專(zhuān)利名稱(chēng)：由人多能干細(xì)胞制備人皮膚替代品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于獲得由人多能干細(xì)胞衍生的人角質(zhì)形成細(xì)胞群的體外方法和制備人皮膚替代品的方法。
背景技術(shù)：
皮膚由形成分化細(xì)胞功能單元的自我更新層組成，所述分化細(xì)胞起源于增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞的單一基層。構(gòu)成角質(zhì)層的死細(xì)胞和垂死細(xì)胞在脫屑過(guò)程中連續(xù)脫落，并被由生發(fā)層中的表皮干細(xì)胞衍生的細(xì)胞替代。表皮功能的喪失導(dǎo)致熱調(diào)節(jié)的喪失、微生物防御性降低、干燥的風(fēng)險(xiǎn)、傷口修復(fù)被抑制以及美容的問(wèn)題。在缺少用于皮膚移植的充足自體同源供體的情況下，用培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞覆蓋傷口代表著有希望的治療選擇。
而且，人皮膚的體外和體內(nèi)模型可以作為用于研究表皮細(xì)胞系或用于測(cè)試美容和藥物化合物的治療或毒性效應(yīng)的極佳工具。例如對(duì)于體外模型的需要通過(guò)以下事實(shí)得到加強(qiáng)存在著提供替代使用動(dòng)物測(cè)試化合物和制劑的替代方式的動(dòng)機(jī)。
另外，許多疾病影響角質(zhì)形成細(xì)胞的功能，或者細(xì)胞自發(fā)地發(fā)揮作用或通過(guò)改變其形成多分層表皮組織的能力。人皮膚的體內(nèi)和體外模型可以作為揭示疾病的分子機(jī)制并因此識(shí)別具有治療潛力的藥學(xué)或生物學(xué)化合物的途徑。
因此，需要一種獲得人角質(zhì)形成細(xì)胞群的方法，該細(xì)胞群隨后可以用于皮膚治療或用于獲得人皮膚的體外和體內(nèi)模型。
胚胎干細(xì)胞和遺傳學(xué)上重編程以復(fù)制胚胎干細(xì)胞(例如，稱(chēng)為“iPS”細(xì)胞的那些， 其代表“誘導(dǎo)的多能干”細(xì)胞)的全部特征的體細(xì)胞是具有廣泛增殖能力并因此提供用于研究和醫(yī)藥上的巨大潛在用途的多能干細(xì)胞。因此現(xiàn)有技術(shù)中已記載有一些用于從多能干細(xì)胞獲得人角質(zhì)形成細(xì)胞的嘗試。例如，文獻(xiàn)WO 02/097068描述了一種用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的角質(zhì)形成細(xì)胞分化的方法。進(jìn)一步的研究報(bào)告了利用胚胎干細(xì)胞獲得人角質(zhì)形成細(xì)胞群(Coraux C.等人，2003 Ji L.等人，2006 ；Metallo CM.等人，2007 以及Aberdam E.等人， 2008)。然而，迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)的方法沒(méi)有獲得由人多能干細(xì)胞衍生的人角質(zhì)形成細(xì)胞， 其在按照使用來(lái)自供體的成人基底角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí)顯示出有效的技術(shù)(例如參見(jiàn)Green， 2008)處理時(shí)表現(xiàn)出形成多分層表皮(在體外或在動(dòng)物異種皮移植后)的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于獲得由人多能干細(xì)胞衍生的人角質(zhì)形成細(xì)胞群的體外方法，包括如下步驟在刺激表皮誘導(dǎo)的物質(zhì)和刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化的物質(zhì)存在下共培養(yǎng)人多能干細(xì)胞和支持外胚層分化的細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及用于獲得由人多能干細(xì)胞衍生的人角質(zhì)形成細(xì)胞群的體外方法，所述方法包括如下步驟在補(bǔ)充有BMP-4和抗壞血酸的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基的存在下，在涂有一層飼養(yǎng)層成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)表面上培養(yǎng)人多能干細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及通過(guò)上述方法可獲得的由人多能干細(xì)胞衍生的分離的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的由人多能干細(xì)胞衍生的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群和任選的藥學(xué)可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明也涉及制備人皮膚替代品的方法，所述方法包括以下步驟提供本發(fā)明的由人多能干細(xì)胞衍生的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群的器官型培養(yǎng)。
本發(fā)明還涉及可由上述方法獲得的人皮膚替代品。
本發(fā)明還涉及用上述人皮膚替代品移植動(dòng)物的方法。
本發(fā)明還涉及可由上述方法獲得的人皮膚的動(dòng)物模型。
最后，本發(fā)明涉及用于治療與皮膚損傷有關(guān)的病癥的上述人皮膚替代品。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明 定義 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)志物”指的是在細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)、糖蛋白或其他分子，且其可用于幫助識(shí)別細(xì)胞。標(biāo)志物一般可由常規(guī)方法檢測(cè)?？捎糜跈z測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的方法的特定的非限制性例子是免疫組織化學(xué)、熒光激活的細(xì)胞分選(FACS) 和酶學(xué)分析。
