專利名稱：高糖基化人凝血因子ix的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高糖基化人凝血因子IX多肽、用于制備所述多肽的方法、包含所述多 肽的藥物組合物以及所述化合物在治療通過(guò)人凝血因子IX緩解的疾病中的用途，特別是 但非唯一地在治療血友病中的用途。
背景技術(shù)：
凝血因子IX(FIX)是結(jié)構(gòu)類似于凝血因子VII、凝血酶原、凝血因子X(jué)和蛋白C的 維生素K依賴性凝血因子。循環(huán)中的人FIX酶原由被分成四個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域的415個(gè)氨基 酸組成，這四個(gè)結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)N端富含Y-羧基谷氨酸(Gla)的結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域 和一個(gè)C-端胰島素樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。FIX的活化通過(guò)在Arg145-Ala146和Arg18tl-Val181 處的限制性蛋白水解釋放35個(gè)氨基酸的活化肽而發(fā)生(khmidt AE和Bajaj SP(2003) Trends in Cardiovascular Medicine 13,39-45) 野生型人凝血因子 IX(SEQ ID NO :1) 具有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(W57和N167)。一些蛋白的半壽期可通過(guò)在野生型蛋白中未被糖基化的氨基酸位置添加N-聚 糖來(lái)延長(zhǎng)(Sinclair AM 禾口 Elliott，S (2005) Journal ofPharmaceutical Sciences 94， 16沈-1635的綜述)。N-聚糖通過(guò)產(chǎn)生蛋白的真核細(xì)胞連接在該蛋白上。隨著新生蛋白從 核糖體轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞的N-糖基化機(jī)構(gòu)(machinery)識(shí)別并糖基化氨基酸鏈的N-糖 基化信號(hào)(N-X-S/T 基序)(Kiely 等(1976)Journal of Biological Chemistry 251， 5490-5495 ;Glabe等(1980) Journal of Biological Chemistry 255，9236-9242)。因此，糖 基化改造(glycoengineered)的蛋白可通過(guò)引入添加N-糖基化位點(diǎn)至蛋白的氨基酸序列 的突變來(lái)制備。該原理已應(yīng)用于獲得長(zhǎng)效的第二代促紅細(xì)胞生成素(Aranesp , Amgen)。 此類糖基化改造在生物藥劑學(xué)的生產(chǎn)方面非常有吸引力，這是由于最終延長(zhǎng)的蛋白分泌至 生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基中。因此，與PEG化不同，糖基化改造不會(huì)使下游加工復(fù)雜化并增加下游 處理的成本。此外，高糖基化可屏蔽蛋白表位(Cheng-Mayer等(1999) Journal of Virology 73,5294-5300)并通過(guò)增大蛋白的溶解度減少聚集(Song等Q001)FEBS Letters 491， 63-66)。實(shí)際上，糖基化改造還可通過(guò)減少蛋白的免疫原性來(lái)改良重組蛋白，從而減少患者 形成針對(duì)該蛋白的中和抗體的風(fēng)險(xiǎn)。有趣的是，N-聚糖對(duì)清除的影響會(huì)隨蛋白的不同而變化。個(gè)別蛋白不受N-聚糖 的去除或添加的影響。相比之下，某些蛋白在其N-聚糖缺失下清除得更快，而如上所述，某 些蛋白的清除可通過(guò)添加額外的N-聚糖延遲(Elliott等Q003)Nature Biotechnology 21,414-421 ；Perlman φ (2003)Journal of Clinical Endocrinology 禾口 Metabolism 88， 3227-3235)。N-聚糖影響某些蛋白的清除的機(jī)制是未知的并且可隨蛋白而變化。對(duì)于促 卵泡激素，已提出用大小增加和來(lái)自唾液酸的負(fù)電荷增加而造成腎清除率減小來(lái)解釋由額 外的N-聚糖誘導(dǎo)的清除的延遲(Perlman等Q003)，見(jiàn)上文)。已知添加額外的N-聚糖 而延長(zhǎng)的蛋白主要是相對(duì)小的蛋白，其符合對(duì)腎清除率的影響。但對(duì)于促紅細(xì)胞生成素， 仍待出現(xiàn)確鑿的證據(jù)證明腎或肝清除率的重要影響。在結(jié)合促紅細(xì)胞生成素受體后，被骨 髓中的細(xì)胞內(nèi)化的促紅細(xì)胞生成素的胞內(nèi)降解，已被認(rèn)為是清除循環(huán)促紅細(xì)胞生成素的主要機(jī)制(Jelkman、(2002) European Journal of Haematology 69，265-274 的綜述)。與野 生型促紅細(xì)胞生成素相比，長(zhǎng)效的高糖基化促紅細(xì)胞生成素與促紅細(xì)胞生成素受體的親和 力降低(Elliott 等(2004)Experimental Hematology 32，1146-1155)，并且近來(lái)的證據(jù)顯 示受體親和力減小和受體介導(dǎo)的降解較慢之間有聯(lián)系，從而導(dǎo)致較長(zhǎng)的循環(huán)半壽期(Gross 和 Lodish，(2006) Journal of Biological Chemistry 281，2024-2032)。有趣的是，高 糖基化促紅細(xì)胞生成素與受體結(jié)合減少似乎起因于唾液酸含量增加(Elliott等Q004) Experimental Hematology 32，1146-115 。高糖基化促紅細(xì)胞生成素的體外活性相對(duì)于 野生型促紅細(xì)胞生成素顯著減小，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是，當(dāng)N-聚糖在野生型蛋白 中不被糖基化的位點(diǎn)處引入蛋白時(shí)，必然預(yù)料到比活性大量減小。US 2003/0036181 (Maxygen, Inc.)描述了 向多肽添加糖基化位點(diǎn)。EP 0640619 (Amgen he.)描述了具有另外的糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物。Mimuro等 (2004) Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2, 275-280 ffi^T^W^H 260 ^ 酸處引入N-糖基化位點(diǎn)的突變A262T的人凝血因子IX。因此對(duì)提供人因子IX的改良變體存在很大的需求，與野生型人因子IX相比， 所述變體顯示增加的體內(nèi)循環(huán)半壽期但并不顯著降低蛋白水解活性或凝血活性(clot activity)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的第一個(gè)方面提供具有一個(gè)或多個(gè)突變的人因子IX多肽類似物，其中所 述突變導(dǎo)致在所述多肽中引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供糖基化人因子IX多肽類似物，其中所述多肽相對(duì)于野 生型人因子IX多肽在除m57或m67之外的一個(gè)或多個(gè)位置被糖基化。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療血友病的方法，其包括給予患者治療有效量的如上 文定義的多肽。附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了培養(yǎng)基中的因子IX蛋白的蛋白印跡，該因子IX蛋白來(lái)自用編碼野 生型人凝血因子IX的PTS87或用編碼高糖基化人凝血因子IX變體的PGB071、pGB072、 pGB073、pGB074或pGB075瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293F細(xì)胞，所述變體具有在野生型人凝血因子IX 中不存在的一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(實(shí)施例2)。圖2描述了與圖1所示相同的培養(yǎng)基經(jīng)PNGase F處理時(shí)的蛋白印跡(實(shí)施例2)。圖3描述了培養(yǎng)基中的因子IX蛋白的蛋白印跡，所述因子IX蛋白來(lái)自用編碼高 糖基化(H)人凝血因子IX(FIX-T172N-K2^N-I251IW^62T)的pGB022或用編碼野生型(W) 人凝血因子IX的PTS87瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293F細(xì)胞。該培養(yǎng)基在SDS-PAGE之前與或不與 PNGase F溫育(實(shí)施例4)。圖4描述了在用高糖基化重組人凝血因子IX變體 FIX-T172N-K2^N-I251IW^62T (填充框)或重組野生型人凝血因子IX(空心環(huán))注射的凝 血因子IX敲除小鼠的血漿中，平均FIX抗原濃度與時(shí)間的關(guān)系曲線(實(shí)施例7)。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一個(gè)方面提供具有一個(gè)或多個(gè)突變的人因子IX多肽類似物，其中所 述突變導(dǎo)致在所述多肽中引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供糖基化人因子IX多肽類似物，其中所述多肽相對(duì)于野 生型人因子IX多肽在除m57或m67之外的一個(gè)或多個(gè)位置被糖基化。意想不到地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的高糖基化多肽類似物顯示凝血因子IX延長(zhǎng)的循環(huán)半 壽期，從而減少治療用肽的給藥頻率和/或增加與治療用肽的接觸。本文所用術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“多肽”和“肽”意指由經(jīng)肽鍵連接的至少五個(gè)組成型氨基 酸組成的化合物。所述組成型氨基酸可來(lái)自由遺傳密碼編碼的氨基酸，并且它們可為并非 由遺傳密碼編碼的天然氨基酸以及合成的氨基酸。并非由遺傳密碼編碼的天然氨基酸為例 如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的氨基 酸包括通過(guò)化學(xué)合成制得的氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體例如D-丙氨 酸和D-亮氨酸、Aib ( α -氨基異丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、Tie (叔丁基甘氨酸)、β -丙 氨酸、3-氨甲基苯甲酸和鄰氨基苯甲酸。本文所用的提及多肽的術(shù)語(yǔ)“類似物”意指一種修飾的肽，其中所述肽的一個(gè)或多 個(gè)氨基酸殘基已被其它的氨基酸殘基取代，和/或其中已從所述肽中缺失一個(gè)或多個(gè)氨基 酸殘基，和或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被添加至所述肽中。氨基酸殘基的此類添加或 缺失可發(fā)生在肽的N端和/或肽的C端。