專利名稱：使用多種多核苷酸的產(chǎn)品標記方法、所述標記的鑒定方法以及標記產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)品標記方法、所述標記的鑒定方法和通過本發(fā)明方法標記的產(chǎn)品。 本發(fā)明中所用的標記基于單鏈核酸。本發(fā)明使得可以區(qū)分真品和偽造品。本發(fā)明特別使得可以對真品進行標記，從而 能夠?qū)ζ溥M行跟蹤和鑒定。物品、特別是高附加值產(chǎn)品或高端產(chǎn)品的偽造或非法復制，不僅給公司造成嚴重 的經(jīng)濟損失，還對就業(yè)、食品安全甚至是社會生活造成嚴重的經(jīng)濟損失。這就是制造商通過 為其產(chǎn)品開發(fā)新型標記和認證技術(shù)來跟蹤和銷毀偽造產(chǎn)品而努力抗擊該禍害的原因。方括號之間的參照符號([X])是指實施例末尾處的參考文獻列表。
背景技術(shù)：
通常用于檢測和鑒定真品的方法之一是通過向該產(chǎn)品引入可被單方面鑒定的化 學物質(zhì)或化合物來對所述產(chǎn)品進行“整批(bulk) ”標記。這種類型的標記必須具有特定的性質(zhì)該標記必須以對于產(chǎn)品終端用戶透明的方 式進行，不應(yīng)該改變該產(chǎn)品的物理-化學性質(zhì)并且不應(yīng)該對產(chǎn)品終端用戶有害。在實踐中， 所述標記還應(yīng)該無法被檢測和/或不能被偽造，從而使得其自身不會與產(chǎn)品同時被偽造?，F(xiàn)在，特別是對于非常大量的諸如香精、美容用乳霜等已知對標記物要求苛刻的 化學物質(zhì)或?qū)τ谥T如皮革、織物等材料而言尚無可靠的技術(shù)是經(jīng)久穩(wěn)定的。如今不存在對 于偽造者造成確實的解密難度的標記技術(shù)。因此，確實需要可以克服現(xiàn)有技術(shù)的這些缺陷、缺點和障礙的標記和標記方法，并 且這使得可以有效地抗擊偽造產(chǎn)品、特別是偽造的高端產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
具體而言，本發(fā)明的目的在于提出滿足上述需求并且解決現(xiàn)有技術(shù)問題的標記方案。本發(fā)明特別涉及一種產(chǎn)品標記方法，所述方法包括將多種單鏈多核苷酸添加在所 述產(chǎn)品上或在所述產(chǎn)品中的步驟，所述多種多核苷酸包括-至少一種包含具有預定長度和序列的單鏈多核苷酸的靶多核苷酸，和-具有相同或不同預定長度和相同或不同預定序列的誘騙多核苷酸(decoy polynucleotide)，所述誘騙多核苷酸的長度與所述至少一種靶多核苷酸相同或不同，且所 述誘騙多核苷酸的序列與所述至少一種靶多核苷酸的序列不同，其中所述靶多核苷酸和誘騙多核苷酸的每一種都不與所述多種多核苷酸中的任 何其它多核苷酸雜交。在本發(fā)明方法的一個特定實施方式中，所述多種多核苷酸還包含至少一種識別多 核苷酸，所述識別多核苷酸由具有預定長度和序列的單鏈多核苷酸組成且用于鑒定所述至少一種靶多核苷酸的性質(zhì)和序列，其中所述識別多核苷酸中的每一種都不與所述多種多核 苷酸中的任何其它多核苷酸雜交。針對如上述所定義的本發(fā)明方法，以及針對本發(fā)明方法的具體實施方式
，應(yīng)考慮 以下具體說明。因此，本發(fā)明的標記由如本說明書中所定義的所述多種多核苷酸組成。這些多核 苷酸是單鏈多核苷酸。在本說明書中，所述多種多核苷酸還稱為“標記物(marker)”。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法能夠獲得的標記產(chǎn)品，和涉及用于檢測該產(chǎn)品的標 記的方法。具體而言，本發(fā)明涉及確定用于實施本發(fā)明方法的標記物、這些標記物的制造、產(chǎn) 品的標記以及用于檢測標記產(chǎn)品中的標記物的技術(shù)。本發(fā)明使得可以區(qū)分偽造品和真品， 甚至可以鑒定分銷渠道的濫用和未被授權(quán)的平行渠道。所述多種多核苷酸中的多核苷酸可以具有幾種類型它們可以是核糖核苷酸聚合 物或單鏈核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核苷酸或單鏈脫氧核酸核酸(DNA)或這些的組合。本發(fā)明中，“多種多核苷酸”是指靶多核苷酸、誘騙多核苷酸以及必要時的識別多 核苷酸的組。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明，使用幾種靶多核苷酸、幾種誘騙多核苷酸、以及必要時 的幾種識別多核苷酸。例如但不限于，可以使用1 100種靶多核苷酸，例如1 50種，例 如5 50種。此外，例如但不限于，可以使用2 100種誘騙多核苷酸，例如2 50種。例 如但不限于，必要時，可以使用1 100種識別多核苷酸，例如1 50種。多核苷酸數(shù)量的 選擇取決于根據(jù)本發(fā)明所需要的標記復雜性。本發(fā)明中，“靶多核苷酸”是指其序列已經(jīng)確定并且構(gòu)造成組成參考序列的多核苷 酸，所述靶多核苷酸用于標記本發(fā)明的產(chǎn)品，然后在該產(chǎn)品對其進行特異性搜索，從而認證 該產(chǎn)品。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明，所述標記物包含幾種相同或不同的靶多核苷酸、優(yōu)選不同 的靶多核苷酸。所述靶多核苷酸可參考確立靶多核苷酸與標記產(chǎn)品之間關(guān)聯(lián)的機密靶/產(chǎn) 品數(shù)據(jù)庫?！皺C密數(shù)據(jù)庫”是指對于給定產(chǎn)品僅本發(fā)明的標記制造者和/或僅所述產(chǎn)品的制造 者/創(chuàng)造者能訪問(下文中將所述標記制造者和/或所述產(chǎn)品制造者/創(chuàng)造者稱為“本發(fā) 明的實施人員”)的數(shù)據(jù)庫。這是對各產(chǎn)品或產(chǎn)品家族分配根據(jù)本發(fā)明確定的特定識別特 征(signature)的對應(yīng)基礎(chǔ)。在僅使用靶多核苷酸和誘騙多核苷酸作為產(chǎn)品的識別特征的情況下，可以將所述 數(shù)據(jù)或?qū)?yīng)基礎(chǔ)稱為“靶/產(chǎn)品機密基礎(chǔ)”或“靶/產(chǎn)品基礎(chǔ)”。因此，如果我們希望對本發(fā) 明的產(chǎn)品進行認證，首先必須在該靶/產(chǎn)品基礎(chǔ)中對分配給所述產(chǎn)品的靶序列進行搜索， 然后例如通過利用下述方法之一進行搜索來查明所述靶序列是否實際上存在于所述產(chǎn)品 中。如果所述靶序列實際上存在，即可斷定所述產(chǎn)品是真品。然而，如果所述靶序列實際上 不存在，即可斷定所述產(chǎn)品是偽造品。當然，只有根據(jù)本發(fā)明對所有真品進行標記，這才有 效。