專利名稱：用于動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體的制作方法
用于動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，被所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，及使用所述細(xì)胞系制備靶蛋白的方法。
背景技術(shù)：
一般而言，作為工業(yè)上用于過表達(dá)靶蛋白的技術(shù)優(yōu)選動物細(xì)胞培養(yǎng)。因為有工業(yè)價值的蛋白大多是人或動物來源的蛋白，且特異性蛋白修飾機(jī)理(糖基化，磷酸化，酰胺化)容易在動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。目前用于工業(yè)的動物細(xì)胞是CH0(中國倉鼠卵巢)，BHK(幼倉鼠腎)及骨髓瘤細(xì)胞，其中，類似于基于微生物的表達(dá)系統(tǒng)，通過將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)所述細(xì)胞來表達(dá)靶蛋白。但是，動物細(xì)胞的缺點在于，相比微生物中的表達(dá)，顯示低水平的轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)。用于克服此缺點的廣泛用于工業(yè)的系統(tǒng)是使用二氫葉酸還原酶(DHFR)基因及其基因活化抑制劑，甲氨喋呤(MTX)的外源基因擴(kuò)增系統(tǒng)。此系統(tǒng)基于，將編碼靶蛋白的基因與編碼選擇性標(biāo)記物(DHFR蛋白)的基因插入染色體DNA的相同區(qū)，則當(dāng)人為逐步增加MTX 濃度時，附近定位的外源基因與細(xì)胞系中對于生存必要的DHFR基因同時擴(kuò)增的現(xiàn)象。已有報道，當(dāng)用MTX處理時，表達(dá)載體內(nèi)的DHFR基因與附近定位的基因同時擴(kuò)增 (Kaufman et al. Mol Cell Biol. Jul ;5 (7) 1750-9 (1985))，還有報道稱，插入表達(dá)載體內(nèi)DHFR基因附近的外源基因在動物細(xì)胞內(nèi)以高水平共表達(dá)(Alt et al. Cold SpringHarb Symp Quant Biol. 42Pt 2:649-57(1978)；美國專利 No. 4656134)?；驍U(kuò)增通常是非常罕見的現(xiàn)象，但有跡象表，可通過選擇抵抗連續(xù)增加的MTX 濃度的細(xì)胞實現(xiàn)獲得基因擴(kuò)增的細(xì)胞，MTX抗性集落形成耗時約3 4周，且使用變動于 50nM 500mM的MTX濃度實現(xiàn)工業(yè)上顯著水平的擴(kuò)增需要幾個月的時間和幾個階段的擴(kuò)增過程。但是，在使用MTX處理的誘導(dǎo)基因擴(kuò)增處理期間，隨著階段性增加的MTX濃度，可在細(xì)胞系生長速率及產(chǎn)率上發(fā)生問題，有報道稱，即便實際增加MTX濃度，重組蛋白表達(dá)非但不增加，反倒減少(Kaufman et al. Mol Cell Biol. J ；5 (7) :1750-9 (1985))。類似地，最近有報道稱，通過突變表達(dá)載體內(nèi)的DHFR基因控制因子序列可顯著增加MTX的基因擴(kuò)增效果(Bai et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. Feb25 ；83 (4) 333-7(2003)) 在本申請通篇參考了多個論文及專利文獻(xiàn)，及標(biāo)出了其引用。將引用的論文及專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用整體并入本說明書，以更完全說明本發(fā)明所屬領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。發(fā)明概述本發(fā)明人為解決使用經(jīng)含DHFR基因的載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞的蛋白的表達(dá)中的低表達(dá)率的問題，基因擴(kuò)增誘導(dǎo)過程中利用的高濃度的甲氨喋呤所致的低水平的細(xì)胞系生長速率及產(chǎn)率的問題進(jìn)行了銳意研究。結(jié)果，本發(fā)明人開發(fā)出通過使用含可操作連接于小鼠來源的DHFR啟動子的人DHFR基因序列的重組載體，由此即使以更低濃度的甲氨喋呤，也可誘導(dǎo)外源基因的有效擴(kuò)增而大量獲得外源蛋白的用于動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，從而完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明旨在提供用于dhfr_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還旨在提供經(jīng)所述載體轉(zhuǎn)化的dhfr_動物細(xì)胞系。