專利名稱：產(chǎn)生2-羥基異丁酸的重組細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目標(biāo)為細(xì)胞，其如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比，它能夠形 成更多的2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸，其特征在于，2-羥 基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰 乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的3-羥基丁酰輔酶A來實(shí)現(xiàn)。
現(xiàn)有技術(shù)甲基丙烯酸、其酯和聚合物在丙烯酸玻璃板、壓鑄模產(chǎn)品、涂層和許多其他產(chǎn)品的 生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用。已知多種用于制備甲基丙烯酸的方法。然而，世界上大部分的商業(yè)生產(chǎn)基于用于 水解從相應(yīng)的2-羥基腈產(chǎn)生的甲基丙烯酸的酰胺-硫酸鹽的化學(xué)方法，其中為了產(chǎn)生Ikg 甲基丙烯酸需要大約1. 6kg硫酸。在US 3，666，805和US 5，225，594中描述了 2-羥基異丁酸Q-HIB)至甲基丙烯 酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化，其中產(chǎn)率為至多96 %。通過在使用水解腈的酶的情況下將2-羥基腈水解為2-羥基異丁酸而得到用于 生產(chǎn)甲基丙烯酸的備選方法。所述水解腈的酶為腈水解酶或者腈水合酶和酰胺酶的組 合(A. Banerjee, R. Sharrna, U. C. Banerjee,2002, ” The nitrile-degrading enzymes current status and future prospects"，Appl. Microbiol. Biotechnol.，60 :33-44 ；禾口 US 6，582，94 。這種方法的一個(gè)嚴(yán)重缺點(diǎn)是在對(duì)于有效的水解腈的酶活性來說所需的中 性PH范圍內(nèi)腈的不穩(wěn)定性。在反應(yīng)混合物中腈的降解導(dǎo)致酮和氰化物的積累，這兩者都抑 制水解腈的酶活性。這兩種方法(即目前占主導(dǎo)地位的基于酰胺-硫酸鹽的方法和酶促的水解腈的方 法)的普遍缺點(diǎn)是需要2-羥基腈。這必須首先從對(duì)環(huán)境有害的反應(yīng)物(即酮和氰化物) 來制備。從CA 2,510, 657中獲知用于經(jīng)由酶促的降解叔丁醇的代謝途徑來提供2_羥基異 丁酸的備選方法。從PCT/EP2007/05^30中獲知用于提供2_羥基異丁酸的其他酶促方法。在那里， 借助于變位酶將作為初產(chǎn)物的3-羥基丁酰輔酶A(3-HBCoA)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基異丁酸。所述 方法具有下列缺點(diǎn)所述方法是不連續(xù)的，作為反應(yīng)物外源地添加3-羥基丁酸(3-HB)，以 及工藝條件需要惰性氣體。轉(zhuǎn)化率為大約20%。因此，克服了所述缺點(diǎn)的用于制備2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元 的聚羥基鏈烷酸的方法是有利的。因此，本發(fā)明的任務(wù)是提供用于形成2-羥基異丁酸的方法，其保證了對(duì)于用于 2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的初產(chǎn)物的需求，所述2-羥 基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸可以被進(jìn)一步加工為甲基丙烯 酸、其酯和聚合物。
發(fā)明描述令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的3-羥基丁 酰輔酶A來形成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸為解決上述 任務(wù)作出了貢獻(xiàn)。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“初產(chǎn)物(Vorprodukt) ”定義了這樣的化合物，其可以通過 使用僅一種酶以酶促方式被轉(zhuǎn)化為所希望的產(chǎn)物；而術(shù)語(yǔ)“中間產(chǎn)物”定義了這樣的化合 物，其可以通過使用至少兩種酶以酶促方式被轉(zhuǎn)化為所希望的產(chǎn)物，其中作為“化合物”，具 有或沒有輔酶A-硫酯官能度的那些應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是等價(jià)的，并因此形成或裂解硫酯的酶不 被考慮在內(nèi)。因此，本發(fā)明的目標(biāo)為細(xì)胞，其如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比，它 能夠形成更多的2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸，其特征在 于，2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為中間產(chǎn) 物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的3-羥基丁酰輔酶A來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)為用于制備根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的方法，和用于用根據(jù)本發(fā)明 的細(xì)胞來制備2-羥基異丁酸的方法，以及用于制備甲基丙烯酸的方法。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，2-羥基異丁酸或者甲基丙烯酸不僅可以從可再生原料例如 碳水化合物和/或甘油來制備，而且可以從源自化石燃料的原料例如甲醇來制備，并因此 可以避開化石原料的可用性不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以以熱負(fù)荷很低的步驟和通常 以少數(shù)幾個(gè)工藝步驟來獲得甲基丙烯酸。本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，避免了許多毒性或攻擊性物質(zhì)，如它們?cè)诔Ｒ?guī)的用于 制備2-羥基異丁酸的化學(xué)方法中產(chǎn)生。在下面將通過實(shí)施例來描述本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明局限于這些示例性的實(shí)施方案。除非另外說明，所有給出的百分比(％ )均為質(zhì)量百分比。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“2-羥基異丁酸”總是描述以這樣形式的相應(yīng)的C4-羧酸， 所述形式為C4-羧酸在由相應(yīng)的微生物形成之后依賴于PH值而呈現(xiàn)的形式。因此，該術(shù)語(yǔ) 總是包括純的酸形式(2-羥基異丁酸)、純的堿形式(2-羥基異丁酸鹽)以及由酸的質(zhì)子化 和脫質(zhì)子化形式所組成的混合物。此外，術(shù)語(yǔ)“3-羥基丁酰輔酶A”原則上不僅包括00-立體異構(gòu)體而且包括 (S)-立體異構(gòu)體，其中特別優(yōu)選的是(R)-立體異構(gòu)體。表述“與其野生型相比，它能夠形成更多的2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單 體單元的聚羥基鏈烷酸”還涉及這樣的情況經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的野生型完全不能形 成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸，或者至少不能形成可檢 測(cè)量的這些化合物；并且在經(jīng)過基因工程改造之后才能形成可檢測(cè)量的這些組分。細(xì)胞的“野生型”優(yōu)選地是指這樣的細(xì)胞，其基因組以如同它自然地通過進(jìn)化而形 成的那種狀態(tài)存在。該術(shù)語(yǔ)不僅用于整個(gè)細(xì)胞，而且用于單個(gè)基因。因此，術(shù)語(yǔ)“野生型”特 別地不包括這樣的細(xì)胞或這樣的基因，其基因序列已由人借助于重組方法至少部分地進(jìn)行 了改變。
隨后，可以通過小心的脫水反應(yīng)從2-羥基異丁酸獲得甲基丙烯酸。在包含2-羥 基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的情況下，可以分離出細(xì)胞中所包含的充滿這些聚羥基 鏈烷酸的顆粒，隨后裂解所述聚合物從而獲得2-羥基異丁酸，其然后可以進(jìn)行脫水從而獲 得甲基丙烯酸。在此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是，所述經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞是如此地經(jīng)基因工程改 造的，從而所述細(xì)胞在確定的時(shí)段內(nèi)，優(yōu)選地在2小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選地在8小時(shí)內(nèi)，和最優(yōu)選地 在M小時(shí)內(nèi)，所形成的2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的量 為所述細(xì)胞的野生型的至少2倍，特別優(yōu)選地至少10倍，更優(yōu)選地至少100倍，更加優(yōu)選地 至少1000倍，和最優(yōu)選地至少10000倍。在此，產(chǎn)物形成的增加可以例如通過下列方式來 測(cè)定將根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞和野生型細(xì)胞各自分開地在相同的條件(相同的細(xì)胞密度、相 同的培養(yǎng)基、相同的培養(yǎng)條件)下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過確定的時(shí)段；隨后測(cè)定細(xì)胞 上清液中(在2-羥基異丁酸的情況下)或者細(xì)胞中(在包含2-羥基異丁酸單體單元的聚 羥基鏈烷酸的情況下)目標(biāo)產(chǎn)物(2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基 鏈烷酸)的量。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可以是原核生物細(xì)胞或真核生物細(xì)胞。所述細(xì)胞可以為哺乳動(dòng) 物細(xì)胞(例如來自人的細(xì)胞)，植物細(xì)胞，或者微生物例如酵母、真菌或細(xì)菌，其中特別優(yōu)選 的是微生物，最優(yōu)選的是細(xì)菌和酵母。作為細(xì)菌、酵母或真菌，以細(xì)菌、酵母或真菌菌株形式保藏于德意志微生物和 細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Brauns chweig, Deutschland)中的那些細(xì)菌、酵母或真菌是特別合適的。