專利名稱：用于治療關(guān)節(jié)炎病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療關(guān)節(jié)炎病癥的領(lǐng)域。本發(fā)明尤其涉及使用包含針對與關(guān)節(jié)相關(guān)的 抗原的人Trl細胞的藥物來治療關(guān)節(jié)炎病癥和與關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
大約4600萬美國人和1000萬歐洲人患有關(guān)節(jié)炎，并且預期這個數(shù)字逐年遞增。類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的特征為導致促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α (TNF)白細 胞介素I(IL-I)的過量產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)的不平衡和抗炎細胞因子例如IL-10、IL-Il的缺 乏。RA通過滑膜發(fā)炎表征，滑膜炎進展為軟骨破壞、骨侵蝕和隨后的關(guān)節(jié)變形。RA的原發(fā) 癥狀為是關(guān)節(jié)發(fā)炎、腫脹、移動困難和疼。在發(fā)炎期間，多形核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞受 牽連。激活的T淋巴細胞產(chǎn)生細胞毒素和促炎細胞因子，而巨噬細胞刺激前列腺素和細胞 毒素的釋放。血管活性物質(zhì)(組胺、激肽和前列腺素)在發(fā)炎部分釋放并導致水腫、發(fā)熱、 紅斑和與發(fā)炎的關(guān)節(jié)相關(guān)的疼痛。在RA的后期，發(fā)炎細胞產(chǎn)生的酶會消化骨骼和軟骨。長 期的損傷導致關(guān)節(jié)的慢性疼痛、機能喪失、變形和甚至壽命變短。全世界RA的患病率通常 為總?cè)丝诘?.0%。幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)，以前稱為幼年類風濕性關(guān)節(jié)炎(JRA)是最常見形式的 幼年持久性關(guān)節(jié)炎。JIA有時被稱為幼年慢性關(guān)節(jié)炎(JCA)，這是一個不準確的術(shù)語，因為 JIA不包括所有形式的幼年慢性關(guān)節(jié)炎。JIA是導致16歲以下的幼年關(guān)節(jié)發(fā)炎和僵硬6周 以上的關(guān)節(jié)炎。JIA的三種主要類型是寡關(guān)節(jié)JIA、多關(guān)節(jié)JIA和系統(tǒng)性JIA。寡關(guān)節(jié)(或 少關(guān)節(jié))JIA在發(fā)病的最初6個月侵襲5個或更少的關(guān)節(jié)。多關(guān)節(jié)JIA在發(fā)病的最初6個 月侵襲5個或更多個關(guān)節(jié)。這種亞型可以包括頸和下巴以及通常被侵襲的小關(guān)節(jié)的侵襲。 全身性的JIA(斯提耳病(Still' s Disease))的特征為關(guān)節(jié)炎、發(fā)燒和橙紅色皮疹。診斷 系統(tǒng)性的JIA是困難的，因為發(fā)燒和皮疹時來時去。系統(tǒng)性的JIA會涉及內(nèi)部器官并導致 漿膜炎(例如心包炎)。強直性脊柱炎(AS ；也稱為別赫捷列夫病/別赫捷列夫綜合癥/馬-施二氏病/脊 椎關(guān)節(jié)炎)是慢性、疼痛、退化性炎性關(guān)節(jié)炎，主要侵襲脊柱和腸薦關(guān)節(jié)，導致最終的脊柱 融合；它是具有可能的遺傳易感性的脊柱關(guān)節(jié)病組的一員。完全的融合導致脊柱的完全強 直，一種稱為竹節(jié)樣脊柱的病癥。銀屑病關(guān)節(jié)炎(也稱為關(guān)節(jié)病性銀屑病或銀屑病性關(guān)節(jié)病)是侵襲大約5-7%的 患有慢性皮膚疾病銀屑病的人的炎性關(guān)節(jié)炎。銀屑病關(guān)節(jié)炎的治療與類風濕性關(guān)節(jié)炎的治 療類似。超過80%的患有銀屑病性關(guān)節(jié)炎的患者會患有銀屑病性指甲病變，特征為指甲出 現(xiàn)坑洼或更極端的情況下，喪失指甲本身(甲松離)。關(guān)節(jié)炎病癥的目前的大多數(shù)治療涉及被認為是驅(qū)使滑膜細胞增殖和軟骨侵蝕的 免疫畸變的糾正。目前的關(guān)節(jié)炎治療包括歸類為非類固醇抗炎藥物(NSAID)的控制疼痛和 炎癥的第一線藥物，例如阿司匹林、布洛芬、萘普生等。二級治療包括包括皮質(zhì)類固醇和緩 解疾病的抗風濕性藥物(DMARD)，例如青霉胺、環(huán)磷酰胺、金鹽、硫唑嘌呤、左旋咪唑、甲氨喋呤、來氟米特、環(huán)孢菌素、依那西普(etanerc印t)和柳氮磺吡啶等。控制疼痛是治療關(guān)節(jié)炎的重要部分。止痛藥只能提供暫時的疼痛緩解。它們不能 減輕炎癥也不能減慢疾病的進展。對乙酰氨基酚(泰諾)是最常用的止痛藥。對更嚴重的 疼痛也可以開具麻醉止疼藥處方。皮質(zhì)類固醇與皮質(zhì)醇密切相關(guān)，皮質(zhì)醇是在腎上腺皮質(zhì)中產(chǎn)生的激素。用皮質(zhì)類 固醇治療風濕性關(guān)節(jié)炎的利害權(quán)衡存在爭議。皮質(zhì)類固醇被認為是很有效的藥物，因為它 們能夠快速減少腫脹和炎癥。然而，公知的是皮質(zhì)類固醇能夠潛在地導致嚴重的和永久性 的副作用。因此，它們也許只在某些情況下系統(tǒng)性地或局部地施用至特定的關(guān)節(jié)來緩解，總 是以最低的可能有效劑量使用最短的可能持續(xù)時間，隨著時間劑量逐漸降低或變少。NSAID不同于皮質(zhì)類固醇。低劑量的NSAID減輕疼痛，高劑量減輕炎癥。大多數(shù) NSAID是環(huán)氧合酶，非選擇性地抑制環(huán)氧合酶-I(COX-I)和環(huán)氧合酶-2(C0X-2)。環(huán)氧合酶 在催化從花生四烯酸形成前列腺素和血栓烷中是限速酶。前列腺素以及其他分子在炎癥過 程中充當信使分子。C0X-1是組成性表達的酶，在調(diào)節(jié)許多正常的生理過程中具有“持家” 功能。NSAID的許多不利作用主要涉及它們對其中前列腺素起保護作用的腎臟和胃腸道的 中C0X-1的抑制。C0X-2是在大多數(shù)組織中具有低表達或表達檢測不到的酶，但是很容易 響應由細胞因子、生長因子和腫瘤的活化而被誘導。NSAID的治療作用由它們對C0X-2的 抑制引起。盡管Coxib (塞來昔布、羅非昔布、伐地昔布、帕瑞昔布和依他昔布)是選擇性的 C0X-2抑制劑，但是其被認為具有抗炎作用但不會破壞保護胃的前列腺素，在臨床應用中發(fā) 現(xiàn)增加心血管的危險，導致一些Coxib (rofecoxib和Valdecoxib)在全世界的停藥。盡管NSAID逐日減少炎癥，但是在多處關(guān)節(jié)患有因炎性關(guān)節(jié)炎超過六個星期的持 續(xù)性炎癥的患者通常需要更強的藥物DMARD。DMARD減慢了作為持續(xù)性炎癥后的驅(qū)動力的 生物學過程。DMARD是慢效抗風濕性藥物。速效的DMARD是甲氨喋呤，其通常需要四到六周 見效。其它的DMARD需要三到6六個月或者更長的時間見效。由于DMARD抑制免疫系統(tǒng)， 長期服用會導致嚴重的副作用。作為RA的有效治療劑，甲氨喋呤可以為單劑或與其它的 DMARD組合使用。已經(jīng)很好地確立了甲氨喋呤的毒性譜，其包括嚴重的和有時致命的肝病、 肺炎和細胞減少癥。近幾年在治療RA中的最令人振奮的進展是生物DMARD的發(fā)展。TNF-在RA進展 中的TNF-在RA進展中的關(guān)鍵作用的證實促成了阻斷該細胞因子活性的靶向治療的發(fā)展。 除了抗TNF治療，已經(jīng)發(fā)展了一些特異地抗免疫相關(guān)疾病過程中涉及的分子(IL-I)或細胞 (B細胞核T細胞)的其它生物DMARD。與傳統(tǒng)的DMARD相比，生物DMARD的潛在優(yōu)點包括 高度特異性地阻斷關(guān)鍵性地參與發(fā)病的靶分子、快速的臨床效果、最小的非特異性毒性、長 的給藥間隔(每周皮下或每月靜脈)、可能的長期免疫調(diào)節(jié)作用和改善的生活質(zhì)量。用于關(guān) 節(jié)炎的生物DMARD包括包括阻斷炎性細胞因子、特異性耗竭B細胞和選擇性抑制T細胞活 化的那些DMARD。盡管有大范圍的藥物可用，但是成功的治療關(guān)節(jié)炎仍然是一個未得到解決的醫(yī)學 需要。盡管生物學DMARD提供了減慢或甚至阻止該病的一個最有希望的途徑，但是它們只 能用于部分患者即使對于最有效的抗TNF治療，至少三分之一的RA患者不產(chǎn)生反應。