǎn)生的條件下，或者可選地，培養(yǎng)在有助于丁醇產(chǎn)生的條件下。在本發(fā)明的一 些實施方案中，酸耐受性是通過比較突變的微生物在半固體或固體支持體上的生長能力與 非突變的親本微生物在相同半固體或固體支持體上的生長能力而測量的相對值。通常，半 固體或固體支持體包含生長培養(yǎng)基和通?；隗w積比體積(w/v)測量的指定濃度的酸。一 般而言，多個容器(通常是培養(yǎng)皿)被填充標(biāo)出酸濃度范圍的半固體或固體支持體。例如， 用于測試丙酮丁醇梭菌的丁醇耐受性的有用支持體是包含強化梭菌培養(yǎng)基(RCM)的瓊脂， 并且有用的乙酸或丁酸濃度范圍是從0.2%到5.0%。仍有菌落形成的最高濃度代表微生 物的酸耐受性。替代的酸耐受性測試方法是用包含指定濃度的酸的溶液覆蓋非酸支持體。通過將突變微生物能夠生長的最高酸濃度除以所記錄的非突變微生物生長的最 高酸濃度，可以計算出突變微生物的相對的酸耐受性。例如，如果使用本發(fā)明的方法分離展現(xiàn)至少4%的乙酸耐受性的丙酮丁醇梭菌菌 株的突變體，而親本菌株具有2%的乙酸耐受性，則突變體的相對的酸耐受性將是非突變親 本菌株的200%。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變微生物的相對的酸耐受性包括與對應(yīng)的非突變 微生物的酸耐受性相比具有至少125%耐受性的微生物。在其他實施方案中，所選擇的突 變微生物相比于對應(yīng)的非突變微生物的酸耐受性表現(xiàn)出至少150 %,200 250%,300%, 400 %,500 %,600 %,700 800%,900%, 1，000 %、2，000 %、3，000 %A, 000 000%, 6，000 000 000 000%, 10，000 %Λ1, 000%, 12，000 %、13，000 %、14，000 % 或15，000%的酸耐受性。如果親本微生物是不能利用的，那么可以使用標(biāo)準(zhǔn)種或標(biāo)準(zhǔn)菌株 進行比較。例如，對于丙酮丁醇梭菌，標(biāo)準(zhǔn)菌株是ATCC 824。在一些實施方案中，酸耐受性是通過測量突變的微生物在包含指定濃度酸的半 固體或固體支持體上的生長能力而確定的絕對值。例如，使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的糖丁 酸梭菌的突變體可能具有對至少0.8%的乙酸或丁酸的絕對耐受性，而親本微生物不能 在0.40%以上的乙酸或丁酸濃度生長。在一些實施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌 的突變體表現(xiàn)出對至少 0. 2%、0. 40%,0. 60%,0. 80%U. 00%U. 20%U. 40%U. 60%, 1.80 %,2. 00 %,2. 20. 0 %,2. 40 %,2. 60 %,2. 80 %,3. 00 %,3. 5 %A. 00 %,5. 006. 00%、7. 00%或8. 00%的乙酸或丁酸的耐受性。溶劑耐受性在一些實施方案中，對溶劑耐受的微生物在固體支持體上的提高的溶劑耐受性進 行誘變和選擇。在一些實施方案中，溶劑耐受的突變體可以用于溶劑或有機酸的生產(chǎn)。例 如，可以將丙酮丁醇梭菌的溶劑耐受突變體培養(yǎng)在有利于乙酸和丁酸產(chǎn)生的條件下，或可 選地，培養(yǎng)在有利于丁醇產(chǎn)生的條件下。在本發(fā)明的一些實施方案中，溶劑耐受性是通過比 較突變的微生物在半固體或固體支持體上的生長能力與非突變的親本微生物在相同半固 體或固體支持體上的生長能力而測量的相對值。通常，半固體或固體支持體包含生長培養(yǎng) 基和通?；隗w積比體積(ν/ν)測量的指定濃度的溶劑。一般而言，多個容器(通常是培 養(yǎng)皿)被填充標(biāo)出溶劑濃度范圍的半固體或固體支持體。例如，用于測試丙酮丁醇梭菌的 丁醇耐受性的有用支持體是包含強化梭菌培養(yǎng)基(RCM)的瓊脂，并且有用的丁醇濃度范圍 是從0.8%到5.0%。仍有菌落形成的最高濃度代表微生物的溶劑耐受性。替代的溶劑耐 受性測試方法是用包含指定濃度的溶劑的溶液覆蓋非溶劑支持體。另一替代的溶劑耐受性測試方法是確定在暴露于丁醇后的存活率。通過將突變微生物能夠生長的最高溶劑濃度除以所記錄的非突變微生物生長的 最高溶劑濃度，可以計算出突變微生物的相對的溶劑耐受性。作為相對的溶劑耐受性計算的實例，使用本發(fā)明的方法分離展現(xiàn)至少5%的丁醇 耐受性的糖丁酸梭菌菌株Co-7449的突變體。另一方面，菌株Co-7449具有近似2. 的丁 醇耐受性。因此，突變體的相對的溶劑耐受性是非突變親本菌株的至少225%。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變微生物的相對的溶劑耐受性包括與對應(yīng)的非突 變微生物的溶劑耐受性相比具有至少125%耐受性的微生物。在其他實施方案中，所選擇 的突變微生物相比于對應(yīng)的非突變微生物的溶劑耐受性表現(xiàn)出至少150 200%,250%, 300 %A00 %>500 %,600 %,700 %,800 %,900 1，000 %、2，000 %、3，000 %A, 0005，000%,6, 000%,7, 000%,8, 000%,9, 000% ,10, 000%、11，000%,12, 000%,13, 000%, 14，000%或15，000%的溶劑耐受性。如果親本微生物是不能利用的，那么可以使用標(biāo)準(zhǔn)種 或標(biāo)準(zhǔn)菌株進行比較。例如，對于丙酮丁醇梭菌，標(biāo)準(zhǔn)菌株是ATCC824。在一些實施方案中，溶劑耐受性是通過測量突變的微生物在包含指定濃度溶劑的 半固體或固體支持體上的生長能力而確定的絕對值。例如，使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的糖丁 酸梭菌菌株Co-7449的突變體具有對至少5%的丁醇的絕對耐受性，而親本微生物不能在2.以上的丁醇濃度生長。在一些實施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌的突變體表 現(xiàn)出至少 2. 0%、2. 5%、3. 0%、3. 5%、4. 0%、5. 0%、6. 0%、7. 0%、8. 0%、9. 0%、10. 0%、 12. 5 %、15. 0 %、20 %或25 %的丁醇耐受性。在其他實施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭 菌的突變體表現(xiàn)出對至少 2. 0%,2. 2%,2. 4%,2. 5%,2. 6%,2. 8%,3. 0%,3. 2%,3. 4%,3.6%,4. 0%,5. 0%,7. 0%、10%、12%或 15%的總 ABE 溶劑濃度的耐受性。發(fā)酵培養(yǎng)基用于產(chǎn)生產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基必須包含適合的以碳為基礎(chǔ)的底物。這些底物被酶促 轉(zhuǎn)化成通過生物化學(xué)途徑、代謝途徑、合成途徑和發(fā)酵途徑產(chǎn)生產(chǎn)物所用的中間化合物。如 本文所用，術(shù)語“以碳為基礎(chǔ)的底物”是指可以被酶促轉(zhuǎn)化成中間產(chǎn)物(隨后轉(zhuǎn)化為期望的 碳靶標(biāo))的包含至少一個碳原子的材料。示例性的以碳為基礎(chǔ)的底物包括但不限于生物 質(zhì)、淀粉、糊精、糖或這些物質(zhì)的水解產(chǎn)物。如本文所用，“生物量”是指包含纖維素和/或淀粉的原料，包括但不限于木片、谷 物秸桿、水稻、草、飼料、佩里草(perrie-grass)、馬鈴薯、塊莖、根、全碾碎谷物、葡萄渣、穗 軸(cob)、谷粒、小麥、大麥、黑麥、高粱、麩、谷類、含糖原料(例如糖蜜、果料、甘蔗或甜菜)、 木材和植物殘體。如本文所用，“淀粉”是指任何含淀粉的材料。具體而言，該術(shù)語是指各種基于植物 的材料，包括但不限于小麥、大麥、馬鈴薯、甜馬鈴薯、木薯、谷物、玉蜀黍、木薯、高粱、黑麥 和麩。總體上，該術(shù)語是指包括植物的復(fù)雜多糖碳水化合物、包括直鏈淀粉和支鏈淀粉的具 有式(C6HltlO5)x的任何材料，其中“X”可以是任何數(shù)字。如本文所用，“纖維素”是指任何含纖維素的材料。具體而言，該術(shù)語是指具有式 (C6HltlO5)xW葡萄糖聚合物(或“纖維二糖”)，其中“X”可以是任何數(shù)字。纖維素是植物細(xì) 胞壁的主要組分，并且是在自然界最豐富的有機物質(zhì)。盡管在纖維素中存在葡糖苷鍵， 在淀粉中存在α-葡糖苷鍵。纖維素與木質(zhì)素一起形成“木質(zhì)纖維素”。25
如本文所用，“半纖維素”是指任何含半纖維素的材料。具體而言，該術(shù)語是指 具有木糖基殘基、葡糖基殘基、半乳糖基殘基、阿拉伯糖基殘基或甘露糖基殘基的雜聚物 (hetropolymer)。適合的底物包括但不限于包含可以被轉(zhuǎn)化成糖的組分的已加工的材料(例如，纖 維素生物質(zhì)、糖原、淀粉及其各種形式，諸如玉米淀粉、小麥淀粉、玉米固形物和小麥固形 物)。其他適合的底物包括但不限于單糖和二糖、糖(粗制的或加工過的)、糖蜜、糖漿和來 自農(nóng)業(yè)材料的汁液(諸如甜高粱汁)、汁液濃縮物、玉米糖漿以及類似底物。各種淀粉是可 商購獲得的?？砂l(fā)酵的糖可以由各種各樣來源獲得，包括木質(zhì)纖維素材料。木質(zhì)纖維素材料可 以由木質(zhì)纖維素的廢產(chǎn)物(例如，植物殘體和廢紙)獲得。適合的植物殘體的實例包括但 不限于任何植物材料，諸如莖、葉、谷殼、苞葉、穗軸等，以及玉米秸稈、甘蔗渣、木材、木片、 木漿和鋸屑。廢紙的實例包括但不限于丟棄的任何類型的紙(例如，光感復(fù)印紙、計算機打 印紙、筆記本紙、便簽紙、打字紙等等)，以及報紙、雜志、紙板和以紙為基礎(chǔ)的包裝材料。如本領(lǐng)域中已知的，除了適當(dāng)?shù)奶荚?，發(fā)酵培養(yǎng)基必須包括適合的一種或多種氮 源、礦物鹽、輔因子、緩沖劑和適合于培養(yǎng)物的生長和促進產(chǎn)生期望的靶標(biāo)(例如丁醇)所 必需的酶促途徑的其他成分。在一些實施方案中，鹽和/或維生素B12或其前體可用于本 發(fā)明。氮源可以是任何適合的氮源，包括但不限于銨鹽或酵母提取物。磷可以以磷酸鹽 形式存在于培養(yǎng)基中，諸如磷酸鈉和磷酸鉀。硫可以以硫酸鹽形式存在于培養(yǎng)基中，諸如硫 酸鈉和硫酸銨。其他的鹽包括但不限于硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鐵、氯化鎂、氯化鈣、氯化錳、氯 化鐵、氯化亞鐵、氯化鋅、氯化銅、氯化鈷和鉬酸鈉。生長培養(yǎng)基還可以包含維生素，諸如鹽 酸硫胺素、生物素和對氨基苯甲酸(PABA)。培養(yǎng)條件多種工業(yè)上重要的微生物的最適培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。視需要，培養(yǎng)條件可 以是厭氧的、微需氧耐受的或需氧條件。如容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的那樣，厭氧條件 是基本上無氧的條件，需氧條件是包含溶解在培養(yǎng)基中的氧以使得需氧培養(yǎng)物將不能區(qū)分 在具有另外的溶解氧的氧傳遞中的差別的條件，并且微需氧耐受的條件是如下的條件其 中一些溶解氧以低于空氣中發(fā)現(xiàn)的水平且往往低于標(biāo)準(zhǔn)溶解氧探頭的檢出限(例如，小于 lppm)的水平存在的條件?？梢詳噭优囵B(yǎng)物或使之維持原狀。通常，培養(yǎng)基的PH隨時間而 變化，因為微生物在數(shù)目上增長，消耗原料并分泌有機酸。通過向生物反應(yīng)器內(nèi)的起始發(fā)酵 培養(yǎng)基中加入緩沖化合物或者通過向生長中的培養(yǎng)物中有效加入酸或堿以保持PH在期望 的范圍內(nèi)，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。