根 據(jù)本發(fā)明合適的細(xì)菌屬于在http://www. dsmz. de/species/bacteria. htm中所列出的那 些類別，根據(jù)本發(fā)明合適的酵母屬于在http://WWW. dsmz. de/species/yeasts. htm中所列 出的那些類別，和根據(jù)本發(fā)明合適的真菌屬于在http://WWW. dsmz. de/species/fungi. htm 中所列出的那些類別。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞是下列屬的那些細(xì)胞曲霉屬(Aspergillus)、棒桿菌 屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動(dòng)桿菌 屬(Acinetobacter)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes) > ff lif M (Lactobacillus)、畐Ij 球菌屬 (Paracoccus)、乳球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)^R 遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、糖酵母屬(Saccharomyces)、埃希 氏菌屬(Escherichia)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、甲基桿菌屬 (Methylobacterium)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅螺菌 屬(Rhodospirillum)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、梭菌 屬(Clostridium)和貪銅菌屬(Cupriavidus)，其中構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑 曲霉(Aspergillus niger)、廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligenes latus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、黃色短桿菌(Brevibacterium f lavum)、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、酉良胃 ft Sl # (Saccharomyces cerevisiae) > IL Sl 3 # Sl # (Kluveromyces lactis)、布蘭克假絲酵母(Candida blankii)、皺落假絲酵母(Candida rugosa)、谷氨酸 棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒桿菌(Corynebacterium efficiens) >運(yùn)動(dòng)發(fā)酵假單胞菌(Zymomonas mobilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形 漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、 富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(特別是富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16)、深紅紅 電累菌(Rhodospiriilum rubrum)、類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、善變甚Ij 求 菌(Paracoccus versutus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)、乙酸 丐不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)禾口巴其Jf德畢赤 酵母(Pichia pastoris)是特別優(yōu)選的。因此，與其野生型相比能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的 3-羥基丁酰輔酶A形成更多的2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷 酸的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞具有酶E1的活性，所述酶E1催化乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基丁 酰輔酶A。所述酶E1優(yōu)選地為選自包含下列的酶3-羥基?；o酶A脫氫酶(EC 1. 1. 1.35),乙酰乙酰輔酶A還原酶(EC 1. 1. 1. 36)，長(zhǎng)鏈-3-羥基酰基輔酶A脫氫酶(EC 1. 1. 1. 211)，和3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶(EC 1. 1. 1. 157)。優(yōu)選地，該酶由選自下列的基因編碼phaB、phbB、fabG、phbNl、phbB2，其中特別優(yōu) 選的是phaB、pt!bB。這些基因的核苷酸序列可以例如從“基因和基因組京都百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) ”(KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù))、國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館(National Library of Medicine) (Bethesda, MD, USA)的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)或者歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(European Molecular Biologies Laboratories)(EMBL, Heidelberg,Deutschland 或 Cambridge,UK) 的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可以是有利的是，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞具有相比于其野生型 而言增加的酶E1的活性，所述酶E1催化乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰輔酶A。術(shù)語(yǔ)“增加的酶的活性”，如其在上文中在酶E1方面和在下面的關(guān)于酶氏等方面的 論述中所使用的，優(yōu)選地理解為增加的細(xì)胞內(nèi)活性?，F(xiàn)在接下來的關(guān)于提高細(xì)胞中的酶活性的論述不僅適用于提高酶E1的活性，而且 適用于下文提及的其活性任選地可以被提高的所有酶。原則上，可以如此來獲得酶活性的增加，即通過增加編碼所述酶的基因序列的拷 貝數(shù)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子，改變基因的密碼子使用，以各種方法類型和方式增加mRNA或酶的半 壽期，修飾基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，或者利用編碼具有增加的活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，以 及任選地將這些措施相組合。根據(jù)本發(fā)明經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞例如通過用載體進(jìn)行轉(zhuǎn) 化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或這些方法的組合來產(chǎn)生，所述載體包含所期望的基因、該基因的等位基因 或其部分和使該基因能夠表達(dá)的啟動(dòng)子。特別地，異源表達(dá)通過將所述基因或等位基因整 合到細(xì)胞的染色體中或染色體外復(fù)制型載體中來獲得。DE-A-100 31 999給出了關(guān)于用于提高細(xì)胞中的酶活性(例如丙酮酸羧化酶的酶 活性)的可能性的綜述，該文獻(xiàn)在此引入作為參考，并且其關(guān)于用于提高細(xì)胞中的酶活性 的可能性的公開內(nèi)容構(gòu)成本發(fā)明公開內(nèi)容的一部分。
上文所提及的以及所有下文所提及的酶或基因的表達(dá)可借助于下列方式來檢 測(cè)1-和2-維蛋白質(zhì)凝膠分離，和隨后用相應(yīng)的評(píng)價(jià)軟件來光學(xué)鑒定凝膠中的蛋白質(zhì)濃 度。如果酶活性的提高僅基于相應(yīng)基因的表達(dá)的提高，那么可以簡(jiǎn)單地通過在野生型細(xì) 胞和經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞之間比較1-或2-維蛋白質(zhì)分離來定量酶活性的提高。用于 制備蛋白質(zhì)凝膠(在棒狀桿菌的情況下)和用于鑒定蛋白質(zhì)的常用方法為Hermann等人 (Electrophoresis, 22 :1712. 23(2001))所描述的程序。也可以通過下列方式來分析蛋白 質(zhì)濃度用對(duì)于待檢測(cè)的蛋白質(zhì)特異的抗體來進(jìn)行Astern-印跡雜交(Sambrook等人， Molecular Cloning -.a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N. Y. USA，1989)，隨后用相應(yīng)的用于濃度測(cè)定的軟件來進(jìn)行 光學(xué)評(píng)價(jià)(Lohaus 禾口 Meyer (1989) Biospektrum，5 :32-39 ；Lottspeich (1999)，Angewandte Chemie 111 =2630-2647)。DNA結(jié)合蛋白的活性可以借助于DNA條帶移位分析(也稱為凝膠 阻滯)來測(cè)量(Wilson 等人，(2001) Journal of Bacteriology，183 :2151-2155)。DNA 結(jié) 合蛋白對(duì)于其他基因的表達(dá)的影響可以通過各種經(jīng)充分描述的報(bào)道基因分析方法來檢測(cè) (Sambrook^Α Molecular Cloning -.a laboratory manual，^!二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N. Y. USA，1989)。細(xì)胞內(nèi)的酶活性可以通過各種經(jīng) 描述的方法來測(cè)定(Donahue 等人，(2000) Journal of Bacteriology 182(19) :5624-5627; Ray 等人，(2000) Journal of Bacteriology 182(8) :2277_2沘4 ;Freedberg 等人，(1973) Journal of Bacteriology 115(3) :816-823)。如果在后面的論述中，沒有說明用于測(cè)定 特定酶的活性的具體方法，那么優(yōu)選地借助于下列文獻(xiàn)中所描述的方法來測(cè)定酶活性的增 加以及酶活性的降低Hermann 等人，Electophoresis, 22 :1712-23(2001) ；Lohaus 等人， Biospektrum 532—39(1998) ；Lottspeich, Angewandte Chemie 111:2630—2647(1999)；禾口 Wilson 等人，Journal of Bacteriology 183 :2151-2155(2001) 如果酶活性的提高是通過內(nèi)源基因的突變而實(shí)現(xiàn)的，那么這樣的突變可以要么根 據(jù)傳統(tǒng)方法隨機(jī)產(chǎn)生，例如通過UV輻射或通過誘發(fā)突變的化學(xué)藥品；要么借助于基因工程 方法例如刪除、插入和/或核苷酸交換來達(dá)到。