本發(fā)明還旨在提供使用所述轉(zhuǎn)化的也打_動物細(xì)胞系制備蛋白的方法。本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點將從以下發(fā)明詳述、權(quán)利要求書及附圖而顯而易見。根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供用于dhfr_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其包括(a)包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中所列的核苷酸序列的二氫葉酸還原酶(DHFR) 啟動子；及(b)可操作連接(operatively linked)于所述啟動子的DHFR-編碼核苷酸序列。本發(fā)明人為解決使用經(jīng)含DHFR基因的載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞的蛋白的表達(dá)中的低表達(dá)率的問題，基因擴(kuò)增誘導(dǎo)過程中利用的高濃度的甲氨喋呤所致的低水平的細(xì)胞系生長速率及產(chǎn)率的問題進(jìn)行了銳意研究。結(jié)果，本發(fā)明人開發(fā)出通過使用含可操作連接于小鼠來源的DHFR啟動子的人DHFR基因序列的重組載體，由此即使以更低濃度的甲氨喋呤，也可誘導(dǎo)外源基因的有效擴(kuò)增而大量獲得外源蛋白的用于動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體。本文所用的術(shù)語“DHFR(二氫葉酸還原酶)”指將二氫葉酸還原成四氫葉酸的酶， 是核酸合成中的必要酶，且是細(xì)胞生長中的必要酶。本發(fā)明涉及在dhfr—動物細(xì)胞中，在低濃度的DHFR抑制劑存在下，特別在低濃度的甲氨喋呤(MTX)存在下實現(xiàn)載體的有效擴(kuò)增而大量生產(chǎn)外源重組蛋白的表達(dá)載體。本文中的術(shù)語“dhfr—動物細(xì)胞”指DHFR不正常表達(dá)而細(xì)胞內(nèi)無所述酶活性或幾乎無所述酶活性的經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞。本發(fā)明利用了所述宿主細(xì)胞的特性及包含待選擇 (selection)的DHFR基因的基因的擴(kuò)增(gene amplification)原理。這是，將dhff動物細(xì)胞用含dhfr基因的載體轉(zhuǎn)化，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用DHFR抑制劑處理時，則選擇出在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增含dhfr的載體的細(xì)胞。因此，實現(xiàn)載體的擴(kuò)增。如本文所用“MTX(甲氨喋呤)”指DHFR抑制劑，其抑制葉酸經(jīng)二氫葉酸(FH2)還原成四氫葉酸(FH4)。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述DHFR啟動子是小鼠來源的，及所述DHFR-編碼核苷酸是人來源的。本發(fā)明中使用的DHFR啟動子是小鼠dhfr基因的啟動子序列中具有適宜于本發(fā)明的目的的啟動子活性的部分序列。本發(fā)明中使用的SEQ ID NO :1及SEQ ID NO 2的啟動子呈現(xiàn)相比以往的動物細(xì)胞表達(dá)用啟動子相對低的啟動子活性，這導(dǎo)致可操作連接于所述啟動子的dhfr基因的表達(dá)率降低，且在低得多的量的MTX濃度下，也可選擇出含dhfr基因的載體在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增的細(xì)胞。結(jié)果，實現(xiàn)載體擴(kuò)增，同時目的外源蛋白的表達(dá)率也增加。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明中使用的啟動子序列由SEQ IDNO :1及SEQ ID NO 2 中所列的核苷酸序列構(gòu)成。在本發(fā)明的重組表達(dá)載體中，DHFR-編碼核苷酸序列可操作連接于所述啟動子。本文所用的術(shù)語“可操作連接的”指核酸表達(dá)調(diào)控序列(例如，啟動子序列)與其他核酸序列之間的功能性連接，由此，所述調(diào)控序列調(diào)控其他核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。本發(fā)明中使用的DHFR-編碼核苷酸序列優(yōu)選為人來源的DHFR基因，最優(yōu)選為如GenBank登錄號匪000791中所述的人DHFR基因⑶S (編碼序列，核苷酸序列第493位 第 1056位)序列可在本發(fā)明中用作DHRF-編碼核苷酸序列。