專利名稱：用于抑制線粒體3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶1(mtgpat1)表達的rna拮抗劑化合物的制作方法
用于抑制線粒體3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶1 (MTGPAT1)表達
的RNA拮抗劑化合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡聚體化合物(寡聚體)，其靶向細胞內(nèi)的mtGPATlmRNA，導(dǎo)致mtGPATl 的表達降低。mtGPATl表達降低有利于一系列疾病，例如超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變 性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依 賴型糖尿病(NIDDM)。
背景技術(shù)：
線粒體3-磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1 (EC 2. 3. 1. 15，也被稱為GPATl，mtGPATl, GPAM， mtGPAM)在肝臟甘油三酯形成中起主要作用，其中高水平的mtGPATl活性導(dǎo)致脂肪肝(肝臟 脂肪變性)，然而mtGPATl的缺乏導(dǎo)致低水平的肝臟甘油三酯及刺激的脂肪酸氧化。3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(GPATs)是催化甘油三酯合成中的限速步驟的酶家族。酶 催化3-磷酸甘油與活化的脂肪酸(?；?輔酶A，?；?CoA)之間的酯鍵形成。早已知，不 只一種酶負(fù)責(zé)細胞內(nèi)GPAT酶促活性，有酶促活性存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜，及一部分酶 不敏感相應(yīng)敏感于NEM滅活(Coleman et al. (2000) Annu. Rev. Nutr. 20,77-103-3 ；Coleman et al. (2004)Prog. Lipid Res. 43,134-176 ；Coleman(2007)Cell Metab 5,87-89)。MtGPATl已鑒定為不敏感于NEM滅活的GPAT酶，及僅存在于線粒體內(nèi)。mtGPATl活 性在肝外組織低，在那里它們負(fù)責(zé)總GPAT活性的10%，然而在肝臟中活性高，其中mtGPATl 占總 GPAT 活性的達 50% (Coleman et al. (2000)Annu. Rev. Nutr. 20,77-103-3 ；Coleman et al. (2004) Prog. Lipid Res. 43,134-176 ； Co leman (2007) Cell Metab 5,87-89)。溶血 磷脂酸(LPA)，全部GPAT活性的產(chǎn)物，可驅(qū)動合成甘油三酯及磷脂。涉及甘油三酯合成的 多數(shù)酶存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，及mtGPATl因此早先被認(rèn)為主要涉及磷脂前體合成。但是，mtGPATl 活性的激素及營養(yǎng)調(diào)節(jié)顯示在肝臟甘油三酯合成中的關(guān)鍵作用(Coleman et al. (2000) Annu.Rev.Nutr. 20,77-103-3 ；Colemanet al. (2004)Prog. Lipid Res. 43,134-176 ； Coleman(2007)Cell Metab5，87-89)。MtGPATl活性響應(yīng)喂食及在肥胖的小鼠中顯著上調(diào) (Xuet al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 349,439-448)。mtGPATl在CHO或HEK293細胞中的過表達導(dǎo)致細胞內(nèi)甘油三酯的水平穩(wěn)固增加 (Igal et al. Q001)J. Biol. Chem. 276,42205-42212)。