通過這些突變獲得經(jīng)改造的細(xì)胞。特別地， 特別優(yōu)選的酶突變體還是這樣的酶，其不再是反饋可抑制的或者至少與野生型酶相比較而 言其反饋可抑制性降低了。如果酶活性的提高是通過提高酶的合成而實(shí)現(xiàn)的，那么就例如增加相應(yīng)基因的拷 貝數(shù)，或者使啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)域或位于結(jié)構(gòu)基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。同樣地，嵌 入至結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒也起作用。通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子另外還可能在任一時(shí)間點(diǎn)處增 強(qiáng)表達(dá)。此外，也可以給酶基因分派所謂的“增強(qiáng)子”作為調(diào)控序列，其通過RNA聚合酶和 DNA之間改善的相互作用也導(dǎo)致提高的基因表達(dá)。通過用于延長(zhǎng)mRNA壽命的措施也可改 善表達(dá)。此外，通過防止酶蛋白質(zhì)的降解也可增強(qiáng)酶活性。在此，基因或基因構(gòu)建體要么 存在于具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，要么整合在染色體中并于其中進(jìn)行擴(kuò)增。備選地，所涉 及的基因的過表達(dá)此外還可以通過改變培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件來達(dá)到。本領(lǐng)域技術(shù)人員 尤其可在 Martin 等人(Bio/Technology 5,137-146(1987))中，在 Guerrero 等人(Gene 138,35-41(1994))中，在iTsuchiya和Morinaga(Bio/technology 6,428-430(1988))中，在 Eikmanns 等人(Gene 102,93-98(1991))中，在 EP-A-O 472 869 中，在 US 4，601，893 中，在 Schwarzer 禾口 PUhler (Bio/Technology 9,84-87(1991))中，在 Reinscheid 等人(Appliedand Environmental Microbiology 60,126-132 (1994))中，在 LaBarre 等人(Journal of Bacteriology 175，1001-1007 (1993))中，在 W0-A-96/15246 中，在 Malumbres 等人(Gene 134,15-24(1993))中，在 JP-A-10—229891 中，在 Jensen 禾口 Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))中，以及在已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中找到 關(guān)于此的指導(dǎo)。與突變一樣，上面所描述的措施產(chǎn)生經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞。為了提高各基因的表達(dá)，使用例如附加型質(zhì)粒。作為質(zhì)?；蜉d體，原則上所有隨時(shí) 可供本領(lǐng)域技術(shù)人員為此目的使用的技術(shù)方案是合適的。這樣的質(zhì)粒和載體可以從例如 Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech Gibco BRL
知。其他優(yōu)選的質(zhì)粒和載體可以在下列文獻(xiàn)中找到=Glover, D. Μ. (1985)，DNA cloning :a practical approach,Vol. I-III,IRL Press Ltd. ,Oxford ；Rodriguez,R. L.禾口 Denhardt, D.T(編輯)(1988), Vectors :a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham ；Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185,3-7 ；Sambrook, J. ；Fritsch, Ε.F.禾口 Maniatis, Τ. (1989), Molecular cloning -.a laboratory manual,第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。隨后，包含待擴(kuò)增的基因的質(zhì)粒載體通過接合或轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)移到所期望的菌株 中。接合的方法例如在Schafer等人，Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759(1994)中進(jìn)行了描述。轉(zhuǎn)化的方法例如在Thierbach等人，Applied Microbiology and Biotechnology 29:356-362(1988) ；Dunican 禾口 Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070(1989)；和 Tauch 等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 123:343-347(1994)中進(jìn) 行了描述。在借助于“交換(cross-over)”事件進(jìn)行同源重組后，所得的菌株包含至少兩個(gè) 拷貝的所涉及的基因。在上文中和在下面的論述中所使用的表述“相比于其野生型而言增加的酶Ex的活 性”優(yōu)選地總是指，各酶Ex的活性增加到至少2倍，特別優(yōu)選地至少10倍，更優(yōu)選地至少 100倍，更加優(yōu)選地至少1000倍和最優(yōu)選地至少10000倍。此外，具有“相對(duì)于其野生型而 言增加的酶Ex的活性”的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞特別地也包括這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞的野生型 不具有該酶Ex的活性或至少不具有可檢測(cè)的該酶Ex的活性，并且在提高所述酶活性之后 (例如通過過表達(dá))才顯示出可檢測(cè)的該酶Ex的活性。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)“過表達(dá)”或者 在下面的論述中所使用的表述“表達(dá)的提高”也包括這樣的情況，即起始細(xì)胞例如野生型細(xì) 胞不具有表達(dá)或至少不具有可檢測(cè)的表達(dá)，并且只有通過重組方法才誘導(dǎo)出可檢測(cè)的酶Ex 的合成。相應(yīng)地，下面所使用的表述“降低的酶Ex的活性”優(yōu)選地是指，降低為至少0. 5倍， 特別優(yōu)選地至少0.1倍，更優(yōu)選地至少0.01倍，更加優(yōu)選地至少0. 001倍和最優(yōu)選地至少 0.0001倍的活性。表述“降低的活性”也包括沒有可檢測(cè)的活性(“零活性”)。特定酶的 活性的降低可以例如通過定向突變，通過添加競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，或者通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知用于降低特定酶的活性的其他措施來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的是，與其野生型相比能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn) 物的3-羥基丁酰輔酶A形成更多的2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥 基鏈烷酸的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞能夠利用碳水化合物、甘油、油和脂肪、二氧化碳、羧酸或甲醇作為碳源。進(jìn)一步地，對(duì)于能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的3-羥基 丁酰輔酶A形成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的根據(jù)本發(fā) 明的細(xì)胞來說優(yōu)選的是，除了酶E1的活性外，所述細(xì)胞任選地還具有酶氏的活性，優(yōu)選地相 比于其野生型而言增加的酶氏的活性，所述酶氏催化兩個(gè)乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶 A0酶E2優(yōu)選地為乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC-編號(hào)2. 3. 1. 9)。該酶優(yōu)選地由選 自下列的基因編碼acatl、acat2、loc484063、Ioc489421、mgc69098、mgc81403、mgc81256、 mgc83664、kat_l、erglO、ygeF、atoB、fadAx、phbA-l、phbA-2、atoB-2、pcaF、pcaF-2、phb_A、 bktB、phaA、tioL、thlA、fadA、paaj、phbAf > pimB、mmgA、yhfS> thl、vraB、thl、mvaC、thiL、 paaj> fadA3>fadA4> fadA5>fadA6> cgl 12392、catF、sc8f4. 03、thiLU thiL2> acaBU acaB2> acaB3 或 acaB4,其中 a-catl、acat2、atoB、thlA、thIB、phaA 禾口 phbA 是優(yōu)選的，phaA 禾口 phbA 是特別優(yōu)選的。這些基因的核苷酸序列可以例如從“基因和基因組京都百科全書”(KEGG數(shù)據(jù) 庫(kù))、國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館(Bethes da, MD, USA)的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)或 者歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg, Deut schland或Cambridge，UK)的核苷酸 序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞具有酶&的至少一種活性，優(yōu)選地，相比于其野生型而 言增加的酶&的活性，所述酶&催化3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酰輔酶A。酶 &優(yōu)選地為羥基異丁酰輔酶A變位酶、異丁酰輔酶A變位酶(EC 5.4.99. 13)或甲基丙二酰 輔酶A變位酶(EC5. 4. 99. 2)，各優(yōu)選地為輔酶B12依賴性變位酶。