本發(fā)明的重組表達(dá)載體用于dhfr_動物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述動物細(xì)胞是酵母(釀酒酵母)，昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞，還更優(yōu)選為CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞系，W138, BHK, COS-7,293, H印G2，3T3，RIN, MDCK細(xì)胞系或 BHK (幼倉鼠腎)細(xì)胞系，最優(yōu)選為CHO細(xì)胞系。已驗證DHFR缺陷型CHO細(xì)胞的安全性及有效性，且得到FDA的批準(zhǔn)而廣泛用于藥用重組蛋白的生產(chǎn)。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的表達(dá)載體還包括額外的外源基因核苷酸序列。本發(fā)明中編碼待表達(dá)的靶蛋白的外源基因包括任何基因序列。例如，所述外源基因包括編碼激素類，激素類似物，酶，酶抑制劑，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或其部分，單鏈抗體，結(jié)合蛋白或其結(jié)合結(jié)構(gòu)域，抗原，粘合性蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白，調(diào)控蛋白，毒素蛋白，細(xì)胞因子，各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，血液凝固因子或疫苗蛋白的核苷酸序列。具體而言，被本發(fā)明的載體擴(kuò)增及表達(dá)的外源基因包括編碼胰島素，IGF-I (胰島素樣生長因子1)，生長激素，BMP (骨形態(tài)生成蛋白)，TGF (轉(zhuǎn)化生長因子)，紅細(xì)胞生成素，G-CSFs (粒細(xì)胞-集落刺激因子)，GM-CSFs (粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞-集落刺激因子)，干擾素-α，干擾素-β，干擾素-Y，白細(xì)胞介素-1 α 及β，白細(xì)胞介素_3，白細(xì)胞介素_4，白細(xì)胞介素-6，白細(xì)胞介素-2，EGFs (表皮生長因子)，降鈣素，ACTH (促腎上腺皮質(zhì)激素)，TNF (腫瘤壞死因子)，TNFR (腫瘤壞死因子受體)， IDS (艾杜糖-2-硫酸酯酶)，atobisban，布舍瑞林，西曲瑞克，地洛瑞林，去氨加壓素，強(qiáng)啡肽A(1 13)，依降鈣素，eleidosin，依替巴肽，GHRH-II (生長激素釋放激素-II)，戈那瑞林，戈舍瑞林，組氨瑞林，亮丙瑞林，賴氨加壓素，奧曲肽，縮宮素，必壓生，胰泌素，辛卡利特，特利加壓素，胸腺噴丁，胸腺素α 1，曲普瑞林，比伐盧定，卡貝縮宮素，環(huán)孢素，exedine, 蘭瑞肽，LHRH(促黃體釋放激素)，那法瑞林，甲狀旁腺素，普蘭林肽，T-20恩夫韋肽，胸腺法新或齊考諾肽的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述外源基因的核苷酸序列上游連接有可在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子序列。所述可在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子序列有巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子、SV40啟動子(SV40晚期啟動子及SV40早期啟動子)，HSV(單純皰疹病毒)的tk啟動子，腺病毒2主要晚期啟動子(PAdml)，腺病毒2早期啟動子(PAdE2)，AAV (人細(xì)小病毒相關(guān)病毒)的P19啟動子，愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)啟動子，勞斯肉瘤病毒(RSV) 啟動子，痘苗病毒7.漲啟動子，小鼠金屬硫蛋白啟動子，MT啟動子，MMTV LTR啟動子，HIV LTR啟動子，β-肌動蛋白啟動子，EFl α-啟動子，人IL-2基因啟動子，人IFN基因啟動子， 人IL-4基因啟動子，人淋巴毒素啟動子及人GM-CSF基因啟動子，及人血紅蛋白，人肌肉肌酸或人金屬硫蛋白來源的啟動子，但不限于這些。本發(fā)明的表達(dá)載體含多聚腺苷酸化序列作為轉(zhuǎn)錄終止序列，例如，牛生長激素終止子(Gimmi, E. R.，et al.，Nucleic Acids Res. 17 :6983-6998 (1989)), SV40 來源的多聚腺苷酸化序列(Schek, N, et al.，Mol. Cell Biol. 12 :5386-5393 (1992)), HIV-I 多聚 A(Klasens, B. I. F. , et al.，Nucleic Acids Res. 26 :1870-1876 (1998))，β-珠蛋白多聚 A (Gil,A. ,et al，Cell 49 :399-406 (1987))，HSV TK多聚 A (Cole，C. N. and Τ. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5 :2104-2113(1985))或多瘤病毒多聚 A (Batt，D. B and G. G. Carmi chael, Mol. Cell. Biol. 15 :4783-4790 (1995))，但不限于這些。