對(duì)于未說(shuō)明旋光異構(gòu)類型的所有氨基酸，其都應(yīng) 理解為意指L-異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)突變導(dǎo)致多肽中引入一個(gè)或多個(gè)N-糖基化 位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)突變導(dǎo)致因子IX多肽類似物與野生型多肽 相比分子量增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)突變導(dǎo)致因子IX多肽類似物與野生型多肽 相比等電點(diǎn)更偏酸性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與野生型多肽相比，所述一個(gè)或多個(gè)突變導(dǎo)致因子IX多肽類 似物的蛋白水解活性和/或凝血活性發(fā)生不超過(guò)0、1、2、5、10、20、50或100倍的減少。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)突變導(dǎo)致因子IX多肽類似物的蛋白水解活性和/或凝 血活性與野生型多肽相比發(fā)生不超過(guò)0倍的減少。細(xì)胞的N-糖基化機(jī)構(gòu)糖基化N-X-S/T基序中的天冬酰胺殘基，并且潛在的N-糖 基化位點(diǎn)可通過(guò)建立此類基序的氨基酸變換而被引入蛋白中。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中， 多肽內(nèi)的突變摻入了一個(gè)或多個(gè)N-X-S/T基序。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè) N-X-S/T基序優(yōu)選建立在其中作為“N”的殘基具有超過(guò)25%的相對(duì)側(cè)鏈表面可接近性 (relative side-chain surface accessibility)的^f立:S。應(yīng)理解的是，對(duì)于重鏈和EGF2結(jié)構(gòu)域的表面可接近性可從已公開(kāi)的晶體學(xué)數(shù)據(jù) 計(jì)算出來(lái)(1RFN，Hopfner 等(1999) Mructure withFolding and Design 7，989_96)，而對(duì) 于GLA和EGFl結(jié)構(gòu)域的計(jì)算可基于從豬FDCa的晶體(及局部建模的)結(jié)構(gòu)建立的同源 模型(1PFX, Brandstetter 等(1995) Proceedings of the National Acedemy of Science ofthe USA 92,9796-9800)。此外，活化肽中沒(méi)有可用的結(jié)構(gòu)信息的殘基被認(rèn)為是重要的。 因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有超過(guò)25 %的相對(duì)側(cè)鏈表面可接近性的殘基可選自以下中 的一個(gè)或多個(gè)YU S3、G4、F9、V10, Qll、G12、R16、K22、R29、T35、R37、T39、F41、W42、Q44、V46、D47、G48、D49、Q50、E52、S53、N54、L57、N58、G59、S61、K63、D65、166、N67、S68、Y69、E70、 W72、P74、F77、G79、K80、N81、E83、L84、D85、V86、T87、N89、190、K91、N92、R94、K100、N101、 S102、A103、D104、N105、K106、V108、S110、E113、G114、R116、E119、N120、Q121、K122、S123、 E125、P126、V128、P129、F130、R134、V135、S136、S138、Q139、T140、S141、K142、A146、E147、 A148、V149、F150、P151、D152、V153、D154、Y155、V156、S158、T159、E160、A161、E162、T163、 I164、L165、D166、I168、T169、Q170、S171、T172、Q173、S174、F175、N176、D177、F178、T179、 R180、G183、E185、D186、K188、P189、K201、V202、D203、E213、E224、T225、G226、K228、E239、 E240、T241、H243、K247、N249、I251、R252、I253、P255、H257、N258、N260、A261、A262、1263、 N264、K265、A266、D276、E277、P278、V280、N282、S283、Y284、D292、K293、E294、N297、1298、 K301、F302、G303、S304、Y306、R312、F314、H315、K316、G317、R318、S319、L321、V322、Y325、 R327、P329、L330、D332、R333、A334、T335、L337、R338、K341、F342、T343、Y345、N346、H354、 E355、G357、R358、Q362、E372、E374、G375、E388、M391、K392、G393、K394、R403、N406、K409、 F410、K411和 K413。因此野生型人因子IX內(nèi)的上述氨基酸位置表示用于引入N-糖基化位點(diǎn)的潛在靶
點(diǎn)ο因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向具有超過(guò)25%的相對(duì)側(cè)鏈表面可接近性的N殘 基的一個(gè)或多個(gè)突變，可選自Y1N、S3N+K5S/T、G4N+L6S/T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/ Τ、G12N+L14S/T、R16N+C18S/T、Κ22Ν、R29N+V31S/T、T35N+R37S/T、R37N、T39N+F41S/T、 F41N+K43S/T、W42N+Q44S/T、Q44N+V46S/T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、 D49N+C51S/T、Q50N+E52S/T、Ε52Ν+Ν54Τ、S53N+P55S/T、C56S/T、L57N+G59S/T、G60S/T、 S61N+K63S/T、K63N+D65S/T、D65N+N67S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、Y69N+C71S/T、S68N+E70S/ Τ、E70N+W72S/T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、F77N+G79S/T、G79N+N81S/T、K80N+C82S/ Τ、E83S/T、E83N+D85S/T、L84N+V86S/T、D85N、V86N+C88S/T、T87N+N89S/T、I90N+N92S/T、 K91S/T、I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94S/T、R94N+E96S/T、Κ100Ν、A103S/T、S102N+D104S/ Τ、A103N+N105S/T、D104N+K106S/T、V107S/T、K106N+V108S/T、V108N+V110S/T、S110N、 E113N+Y115S/T、G114N+R116S/T、R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/ Τ、K122N+C124S/T S123N+E125S/T、E125N+A125S/T、P126N+V128S/T、V128N+F130S/ Τ、P129N+P131S/T、F130N+C132S/T、R134N、V135N+V137S/T、S136N、S138N、Q139N、 T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、Κ142Ν、A146N+A148S/T、E147N+V149S/T、A148N+F150S/ Τ、V149N+P515S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、 D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/ T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+I168S/ Τ、I168N+Q170S/T、Τ169Ν、Q170N、S171N+Q173S/T、Τ172Ν、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/ Τ、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、F178N+R180S/T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/ Τ、G183+E185S/T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/ Τ、K201N+D203S/T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/T、E213N+W215S/T、E224N+G226S/ Τ、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、Κ228Ν、Ε239Ν、E240N+E242S/T、T241N+H243S/T、 H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、I251S/T、I251N+I253S/T、R252N+I254S/T、I253N+P255S/ Τ、P255N+H257S/T、H257N+Y259S/T、N260S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、K265N+N267S/T、A266N+H268S/T、D276N+P278S/T、P278N+V280S/ T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、Y284S/T、S283N+V285S/T、Y284N、D292N+K294S/T、 K293N+Y295S/T、E294N、F299S/T、I298N+L300S/T、K301N+G303S/T、F302N、G303N+G305S/ T、S304N+Y306S/T、Y306N+S308S/T、R312N+F314S/T、F314N+K316S/T、H315N+G317S/T、 K316N+R138S/T、G317N、R318N+A320S/T、S319N+L321S/T、L321N+L323S/T、V322N+Q324S/T、 Y325N+R327S/T、R327N+P329S/T、P329N+V331S/T、L330N+D332S/T、D332N+A334S/T、R333N、 A334N+C336S/T、T335N+L337S/T、L337N、R338N、K341N、F342N+I344S/T、T343N+Y345S/ T、Y345N+N347S/T、M348S/T、H354N+G356S/T、E355N+G357S/T、G357N+D359S/T、R358N、 Q362N+D364S/T、E372N+E374S/T、E374N、G375N、E388N+A390S/T、M391N+G393S/T、 K392N+K394S/T、G393N+Y395S/T、K394N+G396S/T、R403N+V405S/T、I408S/T、K409N+K411S/ T、E410N、K411N+K413S/T 和 K413N。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)N-X-S/T基序優(yōu)選建立在其中作為“N”的 殘基具有超過(guò)50%的相對(duì)側(cè)鏈表面可接近性的位置。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，具有超過(guò) 50%的相對(duì)側(cè)鏈表面可接近性的殘基可選自以下中的一個(gè)或多個(gè)YU S3、G4、F9、V10, Qll、K22、R37、Q44、V46、D47、G48、Q50、E52、S53、N54、L57、 G59、S61、I66、N67、S68、E70、W72、P74、K80、L84、T87、N89、I90、K91、R94、K100、N101、S102、 A103、D104、N105、K106、V108、E113、R116、E119、N120、Q121、S123、E125、P129、S138、T140、 S141、K142、A146、E147、A148、V149、F150、P151、D152、V153、D154、Y155、V156、S158、T159、 E160、A161、E162、T163、1164、L165、D166、1168、T169、Q170、S171、T172、Q173、S174、F175、 N176、D177、F178、T179、R180、G183、E185、D186、K188、P189、K201、V202、D203、E224、T225、 G226、K228、E239、E240、T241、H243、K247、N249、R252、P255、H257、N260、A261、A262、1263、 K265、E277、V280、D292、K293、E294、K301、G303、F314、K316、R318、L321、R327、D332、R333、 R338、K341、F342、T343、H354、E355、G357、E372、E374、G375、M391、K392、G393、N406、E410 和 K413。因此野生型人因子IX內(nèi)的上述氨基酸位置表示用于引入N-糖基化位點(diǎn)的潛在靶