所述對應(yīng)基礎(chǔ)可以由本發(fā)明的識別特征的制造者和/或由制造者/創(chuàng)造者基于本發(fā)明 的識別特征列表來構(gòu)建，例如通過使得每個識別特征對應(yīng)于確定的產(chǎn)品來構(gòu)建。在這種情 況下，所述認證是直接的。本發(fā)明中，“誘騙多核苷酸”是指其序列已經(jīng)選定和被構(gòu)建為不同于靶序列的多核 苷酸。所述誘騙序列用于與本發(fā)明的標記混雜但并非用于在產(chǎn)品中被搜索，以便認證該產(chǎn)品。誘騙序列用于使試圖復制本發(fā)明識別特征的偽造者的工作復雜化。事實上，靶序列僅 為本發(fā)明的實施人員所已知。根據(jù)本發(fā)明，如果存在誘騙序列、靶序列和誘騙序列是單鏈的 短序列并且不會相互雜交，為了進行復制而在靶序列和誘騙序列的混合物中進行一種或幾 種具體序列之間的區(qū)分(在本情形中為了復制靶序列而對靶序列的區(qū)分)變得更困難(如 果不是不可能的話)。誘騙物越多，對實體中的識別特征的復制越困難，并且在統(tǒng)計學上，隨 機確定靶多核苷酸的序列的機會越低。這些誘騙多核苷酸的序列也是本發(fā)明的實施人員所 已知的，然而，這些多核苷酸不在待分配給產(chǎn)品的數(shù)據(jù)庫中。 本發(fā)明中，“識別多核苷酸”是指具有預定序列和長度的使得能夠進行靶多核苷酸 鑒定的多核苷酸。識別多核苷酸具有便于快速檢索和鑒定的性質(zhì)或以便于快速檢索和鑒 定的濃度存在，其充當?shù)谝徽J證測試其缺失是偽造品的第一標志。識別多核苷酸是一種 或幾種其序列已經(jīng)選定和被構(gòu)建來組成代碼的多核苷酸，所述代碼用在用于鑒定靶多核苷 酸的機密數(shù)據(jù)庫或“靶鑒定基礎(chǔ)”中，所述“靶鑒定基礎(chǔ)”用于給出關(guān)于靶多核苷酸的數(shù)量、 性質(zhì)、序列和長度方面的信息。當存在幾種識別多核苷酸時，可以稱為“識別多核苷酸組”。 在該情況下，在各識別多核苷酸或識別多核苷酸組的靶鑒定基礎(chǔ)中，分配了根據(jù)本發(fā)明確 定的靶多核苷酸或靶多核苷酸組。識別多核苷酸的序列僅為本發(fā)明實施人員所已知。本發(fā) 明的識別特征中識別多核苷酸的存在是可選的，其對應(yīng)于本發(fā)明方法的具體實施方式
。如 果產(chǎn)品的本發(fā)明的識別特征中使用一種或幾種識別多核苷酸，則由本發(fā)明的實施人員創(chuàng)建 用于鑒定所述靶的機密基礎(chǔ)。該基礎(chǔ)使得可以基于所述識別多核苷酸鑒定待認證產(chǎn)品中存 在的靶多核苷酸。在該情況下，產(chǎn)品的認證是間接的。事實上，如果希望認證據(jù)假定具有本 發(fā)明識別特征的產(chǎn)品，則根據(jù)下述本發(fā)明的方法之一鑒定識別多核苷酸，接著在靶鑒定數(shù) 據(jù)庫中搜索分配給所述產(chǎn)品的靶序列，然后例如通過使用下述方法之一搜索所述靶序列是 否實際上存在于所述產(chǎn)品中。如果所述靶序列確實存在，即可斷定所述產(chǎn)品是真品。然而， 如果所述靶序列不存在，即可斷定所述產(chǎn)品是偽造品。應(yīng)該注意的是，在本發(fā)明的該實施方 式中，在對產(chǎn)品進行認證之前存在兩個鑒定多核苷酸的步驟，這使得可能的偽造者的任務(wù) 更復雜。當然，只有在根據(jù)本發(fā)明對真品進行標記的情況下這才有效。根據(jù)本發(fā)明，識別多 核苷酸的序列可以含有攜帶代碼的子序列，所述代碼使本發(fā)明的用戶能夠基于靶識別基礎(chǔ) 發(fā)現(xiàn)哪些是靶多核苷酸，哪些是誘騙多核苷酸。因此，在產(chǎn)品的認證過程中，從待認證產(chǎn)品 中提取這些識別多核苷酸，或在所述產(chǎn)品中或所述產(chǎn)品上對其進行直接鑒定。一旦檢測到 識別多核苷酸的性質(zhì)(例如但不限于，可以通過閱讀識別多核苷酸的序列、或通過鑒定在 多個假定的編碼多核苷酸中存在的識別多核苷酸的陣列來實現(xiàn)靶多核苷酸的鑒定)，則本 發(fā)明的用戶可參考相應(yīng)的表格(靶多核苷酸識別基礎(chǔ))，并在其中讀取理論上存在于待認 證產(chǎn)品中的靶多核苷酸的性質(zhì)。所述表格可以例如但不限于儲存于安全的計算機數(shù)據(jù)庫中 (使得能夠確保機密性)，該數(shù)據(jù)庫在產(chǎn)品進行標記期間創(chuàng)建，并且其中成對出現(xiàn)“讀取的 識別多核苷酸的代碼”-“代搜索的靶多核苷酸”。因此，在回頭參考所述表格后，本發(fā)明的 用戶可以推斷出應(yīng)該存在于待認證產(chǎn)品中的靶標記物的確切性質(zhì)。因此，對所述靶多核苷 酸進行提取，然后鑒定。如果檢測出的靶多核苷酸與在表中讀取的理論代碼確切相符，則該 產(chǎn)品可能為真品。如果存在其它靶多核苷酸，本發(fā)明的用戶可以懷疑是標記產(chǎn)品的混合物。 如果檢測出的靶多核苷酸完全不同于期望的多核苷酸，則其可能是偽造品。如果在本發(fā)明 的識別特征中不使用識別多核苷酸，則僅靶/產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫是有用的。
本發(fā)明中，可以例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如使用執(zhí)行例如下文提 出的算法的軟件來設(shè)計所述多種多核苷酸的多核苷酸，以使得對于選自組成所述標記的多 種多核苷酸中的給定多核苷酸而言，所述多種多核苷酸中的其它多核苷酸或者任何這些多 核苷酸的反向互補多核苷酸都不是由與該給定多核苷酸互補的多核苷酸的序列構(gòu)成的。因 此，包括在產(chǎn)品的溫度和分子調(diào)節(jié)環(huán)境下、以及在該溫度和所述多核苷酸分子開發(fā)環(huán)境下， 本發(fā)明識別特征的多核苷酸之間不會形成雙鏈復合體、例如核酸雙鏈體(諸如DNA雙螺 旋)，也不會形成任何雜交?！半p鏈復合體的形成”是指包括在上述條件下熱力學穩(wěn)定的互補核苷酸的配對。給定多核苷酸的“反向互補多核苷酸”是指存在的或理論上的新型多核苷酸，其中 給定多核苷酸的各核苷酸被能夠與該核苷酸配對的互補核苷酸替換，例如在脫氧核糖核酸 多核苷酸的情形中，腺嘌呤替換胸腺嘧啶、胸腺嘧啶替換腺嘌呤、胞嘧啶替換鳥嘌呤、或鳥 嘌呤替換胞嘧啶?！半s交”是指兩個互補的單鏈多核苷酸通過非共價鍵而結(jié)合。該雜交可以是完全 的，即序列全部互補，或不完全的，即序列不全部互補、但是互補至足以使相互雜交并且形 成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，“非雜交”是指由于兩個單鏈多核苷酸不互補和/或互補性不足以形成 雙鏈，因而兩個單鏈多核苷酸未通過非共價鍵結(jié)合。值得注意的是，并非將待引入所關(guān)注產(chǎn)品或物質(zhì)中的本發(fā)明的標記物的多種多核 苷酸都分配到用于直接或間接認證產(chǎn)品的數(shù)據(jù)庫。因此，可以僅使用受限數(shù)量的靶多核苷 酸，這些靶多核苷酸為產(chǎn)品認證過程中要尋找的多核苷酸，并且將它們同時與大量誘騙物 以及必要時與識別多核苷酸一起引入產(chǎn)品中，所述誘騙物和識別多核苷酸的序列不與所述 靶多核苷酸的序列對應(yīng)。因此，靶多核苷酸可以“淹沒^￡大量誘騙多核苷酸中，在以復制所 述識別特征為目的的惡意試圖解碼靶多核苷酸的情況下，這會使問題變得格外困惑。另外， 根據(jù)其中使用識別多核苷酸的本發(fā)明的具體實施方式