在本發(fā)明中，申請人旨在基于用抗關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的Trl細胞提供一種治療關(guān)節(jié) 炎的替代方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種組合物，其包含至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞群， 前提是所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原不是HSP、角蛋白、丙酮酸脫氫酶、拓撲異構(gòu)酶I、心磷脂或IV型 膠原。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述人Trl細胞群是人Trl克隆群。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原選自包含以下物質(zhì)的組瓜氨 酸取代的環(huán)狀或直鏈聚絲蛋白肽、膠原II型肽、人軟骨糖蛋白39(HCgp39)肽、異源核內(nèi)核 蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNPBl、hnRNPD、Ro60/52、BiP、波形蛋白、纖維蛋白原、膠原I、III和V 的肽、膜連蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、乙酰基-鈣蛋白酶抑制蛋白、醛縮酶、snRNP、 PARP, Scl-70, kl-100、磷脂抗原包括陰離子磷脂酰絲氨酸、電荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷 脂酰膽堿、基質(zhì)金屬蛋白酶、原纖蛋白、聚集蛋白聚糖(aggreccan)以及它們的片段、變體 和混合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原是膠原II型和它們的片段、變體 和混合物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原是HCgp39和它們的片段、變 體和混合物。本發(fā)明的另一目標是包含抗關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的至少一種人Trl細胞群的藥物。本發(fā)明的另一個目標是包含抗關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的至少一種人Trl細胞群和與之 組合的一種或多種藥用載體的藥物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述人Trl細胞群是人Trl克隆群。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物或藥物組合物包括至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān) 的抗原的人Trl細胞，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原選自瓜氨酸取代的環(huán)狀或直鏈聚絲蛋白肽、膠 原II型肽、人軟骨糖蛋白39 (HCgp39)肽、HSP、異源核內(nèi)核蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNP Bi、 hnRNP D、Ro60/52、BiP、角蛋白、波形蛋白、纖維蛋白原、心磷脂、膠原I、III、IV和V的肽、 膜連蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、乙?；?鈣蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫酶(PDH)、 醛縮酶、拓撲異構(gòu)酶、snRNP、PARP、SCl-70、kl-100、磷脂抗原包括陰離子磷脂酰絲氨酸、電 荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿、基質(zhì)金屬蛋白酶、原纖蛋白、聚集蛋白聚糖以及它們 的片段、變體和混合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述人Trl細胞針對選自膠原II型、HCgp39和HSP的 關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原等。本發(fā)明涉及包含針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的至少一種人Trl細胞群的組合物在制備 用于治療關(guān)節(jié)病的組合物中的用途。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原選自包含瓜氨酸取代的環(huán)狀或 直鏈聚絲蛋白肽、膠原II型肽、人軟骨糖蛋白39 (HCgp39)肽、HSP、異源核內(nèi)核蛋白(hnRNP) A2肽、hnRNP BUhnRNP D、Ro60/52、BiP、波形蛋白、纖維蛋白原、心磷脂、膠原I、III、IV和 V的肽、膜連蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、乙?；?鈣蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫 酶(PDH)、醛縮酶、拓撲異構(gòu)酶I、snRNP、PARP, Scl_70、&1_100、磷脂抗原包括陰離子磷脂 酰絲氨酸、電荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿、基質(zhì)金屬蛋白酶、原纖蛋白、聚集蛋白 聚糖以及它們的片段、變體和混合物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述至少一種人Trl細胞群針對選自膠原II型、 HCgp39和HSP的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述關(guān)節(jié)病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述關(guān)節(jié)病是強直性脊柱炎。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述關(guān)節(jié)病是幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述關(guān)節(jié)病是銀屑病關(guān)節(jié)炎。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物或藥物組合物被施用到需要的受試者，包 括所述受試者細胞的自身的人Trl細胞。在優(yōu)選的實施方案中，向需要施用的受試者施用104/kg到109/kg Trl細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的藥物或藥學組 合物是與用于治療關(guān)節(jié)炎病癥的一種或多種治療劑聯(lián)合使用的。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述一種或多種治療劑選自組類皮質(zhì)激素、抗-TNF、 抗白細胞介素、抗B淋巴細胞、抗共刺激分子、耐受原劑、抗補體蛋白、T細胞信號轉(zhuǎn)導分子 抑制劑、細胞遷移抑制劑、甲氨喋呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素、 米諾環(huán)素、D-青霉胺。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物或藥物組合物是被施用至對以下一 種或多種治療劑不充分響應或不可能充分響應的受試者中類皮質(zhì)激素、抗-TNF、抗白細 胞介素、抗B淋巴細胞、抗共刺激分子、耐受原劑、抗補體蛋白、T細胞信號轉(zhuǎn)導分子抑制劑、 細胞遷移抑制劑、甲氨喋呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素、米諾環(huán)
素、D-青霉胺。本發(fā)明的另一個目標是治療需要治療關(guān)節(jié)炎病癥的受試者的關(guān)節(jié)炎病癥的方法， 所述方法包括步驟-獲得針對選擇的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的Trl細胞，所述Trl細胞來自所述受試者的血 樣，-克隆針對選擇的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的所述Trl細胞，-進一步增殖前述步驟獲得的Trl克隆，-將由此獲得的Trl克隆在注射進所述受試者中，優(yōu)選通過靜脈途徑。