通過測量光密度(通常在600nm波長)，可以監(jiān)測培養(yǎng)物的生長。對于使用釀酒酵母將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，一般來說，溫度在約25°C至約35°C之間。提 供轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的有用PH范圍在4. 0和6. 0之間、在4. 5和6. 0之間以及在5. 5和5. 8之間。 使培養(yǎng)物生長在沒有攪拌的厭氧條件下。由丙酮丁醇梭菌進行的ABE發(fā)酵通常是在厭氧條件下于約25°C至40°C的范圍內(nèi) 的溫度下進行。歷史上，懸浮培養(yǎng)物不使用攪拌器，但是依賴于放出的氣體或充入的氣體來 混合生物反應(yīng)器的內(nèi)容物。然而，可以攪拌培養(yǎng)物以確保反應(yīng)器內(nèi)容物更均勻的混合。對于固定的培養(yǎng)物，生物反應(yīng)器將沒有攪拌地以固定床(活塞流)模式或流化(充分混合) 模式運轉(zhuǎn)。嗜溫細(xì)菌的發(fā)酵可以達(dá)到約50°C至80°C范圍內(nèi)的溫度。在一些實施方案中，溫 度范圍是約55°C至70°C。在一些實施方案中，溫度范圍是約60°C至65°C。例如，梭菌屬物 種諸如熱纖梭菌或熱硫化氫梭菌可以生長在約60°C至65°C。半固體和固體支持體對于發(fā)酵的、代謝的、呼吸的或合成的產(chǎn)物的產(chǎn)生，使本發(fā)明的微生物生長固定于 半固體或固體支持體?？梢允褂枚喾N類型的半固體和/或固體支持體材料。有用的支持體 材料具有高的表面積與體積比，這樣使得大量活性、生產(chǎn)性細(xì)胞能夠在生物反應(yīng)器中積累。非限制性實例包括固體瓊脂、多孔材料(諸如骨炭)、合成聚合物、天然聚合物、無 機材料或有機材料。天然聚合物包括有機材料，諸如纖維素、木質(zhì)纖維素、半纖維素和淀粉。 有機材料包括原料，諸如植物殘體和紙。應(yīng)理解也可以使用兩種或更多種材料的復(fù)合材料， 諸如合成聚合物與天然植物聚合物的混合物。半固體培養(yǎng)基的實例包括藻酸鹽、κ -角叉菜聚糖和殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯 酰胺-酰胼、瓊脂糖、聚丙烯、聚乙二醇、丙烯酸二甲酯、聚苯乙烯二乙烯苯、聚乙烯苯、聚乙 烯醇、環(huán)氧支持體、纖維素、乙酸纖維素、可光致交聯(lián)的樹脂、預(yù)聚合物、氨基甲酸乙酯和明 膠。固體支持體的實例包括軟木、粘土、樹脂、砂、多孔氧化鋁珠、多孔磚、多孔硅石、硅 藻土、木片或活性炭。適合的無機固體支持體材料是具有可用表面的羥基或氧化物基團的一般無機材 料。這些材料可以按化學(xué)組成被分類為硅質(zhì)或非硅質(zhì)金屬氧化物。硅質(zhì)支持體除了其他之 外還包括玻璃、膠態(tài)硅石、硅灰石、堇青石、干硅膠、膨潤土以及類似物。代表性非硅質(zhì)金屬 氧化物包括礬土、羥基磷灰石和氧化鎳。在固體支持體上固定的方法可以通過任何已知手段從孢子或營養(yǎng)細(xì)胞固定微生物。一般而言，可以通過三種 不同的機制將微生物固定到半固體或固體支持體上。第一種，通過聚合或凝固含有孢子或 營養(yǎng)細(xì)胞的溶液實現(xiàn)在支持體中的截留或包含。有用的可聚合或可凝固的溶液包括藻酸 鹽、κ-角叉菜聚糖、殼聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺-酰胼、瓊脂糖、聚丙烯、聚乙二醇、丙 烯酸二甲酯、聚苯乙烯二乙烯苯、聚乙烯苯、聚乙烯醇、環(huán)氧支持體、纖維素、乙酸纖維素、可 光致交聯(lián)的樹脂、預(yù)聚合物、氨基甲酸乙酯和明膠。第二種固定方法是通過吸附到支持體上。有用的支持體包括例如骨炭、軟木、粘 土、樹脂、砂、多孔氧化鋁珠、多孔磚、多孔硅石、硅藻土或木片。微生物聚居在底物上并形成 生物膜。第三種該方法是通過使用化學(xué)劑將微生物共價偶聯(lián)至支持體，所述化學(xué)劑如戊二 醛、鄰聯(lián)茴香胺(美國專利第3，983，000號)、聚異氰酸酯(美國專利第4，071，409號)、硅 烷(美國專利第3，519，538和3，652，761號)、丙烯酸羥乙酯、過渡金屬激活的支持體、氰尿 酰氯、高碘酸鈉、甲苯以及類似物。還參見美國專利第3，930，951和3，933，589號。在一種實施方案中，固定的孢子諸如丙酮丁醇梭菌的孢子通過熱激被激活，然后 在適當(dāng)條件下被培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基中，從而營養(yǎng)生長接著發(fā)生。這些細(xì)胞仍附入固體支持 體中或附于固體支持體上。在微生物達(dá)到適合的密度和生理狀態(tài)后，可以改變培養(yǎng)條件以 用于酸和/或溶劑的產(chǎn)生。如果固定的細(xì)胞減少溶劑產(chǎn)生，通過首先使細(xì)胞在重復(fù)熱激和培養(yǎng)順序之前形成孢子，將它們再活化。營養(yǎng)細(xì)胞可以在其生長的不同階段被固定。對于展現(xiàn)雙相性培養(yǎng)物的微生物，諸 如具有產(chǎn)酸相和產(chǎn)溶劑相的丙酮丁醇梭菌，可以在細(xì)胞進入期望的培養(yǎng)相后固定它們以便 使期望的產(chǎn)物的產(chǎn)生最大化，其中在丙酮丁醇梭菌的情況下，在產(chǎn)酸相中有機酸是乙酸和 丁酸，在產(chǎn)溶劑相中溶劑是丙酮、丁醇和乙醇?？蛇x地，可以將雙相性細(xì)胞在產(chǎn)酸相中固定， 然后使其適應(yīng)于溶劑生產(chǎn)。在一些實施方案中，通過細(xì)胞懸液的方式引入要固定在生物反應(yīng)器中的微生物。 一般而言，這些微生物作為單細(xì)胞或細(xì)胞的小聚集體分散在培養(yǎng)基中。在其他實施方案中， 通過使用被微生物聚居的懸浮顆粒來將微生物引入生物反應(yīng)器中。這些懸浮顆粒可以被吸 附到固體支持體上，并且常常具有足夠小的尺寸以致它們能夠進入構(gòu)成填充床的固體支持 體的孔結(jié)構(gòu)中并變得固定在其中。通常，不考慮懸浮顆粒的尺寸，可以通過與構(gòu)成填充床的 固體支持體接觸通過接觸轉(zhuǎn)移微生物。在引入的顆粒上的生物膜能夠轉(zhuǎn)移至這些新表面并 聚居在這些新表面上。在一些實施方案中，微生物的期望特性只能通過在固體支持體上培 養(yǎng)而保持，由此使得用于接種生物反應(yīng)器的固體支持體的小的聚居顆粒懸浮液的使用成為 必需。牛物反應(yīng)器在本發(fā)明中可以使用一個或多個生物反應(yīng)器。當(dāng)使用多個生物反應(yīng)器時，它們可 以被串聯(lián)和/或平行排列。多個生物反應(yīng)器勝過一個大生物反應(yīng)器的優(yōu)點包括建造成本和 安裝成本更低、容易放大生產(chǎn)規(guī)模以及生產(chǎn)靈活性更大。例如，單個生物反應(yīng)器可以采用離 線式以供保養(yǎng)、洗滌、殺菌等等，而沒有明顯影響生產(chǎn)計劃。應(yīng)理解平行或串聯(lián)排列的生物反應(yīng)器可以包括一種或多種發(fā)酵工藝類型。例如， 在串聯(lián)排列中，第一個生物反應(yīng)器可以包括分批發(fā)酵，而第二個生物反應(yīng)器可以包括連續(xù) 發(fā)酵。在另一實施方案中，在串聯(lián)排列中每個生物反應(yīng)器相比于串聯(lián)的其他生物反應(yīng)器 可以具有微生物的不同的種、菌株、或者微生物的種或菌株的混合。類似地，在本發(fā)明另一 實施方案中，如在圖8中所圖示的那樣，在串聯(lián)排列中第一個生物反應(yīng)裝置有懸浮培養(yǎng)物 而第二個生物反應(yīng)裝置有固定的細(xì)胞。在這種排列中，培養(yǎng)基被引入到懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng) 器中，并且發(fā)酵流出液被移出并連同另外的培養(yǎng)基一起被進料到第二個生物反應(yīng)器內(nèi)的固 定細(xì)胞。固定的細(xì)胞是表現(xiàn)出提高的產(chǎn)物耐受性的突變體，并且能夠進一步利用培養(yǎng)基中 的底物，產(chǎn)生較高濃度的產(chǎn)物。然后將發(fā)酵流出液移出并送往分離和回收。在本發(fā)明的另一實施方案中，發(fā)酵罐可以被串聯(lián)排列以使得來自發(fā)酵罐的流出液 被立即引入到多個平行發(fā)酵罐中。在一些實施方案中，流出液可以在收獲酸和/或溶劑后 被再循環(huán)并用來制造用于將來發(fā)酵的初始發(fā)酵培養(yǎng)基或原料流，由此使未同化的和回收的 養(yǎng)分和礦物質(zhì)得到最大利用。在一些實施方案中，從流出液中分離產(chǎn)物，然后將產(chǎn)物減少的 流出液用作下一個串聯(lián)發(fā)酵罐的原料?？梢允褂酶鞣N類型的提取技術(shù)，包括氣提、吸附、全 蒸發(fā)、滲透萃取(perstraction)和蒸餾?？梢哉{(diào)整串聯(lián)生物反應(yīng)器的次序以防止或移除由于過度生物質(zhì)生長所致的阻塞。 例如，當(dāng)?shù)谝粋€串聯(lián)發(fā)酵罐達(dá)到高水平生物質(zhì)時，可以代之將其放置在串聯(lián)第二位，以現(xiàn)在 接收具有高產(chǎn)物濃度或減少的養(yǎng)分水平的流出液，所述高產(chǎn)物濃度或減少的養(yǎng)分水平可能抑制生物質(zhì)的進一步生產(chǎn)。如果是填充床生物反應(yīng)器或流化床生物反應(yīng)器，發(fā)酵罐的次序 的適時移位可能防止生物質(zhì)過度生長和發(fā)酵罐的阻塞。在連續(xù)過程中，因為細(xì)胞濃度和流出液的流速可以不受彼此約束而改變，所以有 可能獲得比分批工藝或補料-分批工藝中更高的生產(chǎn)率。在連續(xù)發(fā)酵中，體積產(chǎn)率是通過 產(chǎn)物濃度(本文可互換稱為“滴度”)乘以養(yǎng)分稀釋率(即生物反應(yīng)器的體積轉(zhuǎn)換率或生物 反應(yīng)器停留時間的倒數(shù))而計算出的。最大可達(dá)到的稀釋率是通過能夠在生物反應(yīng)器中穩(wěn) 定保持的生物質(zhì)的濃度而確定的。以恒定稀釋率(即養(yǎng)分消耗率)，隨著提高可以保持的 發(fā)酵滴度，生產(chǎn)率按比例提高。固定細(xì)胞生物反應(yīng)器允許較高濃度的生產(chǎn)生物量積累，并因 此，生物反應(yīng)器能夠以高稀釋率運轉(zhuǎn)，導(dǎo)致體積產(chǎn)率相對于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)物顯著改善。用 于丙酮丁醇梭菌的連續(xù)發(fā)酵的生物反應(yīng)器也是本領(lǐng)域已知的(美國專利第4，424，275號和 美國專利第4，568，643號)。因為高密度、穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)物能夠通過連續(xù)的培養(yǎng)而保持，隨之 而來移出包含產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)液，因此可以使用更小容量的生物反應(yīng)器。用于培養(yǎng)產(chǎn)生靶產(chǎn)物的微生物的常規(guī)生物反應(yīng)器和方法是已知的并且考慮用 于本發(fā)明的方法和組合物。例如，在丙酮丁醇梭菌的分批發(fā)酵中使用的發(fā)酵罐是本領(lǐng)域 公知的(Beesch, S. C. Acetone—butanol fermentation of sugars (糖的丙麗 _ 丁醇發(fā) 酵).Eng.Proc. Dev. 44 1677-1682,1952 ；Beesch, S.C. Acetone-butanol fermentation of starches (淀粉的丙酮-丁 醇發(fā)酵)· Appl. Microbiol. 