點(diǎn)ο因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向具有超過(guò)50%的相對(duì)側(cè)鏈表面可接近性的N殘基 的一個(gè)或多個(gè)突變可選自YIN、S3N+K5S/T、G4N+L6S/T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/T、K22N、R37N、Q44N+V46S/ T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、Q50N+E52S/T、E52N+N54T, S53N+P55S/T, C56S/T、L57N+G59S/T、S61N+K63S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/ T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、K80N+C82S/T、L84N+V86S/T、T87N+N89S/T、K91S/T、 I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94N+E96S/T、K100N、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/ Τ、 D104N+K106S/T、 V107S/T、 K106N+V108S/T、 V108N+V110S/T、 El13N+Y115S/T、 R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、S123N+E125S/T、E125N+A125S/ Τ、P129N+P131S/T、S138N、T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、K142N、A146N+A148S/T、 E147N+V149S/T、A148N+F150S/T、V149N+P515S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、 D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/ T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+1168S/T、1168N+Q170S/T、T169N、Q170N、S171N+Q173S/T、 T172N、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/T、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、F178N+R180S/ T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/T、G183+E185S/T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/ T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/T、K201N+D203S/T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/ T、E224N+G226S/T、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、K228N、E239N、E240N+E242S/T、 T241N+H243S/T、H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、I251S/T、R252N+I254S/T、P255N+H257S/ T、H257N+Y249S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、 K265N+N267S/T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、D292N+K294S/T、K293N+Y295S/T、E294N、 K301N+G303S/T、G303N+G305S/T、F314N+K316S/T、K316N+R138S/T、R318N+A320S/T、 L321N+L323S/T、R327N+P329S/T、D332N+A334S/T、R333N、R338N、K341N、F342N+I344S/T、 T343N+Y345S/T、H354N+G356S/T、E355N+G357S/T、G357N+D359S/T、E372N+E374S/T、E374N、 G375N、M391N+G393S/T、K392N+K394S/T、G393N+Y395S/T、I408S/T、E410N 和 K413N。應(yīng)理解的是，更優(yōu)選在第1位已含有N或第3位已含有S/T的位置引入N-糖基化 位點(diǎn)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)N-X-S/T基序?qū)?yōu)選建立在其中作為“N” 的殘基選自以下中的一個(gè)或多個(gè)的位置YU K22、R37、N54、N58、N67、N81、D85、N89、N92、K100、NlOU N105、S110、N120、 R134、S136、S138、Q139、K142、V156、A161、T169、Q170、T172、N176、D177、K228、E239、N249、 N258、N260、N282、Y284、E294、N297、F302、G317、R333、L337、R338、K341、N346、R358、E374、 G375、N406、E410 和 K413。因此野生型人因子IX內(nèi)的上述氨基酸位置表示用于引入N-糖基化位點(diǎn)的潛在靶
點(diǎn)ο因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向在第1位已含有N或第3位已含有S/T的殘基的一 個(gè)或多個(gè)突變可選自YIN、K22N、R37N、C56S/T、G60S/T、Y69S/T、E83S/T、D85N、K91S/T、R94S/T、K100N、 A103S/T、V107S/T、S110N、K122S/T、R134N、S136N、S138N、Q139N、K142N、V156N、A161N、 T169N、Q170N、T172N、F178S/T、D177N、K228N、E239N、I251S/T、N260S/T、A262S/T、Y284S/T、 Y284N、E294N、F299S/T、F302N、G317N、R333N、L337N、R338N、K341N、M348S/T、G358N、E374N、 G375N、I408S/T、E410N 和 K413N。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)突變選自以下中的一個(gè)或多個(gè)T172N、K228N、I251T 和 A262T。因此所述一個(gè)或多個(gè)糖基化位置可選自T172、K228、N249 和 N260。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)突變不包括作為因子IX多肽內(nèi)的單突變的 A262T。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高糖基化多肽含有至少一個(gè)聚糖。本發(fā)明的肽和藥物組合物可用于治療通過(guò)給予人凝血因子IX緩解的疾病或凝血 因子替代療法，所述疾病例如為出血障礙，例如血友病、血液病、關(guān)節(jié)積血、血腫、皮膚粘膜 出血、遺傳性血液病、家族性出血障礙或家族性血液病。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)給予人凝 血因子IX緩解的疾病為血友病，例如血友病B或克里斯馬氏病(Christmas disease)。
因此本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種治療血友病的方法，所述方法包括給予患者治 療有效量的如上文定義的多肽。還提供用于治療血友病的如上文定義的多肽。還提供如上文定義的多肽在生產(chǎn)用于治療血友病的藥物中的用途。還提供了用于治療血友病的包含如上文定義的多肽的藥物組合物。本文所用術(shù)語(yǔ)“療法”和“治療”意指以對(duì)抗諸如疾病或病癥等的病狀為目的處理 和護(hù)理患者。所述術(shù)語(yǔ)旨在包括對(duì)于患者正在遭受的既定病狀的全方位的治療，例如給予 活性化合物，以緩解癥狀或并發(fā)癥、以推遲疾病、病癥或病狀的進(jìn)展、以緩解或減輕癥狀和 并發(fā)癥、和/或以治愈或消除疾病、病癥或病狀以及以預(yù)防病狀，其中預(yù)防應(yīng)理解為出于對(duì) 抗疾病、病狀或病癥的目的處理和護(hù)理患者并且包括給予活性肽以預(yù)防癥狀或并發(fā)癥的發(fā) 病。被治療的患者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物、特別為人，但其還可包括動(dòng)物，例如狗、貓、牛、羊和豬。 應(yīng)理解的是，治療性和預(yù)防性(預(yù)防的)方案表示本發(fā)明的單獨(dú)的方面。本文所用“治療有效量”的肽意指足以治愈、緩解或部分阻止既定疾病及其并發(fā)癥 的臨床表現(xiàn)的量。足以實(shí)現(xiàn)以上目的的量定義為“治療有效量”。對(duì)于各種目的的有效量將 取決于疾病或損傷的類型和嚴(yán)重性以及受試者的重量和一般狀況。應(yīng)理解的是，確定合適 的劑量可利用常規(guī)試驗(yàn)，通過(guò)構(gòu)造值的矩陣并測(cè)試矩陣中不同點(diǎn)實(shí)現(xiàn)，這全部在受過(guò)訓(xùn)練 的醫(yī)師或獸醫(yī)的普通技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于制備如上文定義的多肽類似物的方法，所述方法包 括以下步驟(a)位點(diǎn)定向誘變?nèi)艘蜃覫X以將一個(gè)或多個(gè)N-X-S/T基序摻入至編碼人因子IX 的DNA中；(b)將所得核酸構(gòu)建體(nucleic construct)轉(zhuǎn)染至生產(chǎn)細(xì)胞中；以及(c)從轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化所述多肽類似物。