圖1 在用膠原II型特異性活化后，Trl克隆的IL-10產(chǎn)生。圖1描述了在存在特異性抗原膠原II型的存在下，T細胞克隆產(chǎn)生的IL-10的特 異性增加。在存在輻射的自身抗原遞呈細胞的存在下克隆由膠原II型激活或沒有用膠原 II型激活。在48小時后，所述IL-10的產(chǎn)量通過ELISA測定。圖2 膠原II型Trl克隆的細胞因子的分泌譜測定在48小時的抗-⑶3+抗-⑶觀單克隆抗體活化的細胞的上清液中的膠原II 型特異性的Trl細胞克隆的IL-10、IL-4和IFN分泌。圖3 膠原II型Trl克隆的體外抑制活性在用CD4+T淋巴細胞的共培養(yǎng)實驗中評價了自身膠原II型Trl克隆的抑制活性。 細胞群用抗-CD3+抗-CD^單克隆抗體共培養(yǎng)三天。接著，自身CD4+T細胞的增值在存在或不存在梯度量的Trl細胞時測定。結(jié)果顯示向CD4+T淋巴細胞加入Trl細胞大大地抑制 了 T細胞的增值。圖4 從類風濕關(guān)節(jié)炎患者分離的膠原II型的細胞因子分泌譜。圖5 從類風濕關(guān)節(jié)炎患者分離的膠原II型Trl克隆的體外抑制活性。圖6 膠原II型特異的Trl細胞抑制膠原誘導的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中重度關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。
具體實施例方式本文所用的術(shù)語“Trl細胞”指的是在靜息時具有以下表型⑶4+⑶25-FoxP3-并且 在激活后能夠分泌高水平的IL-10和顯著水平的TGF-的細胞。Trl細胞部分特征體現(xiàn)在其 獨特的細胞因子狀況它們產(chǎn)生高水平的IL-10，顯著水平的TGF-和中等水平的IFN-，但是 產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生IL-4或IL-2。細胞因子的產(chǎn)生通常在用T淋巴細胞的多克隆激活劑如 抗-CD3+抗-CD^抗體或或白細胞介素_2、PMA+離子霉素激活后的細胞的培養(yǎng)物中評價。 可選地，細胞因子的產(chǎn)生是在用通過抗原提呈細胞提呈的特異性T細胞抗原激活后的細胞 的培養(yǎng)物中評價。高水平的IL-10對應于至少約500pg/ml，典型地大于約1000、2000、4000、 6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000 或 20000pg/ml 或更多。顯著水平的 TGF-對 應于至少大約100pg/ml，典型地大于約200、300、400、600、800或1000pg/ml或更多。中等 水平的IFN-對應于包含在0pg/ml和至少400pg/ml之間的濃度，典型地大于約600、800、 1000、1200、1400、1600、1800或2000pg/ml或更多。很少或沒有IL-4或IL-2對應于少于約 500pg/ml，優(yōu)選地少于約250、100、75或50pg/ml或更少。本文中使用的術(shù)語“抗原”指本發(fā)明使用的細胞調(diào)節(jié)的蛋白或肽或用于本發(fā)明的 任何方法中的蛋白或肽。在一個實施方案中，術(shù)語“抗原”可以指合成衍生的分子或天然衍 生的分子，其與目的抗原具有序列同源性或與目的抗原具有結(jié)構(gòu)同源性或者二者皆有。在 一個實施方案中，所述抗原可以是模擬表位。抗原的“片段”指抗原的作為更短的肽的任何 亞單位?？乖?變體"指與完整的抗原或其片段基本上相似的分子。變體抗原可以通過 用本領(lǐng)域公知的方法直接合成方便地制備。本文所用的術(shù)語“受試者”指人類。本文所用的術(shù)語“有效量”指足以導致有益或期望臨床結(jié)果(如，臨床疾病的改
善)的量。本文所有的術(shù)語“克隆”或“克隆群體”指衍生自獨特分化細胞的分化細胞群。本文所用術(shù)語“治療”一般指臨床介入以試圖改變正在接受治療的個體的自然進 程，并且可以在臨床疾病的進展中進行。期望的效果包括但不限于緩解癥狀、阻止、消除或 抑制疾病的任何直接或間接的病理學后果，減慢疾病進展的速率、減輕或減緩疾病狀態(tài)以 及導致緩解或改善預后。在本發(fā)明的情況下，其指炎癥性關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀的任何改善，以 及患者幸福的任何改善，尤其是體現(xiàn)在以下任何之一的任何改善關(guān)節(jié)腫脹和壓痛減輕、關(guān) 節(jié)疼痛減輕、運動改善、關(guān)節(jié)和周圍組織惡化減慢、急性疾病發(fā)作之間的緩解期的增加、急 性發(fā)作的時間長度的減少和嚴重疾病發(fā)生的預防等。本文所用的術(shù)語“關(guān)節(jié)炎”指的是在關(guān)節(jié)周圍的組織如腱、韌帶和肌肉以及身體的其它器官中的慢性炎癥(任何原因引起但通常是自身免疫過程導致的侵襲關(guān)節(jié)的過程)。 優(yōu)選的被治療的炎癥性關(guān)節(jié)炎是類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)、強直性 關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、多軟骨炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎。優(yōu)選的治療靶標是類風濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明本發(fā)明涉及治療需要治療關(guān)節(jié)炎病癥的受試者的關(guān)節(jié)炎病癥的方法，包括向受試 者施用包含針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞的組合物。根據(jù)本發(fā)明，“人Trl細胞群”對應于上述定義中所述的Trl細胞，并且不包括 ⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細胞或R)xP3+調(diào)節(jié)性T細胞(天然的或傳統(tǒng)的Treg) ,TGF-分泌的Th3 細胞或調(diào)節(jié)性NKT細胞。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原"指免疫原性肽，其存在于關(guān)節(jié)中。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述免疫原性肽可以存在于靜息關(guān)節(jié)中。在另一個實施方案中，所述免疫原性肽可以存在于發(fā)炎的關(guān)節(jié)中。關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的實例包括但不限于，瓜氨酸取代的環(huán)狀和直鏈的聚絲蛋白、膠 原II型肽、人軟骨糖蛋白39(HCgp39)肽、異源核內(nèi)核糖蛋白(hnRNP) A2肽、hnRNP Bi、 hnRNP D、Ro60/52、HSP60、65、70和90、BiP、角蛋白、波形蛋白、纖維蛋白原、膠原I、III、IV 和V型肽、膜連蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、乙?；}蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫 酶(PDH)、醛縮酶、拓撲異構(gòu)酶I、snRNP、PARP, Scl-70, &1_100、磷脂抗原包括陰離子心磷 脂和磷脂酰絲氨酸、電荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿、基質(zhì)金屬蛋白酶、原纖蛋白、 聚集蛋白聚糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述人Trl細胞針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原，選自膠原II型、 HCgp39 和 HSP 蛋白。在更優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含針對膠原II型的人Trl細 胞。針對膠原II型的人Trl細胞可以針對存在于膠原II型的245-273片段 (IAGAPGFPGPRGPPGPQGATGPLGPKGQT, SEQ ID NO 1)中的表位并和 HLA-DR1 或 HLA-DR4 受試