此外，本發(fā)明的表達(dá)載體可含本領(lǐng)域通常使用的抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記物，例如，包括針對氨芐西林，慶大霉素，羧芐西林，氯霉素，鏈霉素，卡那霉素，遺傳霉素 (G418)，新霉素或四環(huán)素的抗性基因。在更優(yōu)選的實施方式中，所述用于大量生產(chǎn)外源蛋白的動物細(xì)胞用表達(dá)載體是具有示于圖3a的基因圖譜的載體，最優(yōu)選為pJK-dhfr-1 (KCTC 11299BP)或ρJK-dhfr_2 (KCTC 11300BP)。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，本發(fā)明提供被所述dhfr—動物細(xì)胞用載體轉(zhuǎn)化的 dhfr—動物細(xì)胞系。本發(fā)明中用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化dhfr_動物細(xì)胞的方法包括顯微注射法(Capecchi， Μ· R.，Cell，22 :479(1980))，磷酸鈣沉淀法(Graham, F. L. et al. , Virology, 52 456(1973))，電穿孔法(Neumann, Ε. et al.，EMB0J.，1 :841 (1982))，脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(Wong，Τ. K. et al.，Gene, 10 :87(1980)), DEAE-葡聚糖處理法(Gopal，Mol. Cell Biol.，5 :1188-1190(1985)),及基因轟擊法(Yang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,87 9568-9572(1990))等。本發(fā)明的另一實施方式中提供了制備外源蛋白的方法，其包括(a)在添加了二氫葉酸還原酶抑制劑的條件下培養(yǎng)用于產(chǎn)生大量所述外源蛋白的本發(fā)明的細(xì)胞系的步驟； 及(b)從細(xì)胞培養(yǎng)物純化外源蛋白的步驟。所述DHFR抑制劑包括，但不限于，例如氨基蝶呤(aminopterin)及甲氨喋呤 (MTX)，更優(yōu)選為甲氨喋呤(MTX)。用于基因擴(kuò)增的MTX由于昂貴，雖然在以試管水平實施的實驗室的實驗中不至成為重要的考慮因素，當(dāng)在以大容量水平實施時，會成為重要的考慮因素。此外，為了逐步適應(yīng)細(xì)胞至1 μ M濃度會耗時多于6個月的漫長的時間，且有高濃度的MTX培養(yǎng)所致的細(xì)胞生長低下的副作用。因此，本領(lǐng)域持續(xù)研究了降低所添加的MTX的濃度的方案。另一方面，本領(lǐng)域為了基因擴(kuò)增利用濃度約0. 05 5mM的MTX。本發(fā)明的制備方法中使用的細(xì)胞系是在低濃度的MTX也可良好實現(xiàn)擴(kuò)增的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。優(yōu)選地，本發(fā)明中添加的MTX濃度優(yōu)選為 0. 001 10 μ Μ,更優(yōu)選為0. 003 1 μ Μ,且最優(yōu)選為0. 005 0. 32 μ Μ。本發(fā)明的制備方法中，培養(yǎng)階段可在本發(fā)明中通常使用的培養(yǎng)基中實施。例如，Eagle 氏 MEM (Eagle 氏最小必需培養(yǎng)基，Eagle, H. Science 130 :432(1959)), α -MEM(Stanner,C. P. et al. ,Nat. New Biol. 230 :52(1971))，Iscove 氏 MEM(Iscove，N. et al.，J. Exp. Med. 147 :923 (1978))，199 培養(yǎng)基(Morgan et al.，Proc. Soc. Exp. Bio. Med.， 73 1(1950)),CMRL 1066，RPMI 1640(Moore et al. , J. Amer. Med. Assoc. 199 :519 (1967)), F12(Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA53 :288(1965))，F(xiàn)lO (Ham, R. G. Exp. Cell Res. 29 515(1963))，DMEM(Dulbecco 氏改良的 Eagle 氏培養(yǎng)基，Dulbecco, R. et al.，Virology8 396(1959))，DMEM 和 F12 的混合物(Barnes, D. et al.