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供編碼如上文定義的人因子IX多肽類似物的核酸構(gòu)建 體。本文所用術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”旨在表示cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA來(lái)源的 任何核酸分子。術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”旨在表示可為單鏈或雙鏈的核酸片段，并且其可基于編碼目 標(biāo)肽的完整或部分的天然存在的核苷酸序列。所述構(gòu)建體可任選含有其它的核酸片段。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可適當(dāng)?shù)貫榛蚪M來(lái)源或cDNA來(lái)源的，例如通過(guò)制備基因 組文庫(kù)或 cDNA 文庫(kù)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(cf. J. Sambrook 等，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor,New York)利用合成的寡核苷酸探針通 過(guò)雜交篩選編碼全部或部分所述肽的DNA序列而獲得，并如本領(lǐng)域已知的通過(guò)引入相應(yīng)突 變而獲得的。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體還可由已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)合成來(lái)制備，例如Beaucage 和 Caruthers， Tetrahedron Letters 22,1859-1869(1981)描述的亞磷酰胺法 (phosphoamidite method) ^Matthes ^. ,EMBO Journal3,801-805 (1984)中
依據(jù)所述亞磷酰胺法，將寡核苷酸合成(例如在自動(dòng)DNA合成儀中)、純化、退火、連接并克 隆至合適的載體中。此外，所述核酸構(gòu)建體可為合成和基因組混合來(lái)源的、合成和cDNA混合來(lái)源的或基因組和cDNA混合來(lái)源的構(gòu)建體，其依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)連接合成來(lái)源、基因組來(lái)源或 cDNA來(lái)源(根據(jù)合適的情況)的片段即與完整核酸構(gòu)建體的各部分對(duì)應(yīng)的片段來(lái)制備。所述核酸構(gòu)建體還可利用例如如US 4，683，202或Saiki等，Science239, 487-491(1988)中所述的特異引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體為DNA構(gòu)建體，該術(shù)語(yǔ)在以下為了便利 將專門使用。以下的陳述還可在適當(dāng)?shù)恼{(diào)整下理解為本發(fā)明的其它核酸構(gòu)建體，這對(duì)于本 領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是清楚的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的重組載體。插入了本 發(fā)明的DNA構(gòu)建體的重組載體可為適宜地經(jīng)過(guò)重組DNA操作的任何載體，并且載體的選擇 將通常取決于其被引入的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可為自主復(fù)制型載體，即作為染色體外 的實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘撸鲚d體可在引入宿主 細(xì)胞時(shí)整合進(jìn)該宿主細(xì)胞基因組，并隨其所整合進(jìn)的染色體一同復(fù)制。載體可為其中編碼本發(fā)明肽的DNA序列可操作地連接至DNA轉(zhuǎn)錄所需的另外的片 段的表達(dá)載體。一般而言，所述表達(dá)載體來(lái)源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可含有以上兩者的元件。 術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”表示排列這些片段以使它們的功能與其預(yù)期目的一致，例如轉(zhuǎn)錄起始 于啟動(dòng)子并沿編碼肽的DNA序列前進(jìn)。所述啟動(dòng)子可為在所選宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并且可來(lái)源 于編碼與所述宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白的基因。若有必要，編碼本發(fā)明肽的DNA序列還可以可操作地與合適的終止子連接，例 如人生長(zhǎng)激素終止子O^lmiter等，在引文中列舉)或(對(duì)于真菌宿主)TPIl (Alber和 Kawasaki，在引文中列舉)或ADH3 (McKnight等，在引文中列舉)終止子。所述載體還可 包含以下元件，例如多腺苷酸化信號(hào)(例如來(lái)自SV40或腺病毒5Elb區(qū))、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列 (例如SV40增強(qiáng)子)和翻譯增強(qiáng)子序列(例如編碼腺病毒VA RNA的序列)。本發(fā)明的重組載體還可包含能夠使所述載體在所討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA 序列。所述載體還可包含選擇性標(biāo)記，例如其產(chǎn)物彌補(bǔ)宿主細(xì)胞的缺陷的基因，例如編 碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI基因 (如P. R. Russell, Gene 40,125-130(1985)所述)，或者賦予藥物抗性的基因，所述藥物例 如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤。對(duì)于絲狀真菌，選擇 性標(biāo)記包括型亟、PyrG. argB, niaD禾口 sC。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用如上文定義的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述細(xì)胞為真核細(xì)胞(例如真核生產(chǎn)細(xì)胞)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì) 胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(例如CH0-K1)或人胚腎(HEK)細(xì)胞(例如HEK293)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供包含如上文定義的多肽的藥物制劑。所述制劑還可包含緩沖系統(tǒng)、一種或多種防腐劑、一種或多種張度劑、一種或多種 螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為水性制劑，即 含水的制劑。這樣的制劑通常為溶液劑或混懸劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物 制劑為水溶液劑。術(shù)語(yǔ)“水性制劑”定義為包含至少50%重量/重量水的制劑。同樣地，術(shù)語(yǔ)“水溶液劑”定義為包含至少50%重量/重量水的溶液劑，而術(shù)語(yǔ)“水混懸劑”定義為包含至少
50%重量/重量水的混懸劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為凍干劑，醫(yī)師或患者在使用前向其加入溶劑 和/或稀釋劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑為無(wú)需任何預(yù)先溶解便可即時(shí)使用的干燥制劑 (例如冷凍干燥的或噴霧干燥的)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明肽的水溶液及緩沖液的藥物制劑，其 中所述肽以0. l-100mg/ml的濃度存在，并且其中所述制劑的pH為約2. 0-約10. 0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑的pH選自:2·0、2· 1、2·2、2·3、2·4、2·5、 2. 6、2· 7、2· 8、2· 9、3· 0、3· 1、3· 2、3· 3、3· 4、3· 5、3· 6、3· 7、3· 8、3· 9、4· 0、4· 1、4· 2、4· 3、4· 4、 4. 5、4· 6、4· 7、4· 8、4· 9、5· 0、5· 1、5· 2、5· 3、5· 4、5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、 6. 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9、7· 0、7· 1、7· 2、7· 3、7· 4、7· 5、7· 6、7· 7、7· 8、7· 9、8· 0、8· 1、8· 2、 8. 3、8· 4、8· 5、8· 6、8· 7、8· 8、8· 9、9· 0、9· 1、9· 2、9· 3、9· 4、9· 5、9· 6、9· 7、9· 8、9· 9 和 10. 0。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰 甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基) 氨基甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸、延胡索酸、酒石酸、天 冬氨酸或其混合物。這些特定緩沖液中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選的實(shí)施方案。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含藥學(xué)可接受的防腐劑。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，所述防腐劑選自苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對(duì)甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì) 羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯代丁醇和硫柳 汞(thiomerosal)、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、脫氫醋酸鈉、氯 甲酚、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、芐索氯銨、氯苯甘醚(chlorphenesine) (3對(duì)-氯苯氧基丙烷-1， 2- 二醇)或其混合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述防腐劑以0. lmg/ml-20mg/ml的濃度存在。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述防腐劑以0. lmg/ml-5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施方案中，所述防腐劑以5mg/ml-10mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述 防腐劑以10mg/ml-20mg/ml的濃度存在。