者相關(guān)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述的組合物包含針對HCgp39的人Trl細胞。 針對HCgp39的人Trl細胞可以針對以下的HCgp39表位PIFGRSFTLASSE (SEQ ID NO 2)、 RSFTLASSETGVG(SEQ ID NO 3), VGYDDQESVKSKV(SEQ ID NO 4)、SQRFSKIASNTQSR(SEQ ID NO 5)、FGRSFTLAS (SEQ ID NO 6)、FTLAS SETG (SEQ ID NO 7)、YDDQESVKS (SEQID NO 8)、 FSKIASNTQ(SEQ ID NO 9)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含針對HSP蛋白如HSP60、HSP70、 HSP90的人Trl細胞。不希望束縛于理論，申請人認為注射的針對關(guān)節(jié)相關(guān)的Trl細胞群會在體內(nèi)被關(guān) 節(jié)中存在的抗原激活，接著能夠調(diào)控關(guān)節(jié)病癥。因此沒有必要注射Trl細胞針對的抗原來 刺激這些細胞。本發(fā)明涉及包含針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原至少一種Trl細胞群的組合物，前提是所述 人Trl細胞群不針對HSP、膠原IV型、丙酮酸脫氫酶、拓撲異構(gòu)酶I和心磷脂。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含針對選自膠原II型和HCgp39的關(guān)節(jié) 相關(guān)的抗原的人Trl細胞群的組合物。
在更優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含針對膠原II型的人Trl細胞群。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含針對HCgp39的人Trl細胞群。在本發(fā)明的一個實施方案中，人Trl細胞抗原通過以下步驟獲得a)從受試者分離祖細胞群，b)通過在IL-10存在下培養(yǎng)所述祖細胞群獲得樹突狀細胞，c)將步驟b)的細胞與分離自受試者的CD4+T淋巴細胞群在關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的存 在下接觸，以使得針對所述抗原的CD4+T細胞分化為Trl細胞群，和d)從步驟c)收集Trl細胞群。在步驟b)中，IL-10在培養(yǎng)基中以50到250U/ml，優(yōu)選地以100U/ml的量存在。 所述獲得Trl細胞的方法在Wakkach等人(Immunity 2003 May ； 18 (5) :605-17)有描述。所述方法也可以用地塞米松和維生素D3進行，耐受原化的或不成熟的DC代替步 驟b)中的DC。本發(fā)明的另一個實施方案中，人Trl細胞可以通過以下步驟獲得a)在含有合適量的IFN-的培養(yǎng)基中培養(yǎng)針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的分離自受試者的 ⑶4+T細胞群，和b)收集Trl細胞群。優(yōu)選IFN-以5ng/ml在于培養(yǎng)基中。在步驟a)中，培養(yǎng)基可以進一步包含適當量 的IL-10，優(yōu)選地為100U/ml。在步驟b)中，Trl細胞群培養(yǎng)在包含IL-15的培養(yǎng)基中來增殖，優(yōu)選地培養(yǎng)基中 的IL-15為5ng/ml。所述獲得Trl細胞的方法描述在專利US6746670中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，人Trl細胞可以通過以下步驟獲得a)在人工抗原提呈細胞提呈的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原存在下，體外激活CD4+T細胞群， 和b)收集包含至少10%的1Trl細胞的活化的⑶4+T細胞。優(yōu)選地，所述人工抗原提呈細胞表達HLAII系統(tǒng)分子和人LFA-3分子，并不表達共 同刺激的分子 B7-1、B7-2、B7-H1、CD40、CD23 和 ICAM-I。所述用于獲得Trl細胞的方法描述在專利申請W002/092793中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，人Trl細胞可以通過以下步驟獲得a)在關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原和適當量的IL-10的存在下，體外激活⑶4+T細胞群，和b)收集Trl細胞群。優(yōu)選地，IL-10在培養(yǎng)基中存在的量為100U/ml。所述方法描述在Groux等人 (Nature 1997,389(6652) :737-42)中。在本發(fā)明的仍然的另一個實施方案中，人Trl細胞可以通過以下步驟獲得a)用關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原刺激白細胞群或外周血單核細胞(PBMC)群，b)從刺激的群中收集抗原特異性的Trl細胞群，c)任選地擴展抗原特異的Trl細胞群。白細胞包含幾種類型的細胞，其通過它們的重要性、它們的分布、它們的個數(shù)、它 們的壽命和它們的潛力表征。這些類型為以下多核或粒性白細胞(在其中發(fā)現(xiàn)了嗜酸性、 嗜中性和嗜堿性白細胞)和單核細胞或外周血單核細胞(PBMCs)，其是大的白血細胞并構(gòu)成免疫系統(tǒng)的主的細胞類型(淋巴細胞和單細胞)。白細胞或PBMC能夠通過本領(lǐng)域技術(shù)人 員知曉的任何方法從外周血中分離。有利地，對于PBMC的分離，可以使用離心、優(yōu)選地密度 梯度離心，優(yōu)選地不連續(xù)的密度梯度離心。替代方案是使用特異的單克隆抗體。在一些實 施方案中，PBMC典型地借助聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)使用標準的程序分離自 全血制品。在其他的實施方案中，所述PBMC通過白細胞除去法收集。所述方法描述在專利申請W02007/010406中。在仍然的另一個實施方案中，人Trl細胞可以通過以下步驟獲得a)在關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的存在下，培養(yǎng)白細胞群或外周血單核細胞(PBMC)群與間 充質(zhì)肝細胞，b)收集Trl細胞群。所述方法也可以用稚細胞或記憶T細胞代替PBMC或白細胞。由此獲得的Trl細胞群可以通過在細胞因子如白細胞介素-2和白細胞介素_4的 存在下培養(yǎng)來進一步增殖?？蓚溥x地，白細胞介素-15和白細胞介素-13也能夠用于Trl 細胞增殖培養(yǎng)。在上述的方法中，人Trl細胞能夠通過在W02005/000344所述的鑒定方法表征。 Trl細胞的所述鑒定方法基于檢測編碼⑶4分子和來自包含⑶18和/或⑶Ila和⑶49b的 分子的基因的表達產(chǎn)物的同時存在。Trl細胞能夠通過Elisa、流式細胞術(shù)或免疫親和方法用針對所述標志物的抗體鑒定 和/或純化。Trl細胞也能夠用流式細胞術(shù)或磁珠通過陽性篩選或陰性篩選富集。這些方法也 描述在 W02005/000344。在本發(fā)明的另一個實施方案中，針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的Trl細胞抗原通過 W02006/108882描述的體外方法增殖，所述方法包括a)在低于35°C的溫度Tl下在培養(yǎng)基Mf中培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞如昆蟲飼養(yǎng)細胞，所述溫 度Tl使得飼養(yǎng)細胞增殖以及所述飼養(yǎng)細胞表達與以下細胞表面蛋白相互作用的因子-CD3/TCR 復合體，-CD^ 蛋白，-IL-2 受體，-CD2 蛋白，-IL-4 受體，b)將洗掉或不含有培養(yǎng)基Mf的步驟a)獲得的飼養(yǎng)細胞與包含在培養(yǎng)基Mp中的 Trl細胞群接觸，其中所述培養(yǎng)基Mp起始不含有步驟a)所述的因子，以獲得含有Trl細胞 群、飼養(yǎng)細胞和培養(yǎng)基Mp的混合物，c)在至少35°C的溫度T2下培養(yǎng)在步驟b)獲得的混合物，選擇所述溫度使得Trl 細胞群增殖但是飼養(yǎng)細胞不增殖，d)收集這樣增殖的Trl細胞群。與上述的細胞表面蛋白相互作用的因子的實例包括-改性的抗CD3抗體，其中所述抗CD3重鏈的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域被跨膜結(jié)構(gòu)域取代，-CD80 或 CD86 蛋白，