1 :85-96,1953 ；Killeffer, D. H. Butanol and acetone from corn. A description of the fermentation process (來 自玉米的丁醇和丙酮。對發(fā)酵工藝的描述).hd. Eng. Chem. 19 =46-50,1927 ；MuCutchan W. N.,禾口 Hickey, R. J. The butanol—acetone fermentations (丁 醇一丙麗發(fā)酵)· Ind. Ferment. 1 =347-388,1954.) 歷史上，用于丁醇生產(chǎn)的發(fā)酵罐具有50，000加侖到200，000 加侖的容量，并且常常沒有機械攪拌系統(tǒng)?？紤]用于本發(fā)明的發(fā)酵罐容量包括具有至少 100L、1000L、10，000L、50，000L、100，000L、250，000L 或 500，000L 容量的發(fā)酵罐。發(fā)酵罐內(nèi)容物的混合可以通過充入無菌氣體例如二氧化碳或N2實現(xiàn)，所述無菌 氣體也可以通過在發(fā)酵罐內(nèi)保持正壓用來防止培養(yǎng)物的污染。也可以在氣舉型反應(yīng)器中利 用從發(fā)酵中排出的氣體(C02、ffi)來保持厭氧、加壓、充分混合的條件?；旌吓囵B(yǎng)物內(nèi)容物 的其他技術(shù)包括攪拌器的使用或發(fā)酵培養(yǎng)液尤其是在移出發(fā)酵產(chǎn)物后返回到發(fā)酵罐中的 培養(yǎng)液的再循環(huán)。在一些實施方案中，發(fā)酵罐中的內(nèi)容物不混合，但是可能依賴于排出的氣 體的產(chǎn)生和移動來混合內(nèi)容物。固定細(xì)胞生物反應(yīng)器在本發(fā)明的一些實施方案中，固定的微生物被培養(yǎng)在填充床生物反應(yīng)器中，也稱 為活塞流生物反應(yīng)器。在其他實施方案中，微生物被培養(yǎng)在膨脹(流化)床生物反應(yīng)器中。 仍在其他實施方案中，將微生物培養(yǎng)在被設(shè)計以雙重模式操作的生物反應(yīng)器中，即所述生 物反應(yīng)器能夠以填充床或膨脹(流化)床模式操作。參見圖19A和19B。固定細(xì)胞生物反 應(yīng)器使用相對小尺寸的固體支持體，該固體支持體提供相對于顆粒體積的大表面積，允許 固定在顆粒上的微生物處理大體積的流體。在填充床生物反應(yīng)器中，細(xì)胞被固定在半固體 或固體顆粒之上或之中，因為粒度，機械約束和/或低流體流速不引起或允許支撐材料的 明顯軸向移動。填充床反應(yīng)器容易構(gòu)建和操作，但是能夠遭受阻塞、養(yǎng)分轉(zhuǎn)移差、以及PH控 制差。
相比之下，膨脹(流化)床反應(yīng)器使用基本上不受機械約束的半固體或固體支持 體，以使得對于足夠的流體流，通常為向上流動的流，顆粒變得在該流中懸浮或“流化”，即 表現(xiàn)得好像它們是流體流的一部分。在顆粒上的流體阻力是主要的懸浮機制，但是浮力也 能有助于顆粒的懸浮。通常，生物反應(yīng)器使用垂直流體運動來懸浮顆粒，但是其他流體運動 是可能的，包括在垂直于生物反應(yīng)器縱軸的方向的流體流。流體速度應(yīng)該足以懸浮顆粒，但 是不夠大以至于不能將顆粒從容器中載出。床的膨脹允許固體顆粒圍繞生物反應(yīng)器移動， 使生物反應(yīng)器內(nèi)的流體徹底混合?；旌戏热Q于在生物反應(yīng)器中達(dá)到的顆粒流化程度。 由于流體的體積必須被循環(huán)以保持顆粒懸浮，所以膨脹床生物反應(yīng)器與填充床相比需要相 對大量的能量來操作。本發(fā)明的雙重模式、填充床-膨脹床生物反應(yīng)器允許整個發(fā)酵運轉(zhuǎn)的過程以任一 種模式進行發(fā)酵的選擇?？蛇x地，發(fā)酵可以在單次發(fā)酵過程中在兩個模式之間交替。雙重 模式生物反應(yīng)器與常規(guī)的膨脹(流化)床生物反應(yīng)器相比具有減少的能量使用，因為具有 必需的增加能量需求的流化作用只需要在以下情況下進行例如，在相對高的細(xì)胞密度，高 產(chǎn)物濃度，或當(dāng)可通過提高生物反應(yīng)器的內(nèi)容物混合而校正的PH或養(yǎng)分不均形成時。以下闡述了用垂直流體流操作的雙重模式生物反應(yīng)器的一個實施方案。生物反應(yīng) 器的固體支持體在填充床模式下用微生物接種，然后將在沒有流體流動的分批模式下將其 保持一段時間。隨著微生物開始聚居到半固體或固體支持體上并在密度上有所提高，啟動 低流體流速以提供其他營養(yǎng)和/或控制PH。然后視需要提高流速以適應(yīng)增加的細(xì)胞密度。 在某一點，提高的流體流將使填充柱開始膨脹或“流化”到名為“膨脹床區(qū)”的生物反應(yīng)器區(qū) 域中。參見圖19B。床膨脹所需的最小流體速度Umf取決于許多考慮因素，包括生物反應(yīng)器 的構(gòu)造及其伴隨的流體動力學(xué)、半固體或固體支持體的具體粒度分布、以及填充床的空隙 容積，如在使用具體實施方案闡述一般的工程學(xué)概念的實施例部分中進一步解釋的那樣。 隨著流體速度的進一步提高，填充床將繼續(xù)膨脹。正如可以理解的那樣，能量的使用最初非 常低并且將隨著流體流動開始而斜升，并且隨后提高以適應(yīng)培養(yǎng)物的生物需要。流化以及 此后的最大能量消耗只需要在雙重模式的生物反應(yīng)器中發(fā)生在如下時間點在該時間點細(xì) 胞密度需要這種混合進一步提高生產(chǎn)率、降低PH或底物不均性、或者以另外方式糾正或處 理由增加的細(xì)胞密度帶來的其他培養(yǎng)條件。對操作垂直流體流雙重模式生物反應(yīng)器的實施方案的另外的說明如下。在填充床 模式過程中通過用被微生物聚居的較小的半固體或固體顆粒連續(xù)灌注填充床，而用微生物 接種生物反應(yīng)器的固體支持體。較小的顆粒能夠進入支持體材料的孔結(jié)構(gòu)并寄居在那兒， 或通過較小顆粒與固體支持體之間的碰撞，微生物可以轉(zhuǎn)移至支持體材料。在M小時后， 停止用具有附著的微生物的較小顆粒灌注支持體，并開始用養(yǎng)分溶液灌注。使用低流速，低 流速視需要隨時間而提高以提供足夠的養(yǎng)分，但在運轉(zhuǎn)到達(dá)到Umf的點的發(fā)酵過程中永遠(yuǎn) 不提高低流速。許多發(fā)酵罐接種方法是可能的，包括從發(fā)酵罐的頂部反向沖洗以便從頂部裝載 床。其他方式包括通過位于沿著反應(yīng)器壁的口添加液體培養(yǎng)物或浸漬的固體支持體。還可 以使用反應(yīng)器流出液來接種其他反應(yīng)器，并且在這種情況下，任何殘余的可發(fā)酵材料可以 在第二個反應(yīng)器中被轉(zhuǎn)化，提高產(chǎn)率/回收率。以相似方式，可以通過底部裝載、頂部裝載或側(cè)面裝載將支持體材料添加到柱/反應(yīng)器以補充從生物反應(yīng)器中降解或損失的支持體材料。為了保持生物反應(yīng)器中包含的流化的支持體材料，將顆粒脫離區(qū)安放在床膨脹區(qū) 上方。脫離區(qū)具有將流化的顆粒從流體中分離的裝置，并由此將顆粒保留在生物反應(yīng)器內(nèi)。 在一些實施方案中，用于將顆粒從流體中分離的裝置包括用于減慢流體速度的裝置。通常， 這是通過增加生物反應(yīng)器的橫截面積而實現(xiàn)的。隨著流體速度減慢，顆粒開始從流體中沉 降出來。顆粒脫離區(qū)的頂部截面不含顆粒。出口可以位于這個頂部以移出流出液。保留顆 粒的其他裝置包括位于生物反應(yīng)器之內(nèi)的過濾器或篩。通過使用沉清槽、離心機、水力旋流 器、所有類型的過濾機(例如轉(zhuǎn)鼓)、助濾器、干燥器或蒸餾設(shè)備，支持體材料可以被移除并 且從流出液流中回收。如之前的實例所說明的，本發(fā)明的雙重模式生物反應(yīng)器包括與填充床區(qū)接合的入 口，所述填充床區(qū)與床膨脹區(qū)接合，所述床膨脹區(qū)與具有出口的顆粒脫離區(qū)接合。參見圖 19B。在一些實施方案中，具有該設(shè)計的生物反應(yīng)器能夠連續(xù)發(fā)酵至少100、250、500、750、 1，000、1250、1，500,2, 000,2, 250,2, 500,3, 000 小時、4，000,5, 000 或6，000 小時。雙重模式 填充床-膨脹床生物反應(yīng)器還可以包括柱膨脹區(qū)。參見圖19B。該區(qū)域與床膨脹區(qū)的下游 端接合，并且它與顆粒脫離區(qū)的上游端接合。柱膨脹區(qū)包括使脫離流體流的顆粒返回膨脹 床區(qū)的傾斜的表面。傾斜的角度當(dāng)從水平測量時是至少15°、20°、30°、40°、45°、50°、 55°、60°、70°或80°。柱膨脹區(qū)還作為顆粒脫離區(qū)起作用，因為該區(qū)的頂部具有較寬的 橫截面直徑，并因而將具有較慢的垂直流速。柱膨脹區(qū)任選地作為可使用的顆粒脫離區(qū)，其 包括用于將支持體材料返回到膨脹床區(qū)的傾斜角。雙重模式填充床-流化床生物反應(yīng)器還可以包括氣體-液體分離區(qū)。參見圖19B。 該區(qū)域與顆粒脫離區(qū)的下游端接合。氣體-液體區(qū)允許排出的氣體或引入的氣體從發(fā)酵培 養(yǎng)液中分離，并且可能為積極產(chǎn)生氣體(諸如co2、H2或甲烷)的培養(yǎng)物所需，或者當(dāng)培養(yǎng)物 被充氣時可能需要氣體-液體區(qū)。氣體-液體區(qū)的替代物是在生物反應(yīng)器出口的下游安放 容納槽(holding tank)。流出液通常將進入該槽并從槽中的低點離開槽，而提供頂部空間 以捕集任何可能溶解于流出液中或作為氣泡或泡沫從生物反應(yīng)器中載出的氣體。通常，經(jīng) 常與冷凝器(condensor)、過濾器和/或滌氣器接合以控制氣味的通氣口被安放在槽內(nèi)的 高點以允許累積的氣體離開系統(tǒng)。取決于多種因素，像流速、原料和不可溶的碎片的產(chǎn)生， 容納槽可以包含沉降區(qū)，其中微粒物質(zhì)能夠沉降出來并且被定期移除。具有用本發(fā)明達(dá)到 的預(yù)期高產(chǎn)物滴度，某些產(chǎn)物像丁醇可以達(dá)到一個濃度點，其中產(chǎn)物將從發(fā)酵流出液中相 分離。容納槽還可以設(shè)計成包括如下區(qū)域通過相分離促進產(chǎn)物從流出液中分離并且還通 過傾析法或抽出密度比流出液小的積累的產(chǎn)物來收獲產(chǎn)物的區(qū)域。上面指出的容納槽還可以用作原位產(chǎn)物提取場所，在其中任何方式的產(chǎn)物回收技 術(shù)-包括但不限于氣提、全蒸發(fā)、真空回收或液-液萃取，可以用來輔助產(chǎn)物從該過程中回 收。雙重模式生物反應(yīng)器還可以包括入口分配區(qū)。參見圖19B。入口分配區(qū)與填充床 區(qū)的上游端接合。入口分配區(qū)分配流體均勻穿過膨脹床以防止在原料分配中的不均勻性或 在床內(nèi)產(chǎn)生PH梯度。一般而言，生物反應(yīng)器跨入口分配區(qū)的壓力降被限制在不超過跨生物 反應(yīng)器長度的總壓力降的30%。在一些實施方案中，壓力降小于總系統(tǒng)壓力的30%、25%、 20%、15%、10%或 5%o31