這些特定防腐劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選的 實(shí)施方案。藥物組合物中防腐劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對(duì)Remington: The Science and Practice ofPharmacy,第 20 版，2000 的弓|用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含等滲劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案 中，所述等滲劑選自鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨 酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、糖醇(例如丙三醇(甘油)、1，2-丙二醇 (丙二醇)、1，3_丙二醇、1，3_ 丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物?？墒褂萌魏?糖，例如單糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、 麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、茁霉多糖、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧 甲基纖維素-Na。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖添加劑為蔗糖。糖醇定義為具有至少一個(gè)-OH基的 C4-C8烴，并包括例如甘露醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖醇添加物為甘露醇。上述糖或糖醇可單獨(dú)或聯(lián)合使用。所用量沒(méi) 有固定的限制，只要所述糖或糖醇可溶于液體制劑中并且沒(méi)有不利地影響利用本發(fā)明的方法達(dá)到的穩(wěn)定作用即可。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖或糖醇的溶度為約lmg/ml-約150mg/ ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述等滲劑以lmg/ml-50mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，所述等滲劑以lmg/ml-7mg/ml的濃度存在。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所 述等滲劑以8mg/ml-2^ig/ml的濃度存在。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述等滲劑以25mg/ ml-50mg/ml的濃度存在。這些特定等滲劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選的實(shí)施方案。藥 物組合物中等滲劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對(duì)Remington=The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000 的引用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含螯合劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案 中，所述螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽或其混合物。在本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述螯合劑以0. lmg/ml-5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述螯合劑以0. lmg/ml-2mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述螯 合劑以aiig/ml-5mg/ml的濃度存在。這些特定螯合劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選的實(shí)施 方案。藥物組合物中螯合劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對(duì)Remington=The Science andPractice of Pharmacy,第 20 版，2000 的弓|用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含穩(wěn)定劑。藥物組合物中穩(wěn)定劑的 使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便,作出對(duì)Remington :The Science and Practice of Pharmacy，第 20 版，2000 的引用。更具體地，本發(fā)明的組合物為穩(wěn)定的液態(tài)藥物組合物，其治療活性組分包括在以 液態(tài)藥物制劑儲(chǔ)存期間可能表現(xiàn)出聚集體形成的多肽?！熬奂w形成”意指多肽分子之間 的物理相互作用，其導(dǎo)致寡聚體的形成，該寡聚體可保持可溶的或從溶液中沉淀出來(lái)的可 見(jiàn)大聚集體。“儲(chǔ)存期間”意指液體藥物組合物或制劑制得后并不立即給予受試者。而 是在制備后，以液態(tài)形式、以冷凍狀態(tài)或以干燥形式包裝用于儲(chǔ)存，用于以后的重構(gòu)成適 于給予受試者的液態(tài)形式或其它形式。“干燥形式”意指通過(guò)冷凍干燥(即凍干；參見(jiàn)例 如 Williams 和 Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38 :48-59)、噴霧干燥(參見(jiàn) Spray-DryingHandbook φStJ Masters (1991)(第 5 片反；Longman Scientific 禾口 Technical， Essez, U.K.)，第 491-676 頁(yè)；Broadhead 等(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18 :1169-1206 和 Mumenthaler 等(1994)Pharm. Res. 11 :12-20)或風(fēng)干(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryobiology 25 :459-470 ；和 Roser (1991) Biopharm. 4 :47-53)來(lái)干燥液體藥物組合物或 制劑。由多肽在液體藥物組合物的儲(chǔ)存期間形成的聚集體可對(duì)該多肽的生物活性產(chǎn)生不利 影響，導(dǎo)致所述藥物組合物療效損失。此外，聚集體形成可引起其它問(wèn)題，例如當(dāng)使用輸注 系統(tǒng)給予含多肽的藥物組合物時(shí)管道、膜或泵的阻塞。本發(fā)明的藥物組合物還可包含足以減少在所述組合物儲(chǔ)存期間多肽聚集體形成 的量的氨基酸堿。“氨基酸堿”意指氨基酸或氨基酸的組合，其中任何給定的氨基酸以其游 離堿的形式或以其鹽的形式存在。當(dāng)使用氨基酸的組合時(shí)，所有氨基酸可以其游離堿的形 式存在、所有可以其鹽的形式存在、或者一些可以其游離堿的形式存在而其它可以其鹽的 形式存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明的組合物的氨基酸為攜帶荷電側(cè)鏈的氨基 酸，例如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定的氨基酸(例如甘氨酸、甲硫氨酸、組氨 酸、咪唑(imidazole)、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸及其混合物) 的任何立體異構(gòu)體(即L、D或其混合物)或這些立體異構(gòu)體的組合可存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要所述特定氨基酸以其游離堿形式或其鹽的形式存在即可。在一個(gè)實(shí)施方案 中，使用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明的組合物還可用這些氨基酸的類似物配制?！鞍被犷愃?物”意指天然存在的氨基酸的衍生物，其引起減少在本發(fā)明的液體藥物組合物儲(chǔ)存期間多 肽聚集體形成的所需作用。合適的精氨酸類似物包括例如氨基胍、鳥氨酸和N-單乙基L-精 氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，合適的半胱氨酸類 似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它的氨基酸一樣，所述氨基酸類似物以其游離堿形 式或其鹽的形式摻入至組合物中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基酸或氨基酸類似 物以足以防止或延遲蛋白聚集的濃度使用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)充當(dāng)治療藥物的多肽為包含至少一個(gè)容易氧化成 甲硫氨酸亞砜的甲硫氨酸殘基時(shí)，可加入甲硫氨酸(或其它的含硫氨基酸或氨基酸類似 物)以抑制這種氧化?！耙种啤币庵讣琢虬彼岬难趸问诫S時(shí)間的最小累積。抑制甲硫氨酸 的氧化導(dǎo)致多肽更大程度地以其合適的分子形式保留?？墒褂眉琢虬彼岬娜魏瘟Ⅲw異構(gòu)體 (L、D或其混合物)或其組合。加入量應(yīng)為足以抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，使得甲硫氨酸 亞砜的量可為管理機(jī)構(gòu)所接受。典型地，這意味著所述組合物含有不超過(guò)約10% -約30% 的甲硫氨酸亞砜。一般而言，這可通過(guò)加入甲硫氨酸，使得所加甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的 比在約1 1-約1000 1的范圍，例如10 1-約100 1的范圍來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含選自高分子量聚合物或低分子化合 物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚 乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基纖維素/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、 HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)如單硫代甘油、巰基乙酸和2-甲硫基乙醇以及不同的鹽 (例如氯化鈉)。這些特定穩(wěn)定劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選的實(shí)施方案。所述藥物組合物還可包含另外的穩(wěn)定劑，其進(jìn)一步提高其中的治療性活性多肽的 穩(wěn)定性。本發(fā)明特別感興趣的穩(wěn)定劑包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，其使多肽免受甲硫氨 酸的氧化，以及非離子型表面活性劑，其使多肽免受凍融或機(jī)械剪切相關(guān)的聚集作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還包含表面活性劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述表面活性劑選自洗滌劑、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化(polyglycolyzed)甘 油酯、乙?