mtGPATl 在肝臟細胞中的過表達 導(dǎo)致甚至更高水平的細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積(Lewin et al. (2005)Am. J. Physiol Endocrinol. Metab 288, E835-E844)，伴隨用于細胞燃料的脂肪酸利用(β -氧化)降低-看起來似乎 高水平的mtGPATl活性導(dǎo)致增加的肝臟脂肪酸攝取及甘油三酯合成(脂肪合成代謝)及 降低的脂肪酸氧化(脂質(zhì)分解代謝)。這與丙二酰-CoA控制的“代謝轉(zhuǎn)換”的觀點一致， 其中細胞的能量需求(通過控制丙二酰-CoA濃度)驅(qū)使活化的脂肪酸向脂肪生成/儲存 (mtGPATl活性)或轉(zhuǎn)移到線粒體，然后脂肪酸氧化(用肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1，CPT-IJt 為限速酶)。在表達高水平的mtGPATl的全部細胞中，甘油三酯合成優(yōu)于將活化的脂肪酸插 入磷脂或膽留醇酯。
mtGPATl的瞬時的肝臟腺病毒-誘導(dǎo)的過表達導(dǎo)致肝臟三酰甘油大量增加，即 肝臟脂肪變性(Linden et al. (2006)FASEB J. 20，434-443)及胰島素抗性(Nagle et al. (2007) J.Biol· Chem. 282，14807-14815)。已產(chǎn)生 MtGPATl 敲除小鼠。當(dāng)保持標(biāo)準(zhǔn)喂 食時，動物具有更低重量及性腺脂肪墊重量，更低肝臟甘油三酯水平，更低血漿甘油三 酯，及更低 VLDL 分泌(Hammond et al. (2002)Mol. Cell Biol. 22,8204-8214 ；Yazdi et al. (2008)Biochem. Biophys. Res. Commun. 369，1065-1070)。MtGPATl 敲除動物也似乎被保 護抵抗胰島素抗性(Neschen et al. (2005) Cell Metab 2, 55-65) 在保持高脂肪，高蔗 糖攝食4個月的小鼠中，mtGPATl的缺乏導(dǎo)致肝臟甘油三酯含量60 %降低，伴隨刺激的脂 肪酸氧化的適應(yīng)癥，例如增加的血漿β-羥基丁酸水平(Hammond et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 25629-25636)。老的mtGPATl敲除小鼠具有增加的長鏈脂肪酸-CoA肝臟蓄積， 提示，酶促活性的平衡的下調(diào)優(yōu)選相比于完全缺乏蛋白(Hammond et al. (2005) J. Biol. Chem. 280,25629-25636)。但是，mtGPATl的缺乏似乎不導(dǎo)致任何肝臟尺寸，肝臟細胞數(shù)，或 線粒體形態(tài)的總變化(Hammond et al. (2007)Exp. Mol. Pathol. 82，210-219)。總的結(jié)論是， 高mtGPATl活性關(guān)聯(lián)于肥胖癥，胰島素抗性，及肝臟脂質(zhì)蓄積。mtGPATl活性抑制至今限于指向酶活性位點的小分子。但是，在GPAT家族不同成 員的活性位點有大程度的蛋白序列同源性(Gonzalez-Baro et al. (2007)Am. J. Physiol Gastrointest. LiverPhysiol 292, G1195-G1199)使設(shè)計特異于蛋白家族的一種奇異成員 的小分子抑制劑成為挑戰(zhàn)。因此，有對亞型特異性GPAT抑制劑的需求，例如mtGPATl特異性抑制劑。含本發(fā) 明的RNA拮抗劑的LNA是所述符合未滿足的涉及mtGPATl表達調(diào)節(jié)的治療性，診斷性及研 究應(yīng)用需求的mtGPATl特異性抑制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供長度10 30個核苷酸之間的寡聚體，其中包括總10 30個核苷酸之 間的連續(xù)核苷酸序列，其中所述連續(xù)核苷酸序列至少80% (例如，85%，90%，95%，98%， 或99%)同源于對應(yīng)于哺乳動物mtGPATl基因或mRNA，例如SEQ ID NO :263或其天然存在 的變體的反向互補體的區(qū)。因此，例如，寡聚體與具有部分SEQ IDNO :263序列的單鏈核酸 分子雜交。本發(fā)明提供綴合物，其包括本發(fā)明的寡聚體，及共價連接到所述寡聚體的至少一 個非-核苷酸或非-多核苷酸部分。本發(fā)明提供藥物組合物，其包括本發(fā)明的寡聚體或綴合物，及藥學(xué)可接受的稀釋 劑，載質(zhì)，鹽或佐劑。