，僅對識別多核苷酸所攜帶的編碼的 閱讀和解密可以斷定在靶多核苷酸和誘騙多核苷酸的組合中哪些實際上對應(yīng)于靶序列，并 且通過排除斷定哪些僅是旨在誤導偽造者的誘騙物?？梢岳米鳛槊撗鹾颂呛怂岷?或核糖核酸的標記物實現(xiàn)本發(fā)明的標記方法。因 此所述多種多核苷酸的多核苷酸可以是單鏈脫氧核糖核酸序列或單鏈核糖核酸序列，或脫 氧核糖核酸序列和核糖核酸序列的組合。因此本發(fā)明的標記物可由稱為“天然堿基”的普 通堿基組成，例如，在DNA中存在的堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶；或在RNA中存 在的堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶(參見例如Molecular Cloning,Maniatis, Cold Spring-Harbor，第二版，第C3 C14頁[1])。本發(fā)明的標記物還可以包含出現(xiàn)頻率較低的 稱為“修飾堿基”的天然或合成化合物，例如由對前述堿基進行諸如脫氨基等修飾而產(chǎn)生的 二氫尿苷(DHU)、肌苷或假尿嘧啶。含氮堿基可由原子質(zhì)量不同的天然同位素和/或穩(wěn)定同 位素構(gòu)成，和/或?qū)ζ溥M行修飾從而在雜交過程期間建立許多與正常氫鍵不同的氫鍵。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，脫氧核糖核酸的序列可以在其序列內(nèi)包含相同比例 的四種天然或修飾的堿基A、C、G和T。根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方式
，核糖核酸的序列 可以在其序列內(nèi)含有相同比例的四種天然或修飾的堿基A、C、G和U。根據(jù)本發(fā)明的另一具 體實施方式(包括前述兩個實施方式或不是兩個之前的實施方式)，包含所述標記的多核苷酸組具有相同數(shù)量的核苷酸和相同的分子量。有利的是，本發(fā)明的該具體實施方式
能夠 使得可能的偽造者對所述聚合物的分離和鑒定更加困難(如果不是不可能的話)。例如， 不可能對上述后面的實施方式、特別是最后一個實施方式的識別特征進行如下的分離和鑒 定所述分離和鑒定借助于電泳(例如在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺上進行的電泳)和/或 質(zhì)譜法等技術(shù)根據(jù)分子尺寸和/或分子量進行。例如，在本發(fā)明的標記中，20個核苷酸的單鏈多核苷酸(或寡聚物)(每個核苷酸 選自4種可能的堿基)能夠?qū)崿F(xiàn)42°種不同的序列，即約1. 1 X IO12種組合，這是1萬億種組 合。因此，根據(jù)本發(fā)明，隨機地從本發(fā)明標記中尺寸為20個核苷酸的多種多核苷酸中提取 出靶標記物、并且該標記物是已經(jīng)分配給靶/產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫中的產(chǎn)品的標記物的可能性幾乎 等于零。另外，本發(fā)明的標記由具有預定長度和序列的幾種靶分子、幾種誘騙物和必要時的 幾種識別多核苷酸組成，這同時確保了標記的極高安全性和顯著的不可侵犯性。因此，所用的多核苷酸由于其性質(zhì)而可包含例如4種含氮堿基的定向組合，所述 組合的性質(zhì)由本發(fā)明的實施人員限定。可以根據(jù)需要(編碼復雜性、標記物攜帶的信息類 型)和這些標記物展現(xiàn)的物理化學性質(zhì)(雜交性、分子量、片段尺寸、含氮堿基的組成)以 計算機化方式來計算所述組合，該組合是本發(fā)明標記物的每種多核苷酸的特異性的來源， 并且該組合可以攜帶與標記產(chǎn)品有關(guān)的信息。根據(jù)待標記產(chǎn)品和所考慮的標記的檢測技術(shù)，可以使用一種或幾種靶多核苷酸。 因此，本發(fā)明允許相當大數(shù)量的識別特征或標記變化形式/替代形式。借助于非限制性實 例，可以列舉第一組靶核苷酸的以下不同形式-一種或幾種大尺寸的單鏈靶多核苷酸，所述大尺寸即包含例如約500 5000個
核苷酸或堿基；-一種或幾種小尺寸的單鏈靶多核苷酸，所述小尺寸即包含例如約5 200個核苷 酸或堿基，例如5 50個核苷酸或堿基；-一種或幾種平均尺寸的單鏈靶多核苷酸，所述平均尺寸即包含例如約201 499 個核苷酸或堿基；-一種或幾種具有恒定末端序列和可變末端序列的單鏈靶多核苷酸，-一種或幾種在大尺寸多核苷酸中插入(或在其中確定)的單鏈靶多核苷酸，因此 這些插入的靶多核苷酸形成多核苷酸的較大部分，-一種或幾種單鏈環(huán)狀多核苷酸，或-這些不同形式的組合。根據(jù)本發(fā)明，可以使用至少兩種靶多核苷酸，一種是環(huán)狀多核苷酸，另一種是直鏈 多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實施人員選定的標記復雜性，可以使用多個靶環(huán)狀多核苷酸或直 鏈多核苷酸、或其混合物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，當某些或一組單鏈多核苷酸是直鏈時，它們可包含 在不同多核苷酸之間為可變的可變末端和在不同多核苷酸之間為恒定的恒定末端?！昂愣?末端”是指包括多核苷酸序列的兩個末端之一并展示出預定和恒定的序列的所述多核苷酸 序列的一部分，也就是說對于本發(fā)明標記物的部分靶序列或所有靶序列是相同的。“可變末 端”是指包括多核苷酸序列的兩個末端的另一個并且展示預定序列的所述多核苷酸序列的 部分，所述預定序列在本發(fā)明標記物中的不同靶序列之間是可變的。這提出了所述靶多核苷酸的一個特定優(yōu)點。事實上，如下文所述，為了以鑒定真品為目的而檢測和解密所述標 記，對于微DNA陣列而言可以使用解密用固相基質(zhì)，所述基質(zhì)上固定有與靶多核苷酸的可 變末端互補的多核苷酸。所述恒定末端自身可用于例如借助于生物素/鏈親和素來突顯靶 多核苷酸在固相基質(zhì)上的雜交。該檢測模式描述于下文。靶多核苷酸的數(shù)量和性質(zhì)以及其尺寸使得可以限定標記復雜性，并以組合方式限 定可能的組合的數(shù)量?？赡艿慕M合的數(shù)量隨著這些多核苷酸的尺寸以指數(shù)方式增加。通過 選擇由所有尺寸相同的多核苷酸中的一種或幾種多核苷酸組成的識別特征，可以設(shè)想大量 組合。在所有可能的組合中隨機復制識別特征的可能性幾乎是零。