-所述飼養(yǎng)細胞分泌的IL-2，-CD58 蛋白，-選自包含IL-4和IL-13的白細胞介素。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的所述Trl細胞可以使用克 隆T細胞的常規(guī)方法克隆。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的 人Trl細胞群或至少一個針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞克隆，所述組合物可以被冰凍保藏。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原選自包括以下的組瓜氨酸 取代的環(huán)狀或直鏈的聚絲蛋白肽、膠原II型肽、人軟骨蛋白糖蛋白39(HCgp39)肽、異源核 內(nèi)核蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNP Bi、hnRNP D、Ro60/52、BiP、波形蛋白、纖維蛋白原、膠原I 型、III型和V型肽、膜連蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、?；}蛋白酶抑制蛋白、醛縮 酶、snRNP、PARP, Scl_70、&1_100、電荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿、基質(zhì)金屬蛋白 酶、原纖蛋白、聚集蛋白聚糖以及它們的片段、變體和混合物。優(yōu)選地，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原 是重組的或合成的抗原。優(yōu)選地，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原是膠原II型和它們的片段、變體和混合物。優(yōu)選地，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原是HCgp39和它們的片段、變體和混合物。術(shù)語關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的“變體”在本文中指與天然抗原幾乎相同并具有相同的生 物活性的抗原。天然抗原與其變體之間的最小的差異可以在于例如氨基酸取代、缺失和/ 或添加。這樣的變體可以含有例如保守的氨基酸取代，其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的 氨基酸殘基取代?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸家族，包括堿性側(cè)鏈(例如， 賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè) 鏈(例如，甘氨酸、天門冬酰胺、谷酰胺、色氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈 (例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β -支鏈側(cè) 鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨 酸)。本發(fā)明的另一個目標是提供包括至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞群 的藥物。本發(fā)明也旨在提供包含至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞群與一種或 多種藥學上接受的載體的藥物組合物。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述人Trl細胞群是人Trl克隆群。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原選自瓜氨酸取代的環(huán)狀和直鏈聚絲蛋 白肽、膠原II型肽、人軟骨糖蛋白39(HCgp39)肽、HSP、異源核內(nèi)核糖蛋白(hnRNP)A2肽、 hnRNP Bi、hnRNP D、Ro60/52、BiP、角蛋白、波形蛋白、纖維蛋白原、心磷脂、膠原I、III、IV 和V型肽、膜連蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、乙?；}蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫 酶(PDH)、醛縮酶、拓撲異構(gòu)酶I、snRNP、PARP, Scl_70、&1_100、磷脂抗原包括陰離子磷脂 酰絲氨酸、電荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿、基質(zhì)金屬蛋白酶、原纖蛋白、聚集蛋白 聚糖，它們的片段、變體與混合物。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的藥物或藥物組合物包含至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞群或克隆，所述抗原選自膠原II型、HCgp39和HSP。優(yōu)選地，所述組合物包含針對膠原II型的人Trl細胞。針對膠原II型的人Trl 細胞可以針對存在于膠原II型的245-273片段(IAGAPGFPGPRGPPGPQGATGPLGH(GQT，SEQ ID NO 1)中的表位并和HLA-DRl或HLA-DR4受試者相關(guān)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述的組合物包含針對HCgp39的人Trl細胞。 針對HCgp39的人Trl細胞可以針對以下的HCgp39表位PIFGRSFTLASSE (SEQ ID NO 2)、 RSFTLASSETGVG(SEQ ID NO 3), VGYDDQESVKSKV(SEQ ID NO 4)、SQRFSKIASNTQSR(SEQ ID NO 5)、FGRSFTLAS (SEQ ID NO 6)、FTLAS SETG (SEQ ID NO 7)、YDDQESVKS (SEQID NO 8)、 FSKIASNTQ(SEQ ID NO 9)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含針對HSP蛋白如HSP60、HSP70、 HSP90的人Trl細胞。本文所用的藥學上接受的載體是常規(guī)的。Remington's PharmaceuticalSciences 16th editi0n(雷明頓藥物科學，第16版)，Osol, A.Ed. (1980)描述了適于藥學遞送本發(fā) 明的組合物的組合物和制劑。一般地，載體的性質(zhì)會依賴于所用的施用方式。例如，胃腸外 制劑常常包含可注射流體作為載劑，例如水、生理鹽水、平衡的鹽溶液、葡萄糖水溶液、芝麻 油、甘油、乙醇及其組合等。載體和組合物可以是無菌的，并且所述制劑適于施用方式。除 了生物學中性的載劑，將被施用的藥物組合物能夠含有少量的非毒性助劑物質(zhì)，如潤濕劑 或乳化劑、防腐劑和PH緩沖劑，例如醋酸鈉或單十二烷酸脫水山梨醇酯。所述組合物可以 是液體溶液、懸浮液、乳液。本發(fā)明涉及包含至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl群的組合物在制備用于 治療關(guān)節(jié)炎病癥的藥物或藥物組合物中的用途。本發(fā)明的目標是用于治療關(guān)節(jié)炎病癥的本文上述的藥物或藥學組合物或其在用 于治療關(guān)節(jié)炎病癥的用途。所述關(guān)節(jié)炎病癥包括但不限于，類風濕性關(guān)節(jié)炎、多軟骨炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、脊 椎關(guān)節(jié)病、強直性脊柱炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)、銀屑病關(guān)節(jié)炎和與關(guān)節(jié)炎有關(guān)的疾 病，諸如系統(tǒng)狼瘡、。優(yōu)選的治療靶標是類風濕性關(guān)節(jié)炎、Sj0gren綜合癥、硬皮病、皮肌炎 (dermatomyosotis)、多發(fā)性肌炎、風濕性多肌痛、纖維肌痛、結(jié)節(jié)病、血管炎。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述人Trl細胞群是人Trl克隆群。