本發(fā)明提供用作藥物的本發(fā)明的寡聚體或綴合物，所述藥物例如用于治療超重， 肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)， 胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。本發(fā)明提供本發(fā)明的寡聚體或綴合物用于制備治療超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂 肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島 素依賴型糖尿病(NIDDM)的藥物的用途。本發(fā)明提供治療超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的方法，所述方法包括給患有，或可能患有超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性 脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病 (NIDDM)的患者施用本發(fā)明的寡聚體，綴合物或藥物組合物。本發(fā)明提供抑制表達mtGPATl的細胞內(nèi)的mtGPATl的方法，所述方法包括給所述 細胞施用本發(fā)明的寡聚體，或綴合物，以實現(xiàn)抑制所述細胞內(nèi)的mtGPATl。

圖1 顯示含針對mtGPATl的單鏈反義寡核苷酸的一系列LNA以相同納摩爾范圍 體外有效。A)用一系列含針對mtGPATl的反義分子的LNA脂質(zhì)-輔助的轉(zhuǎn)染后LTK-D2細 胞內(nèi)的相對mtGPATlmRNA表達。數(shù)據(jù)代表表示為模擬轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)的相應(yīng)mRNA比的百分 率的mtGPATl/GADPH mRNA表達的平均值士SD。B)用一系列含針對mtGPATl的反義分子的 LNA經(jīng)脂質(zhì)-輔助的轉(zhuǎn)染后HuH7細胞內(nèi)的相對mtGPATlmRNA表達。數(shù)據(jù)代表表示為模擬轉(zhuǎn) 染的細胞內(nèi)相應(yīng)mRNA比的百分率的mtGPATl/GADPH mRNA表達的平均值士SD。圖2 雌性C57BL/6小鼠中肝臟mtGPAT mRNA表達的體內(nèi)下調(diào)。測試了 5種不同 mtGPAT 反義寡聚體，SEQ ID NO :33，125，147，176，及 249 對肝臟 mtGPAT mRNA 表達的影響。序列標(biāo)識號簡述1 262提供于表1。263提供于實施例部分后的序列表。264 290提供于表2。選自表1的特別優(yōu)選的反義序列的列表提供于表3。發(fā)明詳述寡聚體本發(fā)明采用寡聚體化合物(在本文中稱為寡聚體)，其用于調(diào)節(jié)編碼哺乳動物 mtGPATl的核酸分子(例如顯示于SEQ ID NO :263的mtGPATl核酸，及所述編碼哺乳動物 mtGPATl的核酸分子的天然存在的變體)的功能。術(shù)語“寡聚體”在本發(fā)明中指由2個或更 多核苷酸共價連接形成的分子(即寡核苷酸)。寡聚體包括長度10 30個核苷酸之間的 連續(xù)核苷酸序列，或由其構(gòu)成。在各種實施方式中，本發(fā)明的化合物不包括RNA (單元)。優(yōu)選是，本發(fā)明的化合 物是線性分子或合成為線性分子。寡聚體是單鏈分子，及優(yōu)選不包括例如，互補于相同寡聚 體內(nèi)的等同區(qū)的至少3，4或5個連續(xù)核苷酸的短區(qū)(即雙鏈體)_在這點上，寡聚體(基本 上)不是雙鏈。在一些實施方式中，寡聚體基本上不是雙鏈，例如不是siRNA。在各種實施 方式中，本發(fā)明的寡聚體可完全由連續(xù)核苷酸區(qū)構(gòu)成。因此，寡聚體基本上不自體互補。靶適宜地，本發(fā)明的寡聚體能下調(diào)mtGPATl基因的表達。在這點上，本發(fā)明的寡聚體 可一般在哺乳動物中例如人細胞中實現(xiàn)mtGPATl的抑制。在一些實施方式中，本發(fā)明的寡 聚體結(jié)合靶核酸，及實現(xiàn)相比正常表達水平至少10%或20%的表達抑制，更優(yōu)選相比正常 表達水平至少30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的抑制。