根據(jù)本發(fā)明，標記信息可以存在于-靶多核苷酸序列，各靶多核苷酸序列在靶/產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫中分配給產(chǎn)品；和 / 或-在靶多核苷酸序列的一種或幾種組合中，所述組合在靶/產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫中分配給產(chǎn)品。因此，可以使用幾種具有預定序列的靶多核苷酸。還可以例如選擇20種都具有不 同預定序列的多核苷酸的群或“庫”，并且針對每種產(chǎn)品選擇這些20種序列中的例如10種 序列的組合來標記一組給定產(chǎn)品。向這些靶序列添加誘騙多核苷酸序列從而構(gòu)成本發(fā)明的標記物。根據(jù)本發(fā)明，誘 騙多核苷酸不與靶多核苷酸雜交，并且它們的作用在于使得為復制本發(fā)明的標記而對其進 行的解密對于偽造者而言更加困難。如同上文對于靶多核苷酸所指出，這些誘騙多核苷酸 可以處于直鏈或環(huán)狀形式，或環(huán)狀多核苷酸與直鏈多核苷酸的混合物。添加到所述標記物 的誘騙多核苷酸的數(shù)量取決于所需的干擾性。優(yōu)選的是，該數(shù)量高于靶多核苷酸的數(shù)量。實 例如上文所給出。所述誘騙多核苷酸具有彼此相同或不同的長度，優(yōu)選的是具有與在本發(fā) 明的標記物中存在的靶序列相同的長度，例如如上文對于靶多核苷酸所指出，長度為15 5000個堿基，例如15 200個堿基、例如20 200個堿基、例如201 499個堿基、例如 500 5000個堿基，或這些長度的混合物?？梢韵蜻@些靶序列和誘騙序列添加識別多核苷酸，從而使得能夠如上所述借助于 數(shù)據(jù)庫來區(qū)分靶多核苷酸和誘騙多核苷酸。識別多核苷酸的數(shù)量具體取決于所需標記的 復雜性。識別多核苷酸可以是環(huán)狀或直鏈的。它們可以具有彼此相同或不同的長度，或具 有與靶多核苷酸和誘騙多核苷酸的長度相同或不同的長度，如同上文對于靶多核苷酸所指 出，長度可以為5 5000個堿基，例如15 200個堿基、例如20 200個堿基、例如201 499個堿基、例如500 5000個堿基，或這些長度的混合物。因此，在本發(fā)明的標記中，多種多核苷酸中的所述多核苷酸可以是環(huán)狀的、直鏈的 或環(huán)狀多核苷酸與直鏈多核苷酸的混合物，例如具有游離3’ OH末端和游離磷酸5’末端。 優(yōu)選的是，本發(fā)明的標記的多核苷酸的長度是5 5000個核苷酸，例如5 100個核苷酸， 例如5 50個核苷酸，例如20 50個核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，多種多核苷酸中的所述多核苷酸是單鏈多核苷酸。事實上，本發(fā)明的 特點之一在于使用能夠使得解密本發(fā)明的標記更困難的單鏈。因此，本發(fā)明的標記方法能夠制造極為大量的標記物。各標記物包含由靶多核苷 酸和必要時的識別多核苷酸組成的編碼。
本發(fā)明標記物的多核苷酸的序列可以根據(jù)經(jīng)驗創(chuàng)建，或優(yōu)選的是，特別是為快速 起見，通過為此目的而能夠生成的合適軟件創(chuàng)建。在后一種情況下，其為本發(fā)明標記物的計 算機設(shè)計或“電子設(shè)計(Design In Silico) ”。為了確定本發(fā)明標記物的靶多核苷酸和誘騙多核苷酸以及必要時的識別多核苷 酸的序列，可以利用以下算法-(0)創(chuàng)建組E，所述組E含有由所述標記產(chǎn)生的多核苷酸組。-(1)隨機產(chǎn)生第一多核苷酸P，其中所述第一多核苷酸的尺寸和多核苷酸數(shù)量可 以由用戶定義，P不屬于E。-⑵根據(jù)Smith和Waterman[2]的算法計算以下多核苷酸之間的雜交評分一方 面由兩個多核苷酸P的鏈接(concatenation)產(chǎn)生的多核苷酸，另一方面由選自多核苷酸 組E中的兩個多核苷酸及其反向互補物的鏈接產(chǎn)生的各多核苷酸。-(3)如果一組評分未超過用戶給定的閾值，在E中添加ρ。返回步驟(1)，條件是 E并非所需尺寸。這些閾值是最小比對評分，在該評分之上的兩個序列被認為具有足以相互 雜交的同一性。一旦確定靶多核苷酸和誘騙多核苷酸的序列，可以通過技術(shù)人員已知的任何現(xiàn)有 方法制造這些靶多核苷酸和誘騙多核苷酸。根據(jù)所制造多核苷酸的性質(zhì)和根據(jù)所選標記， 可以使用一種或幾種策略合成具有例如5個堿基 5000個堿基的可變尺寸的環(huán)狀和/或 直鏈的單鏈核糖核酸和/或脫氧核糖核酸。借助于實施本發(fā)明的可用策略的實例，可以引 用能夠合成環(huán)狀單鏈多核苷酸的策略[3]或多核苷酸的電子合成策略W]。當識別多核苷酸序列為標記所需時，其各自的序列可以根據(jù)經(jīng)驗確定，或通過如 前所述的算法確定，以使得識別多核苷酸既相互之間不雜交，又不與靶多核苷酸或誘騙多 核苷酸雜交。根據(jù)所需標記的復雜性，可以以各種方式來實現(xiàn)使用核糖核酸或脫氧核糖核酸標 記物根據(jù)本發(fā)明方法對溶液或化合物進行標記。每種靶多核苷酸攜帶其序列固有的具體信 息?？梢砸元毺胤绞绞褂妹糠N靶多核苷酸或靶多核苷酸的組合。第一種可能的編碼水平可以是使用一種或多種靶多核苷酸的水平。因此可以通過 一種或幾種具有規(guī)定尺寸和預定序列的但彼此不同的多核苷酸跟蹤幾批標記產(chǎn)品。第二種可能的編碼水平是使用在靶多核苷酸的初始庫中選擇的幾種靶多核苷酸。 因此，編碼不再來自靶多核苷酸的各序列，而是來自產(chǎn)品中所發(fā)現(xiàn)的靶多核苷酸的組合。因 此，根據(jù)本發(fā)明，標記產(chǎn)品可以由η種靶多核苷酸標記，所述η種靶多核苷酸選自可能的N 種不同的多核苷酸，η包括在區(qū)間W ；N]中。在所有情況下，可以通過主要在于使用識別多核苷酸的第三種編碼水平完成本發(fā) 明的標記，由此，如果產(chǎn)品是真品并且采用本發(fā)明方法標記，借助于靶識別數(shù)據(jù)庫可以表明 存在哪些在靶多核苷酸中易于為制造者所用并且可以具有不同的性質(zhì)和濃度的標記物。根據(jù)本發(fā)明，所述產(chǎn)品的標記方法的各步驟可以是具有特定示蹤能力的對象。可 以通過在一個或幾個機密數(shù)據(jù)庫中對各步驟引入特定信息來確保所述示蹤能力。因此，根據(jù)本發(fā)明，例如可以通過字母數(shù)字混合標識符鑒定各批次標記物或標記 物的組合。該標識符可以出現(xiàn)在產(chǎn)品上或通過任何光學表現(xiàn)模式出現(xiàn)例如在標記物批次 的容器上的例如條形碼、數(shù)據(jù)矩陣等。該標識符還可以充當其中儲存有標記物批次的信息的第一數(shù)據(jù)庫中的索引，例如組成標記物批次的每一種標記物的序列、各標記物數(shù)量的各 自比例、制造日期等?？梢詫⒔柚跇擞浳锱蔚臉俗R符來跟蹤的標記物批次的各容器在數(shù)據(jù)庫中與 例如客戶訂單的參考信息相關(guān)聯(lián)，或與將該容器投遞給所述客戶的投遞參考信息相關(guān)聯(lián)。 也可以將來自所述客戶的接收確認輸入該數(shù)據(jù)庫。