酶&優(yōu)選地為這樣的酶，其從下列微生物中分離出=Aquinc0Ia tertiaricarbonis L108> DSM18028> DSM18512> Methylibium petroleiphiIumPMl、 Methylibium sp. R8、自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus) Py2、類球紅細(xì)菌 (ATCC 170 )、類諾卡氏菌屬物種(Nocardioides sp.) JS614、居藻海桿菌(Marinobacter algicola)DG893、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium medicae)WSM419、玫瑰變色菌屬物種 (Roseovarius sp.) 217、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DSM 3638，特別優(yōu)選地為在 PCT/EP2007/052830中所描述的輔酶B12依賴性變位酶，以及這樣的酶，其在至少一個(gè)其部 分序列中在氨基酸水平上與在PCT/EP2007/052830中所描述的變位酶的小或大亞基的氨 基酸序列(登錄號(hào)DQ436457. 1和DQ436456. 1)具有至少60%，優(yōu)選地至少80%，特別優(yōu)選 地至少95%，十分特別優(yōu)選地至少99%的序列同一性，這根據(jù)blastp算法來測(cè)定，其中采 用10的期望閾值，3的字長(zhǎng)，存在的缺口代價(jià)為11和延伸的缺口代價(jià)為1的blosum62矩陣， 以及條件合成得分矩陣調(diào)整(conditional compositional score matrix adjustment) 在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞(其能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物 的3-羥基丁酰輔酶A形成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸) 的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞在作為野生型的情況下具有酶&的活性，優(yōu) 選地具有相比于其野生型而言降低的至少一種酶&的活性，所述酶&催化3-羥基丁酰輔 酶A轉(zhuǎn)化為聚羥基丁酸。酶&優(yōu)選地為聚羥基鏈烷酸合酶，特別優(yōu)選地為聚羥基丁酸合酶。該酶優(yōu)選地由基因phbC或phaC編碼，其中phaC是特別優(yōu)選的。在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞(其能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物 的3-羥基丁酰輔酶A形成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸) 的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞在作為野生型的情況下具有酶&的活性， 優(yōu)選地具有相比于其野生型而言降低的酶&的活性，所述酶&催化3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn) 化為巴豆酰輔酶A。酶&優(yōu)選地為巴豆酸酶(EC-編號(hào)4. 2. 1. 55)或(3R) _3_羥基丁酰輔酶A脫水酶 (EC-編號(hào)4. 2. 1. 17)。該酶優(yōu)選地由選自crt、crtl、crt2、fadB、paaF的基因編碼，其中crt 以及來自梭菌的相應(yīng)基因是優(yōu)選的，來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的 crt是特別優(yōu)選的。在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞(其能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物 的3-羥基丁酰輔酶A形成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸) 的另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞具有酶&的活性，優(yōu)選地具有相比于其 野生型而言降低的酶&的活性，所述酶&催化R-3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為S-3-羥基丁酰 輔酶A。酶&優(yōu)選地為3-羥基丁酰輔酶A差向異構(gòu)酶(EC 5. 1. 2. 3)。該酶優(yōu)選地由選自 fadB、fadBl、fadB2、fad J, fab J-U faoA、yfcX 的基因編碼，其中 fadB、fad J, yfcX 是優(yōu)選 的，fadB、fadJ是特別優(yōu)選的。此外，對(duì)于能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的3-羥基丁酰 輔酶A形成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的根據(jù)本發(fā)明的 細(xì)胞來說優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞具有相比于其野生型而言降低的至少一種酶E7的活 性，所述酶E7接受3-羥基丁酰輔酶A作為底物。一種用于制備2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的方 法為解決開頭所提及的任務(wù)作出了進(jìn)一步的貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟a)在從碳源形成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的 條件下，使根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞與包含碳源的培養(yǎng)基相接觸，以及任選地b)從培養(yǎng)基中純化出2-羥基異丁酸，或者從細(xì)胞中純化出包含2-羥基異丁酸單 體單元的聚羥基鏈烷酸。作為碳源，可以使用例如碳水化合物(例如單糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉 伯糖、木糖)、寡糖(例如麥芽糖、蔗糖、乳糖)和多糖(例如淀粉、經(jīng)水解處理的淀粉、纖維 素、經(jīng)水解處理的纖維素、半纖維素、經(jīng)水解處理的半纖維素))，以及其反應(yīng)產(chǎn)物，例如糖醇 和多羥基酸；二氧化碳；有機(jī)的、任選地?cái)y帶1個(gè)或多個(gè)(例如1、2、3或4個(gè))羥基的單、二 和三羧酸，例如乙酸、酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羥基丙酸、富馬酸、馬來酸、2， 5-呋喃二羧酸、戊二酸、乙酰丙酸、葡糖酸、烏頭酸、琥珀酸和二氨基庚二酸、檸檬酸；脂質(zhì)； 油或脂肪，例如菜籽油、大豆油、棕櫚油、向日葵油、花生油和椰子油；具有優(yōu)選地10至22個(gè) C-原子的飽和和不飽和脂肪酸，例如Y -亞麻酸、二高-Y -亞麻酸、花生四烯酸、棕櫚酸、 硬脂酸、亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸；烴，例如甲烷；醇，例如具有1至22個(gè) C-原子的醇，例如丁醇、甲醇、乙醇；具有優(yōu)選地3至8個(gè)C-原子的二醇，例如丙二醇和丁 二醇；具有3個(gè)或更多個(gè)(例如3、4、5或6個(gè))OH基團(tuán)的多元醇(也稱為多價(jià)或高價(jià)醇)，
11例如甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇)；具有優(yōu)選地3至10個(gè)C-原子和任選地 1個(gè)或多個(gè)羥基的酮，例如丙酮和乙偶姻；內(nèi)酯，例如Y-丁內(nèi)酯，環(huán)糊精，生物聚合物，例如 聚羥基乙酸，聚酯，例如聚交酯，多糖，聚類異戊二烯，聚酰胺；芳香化合物，例如芳香胺、香 草醛和靛藍(lán)；蛋白質(zhì)，例如酶，例如淀粉酶，果膠酶，酸性、雜合或中性纖維素酶，酯酶(例如 脂肪酶)，胰酶，蛋白酶，木聚糖酶，和氧化還原酶(例如漆酶、過氧化氫酶和過氧化物酶)， 葡聚糖酶，植酸酶；類胡蘿卜素，例如番茄紅素、胡蘿卜素、蝦青素、玉米黃素和角黃素； 成蛋白質(zhì)性和非成蛋白質(zhì)性氨基酸，例如賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、 色氨酸和蘇氨酸；嘌呤和嘧啶堿基；核苷和核苷酸，例如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和腺 苷-5'-單磷酸(AMP)；以及上述化合物的前體和衍生物，例如在所述酸的情況下為其鹽。這些物質(zhì)可以單獨(dú)地或者作為混合物進(jìn)行使用。特別優(yōu)選的是使用碳水化合物， 特別是單糖、寡糖或多糖(如例如在US 6，136，576中所描述的)；使用C5-糖；或者使用甘 油。甲醇是優(yōu)選的待使用的醇，這是因?yàn)樗梢杂稍S多各種不同來源例如沼氣、生物 質(zhì)、天然氣或煤來制備?？梢栽谔幚?蒸汽爆破、酸預(yù)處理、酶預(yù)處理)之前或之后，從不同的加工階段 (例如甘蔗汁，糖漿，糖蜜，粗糖，砂糖；玉米粒，磨粉，淀粉，糊精，葡萄糖)，以不同的形式 (純的或者以溶液/懸浮液)和以不同的組成(純化的或作為粗產(chǎn)物)來使用碳源。在一個(gè)優(yōu)選的備選實(shí)施方案中，碳源包括(X)2或C0，特別是合成氣。在這種情況 下使用的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞為產(chǎn)乙酸細(xì)胞，例如醋酸桿菌屬(AcetcAacterium)的物種，例 如伍氏醋酸桿菌(A. Woodii)，和醋酸梭菌(Clostridium aceticum)。特別地，所述產(chǎn)乙酸 細(xì)胞選自凱伍熱厭氧菌(Thermoanaerobacter kivui)、伍氏醋酸桿菌、Acetoanaerobium notera、醋酸梭菌、食甲基丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)、丙酮丁醇梭 菌、熱醋禾裹爾氏菌(Moorella thermoacetica)、粘液真桿菌(Eubacterium limosum)、產(chǎn)生 消化鏈球菌(Peptostreptococcus productus)、揚(yáng)氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)禾口 食羰基化物梭菌(Clostridium carboxidivorans)。在這種情況下，特別合適的細(xì)胞為在食 羰基化物梭菌，特別是諸如“P7”和“P11”這樣的菌株。這樣的細(xì)胞例如在US 2007/0275447 和US 2008/00575M中進(jìn)行了描述。其他在這種情況下特別合適的細(xì)胞為揚(yáng)氏梭菌，特別 是選自揚(yáng)氏梭菌PETC、揚(yáng)氏梭菌ERI2、揚(yáng)氏梭菌COl和揚(yáng)氏梭菌0_52的菌株，并且它們?cè)?WO 98/00558 和 WO 00/68407 中進(jìn)行了描述?？梢砸苑峙椒?分批培養(yǎng))或者以補(bǔ)料分批方法(給料方法)或重復(fù)補(bǔ)料分批 方法(重復(fù)給料方法)，使根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞連續(xù)地或不連續(xù)地與培養(yǎng) 基相接觸并因此進(jìn)行培養(yǎng)，以便產(chǎn)生2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥 基鏈烷酸。