通常，柱膨脹區(qū)、顆粒脫離區(qū)或氣體-液體分離區(qū)中至少一個具有比填充床區(qū)直 徑大的直徑。本發(fā)明的生物反應(yīng)器還可以替代地以與通常流體流相反的方向從生物反應(yīng)器的 頂部向下灌注通過填充床。交替的進料方向可以防止或減少流動限制的形成，由此延長填 充床的壽命，并因而允許延長連續(xù)的發(fā)酵運轉(zhuǎn)。支持體材料一般在不同的粒度分類中是可用的。例如，處于5X8、10X^* 20X60目大小的骨炭是可用的。在每種顆粒分類中存在粒度范圍。例如，對于5X8骨炭， 顆粒大小范圍是3000-5000 μ m。對于任何具體的粒度范圍，具有在該粒度范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最 大顆粒的流化所需的最小流體速度Umf。雙重模式生物反應(yīng)器通常被設(shè)計成具有足夠的總體 高度以便能夠在生物反應(yīng)器內(nèi)保留當(dāng)以Umf操作時在分布范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最小尺寸的顆粒。 一般而言，最小的足夠的生物反應(yīng)器高度是通過確定膨脹床的總高度(H)與填充床的高度 (Hp)的比率來計算的，其中H等于Hp的高度加上床膨脹區(qū)。雙重模式生物反應(yīng)器應(yīng)該具 有至少1. 0的H Hp比率，并且優(yōu)選地具有至少1. 05、1. 10、1. 15、1. 20、1. 25、1. 30、1. 35、 1. 40,1. 45,1. 50,1. 55,1. 60,1. 70,1. 80,1. 90 或 2. 00 的比率。實驗部分詳述了用于獲取具有給定粒度分布范圍的特定半固體或固體支持體材 料的H Hp比率的適用于骨炭的一般方法。可以將膨脹床高度計算為發(fā)酵運轉(zhuǎn)過程中在任意點的填充床的高度，所述任意點 包括至少四分之一、一半或四分之三通過運轉(zhuǎn)的時間點或在運轉(zhuǎn)結(jié)束。這種計算考慮可以 隨外部生物膜的生長而發(fā)生的個體顆粒大小隨時間增加。由于不可溶的碎片的積累，填充 床還能夠增加大小。本發(fā)明的雙重模式生物反應(yīng)器還可以包括用于控制pH、控制氧化還原、引入消泡 劑的裝置，以及用于使生物反應(yīng)器的內(nèi)容物可見和用于引入檢測或測量包括一種或多種發(fā) 酵產(chǎn)物在內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)液的各種組分的探頭的孔道。另外，可以通過孔道引入溫度探頭、壓 力探頭和溶氧探頭或其他的溶解氣體探頭。可選地，可以通過將探頭放在離開生物反應(yīng)器 的流出液流的管線內(nèi)而完成這些測量。還可以存在采樣口以供自動或人工獲得物理樣品。 另外，排出或引入的氣體可以從氣體-液體分離區(qū)的口或廢氣處理系統(tǒng)的管線內(nèi)采樣。生 物反應(yīng)器可以被包殼以用于溫度控制和就地消毒。任選地，生物反應(yīng)器可以具有允許大規(guī) 模進入生物反應(yīng)器內(nèi)部或允許填充床區(qū)、膨脹床區(qū)、柱膨脹區(qū)、顆粒脫離區(qū)或氣體-液體分 離區(qū)中的一個或多個的高度改變的模塊化設(shè)計。本發(fā)明的雙重模式生物反應(yīng)器可以主要以定期提高流體速度的填充床模式運轉(zhuǎn)， 定期提高流體速度實現(xiàn)將柱膨脹到柱膨脹區(qū)或使填充床流動。這能夠以計劃的間隔預(yù)防性 地進行以防止壓力增大和流體流的限制或堵塞。在一些實施方案中，生物反應(yīng)器主要以填 充床模式運轉(zhuǎn)，但以下述頻率被切換到膨脹床模式每小時、2小時、4小時、6小時、8小時、 12小時、18小時、24小時、2天、4天、6天、8天、10天、20天或它們的組合。也可以在流體壓 力超出預(yù)定的工作點時進行切換。在轉(zhuǎn)到較低流體速度后，顆粒將以更松散的構(gòu)型(a loser configuration)沉降， 該構(gòu)型允許與流速提高之前相比相同或更大的流體流速，但具有減少的壓力降。在膨脹床 模式下每次定期流速提高后，在填充床模式下的流速可以被設(shè)定成隨時間漸進上升，例如， 具有l(wèi)OOml/min的起始流速，在第一次提高后流速可以被設(shè)定為105ml/min，在提高后接下來流速為llOml/min等等。這種漸進增加可以防止生物反應(yīng)器內(nèi)部的堵塞或不可接受的壓 力增加。通過增加的流體速度定期對床重新充填的能力以及隨后固體支持體和不可溶顆粒 在流體速度降低后的沉降可能提供一種方法，該方法防止填充床的堵塞或積垢并引導(dǎo)連續(xù) 的發(fā)酵運轉(zhuǎn)超過 100、250、500、750、1，000、1250、1，500,2, 000,2, 250,2, 500,3, 000,4, 000、 5，000、6，000、7，000或8，000小時。取決于駐留在填充床中的不可溶顆粒的大小和密度，轉(zhuǎn) 換成膨脹床模式可能使得有沖洗來自系統(tǒng)的這些不可溶顆粒的機會。使用與生物反應(yīng)器成 一排的容納槽，不可溶顆粒可能從發(fā)酵罐流出液中沉降出來?？蛇x地，不可溶顆?？梢员粸V 出、通過離心或通過其他適合的手段移除。通過從填充床運轉(zhuǎn)模式轉(zhuǎn)換到膨脹床運轉(zhuǎn)模式定期對床重新充填的能力還可以 防止或減輕在床基質(zhì)中的溝流(channeling)。溝流能夠?qū)е逻M料分布和pH控制的不均性， 因為在溝(channel)附近的固體支持體上的細(xì)胞與位于遠(yuǎn)離溝的固體支持體上的細(xì)胞相 比被暴露于更大體積的原料流。在一些實施方案中，在移種生物反應(yīng)器之前或移種生物反應(yīng)器后隨即將流速增加 以開始調(diào)整支持體材料的顆粒間間距，由此提高總體生產(chǎn)率或改變其他參數(shù)，諸如跨整個 床的壓力降。在一些實施方案中，流速的定期提高或降低周期性地膨脹和再沉降支持體材 料和有機體材料。在這樣做時，可以調(diào)整支持體材料之間的空隙間距。任選地，可以將無氧氣體添加到液體培養(yǎng)基以增強混合、提供另外的養(yǎng)分或維持 生物反應(yīng)器內(nèi)部的正壓。流化床的特點和表現(xiàn)依賴于固體和液體兩者的特性。在產(chǎn)物對微 生物有毒性或抑制性效應(yīng)時，可以使用氣提來降低柱流體中的產(chǎn)物濃度，并由此降低或防 止產(chǎn)物的抑制或毒性。在本發(fā)明中使用所需的粒度將依賴于應(yīng)用、生物反應(yīng)器構(gòu)型和操作參數(shù)而變 化。在一些實施方案中，通過篩分對固體支持體分大小。在一些實施方案中，通過顆粒能 夠穿過的篩孔的篩號將顆粒分類。在一些實施方案中，用具有以下美國篩號(U. S. Sieve Number)的篩目篩分顆粒3 1/2、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、 50、60或70。在一些實施方案中，顆粒被篩分至少兩次，第一次使用具有較大開口的篩 目，接著使用具有較小開口的篩目，以產(chǎn)生在限定的粒度分布范圍內(nèi)的顆粒。在一些實 施方案中，顆粒直徑為至少 100μπι、200μπι、300μπι、400μπι、500μπι、600μπι、700μπι、 800 μm、900 μm、1000 μ m、1，100 μ m、1，200 μ m、1，300 μ m、1，400 μ m、1，500 μ m、1，600 μm、 1，700 μ m、1，800 μ m、1，900 μ m、2，000 μ m。在一些實施方案中，顆粒直徑為小于100 μ m、 200 μm、300 μm、400 μm、500 μm、600 μm、700 μm、800 μm、900 μm、1000 μ m、1，100 μ m、 1，200 μ m、l，300 μ m、l，400 μ m、1，500 μ m、1，600 μ m、1，700 μ m、1，800 μ m、1，900 μ m、 2，000 μ m。在其他實施方案中，至少80%、85%、90%、95%或100%的顆粒具有在以下范圍 內(nèi)的直徑100-400 μ m、100-600 μ m、100-800 μ m、200-500 μ m、200-800 μ m、200-1000 μ m、 400-800 μ m、400-1000 μ m、500_1000 μ m、600_l，200 μ m、800_l，400 μ m、1，000-1，500 μ m 或 1，000-2000 μ m。在一些實施方案中，顆粒直徑是等效直徑，即考慮到個體顆粒的不規(guī)則形 狀的直徑。理想地，半固體或固體支持體材料應(yīng)該具有高表面積。這可以通過使用小尺寸顆 粒、具有高孔隙率的顆粒或其組合來實現(xiàn)。在一些實施方案中，顆粒的表面積為至少IOm2/ g、25m2/g、50m7g、75m2/g、100m2/g、125m2/g、150m2/g、175m2/g、200m2/g、22^n7g、250m7g、275m2/g、300m2/g、325m2/g、350m2/g、375m2/g、400m2/g、425m2/g、450m2/g、500m2/g、600m2/g、 700m2/g>800m2/g>900m2/g> 1000m2/g或2000m2/g。另外，堆密度應(yīng)該足夠高以使得最小的 顆粒從柱膨脹區(qū)和/或顆粒脫離區(qū)中的流體流中沉降出來，并由此保留在生物反應(yīng)器中。 在一些實施方案中，支持體的堆密度為至少0. 3g/cm\0. 4g/cm3、0. 5g/cm3,0. 6g/cm3、0. 7g/ cm3、0. 8g/cm3、0. 9g/cm3、l. 0g/cm3、l. lg/cm3、l. 2g/cm3 或 1. 3g/cm3。支持體材料應(yīng)該具有 足夠的硬度以抵抗磨耗并由此在支持體材料彼此接觸和碰撞時明顯地避免粉塵形成。在一 些實施方案中，支持體具有至少20、40、60、80、100、120、140、160或200的球盤硬度數(shù)。支 持體材料還應(yīng)該具有足夠的拉伸強度以抵抗由于內(nèi)部應(yīng)力所致的碎裂，內(nèi)部應(yīng)力是由支持 體材料孔內(nèi)部的生物膜的生長引起的。在一些實施方案中，支持體具有至少20MaP、40MaP、 60MaP、80MaP、lOOMaP、120MaP、140MaP、160MaP、180MaP、200MaP、300MaP 或 400MaP 的屈服強 度。用于收獲產(chǎn)物的裝置許多手段可用于從發(fā)酵培養(yǎng)液分離產(chǎn)物，包括蒸餾、用溶劑連續(xù)提取(美國專利 第4，424，275號和美國專利第4，568，643號)、碳氟化合物的使用(美國專利第4，777，135 號)、吸收材料的使用(美國專利第4，520，104號)、全蒸發(fā)膜的使用(美國專利第 5，755，967號)以及汽提氣的使用(美國專利申請第10/945，551號)。本發(fā)明的一個實施方案使用蒸汽壓縮蒸餾系統(tǒng)。(美國專利第4，671，856、 4，769，113,4, 869，067,4, 902，197,4, 919，592,4, 978，429,5, 597，453 和 5，968，321 號。) 另一實施方案利用機械的蒸汽再壓縮系統(tǒng)來濃縮溶劑并利用塔頂流的焓來蒸發(fā)進料混合 物。在這個實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)液被直接送至MVR塔以用于溶劑濃縮。來自MVR系統(tǒng)的 塔頂流被壓縮。熱交換器用于從具有進料混合物的壓縮的塔頂傳遞熱。包含溶劑的混合物 被傳到后面的蒸餾柱用于分離。MVR柱的底部包含生物質(zhì)和其他較重的化合物。生物質(zhì)通 過任何過濾方式被過濾并且可以被干燥以回收另外的水。過濾流包含大部分水和發(fā)酵培養(yǎng) 基組分。處理該流以移除不期望的組分并且可以將其作為工業(yè)用水回收。以交替構(gòu)型，對 于丙酮丁醇梭菌的分批發(fā)酵，包含在消耗的發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)物的收獲首先需要通過離心 澄清，交叉流過濾或替代的過濾方式。然后將澄清的發(fā)酵培養(yǎng)液送至蒸餾系統(tǒng)中，其中澄清 的培養(yǎng)液進入熱交換器并且通過來自輸出的蒸餾產(chǎn)物和廢液的熱傳遞而被預(yù)熱。將預(yù)熱的 培養(yǎng)液除氣并加至板式蒸發(fā)器/冷凝器中，所述板式蒸發(fā)器/冷凝器有在疊加的金屬板之 間交替形成的由墊圈分隔的對流蒸發(fā)室和冷凝室。培養(yǎng)基進入蒸發(fā)室，在其中培養(yǎng)基沸騰。 離開蒸發(fā)室的加熱的蒸汽通過除霧的篩孔，然后被低壓壓氣機加壓。