核酸不會改變標記產(chǎn)品的任何物理化學性質(zhì)。另外，核酸對其容器、即標記產(chǎn)品不 具有任何影響。最后，已經(jīng)證明核酸在本發(fā)明人進行的許多實驗中是非常穩(wěn)定的。在下文 實例中該穩(wěn)定性得以證明。以非窮舉方式，本發(fā)明中包含的單鏈DNA和RNA標記物可以包括在大范圍的產(chǎn)品 和物質(zhì)中，所述產(chǎn)品和物質(zhì)易于成為非法、濫用性復制(偽造)、黑市上的違法交易的目標， 和/或包括在跟蹤軌跡至關(guān)重要的產(chǎn)品和物質(zhì)中(產(chǎn)品跟蹤)。本發(fā)明的方法適用于所有液體、半液體或固體工業(yè)產(chǎn)品或消費品的標記。可以列 舉但不限于以下產(chǎn)品，例如香料、化妝品、衛(wèi)生潔品、食品、調(diào)味品、植物提取物、煙草制品、 飲料、紡織品、皮革制品、藥品、粉料、清漆、油墨、涂料、化學產(chǎn)品和化合物，更一般而言，所 有易于被偽造的貨物和產(chǎn)品。本發(fā)明還可以適用于來自高端工業(yè)和化妝品工業(yè)的整個范圍的產(chǎn)品香料、淡香 水(eaux de parfum)、古龍水(eaux de toilette)、香精油、乳膏、面膜、發(fā)蠟等。在工業(yè)產(chǎn)品和消費產(chǎn)品領(lǐng)域，本發(fā)明還可用于跟蹤諸如油墨、樹脂、清漆、涂料、染 料、添加劑、芳香劑(aroma)、膠、粉料等各種物質(zhì)。在食品工業(yè)領(lǐng)域，本發(fā)明可應(yīng)用于高端產(chǎn)品，所述高端產(chǎn)品可能是偽造或欺詐 (混合)的目標，例如特別是酒精飲料、烈酒、特級葡萄酒，或甚至是出于例如安全原因而確 保真實性較為重要的任何產(chǎn)品。標記物還可用于醫(yī)藥工業(yè)以標記和跟蹤藥品和其它藥物。本發(fā)明還可用于跟蹤醫(yī)院環(huán)境中的生物樣品。例如對于生化實驗室中的血液樣 品、病理解剖學實驗室中的腫瘤樣品實施可跟蹤性策略，或目的在于構(gòu)建直接認證的可以 在生物資源中心中保持和跟蹤多年的人類組織銀行的策略。通常而言，可以將產(chǎn)品標記為其所代表的物品，或作為組成部分而進行標記。例 如，可以通過已經(jīng)在紙質(zhì)文件上使用并且已預先被標記的油墨對紙質(zhì)文件進行標記。根據(jù)本發(fā)明，可以通過任何合適的手段來實現(xiàn)添加本發(fā)明標記物的步驟，從而使 得能夠向待標記的產(chǎn)品添加組成本發(fā)明標記物的多核苷酸。待標記的產(chǎn)品和物質(zhì)可以大批 通過向其引入最終濃度經(jīng)研究和提供的標記物進行標記，或在產(chǎn)品的表面進行標記。所述 標記物是具有源自核糖核酸或脫氧核糖核酸性質(zhì)的物理化學性質(zhì)的核糖核酸或脫氧核糖 核酸的聚合物它們是帶負電荷的親水性分子。根據(jù)待標記產(chǎn)品的性質(zhì)，可以將它們預先 稀釋或直接添加到產(chǎn)品。還可以將它們封裝。甚至還將它們沉積到或整合到所述產(chǎn)品的表 面?？梢酝ㄟ^在產(chǎn)品制造期間將所述多種多核苷酸添加至所述產(chǎn)品中或添加在最終 產(chǎn)品中或添加在最終產(chǎn)品上(即表面上)來實現(xiàn)向所述產(chǎn)品添加本發(fā)明的標記物。因此本 發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的標記方法可以獲得的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明，當在待標記產(chǎn)品的表面處實現(xiàn)標記物的添加時，可以通過例如將最終產(chǎn)品浸入包含所述標記物的溶液或通過將所述溶液噴涂或蒸發(fā)在最終產(chǎn)品上來進行。優(yōu) 選的是，所述溶液是諸如乙醇、甲醇或二乙二醇等質(zhì)子溶劑，或諸如丙酮或四氫呋喃等極性 非質(zhì)子溶劑。該添加模式適合于例如制造后的固體產(chǎn)品，例如織物、皮革、木材、紙、紙板、煙 草制品、香煙、雪茄等。還可以在產(chǎn)品制造期間通過將所述標記物與組成所述產(chǎn)品的化合物或成分混合 來進行添加。可以在所述產(chǎn)品的成分上或在所述產(chǎn)品的成分中實現(xiàn)多種多核苷酸的引入。 這種類型的添加適合于制造中經(jīng)歷液相或半液相的任何產(chǎn)品和物質(zhì)，標記物可以被加入所 述液相或半液相中?？梢允侨缦虑樾?，例如，對化妝品或藥品進行整體標記。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，可以在添加步驟之前執(zhí)行將所述多種多核苷酸包封 在脂質(zhì)載體中的步驟。該包封步驟使得能夠?qū)⑺龆嗪塑账岜３衷谟欣沫h(huán)境下，或有 助于其將來的提取。例如，作為包封產(chǎn)品，可以使用選自包含陽離子脂質(zhì)載體的組中的產(chǎn) 品，例如二油酰氧基丙基三甲基溴化銨(DOTMA)和二油酰基磷脂?；掖及?DOPE)，或稱 為聚合復合物(polypex)的具有諸如聚賴氨酸、魚精蛋白或聚亞乙基亞胺(PEI)等分子的 多核苷酸復合物。例如，為此目的可以使用Bioch. Biophys. Acta 1280 :1. [5]，J.Biol. Chem. 269 :2550 [6]或 AAPS PharmSc i. 2001 ；3(3) :E21[7]中所述技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，可以在添加步驟之前執(zhí)行將所述多種多核苷酸包封 和/或保護在脂質(zhì)載體或其它載體中的步驟。該步驟進一步確保了穩(wěn)定性和/或促進其回 收。本發(fā)明中，“保護”是指保護本發(fā)明中的多核苷酸，特別是使其免受任何來自環(huán)境 的物理化學攻擊，其中發(fā)現(xiàn)例如在這些聚合物中本發(fā)明的識別特征(香料、食品)填充在碳 納米管中。無論選擇何種添加模式，優(yōu)選以從微摩爾到飛摩爾的極低濃度將本發(fā)明的標記物 添加到產(chǎn)品中以對其進行標記。根據(jù)所考慮的現(xiàn)有或即將出現(xiàn)的檢測技術(shù)以及標記物的尺 寸，將這些標記物以可變的終濃度添加，第一組的各靶多核苷酸的各自的濃度可以不同并 組成編碼亞組。根據(jù)本發(fā)明，所述多種多核苷酸在被添加到產(chǎn)品后的濃度可以是但不限于 IO-6摩爾/dm3 10_18摩爾/dm3。對于液體或固體體積，建議采用這種量/體積。對于液體， 其對應(yīng)于以體積單位計的與產(chǎn)品混合的標記物的量。對于固體，其對應(yīng)于以體積單位計的 與產(chǎn)品混合的標記物的量或沉積在產(chǎn)品表面處的標記物的量。涉及產(chǎn)品表面時，還通過單 位/面積即10_6摩爾/dm2 KT1摩爾/dm2來限定所述量。這些濃度可以通過將濃度更高 的溶液進行稀釋而獲得。所述溶液可以如上文所定義。