；视鸵货?、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(例如泊 洛沙姆例如Pluronie F68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯化山梨糖醇酐 脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫例如Tween-20、 Tween-40, Tween-80和Bri j_35)、甘油一酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙 烯衍生物、醇類、甘油、凝集素類和磷脂類(例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇 胺、磷脂酰肌醇、雙磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂衍生物(例如二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷 脂衍生物(例如棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的1-酰 基-sn-甘油-3-磷酸酯)及溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷 氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂膽堿的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物、二棕櫚酰磷脂酰膽 堿以及極性頭基團(tuán)(即膽堿類、乙醇胺類、磷脂酸、絲氨酸類、蘇氨酸類、甘油、肌醇)的修飾 物，和帶正電的D0DAC、D0TMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸以及甘 油磷酸脂類(例如腦磷脂)、甘油糖脂類(例如吡喃型半乳糖苷(galactopyransoide))、 鞘糖脂類(例如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、十二烷基磷酸膽堿、雞蛋溶血卵磷脂、梭鏈孢酸衍生物(例如?；嵌渌箧滄咚徕c等)、長(zhǎng)鏈脂肪鏈及其C6-C12鹽(例如油酸和辛酸)、酰 基肉毒堿類及衍生物，賴氨酸、精氨酸或組氨酸的Na-?；苌铩⒒蛘哔嚢彼峄蚓彼岬?側(cè)鏈?；苌?、包括賴氨酸、精氨酸或組氨酸與中性或酸性氨基酸的任何組合的二肽的 Na-?；苌?、包括一個(gè)中性氨基酸與兩個(gè)帶電氨基酸的任何組合的三肽的Na-?；?生物、DSS (多庫(kù)酯鈉，CAS登記號(hào)[577-11-7])、多庫(kù)酯鈣，CAS登記號(hào)[1觀_49_4])、多庫(kù)酯 鉀，CAS登記號(hào)[7491-09-0])、SDS (十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍 生物、膽汁酸及其鹽、甘氨酸或?；撬峋Y合物、熊脫氧膽酸、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰?鈉、甘氨膽酸鈉、N-十六烷基-N，N- 二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、陰離子(烷基-芳基-磺 酸鹽類)一價(jià)表面活性劑、兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N，N-二甲基銨基-1-丙磺 酸鹽、3-氯酰氨基-1-丙基二甲基銨基-1-丙磺酸鹽、陽(yáng)離子表面活性劑(季銨堿)(例如 溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶輸)、非離子表面活性劑(例如十二烷基β-D-吡 喃葡萄糖苷)、poloxamine (例如Tetronic’ s)，其為衍生自依次將環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷加 成至乙二胺的四官能嵌段共聚物，或者所述表面活性劑可選自咪唑啉衍生物或其混合物。 這些特定表面活性劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選的實(shí)施方案。藥物組合物中表面活性劑的使用為技術(shù)人員所熟知。為了方便，作出對(duì) Remington :The Science and Practice of Pharmacy，第 20 片反，2000 的弓|用?？赡艿氖潜景l(fā)明的肽藥物制劑中可存在其它成分。所述另外的成分可包括濕潤(rùn) 齊U、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張度改性劑、螯合劑、金屬離子、油脂載體、蛋白(例如人血 清白蛋白、明膠或蛋白類)和兩性離子(例如氨基酸，例如甜菜堿、?；撬帷⒕彼?、甘氨酸、 賴氨酸和組氨酸)。所述另外的成分無(wú)疑不應(yīng)對(duì)本發(fā)明藥物制劑的整體穩(wěn)定性造成不利影 響。含有本發(fā)明的肽的藥物組合物可在數(shù)個(gè)部位給予到需要這樣的治療的患者，例如 在局部部位，例如皮膚和粘膜部位；在旁路吸收部位，例如給予到動(dòng)脈中、靜脈中、心臟中； 和在涉及吸收的位點(diǎn)，例如給予到皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物的給予可通過(guò)幾種給藥途徑給予需要這種治療的患者，所述 給藥途徑為例如舌部給藥、舌下給藥、含服給藥、口腔內(nèi)給藥、口服給藥、胃腸內(nèi)給藥、鼻部 給藥、肺部給藥例如通過(guò)細(xì)支氣管和肺泡或其組合、表皮給藥、皮膚給藥、透皮給藥、陰道給 藥、直腸給藥、眼部給藥如通過(guò)結(jié)膜、輸尿管給藥和腸胃外給藥。本發(fā)明的組合物可以以若干劑型給予，例如作為溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、復(fù) 合型乳劑、泡沫劑、藥膏、糊劑、硬膏、軟膏、片劑、包衣片劑、沖洗劑、膠囊如硬膠囊和軟膠 囊、栓齊 、直腸用膠囊、滴齊 、凝膠齊 、噴霧齊 、散劑、氣霧齊 、吸入齊 、滴眼劑、眼用軟膏、眼用 沖洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟膏、注射液、原位轉(zhuǎn)化溶液劑如原位膠凝劑、原位沉降劑、 原位沉淀劑、原位結(jié)晶劑、輸液劑和埋植劑。本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步例如通過(guò)共價(jià)、疏水和靜電相互作用復(fù)合或連接至藥物 載體、藥物遞送系統(tǒng)和改良藥物遞送系統(tǒng)，以便進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明肽的穩(wěn)定性；提高生物利 用度；增大溶解度；減少不良作用；實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的擇時(shí)治療和提高患者順 應(yīng)性或其任何組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和改良藥物遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于聚合 物，例如纖維素及衍生物、多糖例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸 酯聚合物和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白例如白蛋白、凝膠例如熱膠凝體系，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的嵌段共聚物體系、膠束、脂 質(zhì)體、微球、納米顆粒、液晶及其分散體、脂質(zhì)-水體系中相特性領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的L2 相及其分散體、聚合膠束、復(fù)合型乳劑、自乳化、自微乳化、環(huán)糊精及其衍生物，以及樹枝狀 大分子(dendrimer)。本發(fā)明的組合物可用于配制用于肺部給予本發(fā)明肽的固體制劑、半固體制劑、散 劑和溶液劑，肺病給予使用例如定量吸入器、干粉吸入器和噴霧器，所有這些裝置都為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的組合物尤其可用于配制控釋、持續(xù)釋放、延釋、阻釋和緩釋的藥物遞送系 統(tǒng)。更具體地但不限于，組合物可用于配制本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的腸胃外控釋系統(tǒng)和緩 釋系統(tǒng)(兩種系統(tǒng)均導(dǎo)致給藥次數(shù)減少許多倍)。更優(yōu)選的是，控釋系統(tǒng)和緩釋系統(tǒng)經(jīng)皮下 給予。在不限制本發(fā)明范圍下，有用的控釋系統(tǒng)和組合物的實(shí)例為水凝膠、油凝膠、液晶、聚 合膠束、微球和納米粒。制備可用于本發(fā)明組合物的控釋系統(tǒng)的方法包括但不限于結(jié)晶、冷凝、共 結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻漿化、包囊化、噴霧干燥、微膠囊化、凝聚、相分 離、溶劑蒸發(fā)以制備微球、擠壓和超臨界流體法。對(duì)以下文獻(xiàn)作出整體參考Handbook ofPharmaceutical Controlled Release(Wise, D. L.編 輯 Marcel Dekker, NewYork, 2000)禾口 Drug and the Pharmaceutical Sciences 第 99 卷ProteinFormulation and Delivery(MacNally, E. J. , ed. Marcel Dekker, New York,2000)。腸胃外給藥可通過(guò)注射器、任選筆型(pen-like)注射器經(jīng)皮下注射、肌內(nèi)注射、 腹膜內(nèi)注射或靜脈注射來(lái)進(jìn)行?；蛘?，腸胃外給藥可以依靠輸液泵進(jìn)行。另一個(gè)選擇為以下 組合物其可為以鼻用噴霧或肺部噴霧形式給予本發(fā)明肽的溶液劑或混懸劑。作為又一個(gè) 選擇，含有本發(fā)明肽的藥物組合物還可以適合于透皮給藥，例如通過(guò)無(wú)針注射或貼劑(任 選離子電滲貼劑)來(lái)進(jìn)行；或跨粘膜給藥例如含服給藥。本發(fā)明現(xiàn)將根據(jù)以下的非限制性實(shí)施例來(lái)描述。
實(shí)施例實(shí)施例1編碼具有一個(gè)在野生型人因子IX中不存在的N-糖基化位點(diǎn)的高糖基化人凝血因 子IX的表達(dá)構(gòu)建體的制備編碼高糖基化人凝血因子IX的構(gòu)建體通過(guò)由具有編碼野生型人凝血因子IX的插 入物的PTT5組成的pTS87的位點(diǎn)定向誘變制備。因此，PTS87編碼在氨基酸殘基157和167 具有 N-糖基化位點(diǎn)的人凝血因子 IX。pTS87 用 QuikChange Site-Directed Mutagenesis 試劑盒(Stratagene)，如生產(chǎn)商所推薦利用表1所示的正向引物對(duì)和反向引物對(duì)來(lái)進(jìn)行突 變。將通過(guò)誘變操作得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌中，并將來(lái)自所選克隆的質(zhì)粒通過(guò)DNA 測(cè)序篩選突變。按照該方式建立了表2所述的構(gòu)建體pGB071、pGB072、pGB073、pGB074和 PGB075，其各自編碼具有一個(gè)在野生型人凝血因子IX中不存在的N-糖基化位點(diǎn)的人凝血 因子IX。表 1誘變引物(變換的核苷酸加下劃線)