還可以考慮半連續(xù)的方法，如例如在GB-A-1009370中所描述的。關(guān)于其他已知 的培養(yǎng)方法的概括描述在Chmiel的教科書(“Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,1991))或 Storhas 的教 禾斗書("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen，，，Vieweg Verlag, Braunschweig/ Wiesbaden, 1994)中。待使用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足各菌株的要求。關(guān)于各種微生物的培養(yǎng) SWiffl3^1 American Society for Bacteriology"Manual of Methods forGeneral Bacteriology" (Washington D. C. , USA, 1981)中。作為氮源，可以使用有機(jī)含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米 漿、大豆粉和尿素，或者無機(jī)化合物例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮 源可以單獨(dú)地或者作為混合物來進(jìn)行使用。作為磷源，可以使用磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽。此外，培 養(yǎng)基還必須包含金屬鹽例如硫酸鎂或硫酸鐵，它們是生長(zhǎng)所必需的。最后，除了上面所述的 物質(zhì)外，還可以使用必需的生長(zhǎng)物質(zhì)例如氨基酸和維生素。另外，可以向培養(yǎng)基中添加合適 的前體。所述材料可以以單次添加的形式補(bǔ)充給培養(yǎng)物或者在培養(yǎng)期間以合適的方式供料 給培養(yǎng)物。關(guān)于培養(yǎng)物的pH控制，可以以合適的方式使用堿性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化 鉀、氨或氨水，或者酸性化合物例如磷酸或硫酸。為了控制泡沫形成，可以使用防沫劑例如 脂肪酸聚乙二醇酯。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基中添加合適的具有選擇作用的 物質(zhì)例如抗生素。為了維持有氧條件，向培養(yǎng)物中輸入氧或含氧氣體混合物例如空氣。培養(yǎng) 溫度通常為20°C至45°C，和優(yōu)選地25°C至40°C。特別地，在使用能轉(zhuǎn)化作為底物的甘油的 細(xì)胞的情況下，可以是優(yōu)選的是，使用在US 6，803，218中所描述的此類細(xì)胞作為細(xì)胞。在 該情況下，所述細(xì)胞可以在40至100°C的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，連續(xù)地從營(yíng)養(yǎng)液中純化出2-羥基異丁酸，其中，在這方面進(jìn)一步優(yōu)選的 是，也連續(xù)地進(jìn)行通過發(fā)酵來制備2-羥基異丁酸，從而由2-羥基異丁酸的制備到從發(fā)酵液 中純化出2-羥基異丁酸的整個(gè)過程可以連續(xù)地進(jìn)行。為了從發(fā)酵液中連續(xù)地純化出2-羥 基異丁酸的制備，將發(fā)酵液連續(xù)地引導(dǎo)通過用于分離在發(fā)酵中所使用的微生物的裝置，優(yōu) 選地通過具有20至200kDa的排阻大小的過濾器，在其中發(fā)生固/液分離。還可以設(shè)想使 用離心機(jī)、合適的沉降裝置或這些裝置的組合，其中特別優(yōu)選的是，首先通過沉降來分離出 至少一部分微生物，隨后將從中部分地去除了微生物的發(fā)酵液輸送至超濾或離心裝置。在分離出微生物之后，將在其2-羥基異丁酸比例方面經(jīng)富集的發(fā)酵產(chǎn)品輸送至 優(yōu)選地多步驟的分離設(shè)備。在該分離設(shè)備中，設(shè)置有多個(gè)相繼銜接的分離階段，從這些分離 階段中各自匯出被引回至發(fā)酵罐的回輸管路。此外，從各個(gè)分離階段中引出排出管路。單個(gè) 分離階段可以根據(jù)電滲析、反滲透、超濾或納米過濾的原理進(jìn)行工作。通常，在單個(gè)分離階 段中涉及膜分離設(shè)備?；诎l(fā)酵副產(chǎn)物和底物殘留物的類型和規(guī)模來選擇單個(gè)分離階段。除了借助于電滲析、反滲透、超濾或納米過濾(在其過程中作為終產(chǎn)物獲得了 2-羥基異丁酸水溶液)來分離2-羥基異丁酸外，還可以通過萃取方法由從中去除了微生物 的發(fā)酵液中分離出2-羥基異丁酸，其中在該情況下最終可以獲得純的2-羥基異丁酸。為 了通過萃取來分離2-羥基異丁酸，可以向發(fā)酵液中添加例如銨化合物或胺，以形成2-羥基 異丁酸的銨鹽。然后，可以通過下列方式從發(fā)酵液中分離出該銨鹽添加有機(jī)萃取劑，并隨 后加熱如此獲得的混合物，由此銨鹽富集在有機(jī)相中。然后，例如通過進(jìn)一步的萃取步驟可 以從該相中分離出2-羥基異丁酸，從而獲得純的2-羥基異丁酸。關(guān)于該分離方法的更精 確的細(xì)節(jié)可從W0-A-02/090312獲取，該專利關(guān)于從發(fā)酵液中分離出羥基羧酸的公開內(nèi)容 在此引入作為參考，并且構(gòu)成本申請(qǐng)公開內(nèi)容的一部分。根據(jù)從發(fā)酵液中分離2-羥基異丁酸的方法類型和方式，要么獲得包含2至90重 量％，優(yōu)選地7. 5至50重量％和特別優(yōu)選地10至25重量％的2-羥基異丁酸的2-羥基異丁酸水溶液，要么獲得純的2-羥基異丁酸。隨著濃度增加，2-羥基異丁酸傾向于形成其環(huán)狀二聚體(四甲基乙交酯，TMG)。該 二聚體可以在根據(jù)本發(fā)明的方法的脫水步驟中與2-羥基異丁酸類似地進(jìn)行處理，并因此 應(yīng)當(dāng)在下文中對(duì)于該步驟來說總是包括在術(shù)語(yǔ)“2-羥基異丁酸”之中。此外，還可以在純化之前、期間或之后中和通過根據(jù)本發(fā)明的方法制備的2-羥基 異丁酸，其中為此可以使用例如堿，例如堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物，例如氫氧化 鈣或氫氧化鈉，或者還例如NH3或NH40H。特別地，一種用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法也為解決開頭所提及的 任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟IA)通過上文所描述的方法來制備2-羥基異丁酸，以及任選地，純化和/或中和 2-羥基異丁酸，IB)使2-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸，以及任選地，使甲基丙烯酸鹽或 者甲基丙烯酸酯化。根據(jù)步驟IB)，使2-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸，其中為此可以使用從 發(fā)酵液中分離出的純的2-羥基異丁酸，或者使用在處理發(fā)酵液時(shí)分離出的2-羥基異丁酸 水溶液，其中任選地，該2-羥基異丁酸水溶液還在脫水之前，任選地在合適的共沸劑存在 下，例如通過蒸餾進(jìn)行濃縮。原則上，脫水可以在液相或氣相中進(jìn)行。此外，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是，脫水在催化 劑存在下進(jìn)行，其中所使用的催化劑的類型取決于施行氣相反應(yīng)還是液相反應(yīng)。作為脫水催化劑，不僅可以考慮酸性催化劑，而且還可以考慮堿性催化劑。特別 地，由于低的寡聚物形成傾向，酸性催化劑因而是優(yōu)選的。脫水催化劑不僅可以作為均相催 化劑而且可以作為多相催化劑進(jìn)行使用。當(dāng)脫水催化劑作為多相催化劑存在時(shí)，優(yōu)選的是， 所述脫水催化劑與支持物X相接觸。作為支持物X，可以考慮本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為合適的所 有固體材料。在這種情況下，優(yōu)選的是，該固體材料具有合適的孔體積，其適合于良好地系 住和接納脫水催化劑。此外，在0.01至;3ml/g范圍內(nèi)的根據(jù)DIN 66133的總孔體積是優(yōu)選 的，和在0. 1至1. 5ml/g范圍內(nèi)的總孔體積是特別優(yōu)選的。此外，優(yōu)選的是，按照根據(jù)DIN 66131的BET測(cè)試，適合作為支持物χ的固體材料具有0. 001至1000m2/g，優(yōu)選地0. 005至 450m2/g，和更優(yōu)選地0. 01至300m2/g的表面積。作為用于脫水催化劑的支持物，首先可以 使用具有0. 1至40mm，優(yōu)選地1至10mm，和更優(yōu)選地1. 5至5mm的平均顆粒直徑的疏松材 料。進(jìn)一步地，脫水反應(yīng)器的壁可以充當(dāng)支持物。此外，支持物本身可以是酸性的或堿性的， 或者可以在惰性支持物上涂覆酸性或堿性的脫水催化劑。作為涂覆技術(shù)，特別可以提及浸 沒或浸漬或者摻入到支持物基質(zhì)中。作為還可以具有脫水催化劑特性的支持物X，特別合適的是天然或合成的硅酸鹽 物質(zhì)，例如特別是絲光沸石、蒙脫石、酸性沸石；用一、二或多堿價(jià)無機(jī)酸(特別是磷酸)或 者無機(jī)酸的酸式鹽涂布的支持物材料，例如氧化物或硅酸鹽類型的物質(zhì)，例如A1203、TiO2 ； 氧化物和混合氧化物，例如Y -Al2O3和雜多酸的SiO-Al2O3混合氧化物。相應(yīng)于一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，支持物χ至少部分地由氧化物類型的化合物 組成。這樣的氧化物類型的化合物應(yīng)當(dāng)具有元素Si、Ti、Zr、Al、P中的至少一種元素或者 其中至少兩種元素的組合。這樣的支持物由于其酸性或堿性特性而本身還可以用作脫水催化劑。優(yōu)選的既用作為支持物X也用作脫水催化劑的化合物類別包括硅/鋁/磷氧化物。 優(yōu)選的既用作脫水催化劑也用作支持物X的堿性物質(zhì)包括堿金屬、堿土金屬、鑭、鑭系元素 或其中至少兩種(以其氧化物形式)的組合。這樣的酸性或堿性脫水催化劑不僅可以從 Evonik Degussa GmbH，而且可以從^idchemie AG商購(gòu)獲得。其他類別為離子交換劑。同 樣地，這不僅可以以堿性形式，而且可以以酸性形式存在。特別地，作為均相脫水催化劑，可以考慮無機(jī)酸，優(yōu)選地含磷的酸，和更優(yōu)選地磷 酸。這些無機(jī)酸可以通過浸沒或浸漬而固定在支持物X上。特別地，在氣相脫水的情況下，使用多相催化劑經(jīng)證明是特別有利的。然而，在液 相脫水的情況下，既使用均相脫水催化劑也使用多相脫水催化劑。 此外，優(yōu)選的是，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所使用的脫水催化劑具有+1至-10，優(yōu) 選地+2至-8. 2，和更優(yōu)選地，在液相脫水的情況下+2至-3，和在氣相脫水的情況下-3 至-8. 2的Htl-值。Htl-值相應(yīng)于根據(jù)HMmmert的酸性功能(SMurefunktion)，并且 通過所謂的胺滴定和使用指示劑，或通過氣體形式的堿的吸收來算出(參見“Mudies in Surface Science and Catalytics，，，Vol. 51,1989 :"New solid Acids and Bases，their catalytic Properties，，，K. Tannabe 等人)。