加壓的蒸汽被遞送至 冷凝室，在其中蒸汽部分地或全部地冷凝成蒸餾的產(chǎn)物，把熱傳給沸騰室中的培養(yǎng)液，并然 后被從系統(tǒng)中排出。包含溶解固體的未蒸發(fā)的培養(yǎng)液可以被再循環(huán)并且用來補充新發(fā)酵運 轉(zhuǎn)的進料混合物，或者它可以被從系統(tǒng)中排出。在一些實施方案中，對于丙酮丁醇梭菌的連續(xù)培養(yǎng)物，使抽出的發(fā)酵培養(yǎng)液離開 發(fā)酵罐并離心以濃縮細(xì)胞和顆粒物質(zhì)。可選地，可以通過例如切向流過濾來過濾發(fā)酵培養(yǎng) 液?？梢詫饪s的細(xì)胞和顆粒物質(zhì)回填至發(fā)酵罐(若期望的話)以增加細(xì)胞密度或用于進 一步發(fā)酵部分發(fā)酵的底物?？蛇x地，如果澄清的或過濾的發(fā)酵培養(yǎng)液包含可溶的可發(fā)酵底 物，可以將澄清的或過濾的發(fā)酵培養(yǎng)液回填至發(fā)酵罐。當(dāng)期望從培養(yǎng)基中收獲產(chǎn)物時，許 多策略是可用的，包括儲存澄清的或過濾的發(fā)酵培養(yǎng)液直至存在合理的數(shù)量來開始產(chǎn)物分離運轉(zhuǎn)，諸如蒸餾，或者可選地，澄清的或過濾的發(fā)酵培養(yǎng)液的連續(xù)進料可以被送至分離系 統(tǒng)。在一些實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)液可以被直接加工而不經(jīng)離心或過濾。由某些包含丁醇的溶劑混合物組成的發(fā)酵培養(yǎng)液可以經(jīng)歷基于比重的自發(fā)的相 分離。浮標(biāo)液位指示器的使用可用于從剩余的含水部分中輔助分離包含丁醇的溶劑層。還可以通過氣提或液體萃取回收發(fā)酵產(chǎn)物。在氣提的情況下，期望的產(chǎn)物或抑制 性化合物期望從發(fā)酵培養(yǎng)液中移出。在氣提方法中，通過閃蒸槽、真空提取或冷凝法回收移 出的產(chǎn)物。在抑制性化合物的情況下，對產(chǎn)物進一步純化或處置。生物質(zhì)以及所形成的其 他固體材料和沉淀必須在某點從系統(tǒng)中移出或清洗。這可以通過間斷的或連續(xù)的清洗流實 現(xiàn)。生物質(zhì)移出可以通過之前概括的幾種手段實現(xiàn)。在液體萃取的情況下，生物質(zhì)可以存 在于萃取流或清洗流二者中。液體萃取流被傳至另外的回收和純化操作。實施例^MM 1 句ι含2. 2-2. 6% (ν/ν/) 丁醇的Ρ2+4%木糖瓊脂板的制各為了制備IL的Ρ2培養(yǎng)基，將以下成分稱量到I-L瓶中=Bacto酵母提取物(1. Og)、 乙酸銨(2. 2g)、磷酸氫二鉀(K2HPO4) (0. 5g)、磷酸二氫鉀(KH2PO4) (0. 5g)。將蒸餾水(800mL) 加至混合物中，伴隨攪拌棒攪拌。通過在攪拌盤(stir plate)上混合來溶解這些成分。用 5N NaOH將溶液的pH調(diào)整到7. 2。稱量瓊脂(16克)并加至瓶中。添加適當(dāng)量的蒸餾水將 體積提增到915ml。將瓶蓋上，高壓滅菌30分鐘，并然后放在攪拌盤上。當(dāng)觸摸培養(yǎng)基剛冷 卻時，添加以下物質(zhì)將培養(yǎng)基的終體積提增至IL P2微量元素Q00X)(5ml)和50% (w/ ν)木糖(對于4% (w/v)的終濃度80ml)。通過在I-L瓶中稱量以下成分來制備I-L的200 XP2微量元素硫酸鎂七水合物 (MgSO4. 7H20) (40. Og)、硫酸錳一水合物(MnSO4. H2O) (2g)、硫酸亞鐵七水合物(FeSO4. 7H20) (2g)、對氨基苯甲酸(0. 2g)、鹽酸硫胺素(0. 2g)、檸檬酸(20g)、NaCK2g)、D-生物素 (0. 002g)。用蒸餾水使終體積增加到1-L。使用0. 2微米過濾器將溶液過濾除菌，用鋁箔包 裹，并儲存在4°C。通過在攪拌盤上將200ml蒸餾水加熱到50°C來制備50% (w/v)木糖。將255g 的D-木糖緩慢添加至熱水中并攪拌直至所有木糖溶解。通過添加蒸餾水使體積增加至 500ml。通過0.2微米過濾器對溶液過濾除菌。用以0. 2ml遞增的4. 4-5. 2ml 丁醇分別添加到五個無菌200ml量筒的一個中，制 備具有以0.1%遞增的2. 2-2. 6% (ν/ν) 丁醇的平板。用按照描述制備的Ρ2+木糖瓊脂培 養(yǎng)基將每個量筒中的體積增加到200ml，用石蠟?zāi)っ芊?，并且將量筒顛倒以均勻地混合丁?與P2+木糖瓊脂培養(yǎng)基。將瓊脂培養(yǎng)基放在熱平板上以避免培養(yǎng)基在傾注過程中凝固。使用燃燒器/噴燈 來保持無菌環(huán)境，由每個量筒傾注平板(每個平板大約25-30ml)以得到在以0. 遞增的 平板2. 2-2. 6% (ν/ν)中適當(dāng)?shù)亩〈紳舛取Ｔ谂囵B(yǎng)基凝固后平板被移至厭氧罩并且被單獨 地用石蠟?zāi)し饪谝苑乐苟〈紦p失。在厭氧罩中M小時后，平板是隨時可用的。實施例2 用于分離具有增加的丁醇耐受性的突變體的雙盤誘變測定在第一天，開始待誘變的菌株的種子訓(xùn)練(seed train)。第二天，剪下適當(dāng)數(shù)目 的0.75X6cm濾紙。將半數(shù)濾紙放到包含6mg/ml MNNG的50ml管中。將另一半濾紙放到35包含丁醇的50ml管中。在平板上使用之前將管移至厭氧罩中至少4小時。測量種子訓(xùn)練管的0D_以確定哪個管最接近1的0D_，并且如果需要，等待直到 具體培養(yǎng)物達(dá)到1的0D_。如果三種培養(yǎng)物都已經(jīng)長到高于0D_1，使用YEM做適當(dāng)稀釋以 獲得0D6_. 5的培養(yǎng)物。OD6J). 5的培養(yǎng)物在0. 5小時至1小時內(nèi)達(dá)到OD6tltlI15將200 μ 1上述0D_1的培養(yǎng)物鋪板在每個RCM平板上。將MNNG浸泡的濾紙放在 平板一邊的水平處(參見圖1)。孵育平板1小時。將丁醇浸泡的濾紙放在與MNNG濾紙垂 直(正交)處(參見圖8)。制備三個對照平板沒有丁醇和MNNG的平板，沒有丁醇的平板， 以及沒有MNNG的平板。將平板孵育1至3天。評估了在丁醇濾紙附近(即圖1中的畫圓圈區(qū)域)的分離 的菌落的生長。評定這些菌落以確定它們與親本菌株相比耐受丁醇的能力。將圖1的畫圓圈區(qū)域中分離的細(xì)菌再暴露于MNNG和丁醇的這種雙梯度以獲得多 種突變。這可能提高細(xì)菌耐受丁醇的能力。在暴露于雙梯度兩次后，從畫圓圈區(qū)域中分離 菌落。棚列3翩··卜.躺‘·細(xì)T酉享而憐_辨體使糖丁酸梭菌Co-7449菌株生長在酵母提取物培養(yǎng)基(YEM)中至大約3的0D_， 并用終濃度為50 μ g/ml的N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(MNNG)處理15分鐘。將細(xì)胞 用無葡萄糖的YEM洗滌兩次并以10_3和10_4稀釋度鋪板在強化梭菌培養(yǎng)基(RCM)上以回收 3000-4000個菌落。將菌落在包含5% 丁醇的RCM平板上重復(fù)鋪板?？傆?0個菌落在丁醇 平板中被分離并在包含5%丁醇的RCM平板上被重新劃線。突變體當(dāng)生長在固體支持體上 時與親本Co-7449菌株相比展示出至少高兩倍的對丁醇的耐受性，所述Co-7449親本菌株 在固體支持體上具有大約2. 的丁醇耐受性。通過從第二組5%丁醇RCM平板中取出菌落并使用突變體來接種包含有或沒有 1. 2%丁醇的YEM培養(yǎng)基的燒瓶，測試所選擇突變體在懸浮培養(yǎng)中的丁醇耐受性。菌落在沒 有丁醇的YEM中生長，但是在具有添加到培養(yǎng)液中的1. 2%丁醇的YEM中不生長，說明突變 的微生物在固體支持體上比它們被懸浮在液體培養(yǎng)基中更加耐受溶劑。將從沒有1. 2%丁醇的YEM培養(yǎng)基中取出的樣品鋪板在5%丁醇平板上，但是沒有 生長。高丁醇耐受菌株的保持可能需要在具有溶劑的連續(xù)選擇壓力的固體支持體上傳代以 保留高耐受性。^MM 4 丁醇耐警t牛測丨定方案-固彳本培目X辦夜體培養(yǎng)基研究了對于丁醇耐受性未被適應(yīng)或選擇的梭菌屬的菌株，看它們當(dāng)培養(yǎng)在固體支 持體上時與懸浮培養(yǎng)相比是否具有更大的溶劑耐受性。在第一天，在厭氧罩內(nèi)的P2+4%木 糖的5ml培養(yǎng)物中開始對待研究的菌株的種子訓(xùn)練。制備I-L體積的包含4%木糖和瓊脂 的無菌P2培養(yǎng)基，并將其放在熱平板上。在無菌環(huán)境中，將4. 4,4. 6,4. 8,5. 0和5. 2ml 丁 醇放在250ml無菌量筒中并用P2+4%木糖瓊脂培養(yǎng)基補足到200ml，使丁醇終濃度分別為 2.2、2.3、2.4、2.5和2.6% (ν/ν) 0將溶液充分混合，并在無菌環(huán)境中傾注平板。在平板凝 固后，將其轉(zhuǎn)移至厭氧罩并且在過夜儲存前即刻用石蠟?zāi)し饪?。第二天，測量種子訓(xùn)練管的0D·。挑出0D_在0. 6-1. 0之間的管，并將其用于以 1 20 的稀釋度接種到 IOml 包含 0、0. 5、1.0、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5 和 1. 6% (ν/ν) 丁醇的 Ρ2+4%木糖管中。還制備了沒有接種物的對照管。將管在厭氧罩中孵育。另外，將200μ136的培養(yǎng)物鋪板在0,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5和2. 6% (ν/ν) 丁醇平板上。在1天和3-4天后，測量液體培養(yǎng)物的0D_。檢驗平板生長。對于每種菌株和在每 個時間點的液體培養(yǎng)物，將每個丁醇濃度的OD6tltl相對于0% (ν/ν) 丁醇的0D_作圖為((在 χ%的OD600) / (在0%的OD600)) XlOO0圖2A顯示在不同時間點(0小時、24小時、96小時) 對于使用的三種梭菌屬菌株的包含不同丁醇濃度的不同液體培養(yǎng)物取得的OD6tltl測量結(jié)果。 起點(0小時)的0D_是基于起始培養(yǎng)物的1 20接種。圖2B顯示按1 20接種取得的 起始液體培養(yǎng)物的0D_測量結(jié)果。圖3是來自圖2A的數(shù)據(jù)的圖示并顯示Co-5673隨時間 在每種丁醇濃度(0% -1. 6% ν/ν)的液體培養(yǎng)基中的生長。對于&)-5673，00_在M小時 和96小時的時間點增加最多到1.4% (ν/ν) 丁醇。圖4是顯示在每種丁醇濃度(0^-1.6% 丁醇)的液體培養(yǎng)基中Co-0124隨時間生長的圖。對于Co-0124, OD600在24小時和96小 時的時間點增加最多到1.6% (ν/ν) 丁醇。圖5是顯示在每種丁醇濃度(0^-1.6% 丁醇) 的液體培養(yǎng)基中Co-7449隨時間生長的圖。對于Co-7449，OD600在M小時和96小時的時 間點增加最多到1.4% (ν/ν) 丁醇。圖6Α是顯示分析三種菌株Co-5673、Co-7449和Co-OlM在固體培養(yǎng)基平板 (P2+4%木糖)上在M小時時間點的丁醇耐受性的表。在液體培養(yǎng)基中的丁醇耐受性是 基于相比于起始OD6tltl在OD6tltl上的增加。觀察到的在固體培養(yǎng)基平板上的生長表明丁醇耐 受性。Co-5673顯示在包含0%和2. 2%的丁醇的平板上生長。Co-OlM顯示在包含0%和 2. 2%的丁醇的平板上生長。Co-7449顯示只在包含0%丁醇的平板上生長。圖6B是在M 小時的時間點三種菌株在液體培養(yǎng)基中和在固體培養(yǎng)基上的丁醇耐受性的比較。在固體培 養(yǎng)基上Co-7449在M小時的丁醇耐受性結(jié)果O. )是在與另外兩種菌株分開的實驗中 確定的。所有三種菌株當(dāng)生長在固體培養(yǎng)基上時在M小時表現(xiàn)出更高丁醇耐受性。圖7A是顯示分析三種菌株Co-5673、Co-7449和Co-OlM在固體培養(yǎng)基平板 (P2+4%木糖)上在96小時時間點的丁醇耐受性的表。在液體培養(yǎng)基中的丁醇耐受性是基 于相比于起始OD6tltl在OD6tltl上的增加。觀察到的在固體培養(yǎng)基平板上的生長表明丁醇耐受 性。Co-5673顯示在包含0%和2. 2%的丁醇的平板上生長。Co-OlM顯示在包含0%、2. 2% 和2. 3%的丁醇的平板上生長。Co-7449顯示只在包含0%和2. 2%的丁醇的平板上生長。 圖7B是三種菌株在液體培養(yǎng)基中和在固體培養(yǎng)基上在96小時的時間點的丁醇耐受性的比 較。所有三種菌株當(dāng)生長在固體培養(yǎng)基上時在96小時表現(xiàn)出與液體培養(yǎng)基相比更高丁醇 耐受性。當(dāng)丙酮丁醇梭菌的不同菌株被培養(yǎng)在固體支持體上時發(fā)現(xiàn)的這些微生物的較高丁 醇耐受性是出人意料的結(jié)果，如果該結(jié)果對包括丙酮丁醇梭菌的其他菌株和梭菌屬的其他 種在內(nèi)的其他微生物也適用，則它具有提高生物燃料體積生產(chǎn)率的潛力以及由于減少的能 量需求還具有減少分離成本的潛力。實施例5 使來自環(huán)境樣品的丁醇耐受的微生物適應(yīng)獲得了環(huán)境樣品(分離株)。將該分離株鋪板在一組包含營養(yǎng)瓊脂的相同平板 上。平板具有范圍在1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%的提高的丁醇濃度。具有 1.0%U. 2%和1. 4% 丁醇的平板過度生長，而具有1. 6% 丁醇的平板具有幾個菌落。在具 有1. 8%或2. 0%丁醇的平板上沒有觀察到生長。從1. 6%平板中挑出菌落，并將其在包含 每種提高濃度的丁醇的固體支持體上連續(xù)傳代。在20次傳代后，獲得適應(yīng)于在2. 5%丁醇 中生長的菌株。