術(shù)語(yǔ)“人角質(zhì)形成細(xì)胞群”指的是能夠重建人表皮以及其特征在于能在將分化為角質(zhì)層的死的和完全角質(zhì)化細(xì)胞的過(guò)程中產(chǎn)生角蛋白的細(xì)胞群?；捉琴|(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)志物包括具有角蛋白5、14(K5/K14)和轉(zhuǎn)錄因子ρ63的基底層的標(biāo)志物、具有角蛋白1和角蛋白10(Κ1/Κ10)的上基底層的標(biāo)志物、外皮蛋白(irwolucrin)、抗角蛋白微絲聚集蛋白 (filaggrin)和具有整聯(lián)蛋白α 6和β 4、層粘連蛋白_5和膠原質(zhì)VII的真皮-表皮聯(lián)結(jié)的特異性標(biāo)志物。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“人多能干細(xì)胞”指的是具有形成任何成體細(xì)胞的能力的任何人前體細(xì)胞。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“人胚胎干細(xì)胞”或“hES細(xì)胞”或“hESC”指的是具有形成任何成體細(xì)胞的能力的人前體細(xì)胞。hES細(xì)胞衍生自胎齡小于一周的授精胚胎。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞”或“人iPS細(xì)胞”或“人iPSC”指的是由人非多能細(xì)胞(例如成體體細(xì)胞)人工衍生的人多能干細(xì)胞類(lèi)型。人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在形成任何成體細(xì)胞的能力方面與人胚胎干細(xì)胞相同，但不是來(lái)自胚胎。通常，人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可通過(guò)0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因在任何成體體細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞)中的誘導(dǎo)表達(dá)獲得。例如，人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以按照Takahashi K.等人(2007)、 Yu等人Q007)描述的方案獲得，或通過(guò)任何其中這些原始方案中用于重編程細(xì)胞的一種或其他試劑由作用于或轉(zhuǎn)移到iPS細(xì)胞系起源的體細(xì)胞的任何基因或蛋白替代的其他方案獲得。基本上，成體體細(xì)胞用包含0ct3/4、SoX2、Klf4和c-Myc基因的病毒載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“基本上純的同源群”指的是其中細(xì)胞總數(shù)的大部分(例如，至少約80%、優(yōu)選至少約90%、更優(yōu)選至少約95% )具有目標(biāo)角質(zhì)形成細(xì)胞的規(guī)定的特征的細(xì)胞群。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”指的是已經(jīng)與其自然環(huán)境的至少一些組分分離的細(xì)胞或細(xì)胞群。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基”指的是含有支持人角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活所必需的營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基。因此，本發(fā)明的合適培養(yǎng)基可以是細(xì)胞可以在其中生長(zhǎng)的最低培養(yǎng)基，例如補(bǔ)充有至少10%的胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的 Eagle's最低必需培養(yǎng)基(DMEM)。在另一種具體實(shí)施方式
中，所述培養(yǎng)基是由2/3 DMEMU/3 HAM:F12和10%的胎牛血清(FCII，Hyclone)組成的FAD培養(yǎng)基，其補(bǔ)充有5 μ g/ml胰島素、 0. 5 μ g/ml氫化可的松、IO-iciM霍亂毒素、1. 37ng/ml三碘甲腺原氨酸(triodothyronin)、 24 μ g/ml腺嘌呤和lOng/ml重組人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)表面”或“細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)”指的是適于細(xì)胞培養(yǎng)的每種類(lèi)型的表面或基質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)表面”包括但不限于組織培養(yǎng)平板、皿、孔或瓶。在一種具體的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)表面是培養(yǎng)平板、皿、孔或瓶的塑料表面。細(xì)胞培養(yǎng)表面與真皮成纖維細(xì)胞的涂層相容。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“支持外胚層分化的細(xì)胞”指的是提供適當(dāng)?shù)孜镆约胺置谶m當(dāng)因子以支持人多能干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞。在一種具體的實(shí)施方式中，支持外胚層分化的細(xì)胞選自成纖維細(xì)胞，更特別地人成纖維細(xì)胞，且更特別地真皮成纖維細(xì)胞的組。在一種具體實(shí)施方式
中，支持外胚層分化的細(xì)胞是絲裂霉素滅活的人真皮成纖維細(xì)胞。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“飼養(yǎng)層成纖維細(xì)胞”指的是用作多能干細(xì)胞的基底層并提供分泌的因子、細(xì)胞外基質(zhì)和維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)而不喪失其多能性的細(xì)胞接觸的細(xì)胞。飼養(yǎng)層細(xì)胞可以由Y照射或絲裂霉素滅活。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，飼養(yǎng)層成纖維細(xì)胞可來(lái)自成纖維細(xì)胞，更特別是人成纖維細(xì)胞，且更特別是真皮成纖維細(xì)胞的組，包括真皮成纖維細(xì)胞系。真皮成纖維細(xì)胞系的例子包括但不限于CCD-1112SK(Hovatta 0等人，2003)和3T3-J2(I heinwald JG等人，1975)。在一種具體的實(shí)施方式中，預(yù)先處理真皮成纖維細(xì)胞以涂覆到培養(yǎng)表面之前停止其增殖。因此，真皮成纖維細(xì)胞可以被照射或用細(xì)胞周期阻滯劑例如絲裂霉素處理。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“真皮成纖維細(xì)胞”指的是合成并維持真皮的細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞群。真皮成纖維細(xì)胞的具體標(biāo)志物包括波形蛋白和FAP(成纖維細(xì)胞活化蛋白)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“刺激表皮誘導(dǎo)的物質(zhì)”指的是能夠誘導(dǎo)表皮標(biāo)志物例如角蛋白8、角蛋白18、角蛋白5和角蛋白14的表達(dá)的物質(zhì)。通常刺激表皮誘導(dǎo)的物質(zhì)抑制滋養(yǎng)層和中胚層的誘導(dǎo)。