依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，作為酸性固體催化劑，使用與無 機(jī)酸，優(yōu)選地與磷酸，或與超酸例如硫酸化或磷酸化的鋯氧化物相接觸的多孔支持體，所述 多孔支持體以優(yōu)選地至少90重量％，更優(yōu)選地至少95重量％，和最優(yōu)選地至少99重量％ 基于硅氧化物，優(yōu)選地基于Si02。多孔支持體與無機(jī)酸的接觸優(yōu)選地通過用酸對(duì)支持體進(jìn) 行浸漬來實(shí)現(xiàn)，其中優(yōu)選地以相對(duì)于支持體的重量而言10至70重量％，特別優(yōu)選地20至 60重量％，和更優(yōu)選地30至50重量％的量，使所述酸與所述多孔支持體相接觸，并隨后進(jìn) 行干燥。在干燥后，加熱所述支持體以固定無機(jī)酸，優(yōu)選地在300至600°C，更優(yōu)選地在400 至500°C的溫度下。依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，脫水在氣相中進(jìn)行。在此，可以使 用常規(guī)的裝置(如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其用于氣相反應(yīng))，例如管式反應(yīng)器。特別優(yōu)選的 是，使用管束熱交換器以及包含熱交換板(Thermobleche)作為熱交換器的反應(yīng)器。根據(jù)氣相脫水的一個(gè)實(shí)施方案，將純的2-羥基異丁酸引入到反應(yīng)器中，所述反應(yīng) 器包含上文所提及的固定床催化劑中的一種。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，將以下述形式的2-羥 基異丁酸引入到反應(yīng)器中包含2至80重量％，特別優(yōu)選地5至50重量％，和更加優(yōu)選地 10至25重量％的2-羥基異丁酸的水溶液(各基于水溶液的總重量計(jì))。如此地來選擇反 應(yīng)器內(nèi)的壓力和溫度條件，即從而使得2-羥基異丁酸或水溶液在其進(jìn)入反應(yīng)器中時(shí)以氣 態(tài)形式存在。氣相中的脫水優(yōu)選地在200至400°C，特別優(yōu)選地250至350°C的溫度范圍內(nèi) 來進(jìn)行。在氣相脫水的情況下，反應(yīng)器內(nèi)的壓力優(yōu)選地在0. 1至50巴的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選 地在0.2至10巴的范圍內(nèi)，和最優(yōu)選地在0.5至5巴的范圍內(nèi)。在氣相脫水的情況下，引入反應(yīng)器中的2-羥基異丁酸的量?jī)?yōu)選地在10至100體 積％的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選地在20至100體積％的范圍內(nèi)，和最優(yōu)選地在30至100體積％的 范圍內(nèi)。依照根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)特別的實(shí)施方案，脫水在液相中進(jìn)行。液相脫水 同樣可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有裝置中進(jìn)行，在所述裝置中可以將流體加熱至所希
15望的反應(yīng)溫度，其中可以向所述裝置施加這樣的壓力，所述壓力足以使反應(yīng)組分在所希望 的溫度條件下保持液態(tài)。依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，液相脫水的方法包括第一步驟， 在所述步驟中，將純的2-羥基異丁酸或者包含5至100重量％，特別優(yōu)選地20至100重 量％和最優(yōu)選地50至100重量％的2-羥基異丁酸的水溶液(基于水溶液的總重量計(jì))引 入到反應(yīng)器中。如此地來選擇反應(yīng)器內(nèi)的壓力和溫度條件，即從而使得2-羥基異丁酸或水 溶液在其進(jìn)入反應(yīng)器中時(shí)以液體形式存在。依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案 (其中脫水在液相中進(jìn)行)，使2-羥基異丁酸或水溶液在脫水反應(yīng)器內(nèi)如此地經(jīng)過催化劑 固定床，從而使得液相滴流經(jīng)過催化劑顆粒的表面。這樣的程序例如可以在滴流床反應(yīng)器 中進(jìn)行。液相中的脫水優(yōu)選地在200至350°C，特別優(yōu)選地250至300°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn) 行。在液相脫水的情況下，反應(yīng)器內(nèi)的壓力優(yōu)選地在1至50巴的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選地在2 至25巴的范圍內(nèi)，和最優(yōu)選地在3至10巴的范圍內(nèi)。不僅在氣相脫水的情況下，而且在液相脫水的情況下，脫水過程的催化可以均相 地或多相地來進(jìn)行。在均相催化的情況下，首先將催化劑與純的2-羥基異丁酸或者與包含2-羥基異 丁酸的水溶液相接觸，在此所述催化劑優(yōu)選地為無機(jī)酸例如磷酸或硫酸。隨后，將如此獲得 的組合物引入到反應(yīng)器中，并在所希望的壓力和溫度條件下轉(zhuǎn)變成甲基丙烯酸。還可以考 慮獨(dú)立于2-羥基異丁酸或所述水溶液地將無機(jī)酸引入到反應(yīng)器中。在該情況下，反應(yīng)器具 有至少兩個(gè)輸入管道，一個(gè)用于2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸的水溶液，而另一個(gè)用 于催化劑。如果在滴流床反應(yīng)器中在液相中進(jìn)行脫水，那么優(yōu)選的是，將催化劑與2-羥基 異丁酸或包含2-羥基異丁酸的水溶液一起引入至反應(yīng)器的頂部區(qū)域。在異相催化的情況下，催化劑在反應(yīng)室中以固體基質(zhì)的形式存在，例如以固定床 填料的形式，以涂覆有催化劑的板(優(yōu)選地，被布置于反應(yīng)器內(nèi)的熱交換板)的形式，或者 以涂覆有催化劑的反應(yīng)器壁的形式?？赡艿姆磻?yīng)器例如描述于DE-A-198 48 208、DE-A_100 19 381和EP-A-I 234 612中。在異相催化的情況下，作為催化劑，優(yōu)選的是與無機(jī)酸相接 觸的(優(yōu)選地，用無機(jī)酸浸漬的)多孔支持體。然后，將2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁 酸的水溶液以蒸汽或液體形式與固體催化劑材料的表面相接觸。依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，2-羥基異丁酸在液相中的脫 水，在200至500毫巴的壓力下，在160至300°C，優(yōu)選地200至240°C的溫度下，并在作為 催化劑的堿金屬離子存在下進(jìn)行。在當(dāng)前的反應(yīng)條件下，可以將所產(chǎn)生的甲基丙烯酸以氣態(tài)形式與水一起蒸餾出 來，緊接著冷凝為水溶液，從而可以獲得不包含任何催化劑成分的甲基丙烯酸水溶液。依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，可以任選地使如此獲得的甲基丙 烯酸溶液進(jìn)行酯化，而無需進(jìn)一步的處理。在此，使甲基丙烯酸溶液與相應(yīng)的醇以及合適的 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酯化催化劑(例如濃酸)在加熱下相接觸，并且以這種方式將甲基 丙烯酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酯。優(yōu)選的醇尤其為各具有至少一個(gè)碳原子，優(yōu)選地2至12個(gè)，和特別優(yōu)選地4至9 個(gè)碳原子的醇。所述醇可以具有線性的、支化的或環(huán)狀的結(jié)構(gòu)。此外，所述醇可以包含芳族基團(tuán)或取代基，例如鹵素原子。優(yōu)選的醇特別地為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、ι-甲 基-丙醇、2-甲基-丙醇、叔丁醇、正戊醇、I-甲基-丁醇、2-甲基-丁醇、3-甲基-丁醇、 2，2_ 二甲基-丙醇、正己醇、1-甲基-戊醇、2-甲基-戊醇、3-甲基-戊醇、4-甲基-戊 醇、1，1-二甲基-丁醇、2，2-二甲基-丁醇、3，3-二甲基-丁醇、1，2-二甲基-丁醇、正庚 醇、1-甲基-己醇、2-甲基-己醇、3-甲基-己醇、4-甲基-己醇、1，2-二甲基-戊醇、1， 3-二甲基-戊醇、1，1_ 二甲基-戊醇、1，1，2，2-四甲基-丙醇、芐醇、正辛醇、2-乙基-己 醇、正壬醇、1-甲基-辛醇、2-甲基-辛醇、正癸醇、正i^一烷醇、1-甲基-癸醇、2-甲基-癸 醇、正十二烷醇、2，4_ 二乙基-辛醇、環(huán)戊醇、環(huán)己醇、4-叔丁基-環(huán)己醇、環(huán)庚醇、環(huán)十二烷 醇、2-( 二甲基氨基)-乙醇、3-( 二甲基氨基)-丙醇、4-( 二甲基氨基)-丁醇、5-( 二甲基 氨基)_戊醇、6_( 二甲基氨基)_己醇、8-( 二甲基氨基)-辛醇、10-( 二甲基氨基)-癸醇、 12-( 二甲基氨基)-十二烷醇、2-( 二乙基氨基)-乙醇、3-( 二乙基氨基)-丙醇、4-( 二乙 基氨基)-丁醇、5- (二乙基氨基)-戊醇、6- (二乙基氨基)-己醇、8- (二乙基氨基)-辛醇、 10- ( 二乙基氨基)-癸醇、12- (二乙基氨基)-十二烷醇、2- (二 -(異丙基)-氨基)-乙醇、 3_( 二 _(異丙基)_氨基)_丙醇、4-( 二-(異丙基)-氨基)-丁醇、5-( 二-(異丙基)-氨 基)_戊醇、6_( 二_(異丙基)_氨基)_己醇、8-( 二-(異丙基)-氨基)-辛醇、10-( 二-(異 丙基)_氨基)_癸醇、12-( 二 _(異丙基)_氨基)_十二烷醇、2-( 二丁基氨基)-乙醇、3-( 二 丁基氨基)-丙醇、4- ( 二丁基氨基)-丁醇、5- ( 二丁基氨基)-戊醇、6- ( 二丁基氨基)-己 醇、8_(二丁基氨基)_辛醇、10-( 二丁基氨基)_癸醇、12-( 二丁基氨基)-十二烷醇、2-(二 己基氨基)_乙醇、3-( 二己基氨基)_丙醇、4-( 二己基氨基)-丁醇、5-( 二己基氨基)-戊 醇、6-( 二己基氨基)-己醇、8-( 二己基氨基)-辛醇、10-( 二己基氨基)-癸醇、12-( 二己 基氨基)-十二烷醇、2-(甲基-乙基-氨基)-乙醇、2-(甲基-丙基-氨基)-乙醇、2-(甲 基-異丙基-氨基)_乙醇、2_(甲基-丁基-氨基)_乙醇、2-(甲基-己基-氨基)_乙 醇、2-(甲基-辛基-氨基)-乙醇、2-(乙基-丙基-氨基)-乙醇、2-(乙基-異丙基-氨 基)-乙醇、2-(乙基-丁基-氨基)_乙醇、2-(乙基-己基-氨基)_乙醇、2-(乙基-辛 基-氨基)-乙醇、3-(甲基-乙基-氨基)_丙醇、3-(甲基-丙基-氨基)_丙醇、3-(甲 基-異丙基-氨基)_丙醇、3_(甲基-丁基-氨基)_丙醇、3-(甲基-己基-氨基)_丙 醇、3_(甲基-辛基-氨基)_丙醇、3-(乙基-丙基-氨基)_丙醇、3-(乙基-異丙基-氨 基)_丙醇、3_(乙基-丁基-氨基)_丙醇、3-(乙基-己基-氨基)_丙醇、3-(乙基-辛 基-氨基)_丙醇、4-(甲基-乙基-氨基)_ 丁醇、4-(甲基-丙基-氨基)_ 丁醇、4-(甲 基-異丙基-氨基)_ 丁醇、4-(甲基-丁基-氨基)_ 丁醇、4-(甲基-己基-氨基)_ 丁 醇、4-(甲基-辛基-氨基)_ 丁醇、4-(乙基-丙基-氨基)_ 丁醇、4-(乙基-異丙基-氨 基)_ 丁醇、4-(乙基-丁基-氨基)_ 丁醇、4-(乙基-己基-氨基)_ 丁醇、4-(乙基-辛 基-氨基)_ 丁醇、2-(N-哌啶基)-乙醇、3-(N-哌啶基)-丙醇、4-(N-哌啶基)-丁醇、 