在一些實施方式中， 當(dāng)使用0. 04與25nM之間的，例如0. 8與20nM之間的濃度的本發(fā)明的化合物時，觀察到所 述調(diào)節(jié)。在相同或不同實施方式中，表達抑制小于100%，例如小于98%的抑制，小于95%抑制，小于90 %抑制，小于80 %抑制，例如小于70 %抑制。表達水平的調(diào)節(jié)可通過測量蛋 白水平來測定，例如通過例如SDS-PAGE，然后使用針對產(chǎn)生的靶蛋白的適宜抗體的蛋白印 跡的方法?；蛘撸磉_水平的調(diào)節(jié)可通過測量mRNA水平來測定，例如通過RNA印跡或定量 RT-PCR。當(dāng)通過mRNA水平測量時，當(dāng)使用適當(dāng)?shù)膭┝?，例?. 04及25nM之間的，例如0. 8 及20nM之間的濃度時，下調(diào)的水平在一些實施方式中，一般到無本發(fā)明的化合物的情況的 正常水平的10 20%之間的水平。 本發(fā)明因此提供下調(diào)或抑制表達mtGPATl蛋白和/或mRNA的細胞內(nèi)的mtGPATl 蛋白和/或mRNA的表達的方法，所述方法包括給所述細胞施用本發(fā)明的寡聚體或綴合物， 以下調(diào)或抑制所述細胞內(nèi)的mtGPATl蛋白和/或mRNA的表達。適宜地，細胞是哺乳動物細 胞，例如人細胞。在一些實施方式中，施用可體外實現(xiàn)。在一些實施方式中，施用可體內(nèi)實 現(xiàn)。 本文所用的術(shù)語“靶核酸”指編碼哺乳動物mtGPATl多肽(例如人mtGPATl)的DNA 或RNA，例如SEQ ID NO :263。編碼mtGPATl的核酸或其天然存在的變體，及由其衍生出的 RNA核酸，優(yōu)選mRNA，例如pre-mRNA，盡管優(yōu)選為成熟的mRNA。在一些實施方式中，例如當(dāng) 用于研究或診斷時，“靶核酸”可為cDNA或源于以上DNA或RNA核酸靶的合成的寡核苷酸。 本發(fā)明的寡聚體優(yōu)選能與靶核酸雜交。需知，SEQ ID NO :263是cDNA序列，及如所述，對應(yīng) 于成熟的mRNA靶序列，盡管在cDNA序列中尿嘧啶被胸苷取代。術(shù)語“其天然存在的變體”指在指定的分類群(例如哺乳動物，例如小鼠，猴，及優(yōu) 選人)中天然存在的核酸序列的mtGPATl多肽變體。一般而言，當(dāng)說道多核苷酸的“天然存 在的變體”時，術(shù)語也可包括編碼通過染色體轉(zhuǎn)位或復(fù)制見于染色體10 ；位置10q25. 2Mb 的mtGPATl的基因組DNA的任何等位變體，及RNA，例如由其衍生出的mRNA。“天然存在的 變體”還可包括源于mtGPATlmRNA的可變剪接的變體。當(dāng)說道特異性多肽序列時，例如，術(shù) 語也因此包括天然存在的形式的可例如通過翻譯同時或翻譯后修飾(例如信號肽切割，蛋 白水解切割，糖基化，等)加工的蛋白。序列寡聚體包括對應(yīng)于SEQ ID NO :263所示的核苷酸序列的反向互補體的連續(xù)核苷酸 序列，或由其構(gòu)成。因此，寡聚體可包括選自SEQID N0:l ^2的序列，或由其構(gòu)成，其中 所述寡聚體(或其連續(xù)核苷酸部分)可相對所述選定的序列任選有1個、2個或3個錯配。表1 本發(fā)明的寡聚體序列的列表可根據(jù)本發(fā)明，如別處所述，通過包括增加寡核苷酸Tm的核苷酸類似物來設(shè)計此 表中的寡聚體序列。而且，可將硫代磷酸酯鍵提供為核苷酸間鍵?！癝”代表硫代磷酸酯鍵，粗體字母代表LNA分子。
權(quán)利要求
1.長度10 30個核苷酸之間的寡聚體，例如SEQID NO 125，其包括總10 30個核 苷酸之間的連續(xù)核苷酸序列，其中所述連續(xù)核苷酸序列至少80%同源于對應(yīng)于下列的區(qū) 哺乳動物mtGPATl基因或mRNA的反向互補體，例如SEQ ID NO J63，或者它們的天然存在 的變體。
2.權(quán)利要求1的寡聚體，其中所述連續(xù)核苷酸序列至少80%同源于對應(yīng)于下列任何的 區(qū)=SEQ ID NO 264, 265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279， 280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，及 290。