本發(fā)明還涉及用于檢測通過本發(fā)明的標記方法能夠獲得的產(chǎn)品標記的方法，所述 方法包括多種多核苷酸的分析步驟，該分析步驟使得能夠特異性檢測至少一種靶多核苷酸。另外，本發(fā)明提供了幾種用于檢測本發(fā)明的標記物的方法。所述檢測可以在實驗 室外或在實驗室內(nèi)實現(xiàn)，例如借助于便攜式系統(tǒng)(例如借助于特別為檢測本發(fā)明標記物的 靶多核苷酸而設(shè)計的DNA微陣列)而實現(xiàn)。 根據(jù)本發(fā)明，可以例如通過免疫檢測進行所述分析步驟。根據(jù)本發(fā)明，所述分析步 驟可以包括例如對編碼多核苷酸進行測序的步驟。根據(jù)本發(fā)明，特別是當所述靶多核苷酸 是核糖核酸時，所述分析步驟可以例如包括將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成脫氧核糖核酸。根據(jù)本發(fā)明，所述分析步驟可以包括與特異性雜交聯(lián)合的比色檢測、發(fā)光檢測或熒光檢測。換言之， 所述分析步驟可以使用檢測靶多核苷酸的特定手段。根據(jù)本發(fā)明，所用的分析技術(shù)可以利用標記物的物理化學性質(zhì)、編碼和特異性。所 述分析技術(shù)可以與夾心測試技術(shù)、使用DNA微陣列的檢測技術(shù)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可 以檢測多核苷酸的存在和/或?qū)ζ溥M行鑒定的任何其它技術(shù)相關(guān)。在本發(fā)明的具體實施方式
中，靶多核苷酸和誘騙多核苷酸可以是小尺寸的多核苷 酸，即長度為8 30個核苷酸/核苷，并且是單鏈的。根據(jù)該實施方式且有利的是，根據(jù)這 些多核苷酸的性質(zhì)，它們不能用作可被擴增并且通過諸如聚合鏈式反應(yīng)(“PCR”，聚合酶鏈 式反應(yīng))的指數(shù)擴增技術(shù)進行檢測的模板鏈。因此，不能通過PCR擴增對其進行檢測。在 該實施方式中，多核苷酸的檢測可以在沒有擴增的情況下通過雜交法和直接檢測而進行， 并且僅能由知道所用識別特征的用戶完成。另外，試圖提取、擴增和復制標記產(chǎn)品中存在的 多種多核苷酸的偽造者會受到阻止。另外，有利的是，可以更加快得多地實施僅包括雜交步 驟和所述雜交的檢測步驟的檢測方法。聚合鏈式反應(yīng)需要幾個小時，而只要檢測對于待檢 測的多核苷酸是特異性的，則多核苷酸的簡單雜交幾乎瞬間完成。根據(jù)本發(fā)明，所用的分析技術(shù)可以基于標記物的物理化學性質(zhì)、編碼和特異性。其 可以包含靶多核苷酸的指數(shù)或線性擴增，可以使用任何其它技術(shù)來檢測所述標記物的存 在。換言之，分析步驟可以包括靶多核苷酸的線性擴增步驟。在所述分析步驟之前，本發(fā)明的方法還可以包括以下步驟(a)對產(chǎn)品進行取樣；和(b)提取所述產(chǎn)品的多種多核苷酸。這里，所述方法由使得能夠通過對產(chǎn)品進行取樣而對本發(fā)明的標記實施檢測的方 法構(gòu)成。提取后，可以如上所述對標記物的存在進行分析。根據(jù)本發(fā)明，提取步驟(b)可以通過技術(shù)人員已知的任何技術(shù)實現(xiàn)，從而從樣品 中提取多核苷酸?？梢愿鶕?jù)取決于標記產(chǎn)品的性質(zhì)的策略對所述多核苷酸進行提取?？?以使用已知的或即將出現(xiàn)的任何類型的核糖核酸或脫氧核糖核酸提取技術(shù)來從大量標記 產(chǎn)品中提取多核苷酸。其可以是例如苯酚-氯仿提取。本發(fā)明中能夠使用的提取技術(shù)例如 Molecular Cloning，Maniatis，Cold Spring-harbor，第二片反，第 E3 E4 頁[8]所記載。因此標記產(chǎn)品的分析方法可以由以下步驟組成從這些產(chǎn)品中提取多核苷酸，檢 測由識別多核苷酸攜帶的編碼，訪問數(shù)據(jù)庫以識別靶多核苷酸，由此對由靶多核苷酸攜帶 的編碼進行解密，接著利用該信息以在包括誘騙多核苷酸的多個靶多核苷酸中發(fā)現(xiàn)靶多核 苷酸，然后檢測靶多核苷酸的存在，靶多核苷酸的存在是標記產(chǎn)品的特點(在檢測到標記 的情況下)或推斷出產(chǎn)品是偽造品(在靶多核苷酸不存在或標記與靶/產(chǎn)品數(shù)據(jù)庫不一致 的情況下)。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，對分析步驟具有特異性的檢測可以包括例如以下連 續(xù)步驟(1)使多種多核苷酸與其上固定有探針序列的固相基質(zhì)接觸，這些探針序列與所 述產(chǎn)品的標記的多種多核苷酸中的所述至少一種靶多核苷酸的所述末端中的一個末端互 補，所述接觸使得能夠?qū)卸嗪塑账嵬ㄟ^與固定在所述基質(zhì)上的互補性探針序列雜交而固定在所述載體上；(2)除去未由步驟(i)雜交的多核苷酸；和(3)檢測所述基質(zhì)上的靶多核苷酸的存在。本發(fā)明中，步驟(iii)執(zhí)行的檢測可以通過經(jīng)改進的特定手段實現(xiàn)，例如其可以 涉及使用熒光分子的檢測、使用發(fā)光分子的檢測、使用其反應(yīng)產(chǎn)物可以著色的酶的檢測、使 用所催化的反應(yīng)是放熱反應(yīng)的酶的檢測、使用所催化的反應(yīng)會發(fā)光的酶的檢測、或使用對 靶多核苷酸具有特異性的蛋白(例如抗體、酶)的檢測。根據(jù)一個具體實施方式
，特異性檢測還在步驟(i)和(ii)之間包括通過至少一種 特異性的靶多核苷酸捕獲系統(tǒng)將所述多種多核苷酸捕獲在基質(zhì)上的步驟，在所述系統(tǒng)上固 定有所述產(chǎn)品的標記的多種多核苷酸的至少一種靶多核苷酸。當本發(fā)明的標記包含識別多核苷酸時，該具體實施方式
的方法還可以在步驟(i) 之前包括鑒定這些識別多核苷酸的步驟(X)和根據(jù)所鑒定的識別多核苷酸選擇固相基質(zhì) 的步驟(y)，這樣選擇的固相基質(zhì)包含與根據(jù)識別多核苷酸鑒定的靶序列互補的探針序列。有利的是，該檢測方法可以與包括具有恒定末端和可變末端的靶多核苷酸的本發(fā) 明的標記物一起使用。這些靶多核苷酸如上文所定義。根據(jù)本發(fā)明，可以通過技術(shù)人員已知 的任何手段將與靶多核苷酸互補的多核苷酸(稱為探針序列)固定在固相基質(zhì)上。這些基 質(zhì)上檢測技術(shù)和本發(fā)明中可使用的基質(zhì)的類型記載于Molecular Cloning,Maniatis, Cold Spring-Harbor，第二版，第9. 47 9. 57頁[9]。例如，可以借助于生物素/鏈霉親和素連 接進行所述探針序列在基質(zhì)上的固定，探針與生物素分子偶聯(lián)，而所述基質(zhì)展示鏈霉親和 素分子。例如，還可以通過與帶電尼龍膜形成共價鍵來實現(xiàn)探針序列的固定，所述膜形成固 相基質(zhì)。本發(fā)明中能夠使用的這些技術(shù)是例如記載于出版物[10]、[11]和[12]中的那些 技術(shù)。