實施例6 固定化連續(xù)培養(yǎng)的配置和操作使用具有0. 665空隙率的0. 15L柱并使具有3%葡萄糖的P2培養(yǎng)基以0. 36L/h 的速率流過該柱，建立了具有在IOX^目骨炭上的固定的CO-7449細(xì)胞的填充柱的連續(xù)發(fā) 酵工藝。首先將Co-7449的細(xì)胞固定到柱上，這是通過將柱安裝于中級生長的Co-7449的 分批發(fā)酵并使來自該分批發(fā)酵的培養(yǎng)基循環(huán)經(jīng)過該柱而實現(xiàn)的，然后回到發(fā)酵罐持續(xù)約M 小時的時間。在將細(xì)胞固定到填充柱上以后，然后將柱的出口流從分批發(fā)酵罐斷開，并附加至 另一個收獲池。從發(fā)酵罐到柱的流速被設(shè)定為0. 36L/h。培養(yǎng)基也從100L無菌培養(yǎng)基袋連 續(xù)添加至發(fā)酵罐以保持在發(fā)酵罐中的相同培養(yǎng)基體積。通過使來自發(fā)酵罐的出口流在流經(jīng) 柱之前穿過加熱培養(yǎng)基的熱交換器，填充柱的溫度被保持在允許細(xì)菌生長的溫度。通過將 供應(yīng)給柱的發(fā)酵培養(yǎng)基充入氮來保持系統(tǒng)無氧。使用這些條件，具有固定的Co-7449的填 充柱產(chǎn)生具有0. 24g 丁醇/g葡萄糖的產(chǎn)率和以3. 6h-l稀釋率的4. 9g 丁醇/ (L*h)生產(chǎn)率 的1.36g/L 丁醇滴度。實施例7 固定化連續(xù)培養(yǎng)的配置和操作通過固定具有5. 0%丁醇耐受性的Co-7449的丁醇耐受突變體的細(xì)胞，建立了固 定的連續(xù)培養(yǎng)物。如以上實施例6中所述使用以IOX^目骨炭填充的柱。在細(xì)胞被固定到 填充柱上后，將來自種子分批發(fā)酵罐的入口流和返回到種子分批發(fā)酵罐的出口流斷開。將 來自100L無菌培養(yǎng)基袋的進料線與柱相連并將來自該柱的出口線送回到培養(yǎng)基袋。培養(yǎng) 基至柱的流速被設(shè)定為0. 36L/h。通過使來自培養(yǎng)基袋的出口流在進入柱之前穿過熱交換 器，填充柱的溫度被保持在允許細(xì)菌生長的溫度。使排出的發(fā)酵氣體通過發(fā)酵鎖逸出。使 用這些條件，具有固定的Co-7449突變體的填充柱產(chǎn)生了超過10g/L的丁醇滴度。實施例8 發(fā)酵使用發(fā)酵工藝諸如分批發(fā)酵、補料-分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生了主發(fā)酵培養(yǎng)液， 其中微生物在懸浮培養(yǎng)中生長或固定在固體支持體上。主發(fā)酵培養(yǎng)液包含一些酸和/或溶 劑滴度以及殘余的未同化原料。用于提高的生產(chǎn)率和滴度的殘余原料的進一步利用是通過 放置與第一個生物反應(yīng)器串聯(lián)的包含固定的產(chǎn)物耐受性突變微生物的第二個生物反應(yīng)器 實現(xiàn)的，如圖8所示。附加進料可以按需添加以進一步提高生產(chǎn)率和滴度并由此降低分離 和回收的能量需求。在發(fā)酵過程結(jié)束時，發(fā)酵培養(yǎng)液被傳送以用于分離和回收發(fā)酵產(chǎn)物。如將被理解的那樣，多個生物反應(yīng)器的構(gòu)型是可能的。兩個或多個生物反應(yīng)器可 以用作具有懸浮細(xì)胞或固定細(xì)胞的主生物反應(yīng)器?？梢詫蓚€或多個生物反應(yīng)器串聯(lián)安 放，且每個相繼的生物反應(yīng)器包含具有對產(chǎn)物的更高耐受性的突變微生物。另外，對于串聯(lián) 的生物反應(yīng)器，對于每個生物反應(yīng)器的具體工藝參數(shù)可以被優(yōu)化，諸如稀釋率和進料率、培 養(yǎng)基組分以及溫度。在串聯(lián)的各個生物反應(yīng)器包含不同的微生物菌株或物種或微生物的聚 生體時這一特征可能是特別重要的。不考慮生物反應(yīng)器的構(gòu)型，通過再循環(huán)來自分離和回收階段的加工過的發(fā)酵流出 液獲得原料和水利用上的進一步節(jié)約，其中加工過的發(fā)酵流出液可以充當(dāng)生物反應(yīng)器中的 起始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)或進料流。以這種方式，利用未同化的和/或回收的養(yǎng)分和礦物質(zhì) (例如鐵)。X寸于誅雇的固體支措體材料,《充床區(qū)、膨脹床區(qū)禾Π H Hd的示鋼卜件石角定
實施例9-13舉例說明用來計算雙重模式生物反應(yīng)器的具體設(shè)計參數(shù)的方法。在 這些實施例中，選擇骨炭作為固體支持體材料，使用該相同方法或相似方法也可以產(chǎn)生其 他固體支持體和半固體支持體的設(shè)計參數(shù)。實施例9 骨炭顆粒等效盲徑的計算骨炭顆粒具有不規(guī)則形狀，然而，可以由終端沉降速度計算等效直徑，由此給出相 同密度的“等效”球體的顆粒-液體相互作用的估計。由于在骨炭形狀和大小上的差別，獲 得對于平均沉降速度和對于平均沉降速度的+/_—個標(biāo)準(zhǔn)差(+/-ο)的等效直徑。骨炭顆粒信息骨炭顆粒密度大小形狀沉降速度堆密度空隙率類型(g/mL)(微米)(cm/s士σ )(g/mL)5 >< 82.273000-5000變平面11.42 ±2.570.720.62510 ><282.36900-2500矩形和平面6.40 ± 1.560.690.6320 >< 602.38400-1300正方形到碎4.42 ±0.970.740.65_片形狀_圖9A顯示包括具有不同大小的目、沉降速度(cm/s)以及等效直徑(μ m)的骨炭 顆粒的三個非限制性實例的表。圖9B是使用終端沉降速度，在4%葡萄糖溶液中5X8型骨 炭的等效直徑的圖示。實施例10 骨炭顆粒的最小流化諫度使用壓力降的Ergon方程完成使骨炭顆粒流化所需的最小液體速度的估計?；?顆粒密度和實施例9中公開的等量球面直徑(equivalent spherical diameter)計算三種 類型骨炭顆粒的這種最小流化速度(Umf)。采取的液體性質(zhì)是4%葡萄糖水溶液在35°C的 性質(zhì)。對于每種顆粒類型，3種尺寸用于等效直徑，對應(yīng)于報道的平均沉降速度和各自平 均值的+/_ —個標(biāo)準(zhǔn)差(+/_ σ )(參見實施例9)。最小流化速度取決于流化之前的填充密度(空隙率，￡mf)。因為這是未知的仍是 未知的，因而對一定范圍的空隙率計算結(jié)果。對于球形顆粒，ε mf的常見值是在0. 35-0. 45 范圍內(nèi)。對于具有奇怪形狀和混合大小的顆粒，空隙率可能是顯著不同的。三種類型骨炭的結(jié)果呈現(xiàn)在圖10、11和12所示的表和圖中。圖10A、11A、12A是 顯示以5 X 8、10 X觀和20 X 60型骨炭在4 %葡萄糖溶液中的不同等效直徑，經(jīng)一定范圍的 空隙率分別計算出的最小流化速度(Umf)的表。圖10B、11B、12B是對不同等效直徑，經(jīng)一定 范圍的空隙率計算出的最小流化速度(Umf)的圖示。為了能夠流化每種類型骨炭中的較大顆粒(+1 σ大小)，采取的最小流化速度不 低于對應(yīng)于在0. 45的ε mf的每種類型中較大直徑的那些最小流化速度，如以下列出的骨炭類型最小流化諫度(cm/s)5X81.39410X280.37120X600.144由于奇怪形狀的顆粒、每種類型的大小是一定范圍和未知的填充密度，這些最小流化速度是具有某種程度不確定性的估計值。采用以上所列出的值作為設(shè)備能力的最小 值。以填充床模式的操作將在較低速度發(fā)生，并且以流化膨脹床模式的操作將在略高的速 度發(fā)生。另外，所述計算結(jié)果是對于清潔顆粒的；當(dāng)生物膜在顆粒上生長時，預(yù)期在有效直 徑上和在速度需求上將存在改變。對于這些不確定性，建立了安全系數(shù)，即超過這些速度的 某種能力。實施例11 流化的骨炭顆粒的床膨脹當(dāng)固體顆粒被向上流動的液體流化時，對于比最小流化速度大的液體速度，床膨 脹超過初始膨脹床的水平。使用Richardson&Zaki的模型(Richardson, J. F. ^P Zaki, W. N. 1954. Sedimentation and fluidization =Part I (沉積和流化第 I 部分)· Trans. Inst. Chem. Eng. 32 :35-53)禾口 Richardson&Khan 的相關(guān)性(Khan, A. R.禾口 Richardson, J. F. 1989.Fluid-particle interactions and flow characteristics of fluidized beds and settling suspensions of spherical particles (液體一顆粒相互作用禾口、流化床的、流 動特點以及球狀顆粒的沉降懸浮).Chem. Eng. Comm. 78 :111-130)，編寫程序來估計三種類 型骨炭顆粒(5X8、10X^* 20X60)的床膨脹水平。對于單尺寸顆粒形成了最初的相關(guān) 性，并因此包含某種程度的不確定性，因為每種類型骨炭具有一定范圍的顆粒大小。對于這 種分析，應(yīng)用該模型如同床包含直徑等于等效“平均”直徑的單尺寸顆粒。為了獲得對可能 的變化的一些估計，按照沉降速度對單尺寸顆粒重復(fù)計算等于+1σ “較大值”和-Io “較 小值”的直徑等效直徑(ym)骨炭類型 較大倌 平均倌較小倌5X8988763550
10X28 451341239 20X60 277215156
床膨脹不僅取決于顆粒大小和液體速度，而且取決于床直徑和最小流化的 空隙度(ε mf)。對于這個實施例，分析使用了 D床=IOcm的床直徑和ε mf = 0. 5的空隙率。結(jié)果呈現(xiàn)在圖13、圖14和圖15所示的表和圖中，并且是以膨脹床的總高度與填充 床高度之比(Η/Η_)的形式。圖13Α、14Α、15Α顯示用于計算床膨脹水平的參數(shù)。圖13Β、 14Β、15Β分別是骨炭類型5 X 8、10 X觀和20 X 60的床膨脹的圖示。在每種類型骨炭中的較 大和較小顆粒之間以這一比率擴展對于5X8型(圖1 是最大的，而對于20X60型是最 小的(圖15)。這暗示對于5X8骨炭在生物反應(yīng)器的膨脹區(qū)中保留較小顆粒更為困難，對 于10 X觀骨炭更容易，并且對于20 X 60骨炭最容易。對于能夠在膨脹床和流化床兩種模式下運轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器而言，期望在床膨脹區(qū) 中保留較小顆粒(圖19和圖20)，而仍然實現(xiàn)較大顆粒的流化。因此，對于每種類型的骨 炭，處在液體表觀速度的較小顆粒的膨脹床總高度與填充床高度之比(H/Ht_)只略大于較 大顆粒的最小流化速度。從計算的表和圖，這種狀況對于每種類型骨炭見于如下表觀速度 膨脹床的總高度與填充床(Umf cm/s) 高度之比Η/Η填充骨炭類型 對于較大顆 粒對于較小顆粒5X81.881.38