，Anal. Biochem. 102 :255(1980)), Way-mouth ft MB752/1 (ffaymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22 1003 (1959)), McCoy ' s 5A(McCoy, Τ. A. , et al. , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100 :115(1959))及 MCDB 系列(Ham, R. G. et al. , In Vitro 14 :11 (1978))等。對培養(yǎng)基的說明詳細(xì)描述于 R. IanFreshney， Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique,Alan R. Liss,Inc. ,New York,將其通過引用整體并入本文。在所述細(xì)胞培養(yǎng)步驟中，由宿主細(xì)胞表達(dá)的外源蛋白分泌到培養(yǎng)基。通過純化如此分泌的蛋白可得到大量的靶蛋白。在本發(fā)明中，所述純化步驟可通過本領(lǐng)域通常使用的純化方法實施，例如，利用硫酸銨或PEG的基于溶解度的分級分離(solubility fractionation)，基于分子量的超濾分離，通過各種層析方法(為基于尺寸，帶電性，疏水性或親和力的分離制造的)的分離等多樣的方法，通常利用上述方法的組合來純化。將本發(fā)明的特征及優(yōu)點總結(jié)如下(i)本發(fā)明提供包括啟動子活性減少的DHFR啟動子的用于(&打_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體。(ii)本發(fā)明的載體相比既有的動物細(xì)胞表達(dá)載體，可使在低得多的甲氨喋呤濃度下也可有效選擇外源基因與DHFR基因一起擴(kuò)增的細(xì)胞系克隆。(iii)根據(jù)本發(fā)明，由于所使用的甲氨喋呤濃度的降低，具有成本降低的效果，且在細(xì)胞系的生長速率及產(chǎn)率方面呈現(xiàn)優(yōu)良效果。

圖Ia Ib是本發(fā)明中使用的DHFR基礎(chǔ)啟動子的序列A及序列B。圖2是通過在本發(fā)明中比較熒光素酶表達(dá)量的啟動子性能實驗結(jié)果。圖3a是本發(fā)明的動物細(xì)胞用重組表達(dá)載體的基因圖譜的模式圖。圖北是本發(fā)明的動物細(xì)胞用重組表達(dá)載體的具體實施例，pJK-DHFR-1。圖3c是用于構(gòu)建本發(fā)明的動物細(xì)胞用重組表達(dá)載體的PMS表達(dá)載體的基因圖譜。在圖3a中，DHFR 人來源的DHFR-編碼核苷酸序列；dhfr啟動子SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的小鼠來源的。圖4是顯示本發(fā)明的pJK-DHFR-2表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)的模式圖。圖5是顯示本發(fā)明的pJK-DHFR_0r2表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)的模式圖。圖6a 6b是顯示本發(fā)明的ρJKIg及ρJKIg-RSV HK表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)的模式圖。圖7是將利用pJK-DHFR-1載體制備的人TNFR表達(dá)細(xì)胞系的表達(dá)效價通過ELISA 分析的結(jié)果。圖8是將利用pJK-DHFR-0r2載體制備的人IDS表達(dá)細(xì)胞系的表達(dá)效價通過ELISA 分析的結(jié)果。圖9是將利用pJKIg載體制備的RSV抗體表達(dá)細(xì)胞系的表達(dá)效價通過ELISA分析的結(jié)果。圖10是將利用pJKIg載體制備的GS051抗體表達(dá)細(xì)胞系的表達(dá)效價通過ELISA 分析的結(jié)果。圖11-a是將利用pJKIg載體制備的GS071抗體表達(dá)細(xì)胞系的表達(dá)效價通過ELISA 分析的結(jié)果。圖11-b是將GS071抗體表達(dá)細(xì)胞系用20nM MTX擴(kuò)增后亞克隆得到的細(xì)胞系的表達(dá)效價通過ELISA分析的結(jié)果。圖11-c是將GS071抗體表達(dá)細(xì)胞系用80nM MTX擴(kuò)增后亞克隆得到的細(xì)胞系的表達(dá)效價通過ELISA分析的結(jié)果。
以下將通過實施例更詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員明晰這些實施例僅旨在更具體闡明，且本發(fā)明的范圍不受這些實施例的限制。