換言之，與靶多核苷酸互補的多核苷酸是對所尋找的靶多核苷酸具有特異性的捕獲 系統(tǒng)的實例。根據(jù)本發(fā)明，通過與探針序列雜交固定在基質(zhì)上的靶多核苷酸可以通過技術(shù)人員 已知的任何合適手段進行檢測。其可以例如是利用由標記試劑標記且與靶多核苷酸的另一 末端互補的多核苷酸的檢測，所述標記試劑能夠從包含熒光色素、膠體金顆粒和酶的組中 選擇。這種固相基質(zhì)上的檢測模式使得能夠容易地、可再現(xiàn)地以及立即地進行對本發(fā)明 標記物的檢測。其可以有利地用于本發(fā)明。本發(fā)明的檢測方法還可以包括將對靶多核苷酸進行分析的步驟的結(jié)果與使得能 夠鑒定靶多核苷酸的數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容進行比較的步驟，以及使得能夠鑒定和認證所述產(chǎn)品并 且還能夠確定所述產(chǎn)品的來源的靶多核苷酸分析。換言之，數(shù)據(jù)庫和對由編碼多核苷酸所 攜帶的編碼的解密使得能夠從原始產(chǎn)品中鑒定偽造品。通過使用利用使用包含于標記產(chǎn)品中的靶多核苷酸的所用分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)包含于 標記產(chǎn)品中的靶多核苷酸，可以發(fā)現(xiàn)與該產(chǎn)品有關(guān)的信息。應(yīng)該存在于所測試產(chǎn)品中的 靶多核苷酸的不存在缺失表明可能是所述產(chǎn)品的偽造品。在相同產(chǎn)品中檢測到幾種本發(fā) 明的不同標記物或識別多核苷酸可以表明，這是異常的起始混合初始混合物(abnormal initial mixture)的結(jié)果。在待標記的產(chǎn)品的制造步驟期間，可以使本發(fā)明標記物的制造商用戶與標記物批次的容器的標識符、與例如使用該標記物批次標記的產(chǎn)品批次有關(guān)的參考信息相關(guān)聯(lián)?？?以例如在與前述數(shù)據(jù)庫相同或不同的數(shù)據(jù)庫中進行該關(guān)聯(lián)。取決于該用戶使用的信息系 統(tǒng)，優(yōu)選的是，輸入該數(shù)據(jù)庫并且與生產(chǎn)批次相關(guān)的所述信息足以能夠明確地跟蹤該批次。當對疑似偽造品的產(chǎn)品樣品進行分析時，可以將對所鑒定的多核苷酸序列的檢測 與在標記物的制造和投遞期間輸入數(shù)據(jù)庫的信息進行比較。例如如果未鑒定出標記物則可以表征為偽造。如果在已通過詢查數(shù)據(jù)庫獲得確切 組成且已經(jīng)被部分披露的標記物批次中的至少一種標記物丟失，也可以醒目標記為偽造。 如果在批次標記物中應(yīng)該出現(xiàn)的標記物具有完整性，但所測試的貨物并非來自已經(jīng)接收剛 被披露的標記物批次的定單的制造商，也可以表征為偽造。在濫用分銷渠道或平行市場的情形中，產(chǎn)品是真品，并且所披露的標記物的批次 實際上對應(yīng)于投遞到所測試產(chǎn)品的制造商的標記物的批次。本發(fā)明的方法在收到請求時能 夠從制造數(shù)據(jù)庫標記物獲得標記物批次的標識符。只要示蹤性系統(tǒng)允許，該標識符有利地 使制造商能夠?qū)⑺鶚擞浀漠a(chǎn)品批次對其客戶之一的理論分配與在對產(chǎn)品取樣期間所注意 到的疑似為平行操作(parallelism)的實際分配進行比較。如果產(chǎn)品的理論分配與實際分 配不相符，可能存在分銷渠道的濫用。閱讀由經(jīng)由圖示給出的附圖進行說明的以下實施例后，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言其 它優(yōu)點會變得更顯而易見。


圖1顯示NbBpu 101的切割位點。圖2顯示探針在微陣列上的尋址。圖3顯示Cy5的發(fā)射光譜和吸收光譜。圖4顯示基質(zhì)上的本發(fā)明標記物的檢測方法標記物Ml和M2以混合物形式存在。 它們在固定在微陣列上的探針和通用探針之間建立了一座“橋”因而檢測到信號(Cy5的熒 光)。圖5顯示用NanoChip工作站(注冊商標)(Nanogen Inc.)進行的標記物檢測。圖6顯示偶聯(lián)標記的原理。圖8顯示檢測本發(fā)明的標記和認證本發(fā)明的標記產(chǎn)品的圖。
具體實施例方式實施例實施例1 根據(jù)本發(fā)明方法的標記的制造和產(chǎn)品的標記在該實施例中，所用的靶多核苷酸和誘騙多核苷酸是大小為觀個核苷酸的單鏈 脫氧核糖核酸序列。編碼多核苷酸是大小為4. 3千堿基(1Λ)的環(huán)狀DNA序列。標記產(chǎn)品是香精溶液J’ Adore香水(注冊商標，Christian Dior香水)。完成3種標記，說明在認證方法中有3種可能的假定情況其中所述產(chǎn)品得到認證 的實例和兩個其中所述產(chǎn)品未被認證的實例。I. A靶標記物和誘騙多核苷酸的設(shè)計La.l 原理
以如下方式產(chǎn)生單鏈脫氧核糖核酸的10種多核苷酸10種多核苷酸的5’核苷酸 都是相同的，這由用戶定義。其大體為GCAACTCCAG序列。然后使用“發(fā)明內(nèi)容”中展示的 算法，通過使用以下參數(shù)產(chǎn)生18個3’核苷酸長度等于18個核苷酸的字符串(word)，5個 G核苷酸、5個C核苷酸、4個A核苷酸和4個T核苷酸。然后隨機產(chǎn)生各新型多核苷酸，以使得其含有該預定數(shù)量的每種堿基。根據(jù)Smith 和Waterman算法，使用以下參數(shù)計算該新型多核苷酸和已經(jīng)驗證的多核苷酸組以及由在 該組中將各多核苷酸兩兩鏈接所產(chǎn)生的多核苷酸之間的比對評分(對于第一多核苷酸不 必進行該步驟)AT評分1匹配GC評分1. 5匹配錯配罰分-3空位(gap)罰分-2最小的選擇評分為3，這意味著將新型多核苷酸與來自組中的多核苷酸、或來自組 中的兩個多核苷酸的鏈接物進行比對，如果評分大于3，則將其排除。否則，其得到驗證并將 其添加到所述多核苷酸組。重復該步驟直到獲得10種多核苷酸。表1. 1顯示這些標記物的列表。表1.1:標記物的序列
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)品標記方法，所述方法包括在所述產(chǎn)品上或在所述產(chǎn)品中添加多種單鏈多核 苷酸的步驟，所述多種多核苷酸包含-至少一種由具有預定長度和序列的單鏈多核苷酸組成的靶多核苷酸，和-具有相同或不同預定長度和相同或不同預定序列的誘騙多核苷酸，所述誘騙多核苷 酸的長度與所述至少一種靶多核苷酸相同或不同，且所述誘騙多核苷酸的序列與所述至少 一種靶多核苷酸的序列不同，其中所述靶多核苷酸和誘騙多核苷酸的每一種都不與所述多種多核苷酸中的任何其 它多核苷酸雜交，且其中所述多種多核苷酸中的多核苷酸是脫氧核糖核酸序列或核糖核酸序列，所述脫氧 核糖核酸序列或核糖核酸序列分別包括相同比例的四種天然或修飾堿基A、C、G和T，或A、 C、G 禾口 U。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多種多核苷酸還包含至少一種由具有預定長度 和序列的單鏈多核苷酸組成的識別多核苷酸，其用于鑒定所述至少一種靶多核苷酸的性質(zhì) 和序列，其中所述識別多核苷酸的每一種都不與所述多種多核苷酸中的任何其它多核苷酸 雜交。