5- (N-哌啶基)-戊醇、6- (N-哌啶基)-己醇、8- (N-哌啶基)-辛醇、10- (N-哌啶基)-癸醇、 12-(N-哌啶基)_十二烷醇、2-(N-吡咯烷基)_乙醇、3-(N-吡咯烷基)_丙醇、4-(N-吡咯 烷基)_ 丁醇、5-(N-吡咯烷基)_戊醇、6-(N-吡咯烷基)_己醇、8-(N-吡咯烷基)_辛醇、 10- (N-吡咯烷基)-癸醇、12- (N-吡咯烷基)-十二烷醇、2- (N-嗎啉代)-乙醇、3- (N-嗎啉 代)_丙醇、4-(N-嗎啉代)_ 丁醇、5-(N-嗎啉代)_戊醇、6-(N-嗎啉代)_己醇、8-(N-嗎 啉代)-辛醇、10-(N-嗎啉代)-癸醇、12-(N-嗎啉代)-十二烷醇、2-(N'-甲基-N-哌嗪基)-乙醇、3-(N'-甲基-N-哌嗪基)-丙醇、4-(N'-甲基-N-哌嗪基)-丁醇、5-(N'-甲 基-N-哌嗪基)-戊醇、6-(N'-甲基-N-哌嗪基)-己醇、8-(N'-甲基-N-哌嗪基)-辛 醇、10-(N'-甲基-N-哌嗪基)-癸醇、12-(N'-甲基-N-哌嗪基)-十二烷醇、2-(N'-乙 基-N-哌嗪基)-乙醇、3-(N'-乙基-N-哌嗪基)-丙醇、4-(N'-乙基-N-哌嗪基)-丁醇、 5-(N'-乙基-N-哌嗪基)-戊醇、6-(N'-乙基-N-哌嗪基)-己醇、8-(N'-乙基-N-哌 嗪基)_辛醇、10-(N'-乙基-N-哌嗪基)-癸醇、12-(N'-乙基-N-哌嗪基)-十二烷醇、 2-(N'-異丙基-N-哌嗪基)-乙醇、3-(N'-異丙基-N-哌嗪基)-丙醇、4-(N'-異丙 基-N-哌嗪基)-丁醇、5-(N'-異丙基-N-哌嗪基)-戊醇、6-(N'-異丙基-N-哌嗪基)-己 醇、8-(N'-異丙基-N-哌嗪基)-辛醇、10-(N'-異丙基-N-哌嗪基)-癸醇、12-(N'-異 丙基-N-哌嗪基)-十二烷醇、3-氧雜-丁醇、3-氧雜-戊醇、2，2- 二甲基-4-氧雜-戊醇、 3，6-二氧雜-庚醇、3，6-二氧雜-辛醇、3，6，9-三氧雜-癸醇、3，6，9-三氧雜^一烷醇、 4-氧雜-戊醇、4-氧雜-己醇、4-氧雜-庚醇、4，8- 二氧雜-壬醇、4，8- 二氧雜-癸醇、4， 8- 二氧雜-i^一烷醇、5-氧雜-己醇或5，10- 二氧雜-i^一烷醇。此外，作為溶劑，可以使用乙氧基化的和/或丙氧基化的醇以及乙氧基 化/丙氧基化的混合醇，特別是Ra- (O-CH2-CH2) X-0H或者Ra- (0-CH(CH3) -CH2) χ-0Η或 Ra-(O-CH2-CH(CH3))x-OH,其中Ra為C1至C20-烷基和χ為10至20的整數(shù)；或者乙氧基化 的和/或丙氧基化的氨基醇，例如Rb2N(-CH2-CH2-O) y-H 或者Rb2N(-CH(CH3) -CH2-O) y_H或 Rb2N(-CH2CH(CH3)-0)y-H，其中y為1至4的整數(shù)。Rb為具有1_6個(gè)碳原子的烷基，其中氮也 可以與取代基Rb—起形成五至六元環(huán)。任選地，所述環(huán)還可以被一個(gè)或多個(gè)短鏈烷基(例 如甲基、乙基或丙基)取代。然而，可以有利的是，還在酯化前對(duì)甲基丙烯酸進(jìn)行純化，其中原則上可以使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何純化方法來進(jìn)行純化，所述純化方法常規(guī)地用于純化被污染的、 通過丙烯的催化氣相氧化而獲得的(甲基)丙烯酸。如果脫水在氣相中進(jìn)行，那么優(yōu)選的是，首先使甲基丙烯酸冷凝，從而獲得甲基丙 烯酸水溶液。在此，原則上可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何冷凝方法，例如分級(jí)冷凝， 如在 W0-A-2004/0;35514、W0-A-03/014172 或 EP-A-EP 1 163 201 中所描述的，或者通過完 全冷凝，如在EP-A-O 695 736中所描述的。還可以考慮的是，在冷凝的情況下添加另外的 溶劑，特別是水，以便盡可能完全地吸收甲基丙烯酸。然后，可以在進(jìn)一步的純化步驟中使在冷凝后獲得的甲基丙烯酸水溶液或者在液 相脫水的情況下獲得的甲基丙烯酸水溶液去除水和其他污染物。在此，可以首先在共沸劑 存在下通過共沸蒸餾來除去水，如例如在DE-A-198 53 064中所描述的。還可以考慮的是， 使用高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑來吸收甲基丙烯酸，如例如在EP-A-O 974 574中所公開的。除了這些 蒸餾方法外，還可以使用膜來進(jìn)行除水，如例如在DE-A-44 01 405中所提出的。此外，還可 以考慮通過結(jié)晶方法來純化在液相脫水的情況下得到的或者通過冷凝獲得的甲基丙烯酸 水溶液。在除水后獲得的甲基丙烯酸可以在進(jìn)一步的步驟中更進(jìn)一步進(jìn)行純化。因此，可 以通過進(jìn)一步的蒸餾步驟來去除仍然含有的高沸點(diǎn)污染物。然而，下述情形是特別優(yōu)選的， 即通過結(jié)晶方法來進(jìn)一步純化在除水后獲得的甲基丙烯酸，如例如在DE-A-101 49 353中 所描述的。
然后，任選地，如此獲得的經(jīng)純化的甲基丙烯酸可以經(jīng)歷酯化。此外，一種用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法為解決開頭所提及的任務(wù) 作出了貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟IIA)通過上文所描述的方法來制備包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷 酸，IIB)裂解包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸從而形成2-羥基異丁酸， 以及任選地，中和2-羥基異丁酸和/或純化2-羥基異丁酸，IIC)使2-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸，以及任選地，使甲基丙烯酸鹽或 者甲基丙烯酸酯化?！N用于制備聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法也為解決開頭所提及的任 務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟11IA)通過上文所描述的方法來制備甲基丙烯酸，11 IB)甲基丙烯酸的自由基聚合，其中，任選地，在自由基聚合之前或之后，甲基丙烯酸的羧基基團(tuán)可以至少部分地 被酯化。在下面的實(shí)施例中，實(shí)例性地描述了本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明局限于在實(shí)施例 中所提及的實(shí)施方案，本發(fā)明的應(yīng)用范圍由整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中得出。下面的附圖
為實(shí)施例的組成部分。圖 1 雜合質(zhì)粒 pETlOl/D-TOPO: icmA-icmB。圖 2 雜合質(zhì)粒 pBBRlMCS-2: icmA-icmB。圖3 在給樣品摻添以2-羥基異丁酸后進(jìn)行樣品IM-86中2_羥基異丁酸的定量。 在此使用乳酸甲酯峰(保留時(shí)間7. 16分鐘)作為內(nèi)標(biāo)。描繪了經(jīng)摻添的樣品和原始樣品 的GC-MS-色譜圖片斷。圖4 將2-羥基異丁酸加至樣品IM-89。描繪了原始樣品㈧和經(jīng)摻添的樣品⑶ 的樣品NMR-譜片斷。
實(shí)施例1.基因組DNA的分離以及片段icmA和icmB的擴(kuò)增根據(jù)制造商的說明，用DNeasy Blood & Tissue 試劑盒 ^liagen GmbH, Hilden) /AAquincola tertiaricarbonis (A. tertiaricarbonis DSMZ 18512) 43^! ^ 組DNA，并將其用作PCR的模板以擴(kuò)增出片段icmA(l. 7kbp ；DQ436456)和icmB(0. 4kbp ； DQ436457)。這些片段編碼酶&。在此，使用寡核苷酸Aqt_icmA_fw 5，-CACCATGACCTGGCTTG AGCCGCAG-3’(正向引物；起始密碼子標(biāo)有下劃線)和iVqt-icmA-Hind_rev 5‘-AAAAMGCTTC CTGCTCAGAAGACCGGCGTCTCGCG-3’(反向引物；終止密碼子和Hindi11-切割位點(diǎn)標(biāo)有下劃線) 用于擴(kuò)增 icmA，和使用寡核苷酸 Aqt-icmB-Hind_fw 5，-AAAAAAGCTTCCCACCATGGACCAAATCC CGATCCGC-3’(正向引物；起始密碼子和HindIII-切割位點(diǎn)標(biāo)有下劃線)和Mt-icmB_rev 5’ -TCAGCGGGCGCCGCGCGCGGCGAC-3，(反向引物；終止密碼子標(biāo)有下劃線)用于擴(kuò)增icmB。用Pfu聚合酶(!Iomega，Madison, USA)來進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，根據(jù) SAIKI 等人，1985, Enzymatic amplification of β -globin genomic sequences and
19restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230 1350-1354)。在此，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95°C 60秒，65°C 30秒和72°C 4分鐘。PCR 的實(shí)施在循環(huán)變溫器(Primus 96 advanced ；PEQLAB Biotechno log ie GMBH, Erlangen) 中進(jìn)行。根據(jù)制造商的說明，用QIAquick PCR Purification 試劑盒 ^liagen GmbH, HiIden)來純化所述片段，緊接著用HindIII進(jìn)行限制酶切。將這兩個(gè)批料(Ansatze )經(jīng) 由該HindIII-切割位點(diǎn)進(jìn)行連接。使用連接產(chǎn)物icmA-icmBQ. ΙΙΛρ)作為Pfu-PCR的模板，其中使用寡核苷酸 Aqt-icmA_fw 5’-CACCATGACCTGGCTTGAGCCGCAG-3’ (正向引物；起始密碼子標(biāo)有下劃線)和 Aqt-icmB_rev 5，-TCAGCGGGCGCCGCGCGCGGCGAC-3，(反應(yīng)引物；終止密碼子標(biāo)有下劃線) (35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95°C 60秒，65°C 30秒和72°C 4. 5分鐘)。根據(jù)制造商的說明，將 所獲得的具有相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification試劑盒^liagen GmbH, Hil den)進(jìn)行純化。2.富養(yǎng)羅爾斯通氏菌表達(dá)載體的制備根據(jù)制造商的說明，將經(jīng)純化的PCR片段icmA-icmB (2. lkbp)連接到載體 pETlOl/D-TOPO(Invitrogen GmbH, Karlsruhe)中。將所獲得的雜合質(zhì)粒 pETlOl/ D-T0P0 icmA-icmB (圖 1,SEQ ID No. 1)轉(zhuǎn)移到感受態(tài)大腸桿菌 DH5 α 細(xì)胞(New England Biolabs, Frankfurt)中，并通過限制酶切和測(cè)序來進(jìn)行檢查。為了達(dá)到在富養(yǎng)羅爾斯通氏菌菌株(其在作為野生型的情況下具有酶Ep E2 和&的活性)中進(jìn)行表達(dá)，必須將構(gòu)建體克隆到合適的泛宿主性(broad-host-range) 載體中。所使用的載體為pBBRlMCS-2，其描述于KOVACH等人，(199 . Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166 :175-176 中。為此，用酶XbaI 和 SacI 對(duì)質(zhì)粒 pET101/D-T0P0: icmA-icmB 和 pBBRlMCS-2 進(jìn) 行限制酶切，并將片段icmA-icmB連接到目標(biāo)載體pBBRlMCS-2中，并且用所產(chǎn)生的雜合 質(zhì)粒pBBRlMCS-2: icmA-icmB(圖2，SEQ ID No. 2)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α細(xì)胞(New England Biolabs, Frankfurt)。通過限制酶切和測(cè)序?qū)υ撡|(zhì)粒進(jìn)行檢查，并將其轉(zhuǎn)移到感受態(tài)大腸桿菌S17-1細(xì) 胞(使用該菌株可能實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移，尤其是在富養(yǎng)羅爾斯通氏菌菌株中)中。為 此，用大腸桿菌S17-lpBBRlMCS-2: icmA-icmB作為供者和用富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16 (重新 分類為鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)，DSMZ 428)及富養(yǎng)羅爾斯通氏菌PHB-4 (重 新分類為鉤蟲貪銅菌，DSMZ 541)作為受者進(jìn)行點(diǎn)交配接合(Spotmating-Konjugation) (如描述于 FRIEDRICH 等人，1981， Naturally occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus.J Bacteriol 147 :198-205 中)?？梢垣@得攜帶質(zhì)粒pBBRlMCS-2: icmA-icmB的轉(zhuǎn)接合子。3.在重組的富養(yǎng)羅爾斯通氏菌細(xì)胞中產(chǎn)生2-羥基異丁酸為了研究2-羥基異丁酸的形成，使在實(shí)施例2中所描述的攜帶質(zhì)粒的富養(yǎng)羅爾斯 通氏菌菌株在 50mL VoIlbrecht-MSM-培養(yǎng)基((NH4) 2HP04，2. Og ；KH2PO4, 2. Ig ；MgS04X7H20,0. 2g ；FeCl3X6H20，6mg ；CaCl2X2H20, IOmg ；痕量元素溶液(Pfennig 禾口 Lippert, 1966)， 0. ImL)中生長(zhǎng)。另外，給該培養(yǎng)基補(bǔ)充葡糖酸鈉(15g/L)、卡那霉素(50 μ g/mL)和輔酶 B12 (60 μ g/mL)。將細(xì)胞在30°C和160rpm下在溫控?fù)u床上進(jìn)行溫育。在30小時(shí)后，再次進(jìn) 料葡糖酸鈉(1.5%,w/v)和輔酶B12 (60 μ g/mL)。在培養(yǎng)52小時(shí)后，通過在5000rpnK4°C ) 下離心來進(jìn)行收獲。將培養(yǎng)物上清液貯存于-20°C直至分析。借助于定量1H-NMR-光譜學(xué)進(jìn)行2_羥基異丁酸的檢測(cè)和定量。將樣品定量地進(jìn) 行濃縮。從殘留物中記錄1H-NMR-譜，并計(jì)算相對(duì)于作為內(nèi)標(biāo)的TSP(三甲硅烷基丙酸)的 含量。2-羥基異丁酸在該譜中在大約1. 36ppm處顯示出單峰，并且為了保險(xiǎn)起見，添加了純 物質(zhì)(圖3)。在經(jīng)分析的樣品中，檢測(cè)到最大0.72mmol/kg的2-羥基異丁酸的濃度。與此相反， 在具有空質(zhì)粒的相應(yīng)對(duì)照批料中，沒有檢測(cè)到2-羥基異丁酸。借助于GC-MS和添加純物 質(zhì)2-羥基異丁酸來定量地和定性地確認(rèn)所述NMR-測(cè)量結(jié)果(圖4)。在該情況下，在30m Rtx-1701毛細(xì)管柱(Fisher Scientific, Pittsburgh, USA)上進(jìn)行色譜分離。在凍干后， 用衍生化試劑“Methelute” (Pierce, Rockford, USA)吸收樣品。通過分流/不分流注射器 (Split-/splitless-Injektor)直接進(jìn)樣0. 5 μ L該溶液。通過用數(shù)據(jù)庫(kù)譜圖調(diào)整該質(zhì)譜來 進(jìn)行2-羥基異丁酸峰的鑒定。為了評(píng)定2-羥基異丁酸的含量，給樣品摻添以確定量的比 較物質(zhì)2-羥基異丁酸。在經(jīng)分析的樣品中，檢測(cè)到最大44μ g/mL的濃度。在具有空質(zhì)粒 的對(duì)照批料中，沒有檢測(cè)到2-羥基異丁酸。類似地，從作為碳源的果糖(1.5%，w/v)開始 合成，也可以檢測(cè)到2-羥基異丁酸。4.將2-羥基異丁酸脫水成甲基丙烯酸在攪拌下向5ml根據(jù)實(shí)施例3產(chǎn)生的2-羥基異丁酸溶液(0. 2g/L)中摻入 NaOH (0. 06mg)。在真空下(300托)于185-195°C在攪拌和回流冷凝下使該溶液進(jìn)行溫育。 在5小時(shí)的時(shí)間段期間，每小時(shí)再次添加在5mL中的0. 5mg 2-羥基異丁酸，其包含0. 4重 量％的對(duì)甲氧基苯酚，以防止甲基丙烯酸聚合。在溫育M小時(shí)后，結(jié)束反應(yīng)。2-羥基異丁 酸向甲基丙烯酸的轉(zhuǎn)化合計(jì)超過90%。通過蒸餾從該反應(yīng)批料中分離出甲基丙烯酸。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞，其如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比，它能夠形成更多的2-羥基 異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸，其特征在于，2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作 為初產(chǎn)物的3-羥基丁酰輔酶A來實(shí)現(xiàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有酶&的至少一種活性，所述酶&催化3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為2-羥基異丁酰輔酶A。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言提高的酶&的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中至少一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在作為野生型的情況下具有 酶&的活性，所述酶&催化3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為聚羥基丁酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言降低的酶E4的活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中至少一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在作為野生型的情況下具有 酶&的活性，所述酶&催化3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為巴豆酰輔酶A。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言降低的酶&的活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3中至少一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在作為野生型的情況下具有 酶&的活性，所述酶&催化R-3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為S-3-羥基丁酰輔酶A。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中至少一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有至少一種相比于其野生 型而言降低的至少一種酶E7的活性，所述酶E7接受3-羥基丁酰輔酶A作為底物。
10.用于制備2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的方法，所 述方法包括下列步驟a)在從碳源形成2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的條件 下，使根據(jù)權(quán)利要求1至9中至少一項(xiàng)的細(xì)胞與包含碳源的培養(yǎng)基相接觸，以及任選地b)從培養(yǎng)基中純化出2-羥基異丁酸，或者從細(xì)胞中純化出包含2-羥基異丁酸單體單 元的聚羥基鏈烷酸。
11.用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法，所述方法包括下列步驟IA)通過根據(jù)權(quán)利要求10的方法來制備2-羥基異丁酸，以及任選地，純化和/或中和 2-羥基異丁酸，IB)使2-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸，以及任選地，使甲基丙烯酸鹽或者甲 基丙烯酸酯化。
12.用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法，所述方法包括下列步驟IIA)通過根據(jù)權(quán)利要求10的方法來制備包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸，IIB)裂解包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸從而形成2-羥基異丁酸，以及 任選地，中和2-羥基異丁酸和/或純化2-羥基異丁酸，IIC)使2-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸，以及任選地，使甲基丙烯酸鹽或者甲 基丙烯酸酯化。
13.用于制備聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法，所述方法包括下列步驟IIIA)通過根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法來制備甲基丙烯酸， 11 IB)甲基丙烯酸的自由基聚合，其中，任選地，在自由基聚合之前或之后，甲基丙烯酸的羧基基團(tuán)可以至少部分地被酯
全文摘要
本發(fā)明的目標(biāo)為細(xì)胞，其如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比，它能夠形成更多的2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸，其特征在于，2-羥基異丁酸或包含2-羥基異丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的3-羥基丁酰輔酶A來實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102076864SQ200980124253
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者A·馬克斯, L·賴內(nèi)克, M·珀特, S·沙費(fèi)爾, T·哈斯 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)羅姆有限公司