實施例實施例1小鼠來源的DHFR啟動子，SV40病毒早期啟動子及SV40病毒早期啟動子及增強(qiáng)子的克隆如下進(jìn)行針對DHFR的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。首先，為了獲得屬于小鼠DHFR基因的5，-端序列中的包括強(qiáng)TATA序列的具有基礎(chǔ)啟動子活性的DHFR啟動子區(qū)，使用DNA提取試劑盒(Intron，韓國)分離了小鼠基因組核酸(genomic DNA)。向200ng分離的小鼠核酸添加50pmol Pl及P2引物，0. 5mM dNTP及 Softmax DNA聚合酶(Intron，韓國)，以在95°C 1分鐘，在55°C 40秒鐘及在72°C 40秒鐘的1個循環(huán)重復(fù)四次，然后在72°C 10分鐘來進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)而得到小鼠來源的DHFR啟動子。使用IOng pcDNA3 載體(Invitrogen，USA)作為模板，分別用 P3，P4 及 P3，P5 各引物，利用如同上述獲得小鼠來源的DHFR啟動子的PCR方法(溫度，時間及循環(huán))合成了 SV40病毒的早期啟動子及啟動子/增強(qiáng)子(可操作連接于啟動子的增強(qiáng)子)DNA片段。通過各引物堿基序列及PCR得到的DNA片段大小顯示于表1。表1
權(quán)利要求
1.用于dhfr_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其包括(a)二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子，其包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中所列的核苷酸序列；及(b)可操作地連接于所述啟動子的DHFR-編碼核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的用于(&打_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其中所述DHFR啟動子是小鼠來源的，且所述DHFR-編碼核苷酸序列是人來源的。
3.權(quán)利要求1的用于dhfr—動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其中所述動物細(xì)胞是CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的用于(&打_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體包括額外的外源基因序列。
5.權(quán)利要求1的用于dhfr—動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其中所述外源基因核苷酸序列的上游連接有在真核細(xì)胞內(nèi)運(yùn)作的啟動子序列。
6.權(quán)利要求1的用于(&打_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體如圖3a中的基因圖譜所示。
7.權(quán)利要求6的用于dhfr_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體保藏為KCTC 11299BP。
8.權(quán)利要求6的用于dhfr_動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體保藏為KCTC 11300BP。
9.動物細(xì)胞，其被權(quán)利要求1 8中任一項的載體轉(zhuǎn)化。
10.制備靶蛋白的方法，其包括以下步驟(a)在添加了甲氨喋呤的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9的動物細(xì)胞；及(b)從(a)的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物純化靶蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于動物細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其含可操作連接于DHFR啟動子的二氫葉酸還原酶(DHFR)編碼核苷酸序列，被所述載體轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞系，及使用所述細(xì)胞系制備靶蛋白的方法。相比既有的動物細(xì)胞表達(dá)載體，本發(fā)明的載體能使甚至在低得多的甲氨喋呤濃度下，有效篩選外源基因伴隨DHFR基因擴(kuò)增的細(xì)胞系克隆。本發(fā)明由于可在產(chǎn)生蛋白的細(xì)胞系的建立過程中，通過使用更低濃度的甲氨喋呤短時間內(nèi)確保高產(chǎn)率細(xì)胞系，從而在細(xì)胞系制備方面呈現(xiàn)優(yōu)良的效果。
文檔編號C12N15/64GK102177239SQ200980126484
公開日2011年9月7日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日
發(fā)明者朱惠瓊, 田椿珠, 金在燮, 金根洙 申請人:Aprogen株式會社