權(quán)利要求
1.一種用于在生物反應(yīng)器中制備產(chǎn)物的方法，所述方法包括i)培養(yǎng)微生物，其中所述微生物被適應(yīng)或誘變以表現(xiàn)出與對應(yīng)的非適應(yīng)或非誘變的微 生物的產(chǎn)物耐受性相比對所述產(chǎn)物至少150%的產(chǎn)物耐受性；和 )收獲所述產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述適應(yīng)的微生物或突變的微生物表現(xiàn)出對所述產(chǎn) 物至少200%的耐受性。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物包括單個物種。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)、紫色梭菌(Clostridium puniceum)、糖 丁 酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、1 腸球菌(Enterococcus faecium)、享鳥雞腸球菌(Enterococcus gallinarium)、金黃丁 酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、{[Μ 破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetanomorphum)或熱角軍 H 梭菌 (Clostridium thermosaccharoIyticum)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述適應(yīng)的微生物或突變的微生物是丙酮丁醇梭 菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述產(chǎn)物是丁醇。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表現(xiàn)出 對至少2%丁醇的耐受性。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物被固定在固體支持體上。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法還包括以下步驟通過使包含適應(yīng)的細(xì)胞或突 變的細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)基循環(huán)經(jīng)過所述生物反應(yīng)器來將所述適應(yīng)的微生物或突變的微生物 固定在所述固體支持體上。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述微生物表現(xiàn)出與在液體培養(yǎng)基中表現(xiàn)出的產(chǎn) 物耐受性相比在固體支持體上增強的產(chǎn)物耐受性。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述固體支持體是半固體或固體。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述固體支持體包括多孔材料。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述固體支持體包括選自由以下組成的組的材料 骨炭、合成聚合物、天然聚合物、無機材料或有機材料。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟包括使用串聯(lián)或平行排列的至少兩 個生物反應(yīng)器。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，所述方法還包括在所述至少兩個生物反應(yīng)器的至少一 個中使用懸浮培養(yǎng)。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，所述方法還包括在所述至少兩個生物反應(yīng)器的至少兩 個中使用固定的培養(yǎng)物。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述至少兩個生物反應(yīng)器的至少一個是連續(xù)培養(yǎng)。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟包括以分批培養(yǎng)、補料-分批培養(yǎng)或 連續(xù)培養(yǎng)來培養(yǎng)所述微生物。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟是在填充床生物反應(yīng)器或流化床生物反應(yīng)器中進行。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述流化床生物反應(yīng)器是膨脹床生物反應(yīng)器。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟是在適合于以填充床或流化床模式 操作的生物反應(yīng)器中進行。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述生物反應(yīng)器包括a)填充床區(qū)，所述填充床區(qū)適合于容納固體支持體；b)床膨脹區(qū)，所述床膨脹區(qū)與所述填充床區(qū)接合，當(dāng)以膨脹床模式操作所述生物反應(yīng) 器時，所述床膨脹區(qū)適合于容納所述固體支持體；和c)顆粒脫離區(qū)，所述顆粒脫離區(qū)與所述床膨脹區(qū)接合，所述顆粒脫離區(qū)適合于防止所 述固體支持體從所述生物反應(yīng)器中出去。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述生物反應(yīng)器還包括與所述填充床區(qū)接合的入 口分配區(qū)。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中柱還包括柱膨脹區(qū)。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述生物反應(yīng)器在入口分配區(qū)中具有的壓力降不 超過跨生物反應(yīng)器整個長度總壓力降的30%。
26.如權(quán)利要求22所述方法，其中所述顆粒脫離區(qū)的直徑比所述填充床區(qū)或所述膨脹 床區(qū)的直徑大。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述收獲步驟包括從所述培養(yǎng)物中連續(xù)提取所述產(chǎn)物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述連續(xù)提取是使用汽提氣、溶劑、吸收材料、全 蒸發(fā)膜或蒸餾進行的。
29.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟包括在提供至少6g/L/小時的丁醇生產(chǎn)率的條件下培養(yǎng)所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。
30.如權(quán)利要求7所述的方法，其中每天生產(chǎn)至少1000升的丁醇。
31.如權(quán)利要求7所述的方法，其中每天生產(chǎn)至少1500升的總?cè)軇?br> 32.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟包括培養(yǎng)至少7天。
33.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物包含異源基因。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述異源基因編碼產(chǎn)物生物合成途徑中的酶。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述酶選自由以下組成的組磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸 激酶、NAD依賴性β -羥丁酰輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶、乙 酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶、NADH依賴性丁醇脫氫酶B、NADH依賴性 丁醇脫氫酶Α、醛-醇脫氫酶、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、醛脫氫酶、丁酸乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移 酶A亞基、丁酸乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶B亞基和乙酰乙酸脫羧酶。
36.一種用于制備產(chǎn)物的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器包括a)與固體支持體接觸的生長培養(yǎng)基；b)固定在所述固體支持體上的微生物，其中所述微生物被適應(yīng)或誘變以表現(xiàn)出與對應(yīng) 的非適應(yīng)或非誘變微生物的產(chǎn)物耐受性相比對所述產(chǎn)物至少150%的產(chǎn)物耐受性。
37.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述適應(yīng)的微生物或突變的微生物表現(xiàn)出對所述 產(chǎn)物至少200%的耐受性。
38.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述微生物包括以下屬梭菌屬、腸球菌屬、克雷 伯氏菌屬、乳桿菌屬或芽孢桿菌屬。
39.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述適應(yīng)的微生物或突變的微生物是丙酮丁醇梭 菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。
40.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述產(chǎn)物是丁醇。
41.如權(quán)利要求39所述的系統(tǒng)，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表現(xiàn) 出對至少2%丁醇的耐受性。
42.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述微生物包含異源基因。
43.如權(quán)利要求42所述的系統(tǒng)，其中所述異源基因編碼產(chǎn)物生物合成途徑中的酶。