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述人Trl細胞群或克隆是針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原，所述抗 原選自瓜氨酸取代的環(huán)狀或直鏈聚絲蛋白肽、膠原II型肽、人軟骨糖蛋白39(HCgp39)肽、 HSP、異源核內(nèi)核蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNP BUhnRNP D、Ro60/52、BiP、角蛋白、波形蛋白、 纖維蛋白原、心磷脂、膠原I、III、IV和V的肽、膜連蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、 乙?；?鈣蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫酶、醛縮酶、拓撲異構(gòu)酶I、snRNP、PARP, Scl_70、 kl-100、磷脂抗原包括陰離子磷脂酰絲氨酸、電荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿、基 質(zhì)金屬蛋白酶、原纖蛋白、聚集蛋白聚糖以及它們的片段、變體和混合物。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個人Trl細胞群或克隆針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗 原，所述抗原選自膠原II型、HCgp39和HSP。優(yōu)選地，人Trl細胞或克隆是針對膠原II型。針對膠原II型的人Trl細胞或克 隆可以針對存在于膠原 II 型的 245-273 片段(IAGAPGFPGPRGPPGPQGATGPLGPKGQT，SEQ IDNO 1)中的表位并和HLA-DRl或HLA-DR4受試者相關(guān)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，人Trl細胞或克隆是針對HCgp39。針對HCgp39 的人Trl細胞或克隆可以針對以下的HCgp39表位PIFGRSFTLASSE (SEQ ID NO 2)、 RSFTLAS SETGVG(SEQ ID NO 3), VGYDDQESVKSKV(SEQID NO 4)、SQRFSKIASNTQSR(SEQ ID NO 5)、FGRSFTLAS (SEQ ID NO 6)、FTLASSETG (SEQ ID NO 7)、YDDQESVKS (SEQ ID NO 8)、 FSKIASNTQ(SEQID NO 9)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，人Trl細胞或克隆是針對HSP蛋白如HSP60、 HSP70、HSP90。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本文上面所述的組合物在制備治療類風 濕性關(guān)節(jié)炎的藥物或藥學組合物中用途。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本文上面所述的組合物在制備治療銀屑 病關(guān)節(jié)炎的藥物或藥學組合物中用途。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本文上面所述的組合物在制備治療強直 性脊柱炎的藥物或藥學組合物中用途。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本文上面所述的組合物在制備治療幼年 特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的藥物或藥學組合物中用途。本發(fā)明的一個目標也是治療需要治療的受試者中關(guān)節(jié)炎疾病的方法，所述關(guān)節(jié)炎 疾病優(yōu)選的是類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎或強直性脊柱炎，所述方 法包括向受試者施用有效量的本文上面所述的藥物或藥物組合物。所述組合物可以配制成胃腸外、肌內(nèi)、靜脈、腹膜內(nèi)、注射、鼻內(nèi)吸入、肺吸入、皮 內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)注射。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的藥物和藥物組合物可以注射 在所要治療的關(guān)節(jié)內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可以經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈注射或直接注 射到患者的淋巴結(jié)內(nèi)，優(yōu)選通過靜脈注射。有效治療關(guān)節(jié)炎疾病的針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的Trl細胞的量會取決于炎癥的性 質(zhì)，并且能夠由標準臨床技術(shù)確定。制劑中使用的準確劑量也取決于施用路線和疾病或病 癥的嚴重程度，并且應該根據(jù)醫(yī)師的判斷和各個個體的情形決定。有效的劑量可以從離體 或動物模型試驗系統(tǒng)導出的劑量反應曲線推出。在本發(fā)明的一個實施方案中，向受試者施用104/kg到109/kg細胞。向受試者施用 優(yōu)選地，IO5Ag到107kg細胞更優(yōu)選地約io6/kg細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，當受試者的臨床狀態(tài)減退顯示出疾病發(fā)作時，或當 炎癥病灶能夠通過例如放射性或核磁共振成像觀察時，向受試者施用藥物。在本發(fā)明的一個實施方案中，向受試者施用本發(fā)明的藥物或藥物組合物一次。在本發(fā)明的第二個實施方案中，向受試者施用本發(fā)明的藥物或藥物組合物每月一 次。在本發(fā)明的第二個實施方案中，向受試者施用本發(fā)明的藥物或藥物組合物每季度一次。在本發(fā)明的第四個實施方案中，向受試者施用本發(fā)明的藥物或藥物組合物每年一 次到兩次。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，向有需要的受試者施用的藥物或藥物組合物包含 所述受試者自身的人Tr 1細胞。這表示Trl細胞將被施用到它們來自的受試者或用于產(chǎn)生Trl細胞的前體來自 Trl細胞將被施用到的受試者。本發(fā)明也涉及用于治療需要治療的受試者中的關(guān)節(jié)炎疾病的方法，所述方法包含 以下步驟-采集所述受試者的血樣，-獲得針對選擇的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的Trl細胞，-克隆針對選擇的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的所述Trl細胞，-進一步增殖前一步驟獲得的Trl克隆，-將由此獲得的Trl克隆注射在所述受試者中，優(yōu)選通過靜脈路線。優(yōu)選地，克隆和增殖針對選擇的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的Trl克隆是用以下方法進行 的a)在低于35°C的溫度Tl下在培養(yǎng)基Mf中培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞如昆蟲飼養(yǎng)細胞，所述溫 度Tl使得飼養(yǎng)細胞增殖以及所述飼養(yǎng)細胞表達與以下細胞表面蛋白相互作用的因子-CD3/TCR 復合體，-CD^ 蛋白，-IL-2 受體，-CD2 蛋白，-IL-4 受體，b)將洗掉或不含有培養(yǎng)基Mf的步驟a)獲得的飼養(yǎng)細胞與包含在培養(yǎng)基Mp中的 Trl細胞群接觸，其中所述培養(yǎng)基Mp起始不含有步驟a)所述的因子，以獲得含有Trl細胞 群、飼養(yǎng)細胞和培養(yǎng)基Mp的混合物，c)在至少35°C的溫度T2下培養(yǎng)在步驟b)獲得的混合物，選擇所述溫度使得Trl 細胞群增殖但是飼養(yǎng)細胞不增殖，d)收集這樣增殖的Trl細胞群。與上述的細胞表面蛋白相互作用的因子的實例包括-改性的抗CD3抗體，其中所述抗CD3重鏈的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域被跨膜結(jié)構(gòu)域取代，-CD80 或 CD86 蛋白，-所述飼養(yǎng)細胞分泌的IL-2，-CD58 蛋白，-選自包含IL-4和IL-13的白細胞介素。在本發(fā)明的另一個實施方案中，治療需要治療的受試者中關(guān)節(jié)炎病癥的方法包括 向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的藥物或藥物組合物和用于治療關(guān)節(jié)炎病的一種或多 種治療劑。本發(fā)明涉及本發(fā)明的藥物組合物或藥物的用途，其中向受試者施用有效量的本發(fā) 明的藥物或藥學組合物是與用于治療關(guān)節(jié)病的一種或多種治療劑組合施用。通常用于治療關(guān)節(jié)炎病的治療劑的實例有以下幾種-類皮質(zhì)激素(強的松)，