在一種具體實(shí)施方式
中，刺激表皮誘導(dǎo)的物質(zhì)選自骨形成蛋白(例如BMP-2、 BMP-4和BMP-7)、受體調(diào)節(jié)的Smad蛋白(例如Smadl、Smad5和Smad9)和TGF- β家族的配體(例如生長(zhǎng)和分化因子6GFD-6) (Moreau等人，2004)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，刺激表皮誘導(dǎo)的物質(zhì)選自BMP-2、BMP-4、BMP-7、Smadl、Smad5、Smad7和GFD-6。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 刺激表皮誘導(dǎo)的物質(zhì)是BMP-4。
術(shù)語(yǔ)“BMP-4”指的是骨形成蛋白4。BMP-4是屬于蛋白TGF-β超家族的多肽。示例性的天然ΒΜΡ-4氨基酸序列以登錄號(hào)AAC72278提供于GenP印t資料庫(kù)中。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化的物質(zhì)”指的是刺激角蛋白 5和角蛋白14的表達(dá)的物質(zhì)。事實(shí)上，角蛋白5和角蛋白14是能夠在3D培養(yǎng)中終末分化的基底角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)志物。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化的物質(zhì)選自抗壞血酸和視黃酸。
術(shù)語(yǔ)“抗壞血酸”指的是具有下式的(R)-3，4- 二羥基-5_((S)-1，2- 二羥基乙基) 呋喃-2(5H)_酮:
權(quán)利要求
1.用于獲得由人多能干細(xì)胞衍生的人角質(zhì)形成細(xì)胞群的體外方法，包括如下步驟在刺激表皮誘導(dǎo)的物質(zhì)和刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化的物質(zhì)存在下共培養(yǎng)人多能干細(xì)胞和支持外胚層分化的細(xì)胞。
2.用于獲得由人多能干細(xì)胞衍生的人角質(zhì)形成細(xì)胞群的體外方法，所述方法包括如下步驟在補(bǔ)充有BMP-4和抗壞血酸的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基的存在下，在涂有一層飼養(yǎng)層成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)表面上培養(yǎng)人多能干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的體外方法，其中所述人多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞(hES細(xì)胞)或人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(人iPS細(xì)胞)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其還包括以下步驟在不含抗壞血酸和BMP-4的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基的存在下，在涂有真皮成纖維細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)表面上培養(yǎng)由人多能干細(xì)胞衍生的人角質(zhì)形成細(xì)胞。
5.能夠通過(guò)權(quán)利要求4所述方法獲得的由人多能干細(xì)胞衍生的分離的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群。
6.藥物組合物，含有權(quán)利要求5所述的由人多能干細(xì)胞衍生的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群和任選的藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
7.權(quán)利要求5所述的由人多能干細(xì)胞衍生的分離的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群，其用于治療與皮膚損傷有關(guān)的病癥。
8.制備人皮膚替代品的方法，包括以下步驟提供權(quán)利要求5所述的由人多能干細(xì)胞衍生的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群的器官型培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中權(quán)利要求5所述的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群預(yù)先接種在移植有人真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)上。
10.能夠由權(quán)利要求8或9的方法獲得的人皮膚替代品。
11.權(quán)利要求10所述的人皮膚替代品在篩選化合物中的用途。
12.權(quán)利要求10所述的人皮膚替代品在培養(yǎng)腫瘤和病理試劑中的用途。
13.權(quán)利要求10所述的人皮膚替代品，其用于治療與皮膚損傷有關(guān)的病癥。
14.權(quán)利要求10所述的人皮膚替代品，其用于傷口愈合和燒傷治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于獲得由人多能干細(xì)胞衍生的人角質(zhì)形成細(xì)胞群的體外方法，該方法包括如下步驟在刺激表皮誘導(dǎo)的物質(zhì)和刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化的物質(zhì)存在下共培養(yǎng)人多能干細(xì)胞和支持外胚層分化的細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的涉及制備人皮膚替代品的方法，該方法包括以下步驟提供由本發(fā)明方法得到的由人多能干細(xì)胞衍生的基本上純的同源人角質(zhì)形成細(xì)胞群的器官型培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102186969SQ200980125655
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者欣德·蓋農(nóng), 吉勒·勒邁特, 克里斯蒂娜·巴爾代斯基, 馬克·佩先斯基 申請(qǐng)人:國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究院