3.權(quán)利要求1或2的寡聚體，其中所述連續(xù)核苷酸序列與SEQIDNO :263的相應(yīng)區(qū)的 反向互補體不包括錯配，或包括不多于1個或2個錯配。
4.權(quán)利要求1 3中任一項的寡聚體，其中所述寡聚體的核苷酸序列由連續(xù)核苷酸序 列構(gòu)成。
5.權(quán)利要求1 4中任一項的寡聚體，其中所述連續(xù)核苷酸序列的長度在10 18個 核苷酸之間。
6.權(quán)利要求1 5中任一項的寡聚體，其中所述連續(xù)核苷酸序列包括核苷酸類似物。
7.權(quán)利要求1 6中任一項的寡聚體，其中所述連續(xù)核苷酸包括SEQID NO 1 262 中任一個,或由SEQ ID NO :1 262中任一個構(gòu)成。
8.權(quán)利要求6或7的寡聚體，其中所述核苷酸類似物是糖修飾的核苷酸，例如選自下 列的糖修飾的核苷酸鎖核酸(LNA)單元；2’ -0-烷基-RNA單元，2’ -OMe-RNA單元，2’ -氨 基-DNA單元，及2，-氟-DNA單元。
9.權(quán)利要求6或7的寡聚體，其中所述核苷酸類似物是LNA0
10.權(quán)利要求6 9中任一項的寡聚體，其為間隔聚體。
11.權(quán)利要求1 10中任一項的寡聚體，其中所述寡聚體是SEQIDNO :2，33，125，142， 147，169，176，182，214，249，250 及 254 中任一個。
12.權(quán)利要求1 11中任一項的寡聚體，其抑制表達mtGPATl基因或mRNA的細胞內(nèi)的 mtGPATl基因或mRNA的表達。
13.綴合物，其包括權(quán)利要求1 12中任一項的寡聚體，及共價連接到所述寡聚體的至 少一個非-核苷酸或非-多核苷酸部分。
14.藥物組合物，其包括權(quán)利要求1 12中任一項的寡聚體，或權(quán)利要求13的綴合物， 及藥學(xué)可接受的稀釋劑，載質(zhì)，鹽或佐劑。
15.用作藥物的權(quán)利要求1 12中任一項的寡聚體，或權(quán)利要求13的綴合物，所述藥 物例如用于治療超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精 性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。
16.權(quán)利要求1 12中任一項的寡聚體，或權(quán)利要求13中定義的綴合物用于制備治 療超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的藥物的用途。
17.治療超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性 脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的方法，所述方法包括 給患有，或可能患有超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒 精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的患者施用權(quán)利要求1 12中任一項的寡聚體，或權(quán)利要求13的綴合物，或權(quán)利要求14的藥物組合物。
18.表達mtGPATl的細胞內(nèi)的mtGPATl的抑制方法，所述方法包括給所述細胞施用權(quán)利 要求1 12中任一項的寡聚體，或權(quán)利要求13的綴合物，以抑制所述細胞內(nèi)的mtGPATl。
全文摘要
本發(fā)明涉及寡聚體化合物(寡聚體)，其靶向細胞內(nèi)的mtGPAT1mRNA，導(dǎo)致mtGPAT1的表達減少。mtGPAT1表達降低有利于治療某些疾病，例如超重，肥胖癥，脂肪肝，肝臟脂肪變性，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，胰島素抗性，及非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。
文檔編號C12N15/113GK102076854SQ200980124993
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者E·M·斯特拉爾普, M·林德霍爾姆 申請人:桑塔里斯制藥公司