-抗-TNF，諸如英利昔單抗、阿達木單抗、依那西普；-抗白細胞介素，諸如阿那白滯素、AMG108、艾拉莫德、Actemra；-抗B淋巴細胞，諸如利妥昔單抗、依帕珠單抗；-抗共刺激分子，諸如阿貝西普、貝利木單抗；-耐受原劑(針對B淋巴細胞表面DNA受體的合成分子)諸如LJP394或 TV-4710 ；-抗補體蛋白，諸如依庫珠單抗(Eculizumab)；-T細胞信號轉(zhuǎn)導分子的抑制劑，諸如CP690550 ；-細胞遷移抑制劑，諸如趨化因子受體的拮抗劑(馬拉韋羅，INCB3284)-來氟米特，-柳氮磺吡啶，-羥氯喹，-硫唑嘌呤，-甲氨喋呤，-環(huán)孢菌素，-米諾環(huán)素，-D-青霉胺，-它們的組合治療，諸如甲氨喋呤+柳氮磺吡唆，甲氨喋呤+羥氯喹，甲氨喋呤+硫 唑嘌呤，甲氨喋呤+英利昔單抗，甲氨喋呤+來氟米特，甲氨喋呤+依那西普，甲氨喋呤+依 那西普，環(huán)孢菌素+羥氯喹，環(huán)孢菌素+甲氨喋呤，甲氨喋呤+柳氮磺吡啶+羥氯喹。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，治療需要治療的受試者中關(guān)節(jié)病的方法包括 向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的藥物或藥物組合物與選自下組的一種或多種治療劑 類皮質(zhì)激素、抗-TNF、抗白細胞介素、抗B淋巴細胞、抗共刺激分子、耐受原劑、抗補體蛋白、 T細胞信號轉(zhuǎn)導分子抑制劑、細胞遷移抑制劑、甲氨喋呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、硫 唑嘌呤、環(huán)孢菌素、米諾環(huán)素、D-青霉胺。本發(fā)明涉及本發(fā)明的藥物或藥物組合物在用于治療需要治療的受試者中關(guān)節(jié)炎 病的用途，其中向受試者施用有效量的本發(fā)明的藥物或藥物組合物是與與選自下組的一種 或多種治療劑組合使用類皮質(zhì)激素、抗-TNF、抗白細胞介素、抗B淋巴細胞、抗共刺激分 子、耐受原劑、抗補體蛋白、T細胞信號轉(zhuǎn)導分子抑制劑、細胞遷移抑制劑、甲氨喋呤、來氟米 特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、硫唑嘌呤、壞孢菌素、米諾環(huán)素、D-青霉胺。在另一個實施方案中，本發(fā)明也涉及關(guān)節(jié)炎病的方法，其中本發(fā)明的藥物或藥物 組合物被施用到需要的受試者中，其中所述受試者對選自下組的一種或多種治療劑不充分 響應或不可能充分響應類皮質(zhì)激素、抗-TNF、抗白細胞介素、抗B淋巴細胞、抗共刺激分 子、耐受原劑、抗補體蛋白、T細胞信號轉(zhuǎn)導分子抑制劑、細胞遷移抑制劑、甲氨喋呤、來氟米 特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、環(huán)孢菌素、米諾環(huán)素、D-青霉胺。本發(fā)明涉及本發(fā)明的藥物組合物或藥物的用途，其中所述受試者不充分響應或不 可能充分響應選自下組的一種或多種治療劑類皮質(zhì)激素、抗-TNF、抗白細胞介素、抗B淋 巴細胞、抗共刺激分子、耐受原劑、抗補體蛋白、T細胞信號轉(zhuǎn)導分子抑制劑、細胞遷移抑制 齊U、甲氨喋呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、環(huán)孢菌素、米諾環(huán)素、D-青霉胺?！安怀浞猪憫薄ⅰ安怀浞猪憫凇被颉安豢赡艹浞猪憫敝甘茉囌邔嶋H的或可能的響 應，其指示了就所涉及的受試者而言，治療已經(jīng)為或可能是無效的、有毒的或弱耐受性的。實施例在下面的描述中，沒有給出具有方案的所有的實驗根據(jù)標準的方案進行。包括以下實施例以證實本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該意識到的 是，下面實施例公開的技術(shù)代表了發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的能夠在實施本發(fā)明中良好作用的技術(shù)，并 且由此能夠被認為構(gòu)成其實施的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應該根據(jù)本發(fā)明意識到 在公開的具體實施方案中能夠做出許多改變，并仍然能夠獲得類似的或相似的結(jié)果，而不 偏離本發(fā)明的精神和范圍。實驗程序TRl細胞分離收集來自健康的患者或嚴重的類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的血樣并用梯度密度離心分 離白細胞。接著在膠原II型存在時培養(yǎng)細胞以誘導針對該抗原的Trl細胞的特異性增殖。。 在培養(yǎng)13天后，通過有限稀釋方法克隆細胞群。接著評價克隆對膠原II型的特異性和特 征性的Trl細胞因子產(chǎn)生情況。細胞因子測定為了測定抗原特異性，在48小時的在抗原提呈細胞(4. IO5)存在下和存在或不 存在特異抗原(II型抗原)下刺激的τ細胞克隆的上清液中進行夾心ELISA。為了測定細 胞因子產(chǎn)生情況，膠原II型Trl細胞克隆用抗CD3+抗CD^單克隆抗體刺激，48小時后收 集上清液。用抗 IL-4(llbll)、抗 IL-IO (2a5)、抗-IFN-(xgml. 2)、生物素抗-IL-4(24g2)、 抗-IL-10 (sxcl)、抗-IFN-(r4_6a2) (pharmingenbecton dickinson)。抑制研究對于抑制研究，梯度量的膠原II型特異性的Trl克隆與自身的CD4陽性T淋巴細 胞共培養(yǎng)。用抗-CD3+抗-CD^單克隆抗體刺激共培養(yǎng)物。備選地，膠原II特異的克隆的 上清液被加到用抗-CD3+抗-CD^單克隆抗體刺激的CD4陽性的T淋巴細胞。3天后，用來 自Roche的WST-I增殖試劑盒測定總的細胞增殖。結(jié)果圖1顯示了在抗原存在或不存在時，對膠原II型特異的兩個不同的Trl細胞群的 IL-10產(chǎn)生。結(jié)果顯示，膠原II型刺激誘導IL-10產(chǎn)量的增加。這些結(jié)果證實了所述細胞 群對膠原II型的特異性。為了進一步測定這些對膠原II型特異的Trl細胞群的細胞因子分泌特性，在存 在抗⑶3+抗-⑶觀單克隆抗體時刺激細胞。對48小時的上清液進行ELISA以測定IL-4、 IL-10和IFN產(chǎn)量。圖顯示，后者的膠原II型特異的群觀察到的細胞因子分泌特征對應于 Trl細胞因子分泌特征，即，高產(chǎn)量的IL-10、低產(chǎn)量的IFN和沒有產(chǎn)生IL-4。接著評價這些膠原II型Trl群的抑制活性。在存在抗-⑶3+抗-⑶觀單克隆抗 體時用自身的CD4+T細胞共培養(yǎng)Trl細胞。經(jīng)過3天的刺激后，測定細胞增。圖3顯示兩 個Trl群的結(jié)果并證實了這些細胞的抑制活性。圖4顯示了在體外用抗-⑶3+抗-⑶觀抗體刺激的膠原II型特異的克隆的細胞因子產(chǎn)生特征。該克隆從耐常規(guī)的類風濕性關(guān)節(jié)炎治療包括抗-TNF-α抗體的患者的外周血產(chǎn)生。在不存在IL-4時高產(chǎn)量的IL-10和IFN γ是其Trl細胞身份的特征。該激活的克隆的上清液能夠體外抑制⑶4+Τ淋巴細胞增殖(圖5)。IL-10和TGF β 伴隨的阻斷使得在該實驗中恢復增殖，這顯示了 Trl克隆的抑制活性通過這兩個細胞因子 介導。由此該實驗證實了膠原II型特異的Trl細胞能夠從耐常規(guī)的類風濕性關(guān)節(jié)炎治 療的患者分離和這些Trl細胞能夠經(jīng)IL-I合TGF-β抑制⑶4+Τ細胞增殖。接著在體內(nèi)在膠原誘導的關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中測定膠原II型特異的Trl細胞的 作用。在7 天內(nèi)在 IL-10 (50ng/ml)和抗-IL-4 (10g/ml)存在下用牛膠原 II 型(5g/ml) 激活來自轉(zhuǎn)基因的TBC小鼠的小鼠脾細胞(表達對膠原II型特異的T細胞受體)。在DBA-I小鼠中在第O天通過皮下注射膠原II型(IOOg)的弗氏完全佐劑溶液接 著在第21天也進行皮下注射用膠原II型(IOOg)的弗氏不完全佐劑溶液進行第二次免疫 來誘導關(guān)節(jié)炎。通過測定關(guān)節(jié)的腫脹和發(fā)炎的手指或足趾來評價疾病的嚴重性。在第19天靜脈 注射對膠原II型(150萬)特異的合成的Trl細胞。圖6顯示靜脈施用膠原II型特異的Trl細胞抑制了膠原誘導的小鼠模型中的嚴 重關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。