以及由該突變弓丨起的氨基酸變換
氨基酸的變換誘變引物對(duì)T172N正向引物 5'-GGATAACATCACTCAAAGCAACCAATCATTTAATGACTTCACTCGGG-3' 反向引物 5'-CCCGAGTGAAGTCATTAAATGATTGGTTGCTTTGAGTGATGTTATCC-3'K228N正向引物 5'-GCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAlATTACAGTTGTCGCAGG-3' 反向引物 5'-CCTGCGACAACTGTAATATTAACACCAGTTTCAACACAGTGGG-3'I251T正向引物 5'-CAGAGCAAAAGCGAAATGTGACTCGAATTATTCCTCACCACAAC-3' 反向引物 5'-GTTGTGGTGAGGAATAATTCGAGTCACATTTCGCTTTTGCTCTG-3'A262T正向引物 5'- CCACAACTACAATGCAACTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCC-3' 反向引物 5'-GGGCAATGTCATGGTTGTACTTATTAATAGTTGCATTGTAGTTGTGGC-3'T343N-Y345T正向引物 S'-GTCTTCGATCTACAAAGTTCAACATCACTAACAACATGTTCTGTGCTGGC-S' 反向引物 5'-GCCAGCACAGAACATGTTGTTAGTGATGTTGAACTTTGTAGATCGAAGAC-3'表2相對(duì)于野生型人凝血因子IX的氨基酸變換以及由構(gòu)建體編碼的野生型人凝血因 子IX或高糖基化人凝血因子IX中可能的N-糖基化位點(diǎn)
構(gòu)建體氨基酸變換157167172228249260343pTS87++———pGB071T172N+++———pGB072K228N+++———pGB073I251T++—+——pGB073A262T++——+—pGB075T343N-Y345T+++實(shí)施例2在哺乳動(dòng)物HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)具有一個(gè)在野生型人因子IX中不存在的 N-糖基化位點(diǎn)的高糖基化人凝血因子IX將適應(yīng)懸浮液的人胚腎(HEK293F)細(xì)胞(Freestyle，Invitrogen)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，用編碼野生型人凝血因子IX的PTS87表達(dá)質(zhì)?；蚓幋a高糖基化人凝血因子IX的 pGB071、pGB072、pGB073、pGB074和pGB075構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)言之，將30 μ g的各種質(zhì)粒與 40 μ 1 293fectin (Invitrogen)保溫20分鐘，隨后加至含3 X IO7個(gè)細(xì)胞的補(bǔ)充有維生素K 的無(wú)血清 Freestyle 293 Expression Medium 的 125ml Erlenmeyer 錐形瓶中。將轉(zhuǎn)染細(xì) 胞在振蕩培養(yǎng)箱(37°C，8% 0)2和125rpm)中孵育。轉(zhuǎn)染四天后，將細(xì)胞沉淀并收獲無(wú)血清 的培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸于補(bǔ)充有胎牛血清和維生素K的ulbecco氏MEM(Invitrogen)中， 并在振蕩培養(yǎng)箱中孵育。次日，將細(xì)胞沉淀，并收獲含血清的培養(yǎng)基。將收獲的無(wú)血清培養(yǎng)基的樣品在37°C下與或不與肽N-糖苷酶F (PNGase F)溫育 1小時(shí)，隨后加載至SDS-PAGE凝膠上并電泳。電泳后，將凝膠上的蛋白通過(guò)電印跡轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。膜上的凝血因子IX通過(guò)將膜與兔抗-FIX抗體和IRDye 680綴合的羊抗-兔 IgI (LI-COR)依次溫育可視化。用Odyssey掃描儀(LI-C0R)于680nm下進(jìn)行讀出。膜的 讀出示于圖1(與PNGase F溫育的樣品)和圖2 (與PNGaseF溫育的樣品)中。由轉(zhuǎn)染了 pGB071、pGB072、pGB073、pGB074或pGB075的細(xì)胞分泌的凝血因子IX變體的電泳遷移率， 相對(duì)于轉(zhuǎn)染了 PTS87的細(xì)胞分泌的野生型凝血因子IX的遷移減少(圖1)。PNGase F去除 了 N-連接的聚糖，經(jīng)PNGase F處理后突變型和野生型凝血因子IX蛋白的遷移率相等(圖 2)，表明了野生型和變體FIX蛋白在PNGaseF處理前不同的電泳遷移率與N-聚糖有關(guān)。因 此，高糖基化人凝血因子IX確實(shí)由轉(zhuǎn)染了 pGB071、pGB072、pGB073、pGB074或pGB075的細(xì) 胞產(chǎn)生。這表明了分別在5種FIX變體中的第172、2觀、249、260和343位氨基酸處引入的 N-糖基化位點(diǎn)的應(yīng)用。通過(guò)在ACL 9000 血 M 監(jiān)測(cè)儀(clotting instrument) (InstrumentationLaboratory)中使用來(lái)自同一生產(chǎn)商的試劑進(jìn)行活化部分促凝血酶原激 酶時(shí)間(APTT)測(cè)定，分析收獲的含血清培養(yǎng)基樣品的凝血因子IX的活性。還通過(guò)酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定分析同一培養(yǎng)基的凝血因子IX抗原含量，隨后培養(yǎng)基中的凝血因子IX蛋白的 比活通過(guò)結(jié)合表3所示的ELISA和凝血測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算。與野生型人凝血因子IX的比活相 比，在第172、2觀、249或260位具有額外的N-糖基化位點(diǎn)的凝血因子IX變體的比活相等 或適度下降。因此，在這些位置的N-聚糖并不特別不利于人凝血因子IX的凝血活性。相 反，F(xiàn)IX-T343N-Y354T變體的比活相對(duì)于野生型人凝血因子IX的比活顯著減少。表3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)基中的野生型和高糖基化人凝血因子IX的表征
權(quán)利要求
1.一種具有一個(gè)或多個(gè)突變的人因子IX多肽類似物，其中所述突變導(dǎo)致所述多肽中 引入一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中所述糖基化包括N-糖基化。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中與野生型多肽相比，所述一個(gè)或多個(gè)突變導(dǎo)致所述因子IX 多肽類似物的蛋白水解活性和/或凝血活性發(fā)生不超過(guò)0、1、2、5、10、20、50或100倍的減 少。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變包括摻入一個(gè)或多個(gè) N-X-S/T 基序。
4.權(quán)利要求3的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)N-X-S/T基序建立在其中預(yù)期作為“N”殘 基的所述殘基具有超過(guò)25%或超過(guò)50%的相對(duì)側(cè)鏈表面可接近性的位置。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變選自以下中的一個(gè)或多個(gè)YIN、S3N+K5S/T、G4N+L6S/T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/T、G12N+L14S/T、R16N+C18S/ Τ、K22N、R29N+V31S/T、T35N+R37S/T、R37N、T39N+F41S/T、F41N+K43S/T、W42N+Q44S/ T、Q44N+V46S/T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、D49N+C51S/T、Q50N+E52S/ Τ、E52N+N54T、S53N+P55S/T、C56S/T、L57N+G59S/T、G60S/T、S61N+K63S/T、K63N+D65S/ T、D65N+N67S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、Y69N+C71S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/T、 W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、F77N+G79S/T、G79N+N81S/T、K80N+C82S/T、E83S/T、E83N+D85S/ Τ、L84N+V86S/T、D85N、V86N+C88S/T、T87N+N89S/T、I90N+N92S/T、K91S/T、I90N+N92S/ Τ、K91N+G93S/T、R94S/T、R94N+E96S/T、Κ100Ν、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/ Τ、D104N+K106S/T、V107S/T、K106N+V108S/T、V108N+V110S/T、S110N、El 13N+Y115S/T、 G114N+R116S/T、R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、K122N+C124S/ T S123N+E125S/T、E125N+A125S/T、P126N+V128S/T、V128N+F130S/T、P129N+P131S/ Τ、 F130N+C132S/T、 R134N、 V135N+V137S/T、 S136N、 S138N、 Q139N、 T140N+L142S/T、 S141N+L143S/T、K142N、A146N+A148S/T、E147N+V149S/T、A148N+F150S/T、V149N+P515S/ Τ、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/ Τ、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、Α161Ν、 E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、1164N+D166S/T、L165N+N167S/T、D166N+1168S/T、 I168N+Q170S/T、Τ169Ν、Q170N、S171N+Q173S/T、Τ172Ν、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/ Τ、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、F178N+R180S/T、T179N+V181S/T、R180N+V182S/ Τ、G183+E185S/T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/T、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/ Τ、K201N+D203S/T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/T、E213N+W215S/T、E224N+G226S/ Τ、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、Κ228Ν、Ε239Ν、E240N+E242S/T、T241N+H243S/T、 H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、I251S/T、I251N+I253S/T、R252N+I254S/T、I253N+P255S/ Τ、P255N+H257S/T、H257N+Y259S/T、N260S/T、A262S/T、A261N+I263S/T、A262N+N264S/ Τ、I263N+K265S/T、K265N+N267S/T、A266N+H268S/T、D276N+P278S/T、P278N+V280S/ Τ、E277N+L279S/T, V280N+N282S/T、Y284S/T, S283N+V285S/T、Υ284Ν、D292N+K294S/T、 K293N+Y295S/T、Ε294Ν、F299S/T、I298N+L300S/T、K301N+G303S/T、F302N、G303N+G305S/ Τ、S304N+Y306S/T、Y306N+S308S/T、R312N+F314S/T、F314N+K316S/T、H315N+G317S/T、 K316N+R138S/T、G317N、R318N+A320S/T、S319N+L321S/T、L321N+L323S/T、V322N+Q324S/T、 Y325N+R327S/T、R327N+P329S/T、P329N+V331S/T、L330N+D332S/T、D332N+A334S/T、R333N、A334N+C336S/T、T335N+L337S/T、L337N、R338N、K341N、F342N+I344S/T、T343N+Y345S/ T、Y345N+N347S/T、M348S/T、H354N+G356S/T、E355N+G357S/T、G357N+D359S/T、R358N、 Q362N+D364S/T、E372N+E374S/T、E374N、G375N、E388N+A390S/T、M391N+G393S/T、 K392N+K394S/T、G393N+Y395S/T、K394N+G396S/T、R403N+V405S/T、I408S/T、K409N+K411S/ T、E410N、K411N+K413S/T 和 K413N。
6.權(quán)利要求4的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變選自以下中的一個(gè)或多個(gè)YIN、S3N+K5S/T、G4N+L6S/T、F9N+Q11S/T、V10N+G12S/T、K22N、R37N、Q44N+V46S/ T、V46N+G48S/T、D47N+D49S/T、G48N+Q50S/T、Q50N+E52S/T、E52N+N54T、S53N+P55S/T、 C56S/T、L57N+G59S/T、S61N+K63S/T、I66N+S68S/T、Y69S/T、S68N+E70S/T、E70N+W72S/ T、W72N+P74S/T、P74N+G76S/T、K80N+C82S/T、L84N+V86S/T、T87N+N89S/T、K91S/T、 I90N+N92S/T、K91N+G93S/T、R94N+E96S/T、K100N、A103S/T、S102N+D104S/T、A103N+N105S/ T、 D104N+K106S/T、 V107S/T、 K106N+V108S/T、 V108N+V110S/T、 El13N+Y115S/T、 R116N+A118S/T、E119N+Q121S/T、K122S/T、Q121N+S123S/T、S123N+E125S/T、E125N+A125S/ Τ、P129N+P131S/T、S138N、T140N+L142S/T、S141N+L143S/T、Κ142Ν、A146N+A148S/T、 E147N+V149S/T、A148N+F150S/T、V149N+P515S/T、F150N+D152S/T、P151N+V153S/T、 D152N+D154S/T、V153N+Y155S/T、D154N+V156S/T、Y155N+N157S/T、V156N、S158N+E160S/ T、T159N+A161S/T、E160N+E162S/T、A161N、E162N+I164S/T、T163N+L165S/T、I164N+D166S/ Τ、L165N+N167S/T、D166N+1168S/T、1168N+Q170S/T、Τ169Ν、Q170N、S171N+Q173S/T、 Τ172Ν、Q173N+F175S/T、S174N+N176S/T、F175N+D177S/T、F178S/T、D177N、F178N+R180S/ Τ、T179N+V181S/T、R180N+V182S/T、G183+E185S/T、E185N+A187S/T、D186N+K188S/ Τ、K188N+G190S/T、P189N+Q181S/T、K201N+D203S/T、V202N+A204S/T、D203N+F205S/ Τ、E224N+G226S/T、T225N+V227S/T、G226N+K228S/T、Κ228Ν、Ε239Ν、E240N+E242S/T、 T241N+H243S/T、H243N+E245S/T、K247N+N249S/T、I251S/T、R252N+I254S/T、P255N+H257S/ Τ、H257N+Y249S/T、A262S/T、Α261N+I263S/T、A262N+N264S/T、I263N+K265S/T、 K265N+N267S/T、E277N+L279S/T、V280N+N282S/T、D292N+K294S/T、K293N+Y295S/T、Ε294Ν、 K301N+G303S/T、G303N+G305S/T、F314N+K316S/T、K316N+R138S/T、R318N+A320S/T、 L321N+L323S/T、R327N+P329S/T、D332N+A334S/T、R333N、R338N、Κ341Ν、F342N+I344S/T、 T343N+Y345S/T、H354N+G356S/T、E355N+G357S/T、G357N+D359S/T、E372N+E374S/T、Ε374Ν、 G375N、M391N+G393S/T、K392N+K394S/T、G393N+Y395S/T、I408S/T、Ε410Ν 和 Κ413Ν。
7.權(quán)利要求1的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變選自以下中的一個(gè)或多個(gè)Y1N、K22N、R37N、C56S/T、G60S/T、Y69S/T、E83S/T、D85N、K91S/T、R94S/T、K100N、A103S/Τ、V107S/T、S110N、K122S/T、R134N、S136N、S138N、Q139N、K142N、V156N、A161N、T169N、 Q170N、T172N、F178S/T、D177N、K228N、E239N、I251S/T、N260S/T、A262S/T、Y284S/T、Y284N、 E294N、F299S/T、F302N、G317N、R333N、L337N、R338N、K341N、M348S/T、G358N、E374N、G375N、 I408S/T、E410N和 K413N。
8.權(quán)利要求1的多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變選自以下中的一個(gè)或多個(gè)T172N、K228N、I251T和 A262T。
9.一種糖基化人因子IX多肽類似物，其中所述多肽相對(duì)于野生型人因子IX多肽在除 N157或附67之外的一個(gè)或多個(gè)位置被糖基化。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中所述多肽在一個(gè)或多個(gè)位置被糖基化，所述位置選自以下 中的一個(gè)或多個(gè)YU S3、G4、F9、V10, Qll、G12、R16、K22、R29、T35、R37、T39、F41、W42、Q44、V46、D47、 G48、D49、Q50、E52、S53、N54、L57、N58、G59、S61、K63、D65、166、N67、S68、Y69、E70、W72、 P74、F77、G79、K80、N81、E83、L84、D85、V86、T87、N89、I90、K91、N92、R94、K100、N101、S102、 A103、D104、N105、K106、V108、S110、E113、G114、R116、E119、N120、Q121、K122、S123、E125、 P126、V128、P129、F130、R134、V135、S136、S138、Q139、T140、S141、K142、A146、E147、A148、 V149、F150、P151、D152、V153、D154、Y155、V156、S158、T159、E160、A161、E162、T163、1164、 L165、D166、I168、T169、Q170、S171、T172、Q173、S174、F175、N176、D177、F178、T179、R180、 G183、E185、D186、K188、P189、K201、V202、D203、E213、E224、T225、G226、K228、E239、E240、 T241、H243、K247、N249、I251、R252、I253、P255、H257、N258、N260、A261、A262、I263、N264、 K265、A266、D276、E277、P278、V280、N282、S283、Y284、D292、K293、E294、N297、1298、K301、 F302、G303、S304、Y306、R312、F314、H315、K316、G317、R318、S319、L321、V322、Y325、R327、 P329、L330、D332、R333、A334、T335、L337、R338、K341、F342、T343、Y345、N346、H354、E355、 G357、R358、Q362、E372、E374、G375、E388、M391、K392、G393、K394、R403、N406、K409、E410、 K411 和 K413。
11.權(quán)利要求9的多肽，其中所述多肽在一個(gè)或多個(gè)位置被糖基化，所述位置選自以下 中的一個(gè)或多個(gè)T172、K228、N249 和 N260。
12.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的多肽，其中所述高糖基化多肽包含至少一個(gè)聚糖。
13.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的多肽。
14.一種用于制備權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的多肽類似物的方法，所述方法包括以下步驟(a)位點(diǎn)定向誘變?nèi)艘蜃覫X以將一個(gè)或多個(gè)N-X-S/T基序摻入至編碼人因子IX的DNA中；(b)將所得核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至生產(chǎn)細(xì)胞中；以及(c)從轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細(xì)胞中純化所述多肽類似物。
15.一種核酸構(gòu)建體，其編碼權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的人因子IX多肽類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及高糖基化人凝血因子IX多肽、用于制備所述多肽的方法、包含所述多肽的藥物組合物以及所述化合物在治療通過(guò)人凝血因子IX緩解的疾病中的用途，特別是但非唯一地在治療血友病中的用途。
文檔編號(hào)C12N9/64GK102105582SQ200980124494
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日
發(fā)明者C·克里斯滕森, G·博爾特 申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克有限公司