3.如權(quán)利要求1所述的標記方法，其中所述多種多核苷酸中的所述多核苷酸是環(huán)狀或 直鏈的。
4.如權(quán)利要求1所述的標記方法，其中使用至少兩種靶多核苷酸，一種是環(huán)狀多核苷 酸，另一種是直鏈多核苷酸。
5.如權(quán)利要求3或4所述的標記方法，其中所述直鏈多核苷酸包含在不同的多核苷酸 之間可變的可變末端和在不同的多核苷酸之間恒定的恒定末端。
6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的標記方法，其中所述多種多核苷酸中的所述至少一 種靶多核苷酸的長度為5 50個核苷酸。
7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的標記方法，其中所述多種多核苷酸中的所述多核苷 酸的長度為5 5000個核苷酸。
8.如前述權(quán)利要求中任一項所述的標記方法，其中所述添加步驟通過在所述產(chǎn)品制造 期間將所述多種多核苷酸添加至最終產(chǎn)品中或最終產(chǎn)品上來進行。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項所述的標記方法，其中所述添加步驟通過將所述多種多 核苷酸添加在所述產(chǎn)品的表面來進行。
10.如前述權(quán)利要求中任一項所述的標記方法，其中在添加步驟之前進行將所述多種 多核苷酸包封在脂質(zhì)載體中的步驟。
11.如前述權(quán)利要求中任一項所述的標記方法，其中所述多種多核苷酸的引入在所述 產(chǎn)品的成分上或其中進行。
12.如前述權(quán)利要求中任一項所述的標記方法，其中添加所述多種多核苷酸后所述產(chǎn) 品中所述多種多核苷酸的濃度為10_6摩爾/dm3 10_18摩爾/dm3。
13.一種標記產(chǎn)品，所述標記產(chǎn)品能夠通過權(quán)利要求1 12中任一項所述的方法獲得。
14.如權(quán)利要求13所述的標記產(chǎn)品，所述標記產(chǎn)品選自包含香精、化妝品、衛(wèi)生潔品、 食品、調(diào)味品、植物提取物、煙草制品、飲料、紡織品、皮革制品、藥品、粉料、清漆、油墨、食 品、碳氫化合物、紙、涂料以及化學產(chǎn)品和化合物的組。
15.一種權(quán)利要求13所述產(chǎn)品的標記的檢測方法，所述方法包括對所述多種多核苷酸 進行分析的步驟，所述分析步驟使得能夠特別是檢測所述至少一種靶多核苷酸，所述方法 包括以下連續(xù)步驟(i)使所述多種多核苷酸與其上固定有探針序列的固相基質(zhì)接觸，所述探針序列與所 述產(chǎn)品標記的多種多核苷酸中的所述至少一種靶多核苷酸的所述末端中的一個末端互補， 所述接觸使得能夠?qū)卸嗪塑账嵬ㄟ^與固定在所述基質(zhì)上的所述互補探針序列雜交而固 定在所述基質(zhì)上；( )除去未由步驟(i)雜交的多核苷酸；(iii)檢測所述基質(zhì)上的靶多核苷酸的存在；和(iv)將步驟(iii)的結(jié)果與能夠鑒定和認證所述產(chǎn)品的數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容進行比較。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，所述方法在所述分析步驟之前還包括以下步驟(a)取得所述產(chǎn)品的樣品；和(b)從所述樣品提取所述多種多核苷酸，對從所述樣品提取的所述多種多核苷酸完成 所述分析步驟。
17.如權(quán)利要求15或16所述的檢測方法，其中所述分析步驟包括進行所述靶多核苷酸 的聚合鏈式反應(yīng)。
18.如權(quán)利要求15 17中任一項所述的檢測方法，其中通過免疫檢測進行所述分析步馬聚ο
19.如權(quán)利要求15所述的標記檢測方法，其中利用生物素/鏈霉親和素連接使與所述 靶多核苷酸互補的多核苷酸固定在所述固相基質(zhì)上。
20.如權(quán)利要求15所述的標記檢測方法，其中通過與不帶電的尼龍膜形成共價鍵而使 與所述靶多核苷酸互補的多核苷酸固定在所述基質(zhì)上，所述膜形成所述固相基質(zhì)。
21.如權(quán)利要求15 20中任一項所述的標記檢測方法，其中利用被標記試劑標記且與 所述靶多核苷酸的另一端互補的多核苷酸檢測固定于所述基質(zhì)的靶多核苷酸，所述標記試 劑選自包含熒光素、膠體金顆粒和酶的組。
22.如權(quán)利要求15所述的標記檢測方法，其中所述數(shù)據(jù)庫能夠確定所述產(chǎn)品的來源。
23.如權(quán)利要求15 22所述的標記檢測方法，其中所述數(shù)據(jù)庫能夠鑒定真正產(chǎn)品的偽1Δ=. 口 In ΡΠ ο
24.如權(quán)利要求15 23中任一項所述的標記檢測方法，其中步驟(b)所定義的提取為 苯酚-氯仿提取。
25.如權(quán)利要求15 M中任一項所述的檢測方法，其中當所述靶多核苷酸為核糖核酸 時，所述分析步驟包括將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成脫氧核糖核酸。
26.如權(quán)利要求15 M中任一項所述的檢測方法，其中所述分析步驟包括對所述靶多 核苷酸進行測序的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)品標記方法、所述標記的鑒定方法和通過本發(fā)明方法標記的產(chǎn)品。本發(fā)明中所用的標記基于單鏈核酸。本發(fā)明的標記方法包括將多種單鏈多核苷酸添加在所述產(chǎn)品上或在所述產(chǎn)品中的步驟，所述多種多核苷酸包括至少一種包含具有預定長度和序列的單鏈多核苷酸的靶多核苷酸，以及具有相同或不同預定長度和相同或不同預定序列的誘騙多核苷酸，所述誘騙多核苷酸的長度與所述至少一種靶多核苷酸相同或不同，且所述誘騙多核苷酸的序列與所述至少一種靶多核苷酸的序列不同，其中所述靶多核苷酸和誘騙多核苷酸的每一種都不與所述多種多核苷酸中的任何其它多核苷酸雜交。本發(fā)明的方法使得可以例如標記香精、化妝品、衛(wèi)生潔品、食品、調(diào)味品、植物提取物、煙草制品、飲料、紡織品、皮革制品、藥品、粉料、清漆、油墨、碳氫化合物、紙、涂料以及化學產(chǎn)品和化合物。
文檔編號C12Q1/68GK102124127SQ200980122362
公開日2011年7月13日 申請日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日
發(fā)明者亞歷山大·雅各布, 卡洛斯·克梅格尼·卡塔莫, 尼古拉斯·德拉考特, 斯特凡·蒙特奧斯, 西爾萬·勞瑞克 申請人:生物量子公司