權(quán)利要求
1.包含至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞群的組合物，其中所述關(guān)節(jié)相關(guān)的 抗原不是HSP、角蛋白、丙酮酸脫氫酶、拓撲異構(gòu)酶I、心磷脂或膠原IV型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述人Trl細胞群是人Trl克隆群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項的組合物，其中所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原選自包含以下物質(zhì) 的組瓜氨酸取代的環(huán)狀或直鏈聚絲蛋白肽、膠原II型肽、人軟骨糖蛋白39 (HCgp39)肽、異 源核內(nèi)核蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNP Bi、hnRNP D、Ro60/52、BiP、波形蛋白、纖維蛋白原、膠 原I型、III型和V型的肽、膜連蛋白V、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、乙酰基-鈣蛋白酶抑 制蛋白、醛縮酶、snRNP、PARP、Scl-70、&1-100、包括陰離子磷脂酰絲氨酸、電荷中性的磷脂 酰乙醇胺和磷脂酰膽堿的磷脂抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶、原纖蛋白、聚集蛋白聚糖以及它們的 片段、變體和混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原是膠原II型及其片段、變體和 它們的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原是HCgp39及其片段、變體和它 們的混合物。
6.包含至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞群的藥物。
7.包含至少一種針對關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的人Trl細胞群和與其組合的一種或多種藥學 上接受的載體的藥物組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物或根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述人Trl細胞群是 人Trl克隆群。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物或藥物組合物，其中所述人Trl細胞群針對選自以下的 關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原瓜氨酸取代的環(huán)狀或直鏈聚絲蛋白肽、膠原II型肽、人軟骨糖蛋白 39 (HCgp39)肽、HSP、異源核內(nèi)核蛋白(hnRNP) A2 肽、hnRNP Bi、hnRNP D、Ro60/52、BiP、角 蛋白、波形蛋白、纖維蛋白原、心磷脂、膠原I型、III型、IV型和V型的肽、膜連蛋白V、葡萄 糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、乙?；?鈣蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫酶(PDH)、醛縮酶、拓撲異 構(gòu)酶1、8業(yè)呢、 41^、5(31-70、&1-100、包括陰離子磷脂酰絲氨酸、電荷中性的磷脂酰乙醇胺 和磷脂酰膽堿的磷脂抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶、原纖蛋白、聚集蛋白聚糖以及它們的片段、變 體和混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物或藥物組合物，其中所述人Trl細胞群針對選自膠原II型、 HCgp39和HSP的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10任一項的藥物或藥物組合物，其用于治療關(guān)節(jié)炎病。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物或藥物組合物，其中所述關(guān)節(jié)炎病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物或藥物組合物，其中所述關(guān)節(jié)炎病是強直性脊柱炎。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物或藥物組合物，其中所述關(guān)節(jié)炎病是幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物或藥物組合物，其中所述關(guān)節(jié)炎病是銀屑病關(guān)節(jié)炎。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15任一項的藥物或藥物組合物，其中所述藥物或藥物組合物將 被施用到需要其的受試者中，所述藥物包含對于所述受試者的細胞是自體的人Trl細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-16任一項的藥物或藥物組合物，其中104/kg到109/kgTrl細胞 被施用到需要其的受試者中。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-17任一項的藥物或藥物組合物，其中向受試者施用有效量的本發(fā)明的藥物或藥物組合物是與用于治療關(guān)節(jié)炎病的一種或多種治療劑聯(lián)合進行。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物或藥物組合物，其中向受試者施用有效量的本發(fā)明的藥物 或藥物組合物是與選自下組的一種或多種治療劑聯(lián)合進行類皮質(zhì)激素、抗-TNF、抗白細 胞介素、抗B淋巴細胞、抗共刺激分子、耐受原劑、抗補體蛋白、T細胞信號轉(zhuǎn)導分子抑制劑、 細胞遷移抑制劑、甲氨喋呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、環(huán)孢菌 素、米諾環(huán)素、D-青霉胺。
20.根據(jù)權(quán)利要求11-17任一項的藥物或藥物組合物，其中所述受試者對以下一種或 多種治療劑不充分響應或不可能充分響應類皮質(zhì)激素、抗-TNF、抗白細胞介素、抗B淋巴 細胞、抗共刺激分子、耐受原劑、抗補體蛋白、T細胞信號轉(zhuǎn)導分子抑制劑、細胞遷移抑制劑、 甲氨喋呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、環(huán)孢菌素、米諾環(huán)素、D-青 霉胺。
21.治療需要治療關(guān)節(jié)炎病癥的受試者的關(guān)節(jié)炎病癥的方法，所述方法包括步驟-獲得針對選擇的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的Trl細胞，所述Trl細胞從所述受試者的血樣獲得，-克隆針對選擇的關(guān)節(jié)相關(guān)的抗原的所述Trl細胞， -進一步增殖前述步驟獲得的Trl克隆，-將由此獲得的Trl克隆注射進所述受試者中，優(yōu)選通過靜脈途徑。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含針對關(guān)節(jié)相關(guān)的人Tr1細胞的組合物和治療關(guān)節(jié)炎病癥的方法。
文檔編號C12N5/0783GK102076845SQ200980124832
公開日2011年5月25日 申請日期2009年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者克里斯蒂安·喬根森, 埃萊娜·阿斯納格利, 瓦萊麗·布魯恩, 納薩莉·貝爾蒙特, 阿爾諾·福薩特 申請人:特克賽爾公司, 蒙彼利埃大學區(qū)域醫(yī)學中心, 蒙彼利埃第一大學