44.如權(quán)利要求43所述的系統(tǒng)，其中所述酶選自由以下組成的組磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸 激酶、NAD依賴性β -羥丁酰輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶、乙 酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶、NADH依賴性丁醇脫氫酶B、NADH依賴性 丁醇脫氫酶Α、醛-醇脫氫酶、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、醛脫氫酶、丁酸乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移 酶A亞基、丁酸乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶B亞基和乙酰乙酸脫羧酶。
45.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括用于將所述微生物保持在連續(xù)培養(yǎng)中的直ο
46.如權(quán)利要求45所述的系統(tǒng)，其中發(fā)酵工藝是連續(xù)培養(yǎng)，還包括在產(chǎn)物純化過程中 回收的發(fā)酵培養(yǎng)液的養(yǎng)分和礦物質(zhì)的再循環(huán)和再利用。
47.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述微生物表現(xiàn)出與在液體培養(yǎng)基中表現(xiàn)出的產(chǎn) 物耐受性相比在固體支持體上增強的產(chǎn)物耐受性。
48.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述固體支持體包括多孔材料。
49.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述固體支持體包括選自由以下組成的組的材 料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、無機材料或有機材料。
50.如權(quán)利要求39所述的系統(tǒng)，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌被培 養(yǎng)在提供至少6g/L/小時的丁醇生產(chǎn)率的條件下。
51.如權(quán)利要求39所述的系統(tǒng)，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌被培 養(yǎng)在提供至少10g/L/小時的總?cè)軇┥a(chǎn)率的條件下。
52.如權(quán)利要求40所述的系統(tǒng)，其中每天生產(chǎn)至少1000升的丁醇。
53.如權(quán)利要求40所述的系統(tǒng)，其中每天生產(chǎn)至少1500升的總?cè)軇?br> 54.一種生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器包括a)填充床區(qū)，所述填充床區(qū)適合于容納固體支持體；b)床膨脹區(qū)，所述床膨脹區(qū)與所述填充床區(qū)接合，當(dāng)以膨脹床模式操作所述生物反應(yīng) 器時，所述床膨脹區(qū)適合于容納所述固體支持體；和c)顆粒脫離區(qū)，所述顆粒脫離區(qū)與所述床膨脹區(qū)接合，所述顆粒脫離區(qū)適合于防止所 述固體支持體從所述生物反應(yīng)器中出去。
55.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，其中所述填充床區(qū)與所述床膨脹區(qū)的結(jié)合高度 (H)與所述填充床區(qū)的高度(Hp)之比大于1.01。
56.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器還包括適合于安放在所述床 膨脹區(qū)和所述顆粒脫離區(qū)之間的柱膨脹區(qū)，其中所述柱膨脹區(qū)的上游端與所述床膨脹區(qū)接合，并且所述柱膨脹區(qū)的下游端與所述顆粒脫離區(qū)接合。
57.如權(quán)利要求56所述的生物反應(yīng)器，其中所述柱膨脹區(qū)包括距水平線向上傾斜至少 10°的傾斜角度。
58.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器還包括與所述顆粒脫離區(qū)接合 的氣體-液體分離區(qū)。
59.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器被設(shè)置成以填充床模式或以膨 脹床模式操作。
60.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器還被設(shè)置成在填充床模式和膨 脹床模式的操作之間交替。
61.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器能夠連續(xù)發(fā)酵至少100小時。
62.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體是半固體或固體。
63.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體包括多孔材料。
64.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體包括至少50m2/g的表面積。
65.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體包括至少0.3g/cm3的堆密度。
66.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體包括至少60的球盤硬度數(shù)。
67.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體包括至少20MaP的屈服強度。
68.如權(quán)利要求M所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體包括選自由以下組成的組 的材料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、無機材料或有機材料。
69.一種用于在固體支持體上發(fā)酵生物學(xué)產(chǎn)物的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器包括a)填充床區(qū)，包括其中的固體支持體，所述固體支持體包含其上用于發(fā)酵所述生物學(xué) 產(chǎn)物的微生物；b)床膨脹區(qū)，所述床膨脹區(qū)與所述填充床區(qū)接合，當(dāng)以膨脹床模式操作所述生物反應(yīng) 器時，所述床膨脹區(qū)適合于包含所述固體支持體；和c)顆粒脫離區(qū)，所述顆粒脫離區(qū)與所述床膨脹區(qū)接合，所述顆粒脫離區(qū)適合于防止所 述固體支持體從所述生物反應(yīng)器中出去。
70.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，其中所述填充床區(qū)與所述床膨脹區(qū)的結(jié)合高度 (H)與所述填充床區(qū)的高度(Hp)之比大于1.01。
71.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器還包括適合于安放在所述床 膨脹區(qū)和所述顆粒脫離區(qū)之間的柱膨脹區(qū)，其中所述柱膨脹區(qū)的上游端與所述床膨脹區(qū)接 合，并且所述柱膨脹區(qū)的下游端與所述顆粒脫離區(qū)接合。
72.如權(quán)利要求71所述的生物反應(yīng)器，其中所述柱膨脹區(qū)包括距水平線向上傾斜至少 10°的傾斜角度。
73.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器還包括與所述顆粒脫離區(qū)接合 的氣體-液體分離區(qū)。
74.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器被設(shè)置成以填充床模式或以膨脹床模式操作。
75.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器還被設(shè)置成在填充床模式和膨 脹床模式的操作之間交替。
76.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器能夠連續(xù)發(fā)酵至少100小時。
77.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，其中所述微生物包括以下屬梭菌屬、腸球菌 屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬或芽孢桿菌屬。
78.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，其中所述微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌 或糖丁酸梭菌。
79.如權(quán)利要求78所述的生物反應(yīng)器，其中所述產(chǎn)物是丁醇。
80.如權(quán)利要求78所述的生物反應(yīng)器，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭 菌表現(xiàn)出對至少2%丁醇的耐受性。
81.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器還包括以下步驟通過使包含 所述微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基循環(huán)經(jīng)過所述生物反應(yīng)器來將所述微生物固定在所述固體支持 體上。
82.如權(quán)利要求81所述的生物反應(yīng)器，其中所述循環(huán)的發(fā)酵培養(yǎng)基包含固定在顆粒上 的微生物。
83.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體是半固體或固體。
84.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體包括多孔材料。
85.如權(quán)利要求69所述的生物反應(yīng)器，其中所述固體支持體包括選自由以下組成的組 的材料骨炭、合成聚合物、天然聚合物、無機材料或有機材料。
86.一種用于制備生物學(xué)產(chǎn)物的方法，所述方法包括a)將微生物培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中，所述生物反應(yīng)器包括i)填充床區(qū)，包括其中的固體支持體，所述固體支持體包括其上用于發(fā)酵所述生物學(xué) 產(chǎn)物的微生物； )床膨脹區(qū)，所述床膨脹區(qū)與所述填充床區(qū)接合，當(dāng)以膨脹床模式操縱所述生物反應(yīng) 器時，所述床膨脹區(qū)適合于包含所述固體支持體；知iii)顆粒脫離區(qū)，所述顆粒脫離區(qū)與所述床膨脹區(qū)接合，所述顆粒脫離區(qū)適合于防止 所述固體支持體從所述生物反應(yīng)器中出去；以及b)收獲所述產(chǎn)物。
全文摘要
提供了用于適應(yīng)或選擇具有提高的產(chǎn)物耐受性的微生物的方法。另外，公開了能夠以填充床或流化床操作的生物反應(yīng)器，以及使用該生物反應(yīng)器培養(yǎng)被適應(yīng)或選擇增加的產(chǎn)物耐受性的微生物的方法。
文檔編號C12M3/04GK102057046SQ200980121678
公開日2011年5月11日 申請日期2009年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月9日
發(fā)明者P·R·康塔格, 亨德里克斯·J·米爾曼, 伊恩·馬多克斯, 戴維·C·沃爾瑟, 斯泰西·M·伯恩斯-蓋蒂施, 約翰·C·陳, 阿爾文·W·尼諾 申請人:鈷技術(shù)有限公司